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MAYARA GELINSKRICARDO ANDRADESILVANA A. ARMELIN RODRIGUES

PCR: REAO EM CADEIA DA POLIMERASE E MINIPREPARAO DE DNA (MINIPREP)

Prof. Odair Jos Andrade Pais dos SantosBiologia Molecular II

Londrina2015SUMRIO

CAPITULO I - PCR: REAO EM CADEIA DA POLIMERAS31. INTRODUO62. OBJETIVO33. MATERIAL E MTODOS73.1 MATERIALPARA A TCNICA PCR73.2 MATATERIAL PARA ELETROFORESE EM GEL73.4.2 TCNICA DA PCR84. PREPARO PARA ELETROFORESE EM GEL95. RESULTADOS E DISCUSSO136. CONCLUSO14

CAPITULO II - MINIPREPARAO DE DNA (MINIPREP)41. INTRODUO152. OBJETIVO17 3. MATERIAL E MTODOS 183.1 MATERIALPARA A TCNICA PCR183.2 MTODOS194. RESULTADO E DISCUSSO24 5. CONCLUSO256. BIBLIOGRAFIA 26

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PCR: REAO EM CADEIA DA POLIMERAS

1 INTRODUO

A tcnica de amplificao de segmentos de DNA, a qual usa a reao em cadeia da polimerase, conhecida como PCR, sigla do ingls Polymerase Chain Reaction, tem trazido novas possibilidades nas mais variadas reas da Cincia (ZAHA; FERREIRA; PASSAGLIA, 2014). Na reviso elaborada por Templeton (1992apud VERLENGIAet al., 2013) sobre The polymerase Chain Reaction: History, MethodsandApplications,ele coloca a tecnologia de PCR como um resultado de uma srie de descobertas significativas da pesquisa cientfica na poca, a qual teve incio com a descoberta, por Arthur Knorberg em 1955, da primeira DNA polimerase, sendo purificada pela primeira vez em 1958.Em 1985, o Dr Kary B. Mullis, tornou publica a moderna tecnologia da PCR pela primeira vez, no Simpsio de Gentica Humana da Sociedade Americana,sendo esta desenvolvida para diagnsticos de anemia falciforme (SAIKI et al., 1985 VERLENGIA et al., 2013).As molculas de DNA ou cDNA podem ser amplificadas milhares ou milhes de vezes, devido a simplicidade e rapidez do processo envolvido na tcnica da PCR (ZAHA; FERREIRA; PASSAGLIA, 2014).De acordo com Verlengiaet al. (2013), so os iniciadores oligonucleotdeos ou primers que comandam a replicao ou amplificao enzimtica in vitro das sequncias de DNA (alvo) na PCR e geram dessa forma um nmero exponencial de cpias das sequncias desejadas, quantidades da ordem de nanogramas de cidos nucleicos.Zaha, Ferreira e Passaglia (2014) detalham que a PCR consiste de ciclos repetidos de desnaturao do DNA de fita dupla, hibridao dos iniciadores nos alvos de fita simples e sntese da nova cadeia por uma DNA polimerase. O cido nucleico de fita dupla convertido em fita simples com a desnaturao do DNA quando exposto a temperaturas elevadas (ZAHA; FERREIRA; PASSAGLIA, 2014), a desnaturao do DNA-alvo demanda de 3 a 5 minutos em temperaturas entre 94C e 95C previamente ao 1 ciclo e mantida nos demais ciclos por 30 a 60 s.Temperatura e tempo de desnaturao so dependentes da extenso e quantidade de G e C da sequncia-alvo (VERLENGIA et al., 2013).O pareamento entre bases nitrogenadas dos iniciadores e sequncias especficas do DNA-alvo promovem a hibridao dos iniciadores, quando em temperaturas adequadas obtidas a partir das sequncias dos iniciadores. H interao por complementariedade das bases entre iniciadores e sequncias-alvo (VERLENGIA et al., 2013). Uma DNA polimerase termoestvel promove a sntese da nova cadeia de DNA unindo os desoxinucleotdeos trifosfatos na extremidade 3 OH livre no duplex formado entre o DNA-alvo e o iniciador, sendo essa nova sequncia de nucleotdeos complementar a sequncia-alvo (VERLENGIA et al., 2013)..O tamanho, o nmero de cpias do DNA-alvo e a temperatura aplicada na etapa de sntese dos produtos de PCR influem no tempo de extenso. A Taq DNA polimerase atua em temperaturas de 20 C e 85 C. A temperatura de 72C a mais empregada para a extenso dos iniciadores e a qual a Taq DNA polimerase tem seu melhor desempenho. Na demanda de tempo de extenso muito longo, por conta de produtos maiores do DNA-alvo, faz-se necessrio adicionar gelatina ou albumina srica bovina soluo tampo da reao com o objetivo de ampliar a atividade e estabilidade da Taq DNA polimerase (VERLENGIA et al., 2013).De acordo com Verlengiaet al. (2013), as etapas de desnaturao, hibridao e extenso da PCR requerem ciclos de temperaturas variveis e tais temperaturas devem ser totalmente adequadas para que se possa manter a estringnciarequerida para a hibridao dos iniciadores s sequncias-alvo e garantir as condies timas para a desnaturao e a extenso do DNA de fita dupla. A estringncia est relacionada com as condies da hibridao, pois so elas que formam ou no as pontes de hidrognio essenciais para manter as fitas de cidos nucleicosunidas. Os fatores temperatura, condies inicas e concentrao de molculas que dificultam a formao de hbridos promovem o controle da estringncia. A alta estringncia mantm a hibridao de sondas com grande similaridade sequncia apenas ea baixa estringncia, diminui a especificidade e aumenta a probabilidade de pareamento inadequado de nucleotdeos. Zaha, Ferreira e Passaglia (2014) explicam que a PCR demanda de aquecimento e resfriamento rpido das amostras e isto possvel de ser realizado com um aparelho denominado termociclador, o qual possibilita controlar e alternar temperaturas em perodos programados de tempo de acordo com os ciclos de PCR desejados, como por exemplo, aquecer uma amostra a 95C para desnaturar o DNA-alvo, reduzir a temperatura para 45-65C para proporcionar o anelamento dos iniciadores, elevar novamente a temperatura para 68 C 72 C para a extenso da cadeia da DNA (polimerizao). So as etapas de desnaturao, anelamento e polimerizao, repetidas vrias vezes (20 a 30 ciclos) que possibilitam a amplificao do DNA-moldeA PCR uma tcnica muito sensvel, a qual permite amplificar o DNA mesmo a partir de uma amostragem muito pequena e por conta dessa importante caracterstica tem sido possvel a sua aplicao em diferentes nveis de pesquisa, tais como, testes de identificao gentica, medicina forense, diagnstico de doenas infecciosas, controle de qualidade industrial, etc (ZAHA; FERREIRA; PASSAGLIA, 2014). De acordo com Zaha, Ferreira e Passaglia (2014), as molculas biolgicas como DNA e RNA por exemplo, possuem carga eltrica negativa as quais em contato com um campo eltrico migram na direo do polo oposto: positivo; a migrao depende da forma e da razo carga/massa da molcula. A eletroforese promovida em um gel de agarose, promove a migrao de molculas de DNA de tamanhos e velocidades diferentes atravs da rede de poros do gel. As molculas menores migram mais rapidamente sobre o gel e assim a eletroforese viabiliza a separao das molculas de DNA de acordo com suas dimenses.Para analisar os resultados da eletroforese em gel basta corar o DNA presente no prprio gel, tornando-o visvel, onde a molcula de DNA se liga ao corante e ao ser exposta luz UV resulta uma cor avermelhada fluorescente (ZAHA; FERREIRA; PASSAGLIA, 2014). .

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2 OBJETIVO

Realizar a tcnica de reao em cadeia da polimerase PCR,depolymerasechainreaction.

3 MATERIAL E MTODOS

3.1 MATERIALPARA A TCNICA PCR

1L de DNA (no faz parte do MIX)1,5 L de primer F (20 pmolL)1,5 L de primer R (20 pmolL)0,2 L de enzimaTaq DNA polimerase (5 U L) (no faz parte do MIX)5L de tampo 10X Rnx Buffer (Invitrogen), especfico da enzima Taq DNA polimerase1L de desoxiribonucleotdeos (10mM)1,2 L de cloreto de magnsio (50mM)gua ultrapura estril para um volume final de 50 L1,2 L MagnsioTubosEppendorf ou tubos de microcentrfugaMicropipetas automticas Ponteiras descartveis para as micropipetasFrascos para descarteTermociclador

3.2 MATATERIAL PARA ELETROFORESE EM GEL

Forma para acondicionar o gelFita adesivaGel de agarose 1% em tampo TBE 1 x concentrado.MicroondasMicropipeta automticaPonteiras descartveis para as micropipetasFrascos para descarteBquerBasto de vidro

3.3.1 MTODOS

3.4.2 TCNICA DA PCR

O MIX para a PCR foi preparado na quantidade suficiente para 9 amostras, uma para cada aluno e uma amostra extra devido ao resduo que fica retido no bquer e dessa forma no comprometer as quantidades necessrias na preparao do MIX. O MIX para a PCR foi preparado diretamente nos tubos Eppendorfs, utilizando-se de micropipetas automticas,nas seguintes quantidades:13,5 L dePrimer F13,5 L de Primer R45 L de Tampo 9 L de desoxiribonucleotdeos (DNTP) 10,8 L de Magnsio347,4 L de guaCada aluno preparou o seu material de PCR. Foi preparado 48,8 L de Mix no tubo eppendorf, o qual na sequncia recebeu 0,2 L de Taq DNA polimerase, com o auxlio de uma micropipeta, de modo que a micropipeta a dispensasse cuidadosamente em um dos lados da parede interna do eppendorf e 0,1 L de DNA dispensado pela micropipeta no outro lado da parede do eppendorf. A tcnica da PCR ocorre semelhana do processo natural celular de replicao do DNA, logo a tcnica foi desenvolvida respeitando-se as etapas naturais com o auxlio do termociclador, equipamento que permite o controle e a alternncia das temperaturas requeridas em cada um dos trs passos do ciclo da PCR. Iniciou-se temperatura ambiente (laboratorial), de 20-25 C, seguida da subida da temperatura para 90C,a qual uma fase importante de estabilizao do material da amostra de DNA.Passo 1 Para a desnaturao: aplicou-se a temperatura de 94 C por 5. Na busca pela desnaturao das molculas indesejadas e pelo desnovelamento do DNA, separando-se a cadeia dupla em dois filamentos de DNA, que normalmente so unidos por ligaes de hidrognio e que por serem ligaes fracas se quebram com a temperatura elevada, ao contrrio das ligaes entre as molculas de fosfato e desoxirribose que se mantm unidas, por ligaes covalentes mais fortes. Passo 2 Para a hibridao: nessa etapa aplicou-se a temperatura de 57 C por 2:30 minutos, buscando-se a ligao dos iniciadores (primers) ao DNA da amostra.Passo 3 Para a Extenso: aplicou-se a temperatura de 72 C por 2 minutos. Nessa etapa no pode haver variao da temperatura, para a polimerase.Normalmente aps isso, d-se incio repetio dos ciclos, os quais normalmente acontecem de 30 a 40 ciclos). Foram repetidos poucos ciclos neste procedimento devido ao curto tempo da aula prtica.

4. PREPARO PARA ELETROFORESE EM GEL

A forma do gel foi preparada, tendo as suas extremidades fechadas com fita adesiva, dando-lhe o aspecto de uma caixinha e foi mantida na superfcie nivelada da bancada do laboratrio. O pente foi adaptado de maneira que no atingisse o fundo da forma.A agarose (polissacardeo) foi diluda com gua em bquer, com o auxlio de um basto de vidro e levada ao forno microondas para solubilizar, sendo monitorada pra que ela no fervesse.O gel foi cuidadosamente despejado na forma, at atingir a espessura de 5 mm, ou seja at formar o Slot, na profundidade ideal (Figura 1)

Figura 1 Pente sobre a forma com gel

Fonte: os prprios autores, 2015

Esperou-se o tempo de gelificao da agarose, o qual ao gelificar adquiriu o aspecto turvo (Figura 2), como era o esperado. Aps esse tempo, as fitas adesivas das laterais da forma foram removidas e o pente foi tambm removido cuidadosamente a fim de no danificar os slots, conforme a Figura 2.

Figura 2Forma com gel gelificado e com aspecto turvo,aps a retirada dopente. possvel observar-se os poos de gel formados pelo pente, onde sero depositadas as amostras de DNA

Fonte: os prprios autores, 2015

A amostra foi aplicada no gel com o auxlio de uma micropipeta automtica, ajustando-se o seu volume e aspirando-se a amostra. Usando-se as duas mos para ter-se a firmeza necessria, mergulhou-se a ponta do tip (ponteira da micropipeta)bem acima da regio central do slot, sem afundar o tip no fundo do slot e a amostra foi dispensada lenta e cuidadosamente no slot, pequeno poo de gel.A fim de aprimorar a tcnica, foi possvel praticar com as micropipetas, coletando-se pequenas amostras sobre o papel na bancada com a micropipeta e dispensando-se a amostra no fundo do slot (Figura 3).

Figura 3 Amostras sobre o papel e a forma com gel para prtica

Fonte: prprios autores, 2015

5 RESULTADOS E DISCUSSO

A tcnica da PCR foi realizada respeitando-se os trs passos de um ciclo semelhante ao natural: desnaturao, hibridao e extenso. O procedimento teve continuidade com o preparo e gelificao do gel utilizado em eletroforese, da mesa que recebe o pente e o gel para a aplicao da amostra nos pequenos poos de gel. Contudo no houve continuidade com a eletroforese e, portanto, no h resultados a serem demonstrados e analisados. Quando a eletroforese realizada, aps a aplicao da amostra de DNA nos poos de gel aplica-se uma corrente eltrica sobre esse gel, porque tanto DNA como RNA possuem carga eltrica negativa e quando colocadas num campo eltrico tendem a migrar em velocidades diferentes e em direo do eletrodo oposto: positivo. A eletroforese em gel possibilita a separao das molculas de DNA conforme o seu tamanho. Molculas menores migram mais rapidamente no gel (ZAHA; FERREIRA; PASSAGLIA, 2014).Segundo Zaha, Ferreira e Passaglia (2014), para analisar os resultados da eletroforese em gel necessrio colocar o DNA em evidncia e uma forma simples para resolver isso corando-se o DNA presente no gel.Quando uma quantidade mnima suficiente de DNA se liga a um corante, como por exemplo, o brometo de etdio e recebem luz ultravioleta, ocorre o fluorescimento em cor avermelhada.Contudo, o corante citado perigoso e mutagnico e a radiao UV promove queimaduras, logo tem sido empregados corantes alternativos como o sybrgreen que cora o DNA de verde ou azul e no necessariamente demanda da luz UV para a visualizao dos resultados.

6 CONCLUSOA PCR uma tcnica simples e extremamente rpida, pois permite amplificarin vitro as partes de interesse de uma amostra de DNA. Estas amostras podem representar quantidades muito pequenas de material gentico, podendo ser amplificadas milhes de vezes e em poucas horas.

MINIPREPARAO DE DNA (MINIPREP)

1 INTRODUO

O termo "plasmdeo" originalmente foi introduzido pelo bilogo molecular Joshua Lederberg. De modo geral, o plasmdeo bacteriano so molculas de DNA circulares de fita dupla independentemente do DNA cromossmico. Neste sentido cada plasmdeo contm uma seqncia de DNA portadores de genes plasmidial cujo tamanho pode variar de 5 a 400 kilobases pares de bases. Estes elementos genticos podem ser transferidos entre as mesmas espcies ou entre espcies diferentes. (NASCIMENTO, A. C. A; ESPREAFICO, M. E, LARSON, P. L. M, MONESI, N; ROSI, N. M. M; RODRIGUES V. 2003)Nas pesquisas de engenharia gentica e biologia molecular a capacidade de replicao independente e recombinao gnica dos plasmdeo so amplamente estudadas. Funcionando como ferramentas biolgicas os vetores de genes de DNA os quais ao ser inserido em outra seqncia gentica estes podem replicar conforme as divises celulares possibilitando clonagem, crescimento para seqenciamento, manipulao gnica do fragmento.Em sntese, entre os mecanismos que viabilizam a remoo dos plasmdeo para novo arranjamento, podemos destacar a minipreparao de plasmdeo conhecido como (MINIPREP). A minipreparao consiste na amplificao e extrao do DNA de interesse. Por esse modo, parte da cultura de bactrias transformadas centrifugada e submetida a solues que permitem a exposio e o armazenamento dos plasmdeos aps a lise bacteriana. (FIGUEIREDO, G. S. F, REIS, A.C. de M, CASTRO, A.S, BORGES, N. C. R., 2003) Na prtica laboratorial a tcnica da lise alcalina a mais freqente nas montagens de DNA recombinante de plasmdeo. Conforme Soares (2011) o mtodo de isolamento por lise alcalina baseia-se na diferena em desnaturao, em condies alcalinas (pH ~12) entre o DNA plasmidial circular e o cromossomal de alto peso molecular. Alm destes, outros componentes celulares, tambm so separados, tais como protenas, lipdeos, lquidos, polissacardeos, cidos nuclicos, molculas orgnicas de baixo peso molecular tambm so separados.Moreira (2003), explica que mtodo de extrao por lise inicia-se com a suspenso das clulas, coletadas atravs de centrifugao, com a soluo I (Tris, EDTA). O EDTA remove ons de Mg 2+ da superfcie celular, desorganizando a sua estrutura e reduzindo a atividade das nucleases que podem degradar o plasmdeo. Na segunda etapa, a soluo de tampo (ou soluo II) de lise contm hidrxido de sdio (NaOH) elevando o pH amostra para (12 a 12,5), e o SDS, cujo a finalidade desnaturar completamente DNA plasmdeo e o DNA genmico, em outras palavras , separar o DNA em cadeias simples.De acordo com Schaefer (2006) ao incorporar soluo III, acetato de potssio (ou acetato de sdio) com pH 5,5, a amostra neutralizado sob condies de alta concentrao de sais, fazendo com que o DNA cromossomal precipite, enquanto que o DNA plasmidial permanea em soluo. Por fim, a centrifugao final produz um extrato claro com o DNA plasmidial em soluo. Ao final para purificar a amostra, eliminando molculas indesejveis, pode-se empregar na amostra um fenol-clorofrmio ou etanol tornando a mais viscosa. Em seguida, o excesso do sobrenadante removido atravs do uso de um centrifuga e posteriormente so submetidas secagem, posteriormente as amostras ressuspendidas em gua Mili Q e seguem para desnaturao em temperatura ambiente, ou estufa a 37 C. (FIGUEIREDO, G. S. F, REIS, A.C. de M, CASTRO, A.S, BORGES, N. C. R., 2003)

2 OBJETIVO

Extrair DNA plasmidial bacteriano em pequena escala aplicando o mtodo de lise celular alcalina.

3 MATERIAL E MTODOS

3.1 MATERIALPARA A TCNICA PCR

Cultura bacteriana em meio LBTubos eppendorfsCentrifugaMicropipetasClorofrmioNaOH 0,2MSDS 1%Tampo de lise ( 25Mm Tris-HCL Ph 8.0, 10Mm EDTA pH 8.0, glicose 50Mm)IsopropanolEtanol 70% geladoGeloFolha de papel toalha (descartante)Micropipetas.

3.2 MTODOS

Aps crescimento das bactrias por 16 horas, a 37 C, em meio LB contendo antibitico (agente seletivo), sob vigorsa agitao de 250 rpm, foi realizado a transferncia de 1,0mL da cultura bacteriana de aspecto turvo em tubos de microcentrifuga do tipo eppendorf e centrifugado por 3 minutos a 14.000 rpm, a temperatura ambiente. Nesta parte do processo as clulas bacterianas que estavam em suspenso no meio lquido se precipitaram na parte inferior do tubo e apresentado aspecto claro. Conforme figura 1, abaixo.

Figura -1: Precipitao de clulas bacterianas em suspenso no meio lquido

Fonte: prprios autores, 2015

No segundo momento, retirou-se o sobrenadante no hipoclorito 1% e manteve-se o eppendorf invertido para a secagem do precipitado, tendo cuidado para no remover o sedimento celular. Na terceira etapa, com uso de uma micropipeta realizou-se a ressuspenso das clulas em vrtice fazendo uso de 100 uL de tampo de lise (25mM Tris-HCL ph 8.0), 10mM EDTA Ph 8,0, glicose 50mM). As clulas ressuspensas com essa soluo tamponada de modo que as Rnase foram lisadas de todas as molculas em nucleotdeos, mas o ADN no foi afetado.Para lise celular bacteriana foi adicionado 200 uL de soluo alcalina recm preparada (NaOH) 0,2M ; SDS 1%). E homogeneizando levemente por inverso o tubo por 6 vezes com cuidado para que o DNA liberado em pequenos fragmentos no contaminar a amostra. Adicionado 150 uL de soluo III que foi preparado com 60.0 mL de 5M de acetato de potssio, 11,5 mL de acido actico glacial e 28,5 ml de gua. Incubado no gelo por 10 minutos. Ao fim, resultaram numa suspenso clara e viscosa, com componentes moleculares no fundo, conforme figura 2, abaixo.

Figura-2: Suspenso clara e viscosa Fonte: prprios autores, 2015

Ao utilizarmos o composto de, SDS 1% como um detergente inico ele rompeu as membranas celulares e desestabilizou todas as interaes hidrofbicas destas molculas. Ou seja, seria uma espcie de emuslficante lipdico. E o pH elevado do hidrxido de sdio (NaOH) de 0,2 M desnaturou tambm outras macromolculas atacando os ons. Desta forma o aspecto claro da amostra porque as clulas forma lisadas e a viscosidade aumentada pelo aumento da concentrao de macromolculas na soluo lisadas. E o baixo pH da soluo de acetato de potssio, neutralizou o NaOH fazendo com que o pH da amostra retorna-se a ficar neutro. As molculas de DNA cromossmico e as outras macromolculas formam um precipitado, porque eles se ligam um ao outro formando uma massa desnaturada, mas os plasmdeos no precipitam mas se renaturam e no se agrega como as outras molculas porque so circulares superenrroaladas, conforme demonstra figura abaixo.

Figura-3: DNA plasmdico.

Fonte: prprios autores, 2015.Portanto, DNA do plasmdeo permanece em soluo enquanto que as protenas e outras molculas de DNA precipitam.Aps esse resultado, o sobrenadante de aspecto lmpido foi transferido para um novo tubo eppendorf previamente rotulado e descartado o pellet no hipoclorito a 1%. Adicionou-se volume de clorofrmio 1:1, na capela aproximadamente 450 ul utilizando para precipitar os cidos nuclicos, e depois foi misturado com auxilio do vrtex e centrifugado por 3 minutos a 14.000 rpm, conforme imagem abaixo.Figura-4: Centrifugao da suspenso com clorofrmio.

Fonte: prprios autores, 2015.Novamente transferido a fase aquosa para um novo tubo eppendorf foi adicionado 0,7 mL de isopropanol para precipitar o DNA cromossmico, pois as molculas de DNA tm carga negativa devido aos fosfatos sendo altamente solveis em gua, mas no solvel em solventes orgnicos. Realizado esta etapa, a amostra foi incubado no gelo por 10 minutos e posteriormente centrifugado por 15 minutos a 14.000 rpm. Figura-5: Amostra incubada em gelo.

Fonte: prprios autores, 2015Posteriormente aplicou-se o etanol a 70% gelado invertendo a mistura, realizando a lavagem para acelerar o processo. Ao final, a amostra foi invertida sobre o descarte (folha de papel toalha), conforme demonstrado abaixo, figura 6 etanol a 70%.Figura-6: Etanol a 70%

Fonte: prprios autores

Descartado o sobrenadante o sedimento ficou visvel neste ponto, observe a figura 7, abaixo.

Figura-7: Sobrenadante de isopropanol invertido sobre o descarte.

Fonte: prprios autores, 2015.Posteriormente o sobrenadante formado com uso do etanol foi removido invertendo o tubo do eppendorf sobre o descarte (folha de papel toalha) e o restante retirado com auxilio de uma micropipeta permanecendo o pellet deixando o secar por 5 minutos.Depois de o etanol ter sido evaporado foi aplicado ao precipitado 50 uL de gua Milli Q para ressuspender e ao final o sobrenadante foi removido com auxlio de micropipeta.

4 RESULTADO E DISCUSSOO tampo de lise celular tradicionalmente composto por um detergente SDS, associado a um coquetel de inibidores. Quando aplicado o componente de hidrxido de sdio (NaOH) na amostra ocorre a desnaturao protenas, enzimas, incluindo DNA cromossmico e plasmidico, de modo que o pH tem de ser rapidamente reduzido no passo seguinte mas o DNA cromossmico sofre espcie de cozimento levando mais tempo para resnaturar do que o DNA plasmidico. Portanto o DNA cromossmico sendo maior, de peso molecular maior, clivado mais rpido. (OLIVEIRA, 2008)E quando aplicado o SDS 1% ele rompeu as ligaes hidrofbicas (lipdicas). No final para preservar o ph da amostra, neutralizando o alto pH do hidrxido de sdio (NaOH) o acetato de potssio equilibra os grupos ionizantes. Ou seja, a lise alcalina faz por diferena de desnaturao por pH, isto torna possvel isolar o DNA cromossmico do DNA plasmidico.

5 CONCLUSO

Realizando uma comparao visual, podemos observar que o DNA cromossmico e maior que o DNA plasmidico. Tal como para o DNA genmico, a extrao de DNA plasmidico envolve a lise celular e purificao do plasmdeo. As molculas supernrrolados e extremamente pequenas, j o DNA cromossmico, maior e menos superenrrolado. Alm disso, a extrao do DNA plasmidico pode ser completado com uso da amplificao pelo PCR.

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