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\>wxBioquímica I2010/ 2011Preparação e Propriedades de Soluções TampãoAlunas: Andreia Sousa n.º 40261 Alexandra Salvado n.º 4026701 de Março de 20111.º Ano - 2.º SemestrePreparação e Propriedades de Soluções Tampão21. Apresentação, Tratamento e Discussão de Resultados1.1.Estudo da influência do pH na capacidade de uma solução tampãoQuadro 1. Estudo do efeito do pH na capacidade de uma solução tampão de fosfatos0.1M.pHFracção molar H2PO40.910 0.794 0.606 0.495 0.382 0.197TRANSCRIPT
\>wx
2010/ 2011
01 de Março de 2011
Preparação e Propriedades de Soluções Tampão
Alunas:
Andreia Sousa
n.º 40261
Alexandra Salvado
n.º 40267
Bioquímica I
1.º Ano - 2.º Semestre
2 Preparação e Propriedades de Soluções Tampão
01 de Março de 2011
1. Apresentação, Tratamento e Discussão
de Resultados
1.1.Estudo da influência do pH na capacidade de uma solução
tampão
Cálculos:
pH
Fracção molar
H2PO4-
Fracção molar HPO4
-
Volume KH2PO4 0,1 M (mL)
Volume K2HPO4 0,1 M (mL)
pHi
c
pHiexp
pHf
c
pHfexp
∆pHc
∆pHexp
5.9 0.910 0.091 9.10 0.91 5.89 5.76 5.52 5.59 -0.37 -0.17
6.3 0.794 0.206 7.94 2.06 6.31 6.15 6.16 6.04 -0.15 -0.11
6.7 0.606 0.394 6.06 3.94 6.70 6.52 6.61 6.42 -0.09 -0.10
6.9 0.495 0.505 4.95 5.05 6.90 6.73 6.81 6.65 -0.09 -0.08
7.1 0.382 0.619 3.82 6.19 7.10 6.88 7.01 6.79 -0.09 -0.09
7.5 0.197 0.800 1.97 8.03 7.49 7.28 7.37 7.13 -0.12 -0.15
7.9 0.089 0.911 0.89 9.11 7.90 7.62 7.68 7.43 -0.22 -0.19
Quadro 1. Estudo do efeito do pH na capacidade de uma solução tampão de fosfatos
0.1M.
3 Preparação e Propriedades de Soluções Tampão
01 de Março de 2011
Concentrações
Fracção Molar
Volumes
Volume K2HPO4 Volume KH2PO4
pH inicial (pHic)
H2PO4-
HPO42- + H+
Ci cf
pH = 5.9
4 Preparação e Propriedades de Soluções Tampão
01 de Março de 2011
pH final (pHfc)
H2PO4-
HPO42- + H+
Ci cf
pHc
Concentrações
Fracção Molar
Volumes
Volume K2HPO4 Volume KH2PO4
pH inicial (pHic)
pHic = 6,31
pH
pH = 6,3
pH final (pHfc)
pHfc =6,16
5 Preparação e Propriedades de Soluções Tampão
01 de Março de 2011
Concentrações
Fracção Molar
Volumes
Volume K2HPO4 Volume KH2PO4
pH inicial (pHic)
pHic = 6,7
pH
Concentrações
Fracção Molar
Volumes
Volume K2HPO4 Volume KH2PO4
pH inicial (pHic)
pHic = 6,9
pH
pH = 6,7
pH final (pHfc)
pHfc =6,61
pH = 6,9
pH final (pHfc)
pHfc =6,81
6 Preparação e Propriedades de Soluções Tampão
01 de Março de 2011
Concentrações
Fracção Molar
Volumes
Volume K2HPO4 Volume KH2PO4
pH inicial (pHic)
pHic = 7,10
pH
Concentrações
Fracção Molar
Volumes
Volume K2HPO4 Volume KH2PO4
pH inicial (pHic)
pHic = 7,49
pH
pH final (pHfc)
pHfc =7,01
pH = 7,1
pH = 7,5
pH final (pHfc)
pHfc =7,37
7 Preparação e Propriedades de Soluções Tampão
01 de Março de 2011
Concentrações
Fracção Molar
Volumes
Volume K2HPO4 Volume KH2PO4
pH inicial (pHic)
pHic = 7,90
pH
pH = 7,9
pH final (pHfc)
pHfc =7,68
8 Preparação e Propriedades de Soluções Tampão
01 de Março de 2011
5,5
5,6
5,7
5,8
5,9
6
6,1
6,2
6,3
6,4
6,5
6,6
6,7
6,8
6,9
7
7,1
7,2
7,3
7,4
7,5
7,6
7,7
7,8
7,9
5,76 6,15 6,52 6,73 6,88 7,28 7,62
pH
Fracção molar de HPO42-
pHic e pHi
exp versus fracção molar de HPO42-
pH inicial calculado
pH inicial experimental
Gráfico 1. Gráfico que representa pHic versus fracção molar de HPO2-
4 (pontos unidos por uma linha a cheio) e pHi
exp versus fracção molar de HPO2-4 (pontos individuais). Ambos os conjuntos
de pontos são para o intervalo de valores de pH entre 5.9 e 7.9.
Os valores de pH experimentais foram em todos os casos mais baixos que o pH
calculado. Pode-se então concluir que ocorreram erros na medição dos volumes –
foram medidos volumes menores do que o devido. Tendo em conta que o erro ocorrido
manteve-se “constante” em todas as medições - a diferença entre o pH experimental e
o pH calculado é idêntica em todas – é possível considerar que a escolha do material
para a medição pode não ter sido a mais apropriada (devido ao erro associado ao
material - dever-se-ia ter optado por um material cujo erro associado fosse o menor).
9 Preparação e Propriedades de Soluções Tampão
01 de Março de 2011
pHfc pHf
exp
5.52 5.59
6.16 6.04
6.61 6.42
6.81 6.65
7.01 6.79
7.37 7.13
7.68 7.43
Gráfico 2 Gráfico que representa pH final calculado e pH final experimental versus pH inicial calculado.
Após a adição de 0,1 mL de HCl registaram-se os valores
finais do pH. Através do Quadro 2 é possível observar que houve
alguma discrepância entre os valores de pH calculados e
experimentais. No entanto, como foi referido anteriormente, os
erros na medição mantiveram-se e por isso, no final, a variação
de pH experimental, na maioria dos casos, foi aproximadamente
igual à calculada, como se pode comprovar no gráfico abaixo
(Gráfico 2).
Numa solução tampão o ácido e a sua base conjugada encontram-se em
equilíbrio. Quando se adiciona pequenas quantidades de ácido ou base a variação de
pH é quase insignificante.
O valor de pH para o qual se considera efectivo um sistema tampão é o valor
que tiver menos variação de pH, ou seja, é o valor para o qual o ácido e a sua base
0
0,03
0,06
0,09
0,12
0,15
0,18
0,21
0,24
0,27
0,3
0,33
0,36
0,39
5,89 6,31 6,7 6,9 7,1 7,49 7,9
|Δp
H|
pHic
ΔpH experimental e ΔpH calculado versus pHc
i
Δ pH final calculado
Δ pH final experimental
Quadro 2 Quadro com os valores de pH finais, calculados e experimentais.
10 Preparação e Propriedades de Soluções Tampão
01 de Março de 2011
conjugada têm a mesma concentração, já que é quando reagem e neutralizam de igual
modo tanto as bases como os ácidos adicionados, respectivamente. Através da
equação de Henderson-Hasselbalch concluímos então que a capacidade tamponante é
máxima quando o pH é igual ao pKa.
Pode-se comprovar o que foi dito anteriormente no gráfico, pois quando o pH é
mais perto de 6.89 (que é o valor de pKa) a variação que ocorreu por se adicionar HCl
foi muito mais pequena do que para os outros valores de pH, tanto para a esquerda
como para a direita do gráfico – quanto mais longe o valor de pH estiver do de pKa
mais efeito tem o HCl, pois mais variação ocorre. Logo, existe uma menor capacidade
tampão do sistema.
1.2.Preparação de uma solução tampão de fosfatos por diferentes
métodos
Quando se preparam soluções tampão o pH nem sempre é o que se esperava.
A razão para tal é que o pH é medido em relação à actividade do par ácido-base e não
pela concentração do ácido ou da base conjugada. Assim, quando queremos preparar
uma solução com um pH exacto muitas das vezes é necessário acertá-lo gota a gota.
No caso dos cálculos do grupo 4, que foi o que os operadores realizaram, o volume de
NaOH igual a 13,42 mL não resultou no valor de pH esperado (7,2), visto que
ultrapassou esse valor (7,4). Não se pôde adicionar HCl para fazer descer o pH porque
iria reagir com o NaOH o que, numa solução tampão não é permitido, visto que não é
suposto os reagentes reagirem. Então a solução é repetir o procedimento e adicionar
menos quantidade volúmica de NaOH. Experimentou-se, então, realizar esta parte do
procedimento com um volume de 12 mL e pH também ainda não era o esperado, mas
como não o ultrapassava foi-se adicionando, gota-gota, NaOH até perfazer o pH de
7,2. Para agitar melhor a solução e para se observar o efeito do aumento do pH mais
rapidamente utilizou-se uma barra magnética.
11 Preparação e Propriedades de Soluções Tampão
01 de Março de 2011
Grupo 1
Método 1 – Toda a molaridade provém do ácido.
A relação entre a concentração do ácido e da base é igual para todos.
pH tampão fosfatos 0,05 M
Método 2 – Toda a molaridade provém da base conjugada
12 Preparação e Propriedades de Soluções Tampão
01 de Março de 2011
pH tampão fosfatos 0,05 M
Grupo 2
Método 1 – Toda a molaridade provém do ácido.
[
13 Preparação e Propriedades de Soluções Tampão
01 de Março de 2011
pH tampão fosfatos 0,10 M
Método 2 – Toda a molaridade provém da base conjugada
[
pH tampão fosfatos 0,05 M
Grupo 3
Método 1 – Toda a molaridade provém do ácido.
[
14 Preparação e Propriedades de Soluções Tampão
01 de Março de 2011
pH tampão fosfatos 0,15 M
Método 2 – Toda a molaridade provém da base conjugada
[
pH tampão fosfatos 0,15 M
Grupo 4
Método 1 – Toda a molaridade provém do ácido.
[
15 Preparação e Propriedades de Soluções Tampão
01 de Março de 2011
pH tampão fosfatos 0,20 M
Método 2 – Toda a molaridade provém da base conjugada
[
pH tampão fosfatos 0,20 M
16 Preparação e Propriedades de Soluções Tampão
01 de Março de 2011
1.3. Estudo da influência da molaridade na capacidade de uma
solução tampão
Quadro 3 Estudo do efeito da molaridade na capacidade de uma solução tampão de fosfatos (pH7,2) – registo dos resultados calculados e experimentais.
Solução pHic pHi
exp pH f*c pHf*exp pHc pHexp
Tampão de Fosfatos (pH = 7,2) 0,05M
7,2 7,19 7,01 6,87 -0,19 -0,32
Tampão de Fosfatos (pH = 7,2) 0,10 M
7,2 7,26 7,18 7,05 -0,02 -0,21
Tampão de Fosfatos (pH = 7,2) 0,15M
7,2 7,27 7,2 7,13 0 -0,14
Tampão de Fosfatos (pH = 7,2) 0,20M
7,2 7,21 7,20 7,15 0 -0,06
Na apresentação desta tabela é de salientar que não se mediu o pH da água
destilada devido à falta de tempo com que nos deparámos. No entanto, teoricamente
sabemos que o pH da água destilada deveria ser 7, mas experimentalmente o pH
deveria ser um pouco mais baixo devido ao seu contacto com o ar (que contem CO2),
pois ocorre a reacção: H2O + CO2 H2CO3. Ao adicionar HCl o pH deveria descer
ainda mais, o que causaria uma variação de pH negativa (sendo a maior variação de
todos os casos, já que não é uma solução tampão) tanto teórica como
experimentalmente.
17 Preparação e Propriedades de Soluções Tampão
01 de Março de 2011
Gráfico 3 Gráfico que representa pH final calculado e pH final experimental versus molaridade da solução tampão.
Nos restantes casos, soluções tampão, a variação de pH variou com diferentes
concentrações de fosfatos. Ao adicionar HCl, foram adicionados iões H+ à solução que
contribuíram para o gasto da base conjugada e para a formação de ácido, fazendo o
pH descer ligeiramente.
Através da análise do quadro e do gráfico acima representados (Quadro 3,Gráfico
3, respectivamente) pode-se concluir que quanto maior a concentração de fosfatos,
mais pequena é a variação de pH. Assim, podemos dizer que a molaridade tem
consequências na capacidade tampão: quanto maior a molaridade da solução, maior a
capacidade tampão. Isto deve-se ao facto de quando a molaridade é maior o número
de moles em solução também é maior – haverá maior o número de iões que
neutralizam o ácido e consequentemente haverá menor variação de pH.
0
0,02
0,04
0,06
0,08
0,1
0,12
0,14
0,16
0,18
0,2
0,22
0,24
0,26
0,28
0,3
0,32
0,34
0,05 0,1 0,15 0,2
|Vari
ação
de p
H|
Molaridade da Solução tampão
ΔpH experimental e ΔpH calculado versus molaridade da solução tampão
Δ pHc
Δ pHexp
18 Preparação e Propriedades de Soluções Tampão
01 de Março de 2011
1.4. Estudo da influência da temperatura no valor de pH de uma
solução tampão
Quadro 4 Estudo do efeito da temperatura no valor de pH de uma solução tampão – registo de resultados.
Solução Tampão
Condições Usadas
Temperatura (ºC)
pHexp
Tampão de
Fosfatos (pH 7,2)
0,1 M
1 – Gelo
2 7,29
2- Temperatura Ambiente
20 7,19
3 – Banho Termostatizado
37 7,17
Como é visível no quadro acima apresentado (Quadro 4) o valor de pH aumenta
com a diminuição de temperatura. Como referido anteriormente, o pH é medido em
relação à actividade do par ácido-base por isso, com o aumento da temperatura, a
actividade dos iões H+ aumenta e consequentemente o pH ( ) diminui.
Quando a temperatura diminui a actividade dos iões H+ diminui e portanto o pH
aumenta. Nesta actividade laboratorial, por falta de tempo, as soluções 1 e 3 só
estiveram colocadas no gelo e em banho de água, respectivamente, durante cerca de
15 minutos e não os 30 minutos devidos, também não foi possível realizar o
procedimento com o Tris-HCl.
2. Bibliografia
Simões, José A. Martinho, Guia do laboratório de Química e Bioquímica, 2ª
edição, Lidel, Lisboa, 2008;
Voet, D. e Voet, J.G. (1995) Biochemistry, 2ª ed., John Wiley & Sons: New York,
pp. 56-62 & 105-119.
19 Preparação e Propriedades de Soluções Tampão
01 de Março de 2011
3. Questionário
3.1. Quais são os critérios gerais mais importantes a considerar na escolha de uma solução
tampão a ser usada em experiencias bioquímicas? Justifique sucintamente.
A escolha de uma solução tampão deve ser feita em relação aos seguintes
critérios: o intervalo de pH que se vai estudar; deve ser impermeável relativamente às
membranas celulares (muito solúvel em água e pouco solúvel noutros solventes); não
deve interferir nos processos biológicos; não deve absorver radiação visível ou UV; não
deve formar compostos insolúveis (precipitação); de ter uma contribuição mínima para
a composição iónica (força iónica do meio influencia processos biológicos); a influência
da temperatura na alteração do pH deve ser limitada e o pKa deve distar pouco do pH.
3.2 Muitos protocolos de purificação de proteínas requerem que todos os procedimentos
sejam realizados a 4ºC para se minimizar a inactivação das proteínas. No caso de se
trabalhar com uma proteína muito sensível ao valor de pH do meio, a preparação das
soluções tampão e o acerto final do seu valor de pH são realizadas numa câmara
frigorífica. Justifique o procedimento anterior.
Como foi provado nesta actividade laboratorial, a temperatura afecta o valor de
pH logo, se se está a trabalhar com uma enzima que é muito sensível ao pH, deve-se
preparar a solução tampão nas condições em que a proteína está activa, para quando
a solução estiver em contacto com ela não sofrer (ou sofrer poucas) alterações e a
proteína não ser desactivada/desnaturada.
Assim, como a proteína está activa aos 4ºC prepara-se a solução tampão num
frigorífico à mesma temperatura para evitar mudanças no valor de pH e a inactivação
da mesma.