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Di r ecci ó n:Di r ecci ó n: Biblioteca Central Dr. Luis F. Leloir, Facultad de Ciencias Exactas y Naturales, Universidad de Buenos Aires. Intendente Güiraldes 2160 - C1428EGA - Tel. (++54 +11) 4789-9293
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Tesis Doctoral
Regulación del splicing alternativoRegulación del splicing alternativoen plantas. Efectos de la luz poren plantas. Efectos de la luz por
señales retrógradas y de la metil-señales retrógradas y de la metil-transferasa de proteínas PRMT5transferasa de proteínas PRMT5
Petrillo, Ezequiel
2011
Este documento forma parte de la colección de tesis doctorales y de maestría de la BibliotecaCentral Dr. Luis Federico Leloir, disponible en digital.bl.fcen.uba.ar. Su utilización debe seracompañada por la cita bibliográfica con reconocimiento de la fuente.
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Cita tipo APA:
Petrillo, Ezequiel. (2011). Regulación del splicing alternativo en plantas. Efectos de la luz porseñales retrógradas y de la metil-transferasa de proteínas PRMT5. Facultad de CienciasExactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires.
Cita tipo Chicago:
Petrillo, Ezequiel. "Regulación del splicing alternativo en plantas. Efectos de la luz por señalesretrógradas y de la metil-transferasa de proteínas PRMT5". Facultad de Ciencias Exactas yNaturales. Universidad de Buenos Aires. 2011.
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Índice
RESUMEN 9
PALABRAS CLAVE 10
ABSTRACT 11
KEYWORDS 12
AGRADECIMIENTOS 13
ABREVIATURAS MÁS USADAS 25
PUBLICACIONES Y FINANCIAMIENTO 26
INTRODUCCIÓN GENERAL 27
EL SPLICING Y SUS ALTERNATIVAS 28
I. BIOGÉNESIS DE UN MENSAJERO, LA TRANSCRIPCIÓN Y EL PROCESAMIENTO 28
II. EL PROCESAMIENTO DE LOS MENSAJEROS, CORTES Y EMPALMES 30
III. LA REGULACIÓN DE LA TRANSCRIPCIÓN, EFECTOS SOBRE EL SPLICING 33
IV. EL FIN DE LA VIDA DE LOS MENSAJEROS, LA DEGRADACIÓN Y EL SPLICING ALTERNATIVO 37
LAS PLANTAS Y EL SPLICING 38
HIPÓTESIS GENERAL 41
PRÓLOGO DEL CAPÍTULO I 42
CAPÍTULO I 44
REGULACIÓN DEL SPLICING ALTERNATIVO DE RSP31 POR LA LUZ 44
INTRODUCCIÓN 44
1. FOTOSÍNTESIS 45
EL CLOROPLASTO Y LOS FOTOSISTEMAS 45
2. LA LUZ COMO SEÑAL 49
I. LOS OJOS DE LAS PLANTAS, LOS FOTORRECEPTORES 49
II. UN TERCER OJO, EL CLOROPLASTO 52
3. EL LENGUAJE DEL CLOROPLASTO 54
I. EXPRESIÓN GÉNICA DEL PLÁSTIDO 54
II. VÍA DE LOS TETRAPIRROLES 56
III. VÍA DE LOS AZÚCARES 56
IV. ESTADO DE ÓXIDO‐REDUCCIÓN DE LOS COMPONENTES DE LA CADENA DE TRANSPORTE ELECTRÓNICO
FOTOSINTÉTICO 57
V. ESPECIES REACTIVAS DE OXÍGENO COMO SEÑALES RETRÓGRADAS 60
RESUMEN DE LOS ANTECEDENTES 62
OBJETIVO GENERAL (CAPÍTULO I) 64
OBJETIVOS PARTICULARES (CAPÍTULO I) 64
METODOLOGÍA (CAPÍTULO I) 65
MATERIAL VEGETAL Y CONDICIONES DE CRECIMIENTO 65
FUENTES DE LUZ Y TRATAMIENTOS LUMÍNICOS 67
TRATAMIENTOS CON DROGAS Y AZÚCARES 67
CORTES (SIN EMPALMES) DE LAS PLÁNTULAS. DISECCIONES. 69
ANÁLISIS DE SPLICING ALTERNATIVO 69
ANÁLISIS DE EXPRESIÓN 74
ENSAYO DE GUS 74
ANÁLISIS DE ALTA RESOLUCIÓN DE SPLICING ALTERNATIVO: PANEL DE RT‐PCR 74
RESULTADOS 75
1. LA LUZ Y SU EFECTO SOBRE EL PROCESAMIENTO DE RCA Y RSP31 75
2. LA INTENSIDAD DE LA LUZ ‐Y NO SU CALIDAD‐ INFLUYE SOBRE EL PATRÓN DE SPLICING ALTERNATIVO DE RSP31
Y RCA 81
3. EL CLOROPLASTO PERCIBE LA LUZ Y TRANSMITE LA SEÑAL AL NÚCLEO GENERANDO EL CAMBIO EN LA
ABUNDANCIA RELATIVA DE ISOFORMAS DE RSP31 85
4. LA SEÑAL VIAJA DE LA HOJA A LA RAÍZ 86
5. IDENTIFICACIÓN DE LA SEÑAL QUE TRANSMITE EL CLOROPLASTO QUE PROVOCA EL CAMBIO EN LA EXPRESIÓN Y
EL SPLICING ALTERNATIVO DE RSP31 88
A) VÍA DE LA EXPRESIÓN GÉNICA Y VÍA DE LOS TETRAPIRROLES. 88
B) VÍA DE LAS ESPECIES REACTIVAS DE OXÍGENO. 89
C) FOTOSÍNTESIS Y AZÚCARES. 92
D) ESTADO DE ÓXIDO‐REDUCCIÓN DEL POOL DE PLASTOQUINONAS Y EXPRESIÓN GÉNICA DEL CLOROPLASTO. 94
6. EXTENSIÓN DEL ANÁLISIS: 97
¿CUÁNTOS EVENTOS DE SPLICING ALTERNATIVO PUEDEN SER MODULADOS POR TRANSICIONES DE
LUZ/OSCURIDAD? 97
ALGUNAS PARTICULARIDADES DEL EVENTO ESTUDIADO 100
DISCUSIÓN (CAPÍTULO I) 103
LA LUZ Y SU EFECTO SOBRE EL SPLICING ALTERNATIVO 103
EL CAMBIO EN EL PATRÓN DE SPLICING DE RSP31 SE EVIDENCIA EN DIFERENTES TEJIDOS DE LA PLANTA Y EN
DIFERENTES ESTADIOS DE DESARROLLO 105
LOS FOTORRECEPTORES, CRIPTOCROMOS Y FITOCROMOS, NO ESTÁN INVOLUCRADOS EN LA VÍA DE SEÑALIZACIÓN
LUMÍNICA QUE CAMBIA LA ABUNDANCIA RELATIVA DE ISOFORMAS DE RSP31 106
¿HAY ALGUNA DIFERENCIA EN EL EFECTO CAUSADO SOBRE EL SPLICING ALTERNATIVO DE RSP31 CUANDO SE
UTILIZAN CALIDADES DE LUZ INCIDENTE DISTINTAS? 107
LOS CAMBIOS INDUCIDOS POR LA LUZ EN EL PATRÓN DE SPLICING ALTERNATIVO DE RSP31 SON MODULADOS POR
LA INTENSIDAD DE LA LUZ INCIDENTE 108
EL CLOROPLASTO ESTÁ INVOLUCRADO EN LA RESPUESTA DEL GEN RSP31 A LAS TRANSICIONES DE LUZ/OSCURIDAD
108
CARACTERIZACIÓN DE LA SEÑAL GENERADA EN EL CLOROPLASTO 110
INTERMEDIARIOS DE LA BIOSÍNTESIS DE CLOROFILA Y EXPRESIÓN GÉNICA DEL PLÁSTIDO 112
ESPECIES REACTIVAS DE OXÍGENO (ROS) 113
SEÑALIZACIÓN POR AZÚCARES 115
ESTADO REDOX DE LA CADENA DE TRANSPORTE ELECTRÓNICO FOTOSINTÉTICO: POOL DE PLASTOQUINONAS 117
GLOBALIDAD DEL EFECTO DE LA LUZ SOBRE EL SPLICING ALTERNATIVO 119
CONSIDERACIONES FINALES 121
PRÓLOGO DEL CAPÍTULO II 122
CAPÍTULO II 124
REGULACIÓN DEL SPLICING ALTERNATIVO POR LA METIL‐TRANSFERASA PRMT5 124
INTRODUCCIÓN 124
1. LOS RITMOS BIOLÓGICOS 125
I. LOS RITMOS CIRCADIANOS Y EL RELOJ BIOLÓGICO 126
II. DIFERENTES ORGANISMOS, ¿DIFERENTES RELOJES? 128
III. EL RELOJ BIOLÓGICO DE ARABIDOPSIS 129
2. METILACIÓN DE PROTEÍNAS 132
I. METILACIÓN DE ARGININAS Y SUS PROTAGONISTAS 132
II. LAS PRMTS EN LAS PLANTAS Y EL ROL DE PRMT5 135
METODOLOGÍA (CAPÍTULO II) 138
MATERIAL VEGETAL Y CONDICIONES DE CRECIMIENTO 138
Fuentes de luz y tratamientos lumínicos 138
ANÁLISIS DE LA EXPRESIÓN GÉNICA 139
Medición por PCR en Tiempo Real (qPCR) 139
ANÁLISIS GLOBAL I: MICROARREGLOS DE EXPRESIÓN EN A. THALIANA 139
ANÁLISIS GLOBAL II: PANEL DE RT‐PCR DE ARABIDOPSIS 140
ANÁLISIS GLOBAL III: TILING‐ARRAYS 140
ANÁLISIS BIOINFORMÁTICO DE LAS SECUENCIAS DADORAS DE SPLICING 141
DETECCIÓN DE SPLICING POR PCR RADIACTIVA Y QPCR 141
EXTRACCIÓN DE PROTEÍNAS Y WESTERN BLOT 142
RESULTADOS 143
1. INTRODUCCIÓN AL CONOCIMIENTO DE PRMT5 Y SU FUNCIÓN: 143
AISLAMIENTO Y CARACTERIZACIÓN INICIAL DE LA MUTANTE PRMT5‐5 143
2. CARACTERIZACIÓN DE LA MUTANTE PRMT5‐5,
SU EFECTO SOBRE LA TRANSCRIPCIÓN Y EL SPLICING ALTERNATIVO 147
a. Análisis inicial, los primeros blancos del efecto de prmt5‐5. 147
b. Regulación de la transcripción y del splicing. 149
c. Regulación circadiana del splicing alternativo por PRMT5. 152
d. Alcances de la regulación del splicing alternativo por PRMT5. 155
3. DESCIFRANDO EL MECANISMO DE ACCIÓN DE PRMT5 SOBRE EL SPLICING ALTERNATIVO (PARTE I). 159
4. EVIDENCIAS DE UN ROL CONSERVADO: DROSOPHILA MELANOGASTER. 161
5. DESCIFRANDO EL MECANISMO DE ACCIÓN DE PRMT5 SOBRE EL SPLICING ALTERNATIVO (PARTE II). 164
DISCUSIÓN (CAPÍTULO II) 166
PRMT5 Y LA REGULACIÓN DEL SPLICING 166
1. ESPECIFICIDAD 166
2. PRMT5 NO AFECTA LOS CAMBIOS SOBRE EL SPLICING ALTERNATIVO GATILLADOS POR TRANSICIONES DE
LUZ/OSCURIDAD 167
3. EFECTOS DE PRMT5 SOBRE EL TRANSCRIPTOMA DE ARABIDOPSIS THALIANA 168
4. EFECTOS CIRCADIANOS DE PRMT5 168
5. PRMT5 Y SU RELACIÓN CON LOS SITIOS 5’ DADORES DE SPLICING 171
6. PRMT5, LOS 5’SS Y LAS PROTEÍNAS SM 174
7. POR SI LAS MOSCAS… EVIDENCIAS DE UN ROL CONSERVADO. 177
CONCLUSIÓN GENERAL 180
CONCLUSIONES (CAPÍTULO I) 180
CONCLUSIONES (CAPÍTULO II) 181
BIBLIOGRAFÍA 183
APÉNDICE DE TABLAS 193
APÉNDICE DE FIGURAS 214
APÉNDICE DE PRIMERS 219
PRIMERS DEL PANEL DE RT‐PCR 220
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REGULACIÓN DEL SPLICING ALTERNATIVO EN PLANTAS
Efectos de la luz por señales retrógradas y de
la metil‐transferasa de proteínas PRMT5
Resumen
Como organismos sésiles, las plantas superiores se caracterizan por un alto grado de
plasticidad en el desarrollo en respuesta a las señales ambientales, optimizando así sus
funciones de una manera que maximiza sus posibilidades de supervivencia y
reproducción. Son capaces de detectar la calidad, cantidad y dirección de la luz, y utilizarla
como una señal externa para optimizar su crecimiento. Por otra parte, el splicing
alternativo es un mecanismo esencial para aumentar la plasticidad del transcriptoma que
juega importantes roles en varios aspectos del desarrollo de los metazoos. Sin embargo,
poco se conoce del proceso en plantas y de las consecuencias del mismo.
Aquí demostramos que el splicing alternativo de varios genes de Arabidopsis thaliana
está regulado por transiciones de luz/oscuridad. Para el caso particular de RSp31 (un gen
que codifica para una proteína reguladora de splicing o SR) es la intensidad de la luz
incidente la que tiene un efecto directo sobre su transcripción y procesamiento. El
cloroplasto percibe la luz y genera una señal (retrógrada) capaz de viajar por la planta que
provoca los cambios observados en la abundancia relativa de isoformas de RSp31. Las
plastoquinonas, componentes de la cadena de transporte electrónico fotosintético, serían
un lugar de integración de diferentes señales y una pieza clave en la respuesta de RSp31 a
la luz.
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Por otra parte, demostramos que la metil‐transferasa de proteínas PRMT5 es un
importante regulador del proceso de splicing alternativo en Arabidopsis thaliana y está
involucrada en la generación de respuestas circadianas en esta planta. Reunimos
evidencia que apunta a un efecto sobre el reconocimiento de los sitios dadores (5’ss) de
splicing en el mecanismo por el cual PRMT5 ejerce su modulación sobre el proceso de
splicing alternativo. Tal mecanismo estaría conservado en Drosophila melanogaster. En
este organismo, al igual que en Arabidopsis, PRMT5 regula la expresión y los patrones de
splicing alternativo de numerosos genes. Sin embargo, si bien controla la actividad
locomotora (una respuesta mediada por el reloj), su vínculo con el oscilador central es
más difuso.
Palabras clave
Transiciones luz/oscuridad, spliceosoma, cloroplasto, fotosíntesis, plastoquinona,
Arabidopsis thaliana, reloj circadiano, PRMT5, metilación de proteínas, splicing
alternativo, Drosophila melanogaster.
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ALTERNATIVE SPLICING REGULATION IN PLANTS
Effects of light‐triggered retrograde signaling and the arginin
methyltransferase PRMT5
Abstract
As sessile organisms, higher plants are characterized by a high degree of
developmental plasticity in response to environmental signals, thereby optimizing their
developmental patterns in a manner that maximizes their chances of survival and
reproduction. Plants are able to detect the quality, quantity and direction of light and to
use it as an external cue to optimize their growth. On the other hand, alternative splicing
is an essential mechanism to increase transcriptome’s plasticity that plays important roles
in various aspects of metazoan development. However, little is known of this process and
its consequences in plants.
Here we show that alternative splicing of several genes of Arabidopsis thaliana is
regulated by light/dark transitions. For the particular case of RSp31 (a gene encoding a
splicing regulator or SR protein) it is the intensity of light what leads to the effect on
transcription and processing. The chloroplast senses light and creates a retrograde signal
that travels through the plant that causes the observed changes in the relative abundance
of RSp31’s isoforms. The plastoquinone pool, from the photosynthetic electron transport
chain, would be a place for integration of different signals and a key factor responsible for
RSp31 responses to light.
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We also identified the protein‐arginine methyltransferase PRMT5 as an important
splicing regulator in Arabidopsis thaliana which is involved in circadian responses. We
raised evidence pointing at an effect on the recognition of the splicing donor sites (5'ss)
underlying the mechanism by which PRMT5 regulates the alternative splicing process.
Such a mechanism would be conserved in Drosophila melanogaster. However, while
controlling locomotor activity in this organism (a response mediated by the clock), the link
to the central oscillator appears more diffuse.
Keywords
Light/dark transition, spliceosome, chloroplast, photosynthesis, plastoquinone,
Arabidopsis thaliana, circadian clock, PRMT5, protein methylation, alternative splicing,
Drosophila melanogaster.
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Agradecimientos
Tanto… TAAAANTO para agradecer…
Me será imposible hacer justicia en esta sección, debería tener varios tomos de
muchas páginas cada uno y aún así dudo de mi capacidad para impartirla. Sin embargo,
intentaré plasmar en ella un reflejo de mis sentimientos para con los que tanto me han
dado a lo largo de la vida y la carrera hasta llegar aquí, a hoy.
Debo comenzar con ustedes, las que fueron por diferentes circunstancias de la vida
mis mamás por elección y debieron también cumplir con el rol de padre, hermana, tía y
abuela. A vos mamá y abuela Rosa (la gran Argentina Italia), y a vos mamá y tía Lily, les
agradezco profundamente todo el esfuerzo que han hecho durante toda mi vida (y gran
parte de la de ustedes) para que no flaquee frente a cualquier obstáculo, no me caiga por
cualquier tropiezo, y me levante después de cualquier caída. Junto al abuelo Alfredo, ese
gordito callado que se fue abriendo con el tiempo, me han dado todo lo que tengo. Les
debo, sí, les debo! haber llegado hasta aquí. No sé si habré llegado muy lejos, supongo
que dependerá de los estándares de cada uno, pero llegué a ver cumplidos la mayoría de
mis deseos de niño. Todo esto gracias a vos Rosa y a vos Lily. Espero que mi vida haga
justicia a sus esfuerzos, sé que mi felicidad es y será siempre para ustedes moneda de
cambio para el pago de todo lo que me han dado. Gracias por romperse todo por mí,
gracias por no pedir nada a cambio, gracias por haber estado siempre, gracias por
quererme y entenderme, gracias por los “suerte, suerte, suerte” antes de cada prueba (sin
los cuales seguramente no hubiese podido aprobar), gracias por desdoblarse en miles de
funciones distintas para mi desarrollo completo como ser humano, gracias por enseñarme
tanto, gracias por haberme enseñado a perdonar, gracias por haberme dado mucho más
de lo que teníamos, gracias, GRACIAS! Si el día de mañana junto a Gri podemos brindarle a
nuestros hijos la mitad de todo esto estoy seguro que los haremos muy felices. Si hay
alguien al que un párrafo, o una carilla, o un par de hojas de agradecimientos le queda
chico es a cada una de ustedes. Las quiero mucho, mil gracias.
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Mi vida comenzó con mi abuela, mi abuelo y mi tía en Naón, un pueblo muy chiquito,
con gente muy muy grande, como vos Gordito querido, amigo del alma, hermano mío. Vos
Juancito (también conocido como “el facha” entre otros apodos) has estado siempre, al
pie del cañón junto a mí. Si bien la carrera y el trabajo nos alejo físicamente, desde 9 de
Julio seguís estando tan presente en mi vida como siempre. Sos una gran persona y sabés
que te deseo lo mejor. Te agradezco haber sido cómplice de mi reencuentro con mi papá y
mi mamá, aunque la palabra cómplice te queda medio chica, ya que fuiste el autor
intelectual y material que permitió que me reúna con ellos. Te agradezco el cariño que
siempre me tuviste. Les agradezco a vos y a tu familia haberme ayudado tanto y
reservarme siempre un lugar en su casa para cuando quiero visitar los pagos. Gracias por
tu amistad! Gracias por compartir conmigo tu inmensa sabiduría innata, de la vida. Gracias
por tu “quiero que sepas que voy a estar ahí para lo que quieras, que la distancia, el
trabajo lo que sea!, no es impedimento para que podamos comunicarnos. Loquito te
quiero un montón! un abrazo enorme!”. Graciasssss!!!
En Naón hay mucha gente que me ayudó mucho, desde mi infancia hasta el día de
hoy, le agradezco al pueblo, al gran Carlos María Naón, abrazando así a todos. De Naón
me fui a Bragado, ahí cursé mis estudios secundarios en el Colegio Nacional de Bragado
(hoy EEM N°2). Innumerable la cantidad de gente que me tendió una mano en esta
ciudad, y sobre todo, en la escuela. Gracias a los profes, Palermo, Maffa, Descalzo,
Hipólito, Amalia!!! Fue allí donde cursé las primeras materias del CBC gracias al sistema de
UBA XXI. Sin embargo, el párrafo aparte es para los amigos que coseché en esta ciudad,
los que sigo viendo hoy (aunque sea poco) y los que casi no veo. Mauri, Juanqui, Nacho,
Diego G., Diego O., Fer, Cricky, Chicky, Rolo, Chino, Boquera, Fischi (que me diste una
ahijada)… a toda la banda, que me sigue aguantando a pesar de los desplantes, a pesar del
abandono, a pesar de las ausencias. Los quiero un montón aunque a veces no parezca.
Gracias por regalarme su amistad, compartir conmigo su alegría, estar cuando hace falta.
Es por ustedes también que en algún momento escribí: "la p@@@!!! son lo más lindo que
tengo en el mundo" en algún mail enviado desde el viejo mundo, en un estado de
abstracción y lejanía del cariño que ustedes son tan hábiles para mostrar. Mil gracias.
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Y continúo entonces con más amigos, la llegada a la facu, la gente nueva de la capital.
Una de las primeras personas que conocí fue Belén, una loca, típica porteña… jajajaja,
quién hubiese dicho que serías como una hermana tiempo más tarde. Gracias a vos cursé
las materias! Vos y tu familia, que prácticamente me adoptó, me ayudaron mucho en los
comienzos en la gran ciudad. Gracias por tu amistad de fierro y por haberme anotado en
cada materia y hacerme estudiar y rendir… Gracias. Junto a vos conocí más tarde a Fede
(Jamiroquai), Boris, Guido, San y las bestias humanas de Gaby y Lau. También llegaría el
turno de conocer a Juan, Naty, Irene, Leti, el gran y mágico Michan. Todos juntos
formamos un grupo muy heterogéneo que se mantiene hasta hoy a pesar de los
diferentes caminos que hemos ido eligiendo. Los adoro locoooos!!! Todo mbututu, son
una masa. La carrera sin ustedes hubiese sido como un asado sin vino! Son los
responsables de que haya querido ir todos los días a la facu! Son una de las cosas más
hermosas que me dio la carrera. Gracias a Gaby y a Lau por los mimos en forma de charla
y torta. Gracias a Fede por las charlas, siempre duras y profundas, siempre interesantes y
vivas. Gracias a vos Guadita por tanto amor, a vos y a Dani por la sobrinita que me
regalaron para mi cumple, gracias por tanta dulzura y tantas lágrimas antes de cada
parcial! Y muchas más gracias por tus resúmenes y tu responsabilidad. Gracias a
michifuxido por tanto amor, sos una bestia Nico, un grosso, tenés la capacidad de hacer
sentir a cualquiera como la persona más copada del mundo pero esa sos vos! Entre estos
encontraría un hermano más, quizás el más hermano porque fuiste con quien conviví
varios años durante mis estudios. El Lava, otro grande si los hay. Gracias por tu humor,
gracias por haberme dado un techo en épocas de crisis, gracias por haberme hecho parte
de tu familia y haber introducido en mi vida a Romina (el desastre con interior más bueno
que he conocido) para que aprenda con ella que el caos no es tan terrible (Gracias Romi!)
pero sí incontrolable. Lavita, te agradezco muchísimo tu cariño, te doy gracias por ser tan
sincero, honesto, y de buen corazón, has sido un pilar en mis años de vida (algo) adulta.
Gracias Man! No te agradezco tu manejo autoritario del control remoto ni la música punk
que mis oídos han tenido que soportar por tu culpa. Sos un gran amigo.
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Y de la facu llegamos al labo, allí llegaría de la mano de Fede P (o Félix, o Pelisch). Un
grosso (sobre todo ahora). Un tipo que cuando se saca la careta de recio y cabrón,
muestra el relleno suave del que está hecho (tontorrón!). Gracias por llevarme al lab
(mentira!). Gracias por abrir tus sentimientos y compartir tu amistad conmigo (verdad).
Gracias por hacer del laboratorio un mejor lugar para los Petry (y peor para los Manolos).
Gracias porque cuando querés combinás conmigo tu buena onda, para elevarnos a la
máxima potencia y así cantar, gritar, y pelear!!! quemando el estrés del día a día. La
entrada al laboratorio fue sencilla, todos hicieron que así lo fuera, y por eso les agradezco
muchísimo. Yo llegaba repleto de miedos y vacío de conocimientos… si bien no cambio
mucho la situación, ahora tengo menos miedo y sé algunas cosas más. En este punto
tengo, debo, y quiero, agradecerle a Kornflit, al ARKido, a Alberto. Gracias ARK por la
oportunidad que me diste de laburar en esto que tanto me gusta (la mayor parte del
tiempo). Pero más te agradezco por tu humanidad, por la libertad que me diste siempre y
por haberte tirado sin paracaídas conmigo a un tema nuevo para ambos (a pesar de que
podías quedarte en la seguridad y el confort de tu campo conocido). Sos un gran maestro.
Gracias también por tu humor (tan afín al mío en algunos momentos), por tu latín, por tus
críticas, por tus halagos, por tu ternura, por el pagARK y la masterARK (chiste, chiste).
Gracias, mil gracias por preocuparte por el bienestar personal de cada uno de nosotros.
En el laboratorio tendría que trabajar con Fededa… un desconocido para mí. En pocos
días descubrimos que habíamos sido hechos de la misma madera y, como dos niños,
trabajamos y jugamos juntos desde entonces hasta su partida a Europa. Gorrrrdo!!!
Gracias por tanta enseñanza a la que me sometiste (sí, sometiste). Gracias por el duro
trabajo que te tomaste para enseñarme como trabajar (duro). Gracias por mostrarme que
se pueden hacer un millón y medio de experimentos a la vez (cosa que no logro del todo
sin vos), leer mil artículos y tener tiempo para la amistad, la familia, y aún más, poder
generar más ideas y mejores, para más experimentos, y nuevas preguntas y… una bestia,
eso sos. Gracias por compartir tus pensamientos conmigo, por cuidarme, por enseñarme,
por los juegos, por las cervezas a las dos de la mañana en el labo! Gracias por cuidarme
con la gran Maru que tenés al lado. Gracias por ser un ejemplo, un modelo a seguir, una
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nueva pregunta a cada minuto. Gracias por ser una oreja amiga y una boca confidente. Ni
siquiera en los primeros momentos me hiciste sentir menos que vos y de inmediato
abriste tu trabajo y me permitiste discutir sobre él como si hubieran pasado mil años de
trabajo juntos. Gracias capo!
Si bien Juan F. merece su párrafo aparte por haber sido mi mentor, no es el último al
que le tengo que agradecer mucho en el labo. De entrada me topé con la presencia de
Mariano, un pibe con el que en principio competía por un lugar. Como bien lo planteaste
en tu tesis hermanito mayor (¡!), el destino haría que los dos trabajemos en el mismo
lugar, generemos una amistad, y hasta vivamos juntos. Gracias loqui por enseñarme tanto
de amistad. Gracias por gastar toda esa cantidad de energía increíble que gastas en que
charlemos, cenemos, veamos una peli, juguemos un partidito. Gracias por distraerme del
día a día, por darme una nueva pasión (el fútbol y el rojo –pero también boca‐), por
ayudarme a que esté menos inmerso en la vorágine del trabajo. Gracias por obligarme a
buscar algo más. Gracias por haber compartido lágrimas y risas conmigo, y gracias por tu
Agustín que ahora también es mi hermano, como tu familia es mi familia. Gracias por
compartir nuestros primeros pasos en este camino. Fue durante esos primeros pasos en el
labo que me encontré con Manolo, Manu, Vale… qué decir si no es gracias, muchas
gracias. A vos Vale porque estás detrás de cada uno de nosotros como una madre, porque
tenés una increíble capacidad de trabajo que se derrama y nos contagia, porque sos capaz
de cualquier cosa para que todo esté bien. Gracias por tus mimos en forma de mates,
abrazos y sabias palabras. Gracias por tu empuje. Gracias por haber formado con Tincho
una familia que todos soñamos tener. Gracias por Tincho . A Manu… qué te puedo
agradecer?... no se me ocurre… las ideas no, nunca tuviste “buenas ideas”, la onda no, sos
re jodido… no sé. Eso te puedo agradecer, esa humildad pampeana que te caracteriza y te
hace creer por momentos tan chiquito. Gracias por las charlas, te acordás cuando entre
los dos no sumábamos 1 gana? (Gracias Fede por esta frase). Gracias por el cariño, gracias
por la ayuda, gracias por las discusiones científicas, gracias por ser una gran persona y
abrir tu corazón conmigo. Gracias por tu sonrisa aún cuando tu mente no está presente,
gracias por estar. Lo mejor para vos y tus nenas . Para contrarrestar con la buena onda
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de este pampeano hacía falta un porteño de ley, por eso el labo contaba ya con Manolo.
Un desastre, tipo Pomelo el personaje de Capusotto. Un rockero (que hace pop)
desalineado que hacía ciencia (pop), quizás un loco… pero me cebaba unos buenos mates
que lo acercaban a mi mundo provinciano y con los que se fue construyendo un lugar en
mi corazón. Gracias Nolo por tu mal humor, por tus frases desubicadas, por tu buen
humor. Gracias por la confianza. Gracias por las charlas, gracias por la magia con la Play.
Gracias porque aún en tu locura de algunos momentos, escuchabas. Gracias por tu
amistad. En esa época, como ahora, compartíamos el labo con el grupo de Anabella. En su
grupo “pipeteaban” Fede (el grosso tipo Fort) y Mati Blaustein. A Anabella tengo que
agradecerle mucho también. No sos mi “jefa” pero siempre has estado bien dispuesta
conmigo (jeje, no podía faltar el doble sentido al que acostumbra nuestra relación), está
claro que sos una amiga más y te lo agradezco. Gracias por tu paciencia, tu confianza y tus
consejos. Y a vos Mati, gracias por las gaviotas, gracias por obsequiarme una pizca de tu
sabiduría cada tanto, gracias por tu revolución, gracias por tu lucha, gracias por tu amistad
de oro, gracias por tu inocencia, bondad y honestidad. Gracias también por darme un
techo en alguna oportunidad!
Fueron pasando los años en el labo y llegaría gente nueva a medida que se iban otros.
Nacho llegó casi junto a Mariano y a mí. Al principio manteníamos cierta distancia, con el
tiempo nos fuimos acercando y nos peleábamos bastante. Creo que yo soy lo negro y vos
lo blanco del ying y el yang. Pero encontramos un equilibrio, un balance y cosas en común
que derivaron en una amistad. Gracias por el “ekeko!!!”, gracias por tu canto, gracias por
tu música. Gracias por estar siempre dispuesto a analizar (con una lógica impecable) cada
resultado o cada situación. Más tarde llegarían otros, el Guille encabeza los primeros de
esta tanda junto al Rasco. Dos bestias. Dos maestros. Hoy devenidos en muy buenos
amigos. Gracias en conjunto por toda la onda que pusieron en el labo y en mi vida. Gracias
por la alegría. Gracias Risso por la birra y la guitarra, y el vino y las empanadas, y el fernét
y las noches de fogón. Gracias Rasco por tu corazón puro y tu amistad. El Rasco se iría,
Guille seguiría entre nosotros, y vendría más gente… Celi, una ídola, por momentos una
autómata implacable que resuelve cualquier dilema físico/matemático y cualquier puzzle
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que le pongan adelante. De a ratos una devoradora de Danettes. Todo el tiempo, un
corazón a flor de piel, un ser humano excelente. Gracias Celi por defenderme aún cuando
soy indefendible! Gracias por estar, gracias por las charlas y discusiones. Gracias por el
querido! Finalmente llegarían las niñas… Mica, que seguiría mi línea e iba a sufrir estar
bajo mi “mandato”… “enseñanza”… o algo de eso. De entrada le puso toooda la garra.
Gracias por tu optimismo tan importante en esta profesión! Gracias por tus cookies y
demás mimos en forma de dulces horneados. Gracias por intentar aprender de mí y
emprolijarme al mismo tiempo. Lu, palabras mayores, otra bestia. Muy buen onda,
muchas ganas de laburar, mucho empuje. De inmediato desarrollamos una excelente
relación, vos con tus mates, yo con mis ganas de tomarlos. Compartimos mucho en tus
comienzos y disfruté mucho trabajar con vos. Estoy obligado a agradecerte que te rías
después de cada chiste mío (la mayoría pésimos), y que te preocupes tanto por mi
bienestar. Gracias Lucha por tu buen humor, tu simpatía y tu cariño . Por esa época de
renovación de la sangre laboratoril y de recambio, también llegaría la sonrisa y la alegría
de Ana F. Gracias flaca! Más tarde se nos unieron Nico (a nuestro lab) y Anita Q. y Berta (al
lab de Anabella). Unos grossos! Con Anita es con la que más acercamiento tuve. Gracias
loca por compartir unos buenos tintos conmigo, gracias por tu alegría, gracias por confiar
en mí, gracias por ayudar y permitir que te ayuden, gracias por las charlas que, en poco
tiempo, fueron muchas. A vos Berta, gracias por hacerme correr para que baje la pancita.
Junto a la gente que fui conociendo en mi labo, fueron apareciendo personas que
alegraron mis días y me dieron una mano (o me hicieron sentir útil) en otros labos. El
grupo de Archie me daría grandes amig@s. Destaco a Dami y a Mati por su ancianidad, y
por más tiempo compartido. Gracias a los dos por la buena onda, las charlas, los mates y
por hacer de mis días en el lab algo más terrenal. Dami, gracias por haberme hecho dar
cuenta que lo mío era la psicología! A Anita F. y a Refo también debo destacarlos. A vos
Ana te agradezco todo el amor y a vos Refo, la falta de él. A los más nuevos como Jime,
José, Marianita, Andrés y María, gracias por la buena onda (sobre todo a vos Jime!). A
todo el grupo, Gracias porque también son parte de esto. En especial a vos Marian
(Pancha), por tu cariño sincero, por tu amistad y por haberme presentado a mi futura
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esposa (en noviembre parece). El grupo de Omar, con Sol, Juli y la ídola Dai. Gracias a
ustedes también. Gracias a vos Omar porque con el tiempo me di cuenta cuánto te
preocupas por todos nosotros y por tus chistes obvio. A Bernon, María, Lidia, los
schszucupkakapak! A los Uchiteles, Marion y Euge! Mil gracias a todo el grupo por tener
siempre a mano algo que necesito, una herramienta, un mate, una ayuda. A Ramona por
los cafecitos y el cariño, gracias! Líneas aparte para la persona que se ocupa de que el labo
funcione más o menos bien, Andrada, jugador de toda la cancha. Gracias por tus palabras,
por tu locro, tus asados y tus empanadas. Gracias por tu cariño Orlando. Gracias Leonor
por todos tus mimos y preocupación por nosotros. Al grupo Colman, donde tengo grandes
amigos. Gracias Ale por contagiarme tu emoción, por ser un niño que disfruta tanto pero
tanto de la ciencia que apasiona. A vos Rodri, gracias por tu amistad, gracias por tu
confianza, gracias por abrir tu corazón conmigo y poder charlar de todo. Gracias también
por tu compañía fuera de la facu, por el fútbol, la play, el boxeo, el trago, los P.U.B. . A
vos Lu por tus valores y por las charlas. A vos Alan por la onda inagotable fuera del lab y tu
amor por los “copetines” en los congresos. A vos Mati por las gaviotas.
En paralelo a lo que iba viviendo dentro de los muros de exactas, también tuve una
vida en el exterior (o casi una vida). Parte de esta vida, sobre todo el orden mental de la
misma se lo debo a mi amigo Oscar, un blusero que una vez fue mi terapeuta. A los
amigos de Campomar, INGEBI y el IFEVA. Gracias Pablo C. por tu ayuda desde el comienzo.
Gracias Marcelo por haber sido un co‐director en todo esto. Gracias Sabri por el aguante,
la voluntad y la garra de siempre. Gracias Sandra, Briardo y demás personas de los Salad
Bar, por haber generado un espacio para nosotros los plantólogos con problemas
moleculares. Fabio y Sara, gracias mil millones de gracias por todo el oído que pusieron,
toda la voz y energía con que siempre me respondieron. Al fútbol y a Marcial como
representante del grupo de gente, de amigos que me han dado tanta felicidad con una
pelotita y una cancha sintética. Marcial gracias por tu cariño y tu bondades. A Mariano
Michat, naonense viejo y peludo, gracias por los libros y los consejos, gracias por la guía en
todo momento de mi carrera. A la familia Citro, a los Bidegain, a los Costa y a tantos otros
que me ayudaron para que pueda estudiar. Gracias a Craig Simpson, a John Brown, a
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Andrea Barta y a Maria Kalyna. A vos Maria Сп0XF1о E0 в0шу дWуD1у. A vos Craig thanks
for your friendship. Nada de esto hubiera sido posible sin la ayuda y la existencia de cada
uno de ustedes.
Finalmente, vuelvo a la familia, donde empezó todo. Gracias Tere y María, por
dejarme conocerlas, por conocerme, por convertirse rápidamente en mis dos hermanas,
como si hubiésemos estado juntos toda la vida. Gracias por el cariño y la aceptación.
Gracias Mariaqui por tu amor. Por hacer tanta fuerza para que me acerque más y más a
los tuyos. A vos papá por dejar que nos conociéramos. Por afrontar la situación y por el
abrazo que me diste ese primer día que te vi. Gracias a los 4 por ser mi familia también.
Gracias a vos Cesáreo porque sos una masa! Excelente cuñado. Y a vos Pedro te agradezco
que me hayas remarcado que engordé en los últimos tiempos. A los Regueiro y los Lisazo
por las Navidades y los años Nuevo con tanta alegría.
A mi vieja. Te agradezco porque un día te llegó una carta, la leíste y permitiste la
relación que hoy tenemos. Gracias por hacerme un lugar en tu familia, por tu frescura y
por comportarnos (en complicidad) como si nunca hubiera pasado nada. Tenemos tanto
de que hablar! Gracias por estar ahí ahora. Gracias a mis más nuevos herman@s, el gran
Pablito, la Tony y Gisela. Gracias a Alberto por los cuidados y el cariño que les diste, y
gracias por recibirme en tu casa como uno más.
A Gri. A vos hermosa, tengo tantas cosas que agradecerte, tantas! Pero voy a empezar
por agradecerle al laboratorio, porque un día abrí la puerta del mismo y allí estabas vos,
una preciosura. No pude evitar exclamar hacia Fede: “ME CASO!”. Desde ese momento
deseé no separarme más de vos, y si bien pasaron menos de 3 años desde aquel día, antes
de que este año termine cumpliré el deseo detrás de mi exclamación. Me parece increíble
cuánto llegaste a conocer de mí en este tiempo, creo que ya sabés más de mí que yo
mismo. Parecés entender la manera en que funciono aún sin palabras. Gracias por todo el
amor que me das, por ser un cable a tierra en mi vida, por borrar el mundo y las
preocupaciones con un abrazo o un beso, por burlarte de mis pavadas y obsesiones
generando que ponga los pies en la tierra, por ser una excelente compañera, por
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preocuparte por mi bienestar, por despertarme con un beso (y hacer que me levante…
cosa muy difícil últimamente), por recordarme cosas importantes que de otra forma se me
pasarían. Gracias por hacer que cada día comience y termine bien, a tu lado. Gracias por
las caricias y los masajes, por hacerme sentir el mejor del mundo, el único, por mirarme
como lo hacés, por aceptarme como soy. Gracias por ser una razón en sí misma, quiero
por y para vos. Por darle real significado a la frase “Te Amo”. Gordita preciosa, te amo.
Gracias por enseñarme el valor de la simpleza, de la honestidad, del valor mismo. Espero
seguir aprendiendo de vos cada día. Te agradezco también por tu familia. A los suegros,
Efrén y Grego, gracias porque inmediatamente me hicieron sentir querido. Gracias por los
mimos, las comidas, por estar siempre y desear que estemos bien. Al grosso del cuña y
compañía. Néstor, Nahu y Marina, gracias a los 3 por tanto amor y tanta alegría. Gracias
sobrinito! Gracias a todos ustedes porque también fueron importantes, sobre todo en los
últimos momentos de esta tesis y durante la fatigante escritura. Gracias Gri por
compartirlos conmigo. Gracias Gri por el aguante, porque a veces desaparezco (o estoy
pero no parece) y vos me lo hacés notar con cariño, con caricias. Gracias por haber leído
gran parte de esta tesis y corregir muchos detalles, sobre todo siendo que el tema te gusta
bastante poco! Gracias por ser mi mujer y hacerme tu hombre. Te adoro con todo mi
corazón. Gracias también por Cielo. Pero más allá de todo esto, gracias por los
agradecimientos que van a venir, gracias por hacer de mi futuro un lugar tan hermoso
para vivir, teniéndote a mi lado. Gracias por acompañarme en este camino.
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Aquí debería ir una frase buena, excelente… a falta de una frase así se
me ocurre sólo una palabra…
GRACIAS!
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A Rosa, Lily y Gri
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Abreviaturas más usadas
ADN: ácido desoxirribonucleico
ARN: ácido ribonucleico
ARNr: ácido ribonucleico ribosomal
ARNm: ácido ribonucleico maduro, mensajero
Pol: ARN polimerasa
ATP: adenosina trifosfato
GTP: guanosina trifosfato
snRNP: complejos nucleares pequeños ribo‐núcleo‐proteicos
PQ: plastoquinona
RCA: Rubisco activasa
DCMU: 3‐(3,4‐diclorofenil)‐1,1‐dimetilurea
DBMIB: 2,5‐dibromo‐3‐metil‐6‐isopropil‐benzoquinona
Col: Columbia (ecotipo de Arabidopsis thaliana)
Osc: oscuridad
PCR: reacción en cadena de la polimerasa
RT: retrotranscripción
qPCR: PCR en tiempo real
L y C: isoformas larga y corta respectivamente, en general, refieren a RCA
mRNA3 y mRNA1: isoformas de RSp31
GUS: glucuronidasa
PRMT: metil‐transferasa de residuos arginina en proteínas
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Publicaciones y financiamiento
Para la realización de la presente tesis de doctorado conté con una beca otorgada por
la Universidad de Buenos Aires. El laboratorio del Dr. Alberto R. Kornblihtt, donde realicé
mis estudios, recibió financiamiento de diversas instituciones a lo largo de esos años:
Agencia Nacional de Promoción Científica y Tecnológica, CONICET, UBA, Fundación
Antorchas, EURASNET y Howard Hughes Medical Institute.
Los hallazgos que relato en el capítulo II forman parte de una publicación en la que
comparto la primera autoría con la licenciada Sabrina Sanchez:
A methyl transferase links the circadian clock to the regulation of alternative splicing. Sanchez, S. E.*, Petrillo, E.*, Beckwith, E. J., Zhang, X., Rugnone, M. L., Hernando, C. E., Cuevas, J. C., Godoy Herz, M. A., Depetris‐Chauvin, A., Simpson, C. G., Brown, J. W., Cerdan, P. D., Borevitz, J. O., Mas, P., Ceriani, M. F., Kornblihtt, A. R. y Yanovsky, M. J. Nature. 468. 2010.
Lo expuesto en el capítulo I será parte de un trabajo en preparación: Petrillo, E., Kalyna, M., Godoy Herz, M., Barta, A. y Kornblihtt, A.R.
También durante la realización de esta tesis, colaboré en los trabajos de diferentes
integrantes del laboratorio del Dr. Alberto R. Kornblihtt y de la Dra. Anabella Srebrow, y
como resultado participé de las siguientes publicaciones:
The serine/arginine‐rich protein SF2/ASF regulates protein sumoylation. Pelisch, F., Gerez, J., Druker, J., Schor, I.E., Muñoz, M.J., Risso, G., Petrillo, E., Westman, B.J., Lamond, A.I., Arzt, E., and Srebrow, A. Proceedings of the National Academy of Science USA. 107(37). 2010.
Control of alternative splicing through siRNA‐mediated transcriptional gene silencing. Alló M., Buggiano V., Fededa J.P., Petrillo E., Schor I., de la Mata M., Agirre E., Plass M., Eyras E., Elela S.A., Klinck R., Chabot B., and Kornblihtt A.R. Nature structural & molecular biology. 16(7). 2009.
A polar mechanism coordinates different regions of alternative splicing within a single gene. Fededa J.P., Petrillo E., Gelfand M.S., Neverov A.D., Kadener S., Nogués G., Pelisch F., Baralle F.E., Muro A.F., and Kornblihtt A.R. Molecular cell. 19(3). 2005.
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P á g i n a | 28
El splicing y sus alternativas
En el principio todo era confusión y no había nada en la tierra.
Génesis 1.1
Para conocer todos los actores (detrás y delante de escena) involucrados en los
diferentes niveles de la vida de un mensajero, y las funciones de cada uno de ellos, es
importante que comencemos desde el principio.
I. Biogénesis de un mensajero, la transcripción y el procesamiento
Debido al alto nivel de conservación que muestran los procesos bioquímicos que
conducen al flujo de la información genética en todos los dominios de la vida, es que se
postuló el “dogma central” de la biología molecular [Crick, 1970]. El mismo indica que la
información presente en la molécula heredable y replicable de ADN (los genes) da lugar a
una molécula de ARN (los mensajeros) que tiene la misma información, por un proceso
denominado transcripción; la información contenida en dicho mensajero es luego leída
por la maquinaria de síntesis de proteínas (los ribosomas) en un proceso denominado
traducción.
La transcripción es llevada a cabo por enzimas con actividad ARN polimerasa. Todos
los eucariotas poseen tres ARN polimerasas (pol) nucleares dependientes de ADN
[Archambault y Friesen, 1993]. La pol I que transcribe el ARN ribosomal (ARNr), la pol II
que transcribe la mayoría de los genes (incluyendo los que codifican proteínas) y la pol III
que transcribe ARN de transferencia y ARNr (5S). En el 2005 se descubrió que las plantas
tienen una cuarta polimerasa nuclear (pol IV) que es necesaria para la síntesis de ARN
pequeño de interferencia (de 24 bases) y la formación de heterocromatina [Onodera et
al., 2005].
P á g i n a | 29
En los procariotas la transcripción genera moléculas de ARN mensajero (ARNm) que
son, por su localización y estructura, sustrato directo de la maquinaria de traducción. En
cambio, en los eucariotas, el metabolismo del ARN involucra un conjunto mucho más
complejo de pasos y mecanismos regulatorios. En primer lugar, la maduración del
mensajero requiere una serie de pasos de procesamiento del ARN precursor (pre‐ARN,
también llamado transcripto primario): el agregado de un nucleótido GTP modificado en el
extremo 5’ (capuchón o cap); un corte hacia el extremo 3’ del transcripto y la adición de
varios nucleótidos de adenina, generando un extremo 3’ definido (corte y poli‐
adenilación); generalmente, un acortamiento por reacciones de corte y empalme de
segmentos internos (splicing); y, en algunos casos, la modificación de ciertos nucleótidos
(edición). En segundo lugar, mientras que la transcripción y el procesamiento tienen lugar
en el núcleo, la traducción ocurre en el citoplasma, por lo que se hace necesaria una
maquinaria de exportación de mensajeros. Cada uno de estos eventos, aunque genere un
gasto energético, aumenta las posibilidades de regulación sobre la expresión génica y
confiere la capacidad de obtener diferentes resultados a partir de un mismo molde. Es
decir, tanto la transcripción como el procesamiento del ARN pueden contribuir a la
generación de variantes proteicas, a través de eventos de inicio de la transcripción
alternativos [Quelle et al., 1995], de corte y poli‐adenilación alternativo [Gautheret et al.,
1998] o de splicing alternativo [Black, 2000; Filichkin et al., 2010]. La información con la
que contamos hoy en día muestra que, de todos ellos, el splicing alternativo es el mayor
contribuyente a la generación de variabilidad proteica. En Drosophila un sólo gen, Dscam,
genera un transcripto primario que puede ser alternativamente spliceado para dar origen
a 38000 mensajeros distintos [Graveley, 2001]. Aproximadamente el 70 % de los genes
humanos, y cerca del 42 % en Arabidopsis thaliana, poseen un evento de splicing
alternativo como mínimo [Fededa et al., 2005; Filichkin et al., 2010].
II.
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P á g i n a | 33
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antigua. La evolución podría luego favorecer la adquisición del nuevo evento o su
eliminación. Según esta explicación, los eventos de splicing alternativo serían estados
transitorios de exones que serán eliminados o se harán constitutivos [Ermakova et al.,
2006].
Sin embargo, la conservación de muchos eventos de splicing alternativo en diferentes
especies sugiere que al menos otra explicación existe. Una alternativa a la hipótesis
anterior es que para la célula resulta de gran utilidad mantener la capacidad de generar
distintos productos a partir de un único gen. Así, el splicing alternativo sería una forma
económica de aumentar la diversidad proteica de la célula. Se ha propuesto que en
muchos casos, los eventos de splicing alternativo provienen de eventos de splicing
constitutivo por aparición de un sitio de splicing competidor [Koren et al., 2007]. La
situación en la cual este hecho representa una ventaja para la célula es aquella en la que
el proceso de splicing alternativo puede ser regulado. Se sabe que los exones que
muestran regulación específica de tejido poseen un alto grado de identidad de secuencia
entre especies y un gran sesgo hacia longitudes que sean múltiplos de 3, sugiriendo una
relevancia funcional para esta situación regulatoria [Xing y Lee, 2005].
III. La regulación de la transcripción, efectos sobre el splicing
Diversas evidencias apoyan la co‐transcripcionalidad del splicing in vivo, desde la
observación en el microscopio electrónico de la formación de los lazos intrónicos en los
ARN que están siendo transcriptos (fig. I2) [Beyer y Osheim, 1988] hasta la co‐
inmunoprecipitación de proteínas que participan en el splicing y de moléculas de ARN
procesado asociadas a la cromatina en genes transcripcionalmente activos [Gornemann et
al., 2005; Listerman et al., 2006] o de factores de splicing asociados a la ARN polimerasa II
[Das et al., 2007]. Se ha mostrado in vivo que la ARN pol II recluta factores de splicing a los
focos de transcripción [Misteli y Spector, 1999]. También se ha trabajado en sistemas in
vitro, donde se puede estudiar mecanísticamente la relevancia funcional de este
acoplamiento. Estos trabajos han mostrado que, en general, el reclutamiento co‐
P á g i n a | 34
transcripcional de proteínas de splicing, cuando la transcripción es llevada a cabo por la
ARN pol II, aumenta en gran medida la eficiencia del splicing y la estabilidad del mensajero
[Das et al., 2007], aunque hay evidencias de que en ciertas condiciones, la co‐
transcripcionalidad no es suficiente para aumentar la eficiencia del splicing [Lazarev y
Manley, 2007]. Lo que sí está claro es que la eficiencia de splicing no es alta cuando la
transcripción es llevada a cabo por otras polimerasas, como la ARN pol I, la pol III o la ARN
polimerasa del fago T7, en lugar de la ARN pol II.
Una consideración a ser tenida en cuenta es que la co‐transcripcionalidad no es
estricta, en el sentido que no todos los intrones son eliminados a medida que son
transcriptos, ni todos son eliminados antes de que la transcripción finalice. Puede darse el
caso de un mismo gen en el cual algunos intrones sean procesados co‐
transcripcionalmente y otros post‐transcripcionalmente. Por ejemplo, en el gen de BR1
(Balbiani ring 1) en Drosophila el intrón 3 es procesado casi siempre en forma co‐
transcripcional, mientras que el intrón 4 sólo lo es en el 10 % de los casos [Bauren y
Wieslander, 1994]. Inclusive, el orden de eliminación de los intrones no tiene por qué
seguir la dirección de la transcripción [de la Mata et al., 2010].
Si bien la co‐transcripcionalidad del splicing es un pre‐requisito para que haya
influencia funcional entre los dos procesos, no implica por sí sola la existencia de una
interacción. Evidencias acumuladas a lo largo de los años llevaron al planteo de dos
modelos posibles, que no son excluyentes y podrían actuar en conjunto, para explicar la
influencia que podría tener la transcripción sobre el splicing alternativo [Kornblihtt, 2007]:
El modelo de reclutamiento, plantea que la maquinaria transcripcional recluta
factores de splicing o co‐activadores transcripcionales con funciones
regulatorias sobre el splicing del ARNm naciente. Este reclutamiento podría
darse en forma diferencial en distintos contextos celulares, dando así lugar a
diferentes resultados de los eventos de splicing.
P á g i n a | 35
El modelo cinético, plantea que la velocidad de elongación de la polimerasa
afecta el momento en el cual diferentes sitios de splicing ‐que pueden
competir‐ son presentados, favoreciendo o desfavoreciendo el reconocimiento
de los factores que se unen a los mismos, según la “fortaleza” de cada sitio
respecto al consenso.
Si consideramos al splicing como un proceso co‐transcripcional y a la vez dinámico, las
elecciones que la maquinaria de splicing tome dependerán de los elementos con los que
cuenta en un momento dado. Dado que muchos de esos elementos corresponden a
secuencias del ARN que está siendo transcripto, el tiempo en el cual se transcriban influirá
en su disponibilidad para la maquinaria de splicing. En conclusión, la regulación de la
transcripción por la ARN pol II, ya sea por factores que se le unan y regulen su actividad o
por la propia naturaleza del molde transcripto, tendrá repercusiones sobre las decisiones
que se toman durante el procesamiento.
La ARN pol II posee una particularidad que la diferencia de las otras polimerasas hasta
aquí mencionadas. El dominio carboxi‐terminal (CTD) de su subunidad mayor es un arreglo
inherentemente desestructurado pero conservado evolutivamente. En hongos, plantas y
animales, está compuesto por 25 a 52 repeticiones en tándem de la héptada consenso
YSPTSPST y puede ser altamente fosforilado cambiando su afinidad por diferentes
factores que involucrados en el procesamiento de los mensajeros [Phatnani y Greenleaf,
2006].
Si bien la ARN pol II es una enzima característicamente muy procesiva (puede recorrer
un molde de varias kilobases en forma completa sin desprenderse), siendo capaz de
transcribir genes de hasta cerca del millón de bases, es también propensa a pausas y
arrestos transcripcionales que determinarán la tasa de elongación (velocidad medida en
cantidad promedio de nucleótidos añadidos por unidad de tiempo) media observada. Las
pausas transcripcionales son eventos normales en la transcripción de todas las ARN
polimerasas dependientes de ADN y tendrían funciones regulatorias de la elongación
transcripcional [Sims et al., 2004]. Se supone que están causadas por un des‐alineamiento
P á g i n a | 36
entre el extremo 3’ del ARN naciente y el sitio activo de la polimerasa, son reversibles y
están reguladas por la participación de diversos factores de elongación, tanto positivos
como negativos [Conaway et al., 2000].
Además de los factores que se unen directamente a la maquinaria transcripcional y
modifican su actividad, el estado del molde que se está transcribiendo también la puede
alterar. La transcripción en un molde cromatinizado es fuertemente regulada por factores
que, no actuando directamente sobre la polimerasa, modifican la estructura cromatínica
[Narlikar et al., 2002]. Esto puede ocurrir de dos formas distintas, una mediada por
complejos remodeladores de la cromatina, y la otra, por proteínas que producen
modificaciones post‐traduccionales en las histonas, especialmente en sus colas N‐
terminales [Johnson et al., 2005; Lee et al., 2005; Berger, 2007; Cottingham, 2008; Hou et
al., 2008; Liu et al., 2010].
Los complejos remodeladores de la cromatina, formados por un número de
subunidades proteicas que puede superar la decena, causan el desplazamiento de
nucleosomas con gasto de energía en forma de ATP [Flaus y Owen‐Hughes, 2001]. Esto
podría liberar secuencias de ADN importantes y también ayudar a la polimerasa a
atravesar los nucleosomas.
Las modificaciones post‐traduccionales que pueden observarse en el dominio N‐
terminal de las histonas incluyen, acetilación, metilación, fosforilación, glicosilación, ADP‐
ribosilación, ubicuitinación y sumoilación. Una de las modificaciones más estudiadas es la
metilación de histonas en lisinas o argininas. Distintas metilaciones pueden estar
involucradas tanto en activación como en represión de la transcripción, no existiendo una
tendencia clara como en el caso de la acetilación [Schneider et al., 2004; Berger, 2007]. Si
incorporamos estas modificaciones al concepto tras el modelo cinético se hace evidente
que las modificaciones que generen (como la metilación) una estructura más compacta de
la cromatina, causarán una menor tasa de elongación; y aquellas que generen una
estructura más laxa (acetilación por ejemplo), darán lugar a tasas de elongación más
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P á g i n a | 38
desde los 5 a los 60 minutos. En los vertebrados, varía entre 20 minutos y 24 horas. En
consecuencia, diferencias de 1000 veces en la abundancia de un ARNm, pueden resultar
de una diferencia pequeña en la estabilidad [Brennan y Steitz, 2001]. Por consiguiente, los
procesos que regulan la vida media de los mensajeros pueden afectar el crecimiento de
una célula, cómo responde a su entorno y cómo se diferencia [Ross, 1995].
La degradación regulada de un ARNm es llevada a cabo por la interacción de
componentes estructurales del mensajero con factores proteicos específicos [Guhaniyogi
y Brewer, 2001]. Un ejemplo es la degradación mediada por codones de terminación
(stop) prematuros (NMD, nonsense‐mediated decay), un mecanismo conocido de
vigilancia y chequeo de los ARNm, y una de las formas que tienen los eucariotas para
controlar la calidad de sus mensajeros. El NMD elimina aquellos transcriptos que darían
productos proteicos truncados [Maquat, 2004; Shyu et al., 2008]. Más de 1/3 de los
eventos de splicing alternativo en humanos generan un codón de terminación prematuro
que conllevaría la degradación del mensajero por NMD [McGlincy y Smith, 2008; McGlincy
et al., 2010].
Las plantas y el splicing
La organización exón‐intrón de plantas superiores es similar a la de vertebrados; el
splicing es catalizado en ambos sistemas por el spliceosoma, que está conformado por las
snRNPs y proteínas auxiliares. Como en otros eucariotas, el proceso de splicing también
utiliza un gran número de proteínas no‐snRNP, que incluye a proteínas ricas en
Serina/Arginina (SR). Sin embargo hay algunas diferencias significativas: los intrones de
plantas son generalmente más cortos y los requerimientos para su reconocimiento
también difieren (las células de plantas en general fallan en procesar ARNs heterólogos).
La diferencia más importante radica en la alta riqueza de los intrones de plantas en
nucleótidos UA o U, en comparación con la que presentan los intrones de vertebrados y
levaduras. Estas secuencias, distribuidas a lo largo de todo el intrón, son requeridas para
el eficiente procesado del mismo y la elección del sitio de splicing (Lorković et al., 2000).
Además, se postula en las plantas la existencia de un proceso activo de reconocimiento de
P á g i n a | 39
intrones en lugar del proceso de definición exónica postulado para los vertebrados,
aunque existen trabajos que implicarían a este último en algunos casos (Simpson et al.,
1999).
Se piensa que el splicing alternativo sería un evento menos común en plantas que en
otros eucariotas superiores, sin embargo, análisis bioinformáticos en Arabidopsis thaliana
han comenzado a cuestionar esta idea (Kazan, 2003) y actualmente se sabe que cerca del
42 % de los genes que tienen intrones en Arabidopsis sufren splicing alternativo [Filichkin
et al., 2010]. La retención intrónica es el evento de splicing alternativo más frecuente en
plantas (fig. I7). Se diferencia mecanísticamente de las otras posibilidades en que no
involucra una competencia entre distintos sitios dadores y aceptores de splicing (fig. I5).
Los mensajeros parcialmente procesados probablemente sean retenidos en el núcleo
dado que la presencia de intrones representa un desafío para el transporte nuclear, en el
sentido de que varios puntos de control deben ser traspuestos para que el transcripto sea
transportado al citoplasma [Black, 2003]; aunque en circunstancias específicas, como
sucede en la biología de los retrovirus, factores codificados por la célula logran sortear la
barrera impuesta por el aparato de exportación núcleo‐citoplasma. Aproximadamente un
30 % de genes de Arabidopsis que sufren splicing alternativo presenta retención de intrón
según análisis computacionales (fig. I7), de los que al menos un porcentaje fue confirmado
por transcripción reversa seguida de la reacción en cadena de la polimerasa o RT‐PCR
[Ner‐Gaon y Fluhr, 2006; Kim et al., 2007]. De forma similar a lo que sucede en humanos,
la gran mayoría de genes con splicing alternativo en Arabidopsis codifica proteínas con
funciones regulatorias. Además, los genes asociados a respuestas frente a estrés son
particularmente propensos a poseer splicing alternativo, tanto en plantas como en
animales (Kazan, 2003). Los pre‐ARN de los genes de Arabidopsis que codifican proteínas
SR, una familia conservada de reguladores de splicing, sufren gran cantidad de eventos de
splicing alternativo produciendo 95 mensajeros diferentes a partir de sólo 15 genes
[Palusa et al., 2007].
P á g i n a | 40
Actualmente en PubMed (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed) se pueden
encontrar más de 600 publicaciones que relacionan los temas splicing alternativo y
plantas; para el momento en que comenzaba esta tesis, por el 2005, apenas llegaban a la
mitad. Esto implica, que en los últimos años se ha avanzado mucho en este campo y en el
conocimiento del modo en que las plantas regulan el procesamiento de los transcriptos, si
repiten estrategias de los animales y/o presentan novedades en su regulación y cuáles
son. Esta última frase, resume las razones que motivaron la realización de la presente tesis
y de los experimentos que discutiremos en las próximas secciones.
Figura I7: Distribución de los diferentes tipos de splicing alternativo en distintos
eucariotas (extraído de [Kim et al., 2007]).
P á g i n a | 41
Hipótesis general
Si bien cada capítulo contará con sus propios objetivos y estrategias, expondré aquí la
hipótesis detrás de toda la tesis debido a que la misma tiene un alcance general y es la
motivación que nos llevó a trabajar en Arabidopsis thaliana.
El splicing alternativo es un mecanismo fisiológicamente relevante en las
plantas que les permite adaptarse a los cambios en las condiciones de su
entorno, como son aquellas relacionadas a la luz incidente.
P á g i n a | 42
Prólogo del Capítulo I (de lo personal y emocional)
¿Quién te quita lo bailado?
Las Sabrosas Zariguellas
Paréntesis personal: Mi director de tesis, un gran consejero y una gran persona, con
acciones y modos que generan admiración en los que llegamos a conocerlo siempre logra
–a pesar de sus preocupaciones que no suelen ser muy pocas‐ “hacerse unos minutos”
para charlar a nivel científico, académico y/o personal. Hay una frase que no se cansa de
repetir: “El producto de la tesis doctoral es el becario”. Con esta quiere decir que más allá
de los resultados obtenidos, del éxito o fracaso a nivel publicaciones, de las frustraciones y
de la suerte (o más común, la ausencia de ella); es el trabajo que vamos haciendo a diario,
los reportes que leemos, que estudiamos, que discutimos; los cursos, el día a día con
nuestros compañeros, un aprendizaje en sí mismo que se ve reflejado en nuestro propio
saber, en la capacidad de generar nuevas preguntas e hipótesis y en las herramientas que
adquirimos para responderlas. ¿Quién nos quita lo bailado?
Antes de finalizar mis estudios de grado, discutimos con Alberto sobre el futuro y
sobre lo que yo planeaba hacer. Los dos dejamos en claro que nos parecía interesante
probar suerte en el mundo de las plantas. Alberto es por definición un botánico
sistemático fanático, cualquiera que haya paseado por un lugar con al menos 1 planta con
él puede dar fe de estas palabras. Sin embargo, el camino que eligió para su actividad
científica, lejos estaba de estos verdes organismos. Mucho más lejos estaba el
conocimiento que tenía yo de los mismos (apenas un aficionado de la biología vegetal).
Pero a ambos nos tentaba la idea de abrir esa nueva puerta con los riesgos que podía
implicar. Tan sólo un día después de la charla que mantuvimos con Alberto, Marcelo
Yanovsky dio una clase en la materia de Sara Maldonado, que yo estaba cursando en ese
momento. Me pareció increíble lo que él estudiaba y de inmediato establecimos una
colaboración… durante el recreo. Se organizó una reunión para que pudiéramos charlar
P á g i n a | 43
los 3 con tranquilidad y comencé a transitar el camino de esta tesis. Más tarde caminaría
también con la ayuda de Pablo Cerdán, Santiago Mora, Sara Maldonado, Noemí Colombo,
Fabio Causín, Mercedes Rivero, Gus‐Gudesblat (entre otros Iusem), Maria Kalyna, Andrea
Barta, la gente de los laboratorios de Pablo, Marcelo y Jorge Casal, y ya no habría vuelta
atrás. Los primeros congresos en que pude entrar en contacto con la gente del mundo de
la fisiología y la biología molecular de las plantas, terminarían definiendo que el camino
elegido era, gracias a ellos, cómodamente transitable.
Decididos, escribimos el proyecto de tesis. No sabía en ese entonces lo poco que
sabía, incluso menos que ahora.
La idea era comenzar con 1 gen, uno cualquiera que tuviera al menos 2 variantes de
splicing, ver si existía alguna regulación mediada por la luz sobre el evento de splicing
alternativo, y empezar a buscar el mecanismo detrás de esa regulación. Era OBVIO que iba
a estar involucrado 1 fitocromo… o 1 criptocromo… no había otra posibilidad… ¿no?
No iba a ser esta la última vez que me equivoque, ni la peor equivocación, sólo sería
otra hipótesis incorrecta, uno más de esos “resultados negativos” que muchas veces no
forman parte de ningún trabajo y no integran la tesis pero, en definitiva, junto a la gente
que nos ayuda a interpretarlos y a sobreponernos son los que “nos hacen”.
Me parecía injusto (sobre todo hacia mi persona) comenzar directamente con la
introducción teórica, los resultados y sus conclusiones, sin “introducirlos” previamente en
el contexto en que fueron generadas. Puede ser interpretado como un intento de
acercarlos a los razonamientos detrás de cada afirmación, o –a un nivel personal‐, un
paréntesis que permitió reafirmarme y dejar por sentado el concepto detrás de “quién te
quita lo bailado”.
P á g i n a | 44
Capítulo I
Regulación del splicing alternativo de RSp31 por la luz
Introducción
La naturaleza se ha planteado el problema de cómo atrapar la huidiza luz que llega
hasta la Tierra y cómo almacenar en forma consistente la más volátil de las energías
Julius Robert Mayer, 1842
La mayor parte de la energía libre consumida por los seres vivos proviene en primera
instancia de la energía de la luz solar. Los organismos capaces de utilizar directamente esa
energía, conocidos como foto‐autótrofos, son la base de la vida en nuestro planeta (junto
a los litó‐trofos, que obtienen la energía por oxidación de compuestos inorgánicos). Las
plantas, que son organismos foto‐autótrofos, generan energía química a partir de la
lumínica por medio de una serie de reacciones que se dan lugar durante un proceso
conocido como fotosíntesis:
H2O + CO2 (CH2O) + O2 Ecuación básica de la fotosíntesis
P á g i n a | 45
En la ecuación de arriba (CH2O) representa un azúcar formado por la asimilación del
dióxido de carbono atmosférico gracias a la energía de la luz. Anualmente se almacenan
unas 1010 toneladas de azúcares y otros compuestos orgánicos, aproximadamente 1017
kcal de energía libre almacenadas por la fotosíntesis (cerca de 2 x 1014 Big Mac).
Debido a que las plantas son organismos sésiles y a que dependen completamente de
la energía de la luz solar para vivir es necesario que puedan detectar la intensidad, la
calidad y la dirección de éste factor ambiental para responder apropiadamente al mismo
optimizando su crecimiento y desarrollo [Batschauer, 1999].
Volviendo a la frase de Mayer que abre el capítulo y esta introducción ¿cómo
resolvieron las plantas, o la naturaleza, el problema de atrapar la más huidiza de las
energías?
1. Fotosíntesis
No es la idea de la introducción rememorar cada uno de los pasos que se suceden
durante el proceso de fotosíntesis y que pueden ser leídos con profundidad suficiente en
distintos libros de texto; pero sí deseo resaltar las características del sistema que tuve en
cuenta y fueron útiles en mis estudios.
El cloroplasto y los fotosistemas
Desde su origen evolutivo como una cianobacteria endosimbionte hace
aproximadamente 1‐1,5 mil millones de años, el cloroplasto se integró completamente y
definió a los eucariotas fotosintéticos. Conceptualmente podemos dividir la fotosíntesis en
dos fases que ocurren enteramente en esta organela. Por un lado, la fase de las reacciones
dependientes de la luz que tiene lugar en la membrana de los tilacoides. En dos de los
diferentes complejos proteicos integrados a la membrana tilacoidal, el fotosistema I y el
fotosistema II, unos pigmentos llamados clorofilas absorben energía de la luz e inician el
flujo de electrones generando ATP y poder reductor. Por otro lado, esa energía química es
utilizada en el estroma del cloroplasto en una segunda fase, independiente de la luz,
P á g i n a | 46
donde el CO2 es asimilado por la ribulosa‐1,5‐bifosfato carboxilasa/oxigenasa (RUBISCO)
generando azúcares. La figura I8 esquematiza las diferentes etapas.
La interacción entre el fotosistema I, que puede ser excitado por radiación de longitud
de onda inferior a los 700 nm generando un reductor fuerte que conduce a la formación
de NADPH (NADPH + H+) y el fotosistema II, que puede excitarse con longitudes de onda
menores a los 680 nm produciendo un oxidante fuerte que conduce a la formación de O2,
establece un gradiente de protones a través de la membrana del tilacoide y la
consiguiente formación de ATP por la fosforilación fotosintética o fotofosforilación (ver
Figura I8).
El fotosistema II cataliza la transferencia de electrones entre el agua y la
plastoquinona, en la dirección termodinámicamente desfavorable, utilizando energía libre
de la luz. Cuando absorbe dos electrones y dos protones cedidos por el fotosistema II, la
plastoquinona se convierte en plastoquinol (estado reducido), pasa a formar parte del
pool* de plastoquinona/plastoquinol (PQ/PQH2) de la membrana del tilacoide y puede
transferir sus electrones al siguiente aceptor de la cadena [Chain, 1985]. El complejo del
citocromo b6f cataliza la transferencia de electrones desde el plastoquinol a la
plastocianina [Illerhaus et al., 2000] y bombea protones (H+) concomitantemente a través
de la membrana tilacoidal hacia el lumen del tilacoide. Hasta aquí se ha generado un
gradiente de protones por la acción conjunta del fotosistema II y el complejo del
citocromo b6f. Además, se redujo a la plastocianina. Esta última, cede luego sus
electrones a un aceptor que forma parte del fotosistema I, el fotosistema absorbe luz y es
capaz de transferir los electrones en estado excitado a la ferredoxina que los cederá, por
la acción de la ferredoxina‐NADP reductasa, al NADP+ formando NADPH. Como esta
reacción ocurre del lado del estroma, la toma de un protón (H+) de ese lado para reducir al
NADP+, también contribuye con la generación del gradiente de protones. La disipación de
este gradiente a través de la ATP sintetasa sirve para generar ATP [Nakamoto et al., 2008].
* Nota de no-traducción: no encontré una traducción al español que comunique lo mismo que la palabra pool en
inglés por lo que decidí utilizarla así, aunque en cursiva para resaltar su origen en otra lengua. Lo más cercano al
concepto en español sería una mezcla de: grupo, banco y reserva.
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P á g i n a | 48
Calvin. La forma reducida o sulfhidrilo de las TRX mencionadas es la más abundante en luz
y es capaz de reducir puentes disulfuros que controlan la actividad de enzimas
biosintéticas. A través de estrategias proteómicas se han identificado varios blancos
cloroplásticos para las TRX [Balmer et al., 2003; Wong et al., 2004; Bartsch et al., 2008]. La
TRX oxidada es reducida por la ferredoxina en una reacción catalizada por la ferredoxina‐
tiorredoxina reductasa. De esta manera las actividades de la fotosíntesis están controladas
en luz y oscuridad por el poder reductor de la ferredoxina y más tarde de la tiorredoxina.
La actividad de la RUBISCO también está controlada por la luz. La noción de que la
regulación de su actividad es un proceso espontáneo controlado por los cambios en el pH
del estroma y el Mg++ debidos a la iluminación persiste en los libros de texto a pesar de
que se ha acumulado evidencia de lo contrario [Portis Jr y Salvucci, 2002]. La activación
depende de otra enzima denominada RUBISCO activasa (RCA), que hidroliza ATP
promoviendo la disociación de azúcares‐fosfato inhibitorios (2‐carboxiarabinitol 1‐
fosfato) que se unen a la RUBISCO, permitiendo así la reapertura de su sitio activo. RCA
consiste usualmente de dos isoformas generadas a partir del splicing alternativo de su
mensajero. Su actividad está regulada por la relación ADP/ATP y la respuesta a esta
relación es modulada en la isoforma proteica larga (la más activa) por cambios redox (de
óxido‐reducción) mediados por TRX f. Esto permite la modulación de la RUBISCO por la
intensidad de la luz [Houtz y Portis, 2003].
En resumen, la luz absorbida en los fotosistemas es convertida en energía química en
la forma de NADPH y ATP, que sirven de co‐sustratos en la reducción del CO2 a
carbohidrato por las enzimas del ciclo de Calvin. Además la luz cumple otra tarea
fundamental: es un elemento regulatorio. La luz activa vías anabólicas fotosintéticas y
desactiva vías catabólicas requeridas en oscuridad, evitando así ciclos fútiles que
ocurrirían si reacciones opuestas tienen lugar al mismo tiempo. Podemos sumarle a esto
el hecho de que la luz varía en intensidad (cantidad) y en longitud de onda (calidad), lo
que generó en las plantas la evolución de complejas redes de regulación para ajustar su
P á g i n a | 49
metabolismo a las condiciones cambiantes del entorno y optimizar así el aprovechamiento
de la energía lumínica. ¿Cómo es que perciben estas diferencias?
2. La luz como señal
I. Los ojos de las plantas, los fotorreceptores
La mayoría de los procesos del desarrollo a lo largo de la vida de las plantas están
influenciados por la luz: germinación de semillas, desarrollo de la plántula, detección de
plantas vecinas, fototropismo y floración. La luz es percibida por diferentes
fotorreceptores que detectan diferentes aspectos del espectro de luz solar. Estos
fotorreceptores incluyen a los fitocromos (Phy), responsables de la detección de luz roja y
roja lejana, y a los criptocromos (Cry), responsables de detectar luz azul junto a las
fototropinas [Batschauer, 1999; Gyula et al., 2003].
Los fitocromos son apo‐proteínas codificadas por una pequeña familia de genes que
en Arabidopsis thaliana cuenta con 5 miembros (PHYA a PHYE). Todos ellos existen como
dímeros compuestos de dos polipéptidos de 125 kDa unidos, cada uno, covalentemente a
un cromóforo tetrapirrol. Son sintetizados en oscuridad en la forma fisiológicamente
inactiva que absorbe luz roja (R) conocida como Pr. Seguido a la absorción de un fotón, la
forma inactiva Pr es convertida en la fisiológicamente activa que puede absorber luz roja
lejana (FR), llamada Pfr, y volver nuevamente a la forma Pr. Además de inducir un cambio
conformacional en la estructura de los fitocromos, la luz causa la auto‐fosforilación del
PHYA [Yeh y Lagarias, 1998] y de otras proteínas blanco de los fitocromos [Sineshchekov y
Fankhauser, 2004], y modula la distribución núcleo‐citoplasma de los fitocromos de
manera dependiente de la calidad e intensidad. En el núcleo los fitocromos se concentran
principalmente en estructuras denominadas speckles* que exhiben un patrón de
formación regulado por ciclos de luz/oscuridad [Kircher et al., 2002]. Los speckles son sub‐
estructuras nucleares poco definidas y poco “entendidas” en las plantas. En las células de
animales se los reconoce como lugares asociados a factores de procesamiento de ARN,
factores de transcripción, proteínas asociadas a la exportación de los mensajeros, etc.
* Nota de no-traducción: nuevamente he preferido conservar la palabra en su idioma de origen por la falta de una
traducción adecuada, podría haberla reemplazado quizás por gránulos nucleares.
P á g i n a | 50
Los criptocromos (CRY1 y CRY2 en Arabidopsis thaliana) son flavoproteínas presentes
en diferentes taxones [Cashmore et al., 1999] que se cree evolucionaron a partir de las
fotoliasas. A diferencia de estas últimas, los criptocromos carecen de actividad reparadora
del ADN. CRY2 se localizan principalmente en el núcleo, lo mismo vale para CRY1 al menos
en oscuridad, y los estudios recientes demuestran que la regulación de la expresión génica
sería el mecanismo más importante en la vía de señalización de los criptocromos. Además,
CRY2 interactuaría físicamente con PHYB estando asociados a los speckles nucleares [Lin y
Shalitin, 2003]. También se postula que la percepción de luz azul por los CRY gatillaría la
rápida desactivación/degradación de COP1 (Constitutive Photomorphogenesis), un
regulador negativo de la fotomorfogénesis, que actuaría como una E3‐ligasa provocando
la degradación de ciertas proteínas en oscuridad. Uno de sus blancos sería HY5 (elongated
Hypocotyl in light 5), un factor de transcripción que activa la expresión de varios genes
“río abajo” de los fotorreceptores [Gyula et al., 2003].
La figura I9 resume los conceptos expuestos hasta aquí y muestra también los eventos
que regulan las distintas vías de señalización a nivel fisiológico. Se puede apreciar lo
compleja que es la situación y la cantidad de actores en el desarrollo de la trama, sin
embargo a esta historia le falta otro punto de vista ¿puede existir otro “ojo” en las
plantas?
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P á g i n a | 52
II. Un tercer ojo, el cloroplasto
En biología nada tiene sentido excepto a la luz de la evolución
Theodosius Dobzhansky
Lynn Margulis parafrasea a Dobzhansky en un artículo (Vol. 31 Nov. 2004,
www.socgenmicrobiol.org.uk/pubs/micro_today/pdf/110406.pdf) de “Microbiology
Today” diciendo que: “actualmente, en biología molecular nada tiene sentido si no es a la
luz de la historia evolutiva de los organismos en sus paleo‐ambientes específicos”. Sin
hacer caso omiso a estas palabras, deseo comenzar esta sección aclarando que se asume
en la actualidad que el cloroplasto evolucionó por la endosimbiosis de una bacteria
fotosintética con un eucariota ancestral [Margulis, 1975; Margulis y Bermudes, 1985]. El
genoma ancestral de la bacteria contenía presumiblemente toda la información necesaria
para la vida de tal organismo. Con el paso del tiempo evolutivo, la relación endosimbiótica
que llevó a la aparición de las algas verdes, y posteriormente a las plantas, redujo la
capacidad codificante de ese genoma. Muchos genes que no son necesarios para la vida
en simbiosis se pueden haber perdido y una gran mayoría fueron transferidos al huésped.
En la actualidad, el genoma de un plástido de plantas superiores contiene menos de 100
marcos de lectura abiertos, y el resto de los más de 3000 polipéptidos que se encuentran
en un cloroplasto, son codificados por genes alojados en el núcleo [Abdallah et al., 2000].
Complejos fotosintéticos y metabólicos esenciales del cloroplasto están compuestos por
subunidades codificadas por distintos genomas (nuclear y plastídico) lo que obliga a una
coordinación ajustada en la expresión de los mismos. El núcleo codifica la mayoría de los
genes requeridos para la expresión génica del cloroplasto, y en adición a tal control
“anterógrado” es que han evolucionado mecanismos de regulación “retrógrada”. A través
de éstos, el estado funcional y de desarrollo del cloroplasto puede modular la expresión
de genes nucleares que codifican para proteínas de localización plastídica [Nott et al.,
P á g i n a | 53
2006]. Podemos agrupar estas señales retrógradas en dos grandes categorías: i) control
biogénico, el control a nivel de desarrollo de la biogénesis de la organela tiene que darse
en la fase apropiada y las subunidades y cofactores necesarios para el ensamblado
correcto deben estar presentes en la estequiometría correcta; y ii) control operacional,
para mantener la producción óptima y reparar los daños inducidos por el estrés oxidativo
son necesarios cambios rápidos en el metabolismo energético que se ajusten a las
condiciones del entorno y de desarrollo [Pogson et al., 2008].
Me enfocaré en las vías de señalización retrógrada bajo las cuales el cloroplasto
controla la expresión de genes nucleares. La primera evidencia de un rol del cloroplasto en
el control de la expresión nuclear provino de mutantes de cebada y Pelargonium con
defectos en los ribosomas plastídicos. En esos mutantes, varias enzimas del ciclo de
Calvin, codificadas nuclearmente, se vieron afectadas en su expresión. Utilizando
Norflurazón (un herbicida) y luz de alta intensidad se genera un daño a los cloroplastos, en
estas condiciones se observó que la expresión de varios genes que codifican proteínas
relacionadas con la fotosíntesis disminuye. Si bien se propuso un único “factor plastídico”
o señal, en la actualidad sabemos que son múltiples vías las que controlan la expresión de
los genes nucleares en función de los requerimientos del cloroplasto [Beck, 2005]. Se ha
acumulado evidencia experimental que permite definir al menos cinco vías de señalización
retrógrada: una de ellas relacionada a intermediarios de la biosíntesis de clorofila o
tetrapirroles; otra, es inducida por la inhibición de la expresión génica del plástido; una
tercera, tiene que ver con una señalización por azúcares; la cuarta es controlada por el
estado redox de la cadena de transporte electrónico fotosintético; y una quinta que
emplea especies reactivas de oxígeno (o ROS) [Zhang et al., 2010]. La figura I10
esquematiza las distintas vías propuestas. ¿Qué sabemos de cada vía?
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P á g i n a | 56
II. Vía de los tetrapirroles
La primera evidencia para postular la vía de los tetrapirroles provino de estudios
realizados en el alga verde Chlamydomonas reinhardtii. Cuando se trataba a las mismas
con inhibidores de los últimos pasos de la síntesis de tetrapirroles, fallaba la inducción de
genes nucleares como LHCB (codifica para una subunidad del complejo antena).
Posteriormente, se encontró que las mutantes gun2, gun3, gun4 y gun5 de Arabidopsis
thaliana que continúan expresando LHCB aún en tratamiento con norflurazón, tienen
defectos en la vía de síntesis de los tetrapirroles. Particularmente, GUN4 y GUN5 operan
en la “rama de magnesio” de la biosíntesis de tetrapirroles que es la que lleva a clorofila
[Mochizuki et al., 2001; Larkin et al., 2003]. Para explicar la señalización por esta vía hay
varias hipótesis. Una de las posibles interpretaciones sería que el nivel de un tetrapirrol
específico se transmite, directa o indirectamente, al citosol [Pesaresi et al., 2007].
También se ha postulado que GUN1 podría participar de esta vía [Koussevitzky et al.,
2007]. Cómo y cuándo actúa esta señal requiere de futuras investigaciones pero se cree
que ABI4, un factor de transcripción involucrado en la vía de respuesta a la fitohormona
ácido abscísico (ABA), parecería participar de la vía de los tetrapirroles tanto como de la
de PGE (fig. I11). El 89 % de los genes que no son reprimidos por el tratamiento con
norflurazón en las mutantes gun1 y gun5 son los mismos, y muchos de ellos contienen
elementos de respuesta a ABA [Pogson et al., 2008].
III. Vía de los azúcares
En plantas con flor los azúcares controlan el crecimiento y el desarrollo a lo largo de
todo el ciclo de vida, y actúan como moléculas que sirven de señal para modular la
expresión de genes involucrados en fotosíntesis, metabolismo, respiración, síntesis de
azúcares y otros procesos. Niveles elevados de glucosa o sacarosa (los productos finales
de la fotosíntesis), reprimen la expresión de genes fotosintéticos [Rolland et al., 2006] y
este fenómeno permitió buscar y aislar mutantes insensibles a la glucosa. Una de estas
mutantes, gin2 (glucose insensitive 2) junto a mutantes puntuales que codifican versiones
de la proteína con escasa actividad quinasa, permitieron estudiar el rol de la hexoquinasa
1 (HXK1) de Arabidopsis thaliana. Las hexoquinasas son enzimas que fosforilan hexosas
P á g i n a | 57
(azúcares de 6 carbonos) y, por lo tanto, las preparan para su posterior degradación. Se
creía que la mayoría de los efectos de la glucosa eran metabólicos pero se ha demostrado
que la HXK1 tiene una función dual, y que mutantes prácticamente inactivos
catalíticamente son capaces de funcionar en la vía de señalización, en tanto que la
mutante nula (sin proteína detectable) gin2 no lo hace [Moore et al., 2003].
Sin embargo, la represión de algunos genes en oscuridad en presencia de glucosa sigue
activa en la mutante gin2, lo que indica la presencia de vías independientes de HXK1. Esto
motivó la búsqueda y el hallazgo de otras vías de las que se puede destacar a la de las
quinasas de proteínas KIN10 y KIN11 que controlarían e integrarían la reprogramación
transcripcional en respuesta a factores como oscuridad, azúcar y estrés [Baena‐Gonzalez
et al., 2007].
Además, el aislamiento de mutantes para las respuestas a azúcar ha revelado una
interacción entre estas vías y las de respuesta a hormonas (ej.: ABA). Para citar un
ejemplo, la mutante abi4, también presenta un fenotipo de insensibilidad al azúcar que le
ha valido su re‐aislamiento bajo los nombres de: gin6, sun6 (sucrose uncoupling 6) y sis5
(sugar insensitive 5); todos ellas, mutantes para el gen que codifica al ya mencionado ABI4
[Rolland et al., 2006; Huang et al., 2010].
No pretendo ir más allá por el camino del azúcar, ya que es muy extenso, presenta
numerosos desvíos y sólo serviría de mera distracción para los propósitos de la presente
introducción. Propongo que continuemos nuestra lectura tomando una vía diferente...
IV. Estado de óxido‐reducción de los componentes de la cadena de transporte
electrónico fotosintético
El transporte electrónico fotosintético lineal comienza en el fotosistema II, los
electrones son entregados luego al complejo del citocromo b6f a través del pool de
plastoquinona (fig. I8). La plastocianina media el transporte desde el complejo del
citocromo b6f hacia el fotosistema I. Desde allí, los electrones son transferidos a la
ferredoxina y entregados finalmente al NADP+ generando NADPH [Nott et al., 2006]. El
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Se creía que el estado redox del pool de PQ es uno de los mayores determinantes de
las señales retrógradas derivadas del transporte electrónico fotosintético. La afirmación se
sostiene sobre evidencias experimentales como el hecho de que genes cuya expresión es
inducida por tratamientos con alta intensidad de luz (que llevaría al pool de PQ a un
estado PQH2 principalmente) también son inducidos por agregado de DBMIB en ausencia
de alta irradiancia, e inhibidos por tratamiento con DCMU [Nott et al., 2006]. En los
últimos años, se ha sugerido que la regulación por la vía de la plastoquinona sería
funcional sólo en exposiciones prolongadas a condiciones ambientales contrastantes, y
por consiguiente, se ha planteado que es poco probable que el estado redox del pool de
PQ tenga un rol primario en los experimentos realizados a tiempos cortos [Piippo et al.,
2006]. Trabajos recientes muestran que al analizar las vías de regulación de un grupo de
2000 genes modulados por luz, más de 50 de ellos (un 2,5 % ) son estrictamente regulados
por el estado redox de la PQ [Fey et al., 2005]. También ponen en evidencia la importancia
de la “vía redox” como fuente de señales retrógradas, ya que cerca de 300 genes (de
aproximadamente 3000 analizados) estarían directamente regulados por señales
generadas en el transporte electrónico fotosintético [Nott et al., 2006].
Lo que sí está claro es que la señal dependiente del estado redox del pool de PQ es
insuficiente para explicar el número de respuestas de aclimatación de la planta, de hecho,
el mismo cambio en el estado del pool de PQ se asocia a diferentes respuestas. Otras
señales que podrían estar involucradas incluyen a la relación ATP/ADP, el estado redox de
componentes del estroma, las tiorredoxinas y los azúcares (tratados más arriba). Se ha
demostrado que las TRX interactúan con la señalización vía PQ para regular la actividad de
una quinasa y es posible pensar que lo hagan para regular otros blancos [Walters, 2005].
Además de los cambios en el estado redox de sus componentes, el transporte
electrónico fotosintético también genera especies reactivas de oxígeno (ROS). El O2 puede
aceptar electrones del fotosistema I en lugar del NADP+, formando superóxido que es
convertido en peróxido de hidrógeno (H2O2) por la superóxido dismutasa. Además, la
clorofila excitada puede transferir energía al O2 para generar O2 singulete que vuelve a su
P á g i n a | 60
estado no‐excitado luego de transferir la energía a algún antioxidante como los
carotenoides [Nott et al., 2006]. ¿Son capaces las ROS de formar parte de una vía de
señalización desde el cloroplasto?
V. Especies reactivas de oxígeno como señales retrógradas
Dado que las reacciones fotoquímicas en el cloroplasto generan ROS es posible pensar
en éstas como una señal. El H2O2 y el oxígeno singulete son generados en el cloroplasto
por exposición a alta intensidad de luz. Debido a su naturaleza altamente reactiva, la
mayoría del oxígeno singulete parece encontrarse exclusivamente dentro del cloroplasto;
sin embargo, el exceso de H2O2 no eliminado por las peroxidasas puede difundir hacia el
citoplasma [Nott et al., 2006]. Cuando se exponen hojas de Arabidopsis thaliana a alta
intensidad de luz, el gen APX2 que codifica para una peroxidasa se activa. La infiltración de
una catalasa (otra enzima capaz de eliminar H2O2) en hojas expuestas a alta intensidad de
luz inhibe la inducción de APX2. Además, el tratamiento exógeno con H2O2 activa la
expresión de APX2 [Karpinski et al., 1999]. Si consideramos estos resultados en conjunto,
es lógico concluir que el H2O2, una especie reactiva de oxígeno, puede modular la
expresión de ciertos genes nucleares (fig. I13).
En la mutante flu de Arabidopsis thaliana, se acumula un intermediario de la
biosíntesis de clorofila en la oscuridad. El mismo actúa como fotosensibilizador. Por
consiguiente, cuando estas plantas son expuestas a la luz generan una gran cantidad de
oxígeno singulete, que a pesar de estar confinado al cloroplasto, induce la expresión de
genes nucleares diferentes a los modulados por el H2O2 [Pesaresi et al., 2007]. El efecto de
la producción de oxígeno singulete a nivel de la expresión génica nuclear fue analizado
con microarreglos que representan el 95 % del genoma de Arabidopsis thaliana y como
resultado, se encontraron 70 genes inducidos y 9 reprimidos por esta especie reactiva de
oxígeno [Beck, 2005].
Trabajos recientes han propuesto una interacción entre las señales dirigidas por el
oxígeno singulete y el peróxido de hidrógeno que tendría lugar modulando el estado
redox del pool de PQ. Se ha demostrado que el tratamiento con H2O2 promueve la
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P á g i n a | 62
Hace casi 30 años se propuso la existencia de un factor generado en el cloroplasto que
puede gatillar una vía de señalización retrógrada. Actualmente, a partir de estudios
genéticos y bioquímicos en diferentes organismos está claro que hay varias vías de
comunicación entre el cloroplasto y el núcleo [Nott et al., 2006].
Resumen de los antecedentes
La fotosíntesis es la conversión de la energía radiante a energía química y es llevada a
cabo por plantas, algas y ciertas especies de bacterias. Estos organismos soportan la vida
en la tierra al cosechar la luz solar poniendo en movimiento los ciclos del carbono, el
nitrógeno y el oxígeno [Puthiyaveetil et al., 2008]. Además de ser una fuente de energía, la
luz es para las plantas una fuente de información acerca de su entorno. Fitocromos,
criptocromos, fototropinas y la familia de fotorreceptores zeitlupe, capturan estas señales
del ambiente que proveen información temporal y espacial para el control del desarrollo y
el crecimiento [Strasser et al., 2010]. Resulta adaptativo que el cloroplasto, el lugar donde
ocurre la fotosíntesis en las plantas, controle y coordine la expresión de aquellos genes
nucleares cuyos productos van a cumplir funciones en el plástido. Desde su comienzo
evolutivo como una bacteria fotosintética endosimbiótica, el cloroplasto ha tenido que
desarrollar vías de comunicación retrógrada que le permitan controlar la expresión de
aquellos genes que ha cedido al genoma nuclear [Jarvis, 2007].
Para mi tesis doctoral he deseado evaluar si estas señales, ya sean las mediadas por
fotorreceptores o por las vías de señalización con origen en el cloroplasto, pueden
modular los patrones de splicing alternativo de algunos transcriptos en Arabidopsis
thaliana. No es ilógico pensar que los fotorreceptores puedan regular el proceso de
splicing. Los mismos forman parte de los speckles y, al menos en células de animales,
estos gránulos nucleares son reservorios o sitios de acumulación de diversos factores de
P á g i n a | 63
splicing y procesamiento del ARN [Kircher et al., 2002; Lamond y Spector, 2003]. Sin
embargo, la posibilidad de que el cloroplasto cuente con la capacidad de regular un
proceso ajeno, como es el splicing para un organismo procariótico, es como mínimo,
menos parsimoniosa. Por este hecho, deseo finalizar esta introducción con un dato: hay
2245 loci anotados del genoma de Arabidopsis thaliana en la base de datos tair
(www.arabidopsis.org) que están asociados al cloroplasto y que tienen 3099 transcriptos
diferentes asociados. Estos números implican que varios de los genes cuyos productos
cumplen alguna función en el plástido sufren splicing alternativo. Por lo tanto, tampoco es
ilógico pensar en la evolución de mecanismos que puedan controlar el proceso de splicing
para ajustarlo a las necesidades del cloroplasto.
P á g i n a | 64
Objetivo general (Capítulo I)
Evaluar la existencia de eventos de splicing alternativo regulados por la luz en
Arabidopsis thaliana e identificar la vía de señalización y los posibles mecanismos
involucrados en la modulación de tal proceso.
A partir de este objetivo general se desprenden una serie de objetivos particulares que
detallo a continuación:
Objetivos particulares (Capítulo I)
Evaluar la existencia de genes de Arabidopsis thaliana que posean eventos de
splicing alternativo regulados por la luz.
Analizar el rol que cumplen los fotorreceptores en el mecanismo de
modulación del procesamiento por luz.
Evaluar la capacidad de diferentes calidades e intensidades de luz de modular
los patrones de splicing de los transcriptos analizados.
Determinar si existe una señal retrógrada (cloroplasto a núcleo) que forme
parte de los mecanismos de regulación del splicing de los transcriptos
estudiados.
Identificar esa señal y componentes de la vía de señalización.
Evaluar la globalidad de los eventos de splicing alternativo regulados por esa
vía de señalización.
P á g i n a | 65
Metodología (Capítulo I)
Material vegetal y condiciones de crecimiento
Para la realización de la tesis se utilizaron mayormente líneas de Arabidopsis thaliana
del ecotipo Columbia (col). A menos que se indique lo contrario, se sembraron
aproximadamente 30 o 40 semillas equidistantes en cajas plásticas transparentes (40 x 33
mm, 15 mm altura) conteniendo alrededor de 4 ml de agar‐agua al 1‐1,5 % (p/v), y se
incubaron por 3‐4 días a 4 ºC en oscuridad. En algunos casos se utilizó un medio de
crecimiento de plantas (sales Murashige & Skoog –MS‐, MES, pH 5,7). Cuando se trabajó
con plantas adultas, se crecieron en macetas plásticas de 110 cm3 conteniendo una mezcla
de perlita, vermiculita y turba (1:1:0,5), y el riego se realizó con solución nutritiva
(Hakaphos Rojo, Compo) durante el período de crecimiento. La temperatura en las
cámaras fue mantenida en 22‐24 ºC. Las condiciones lumínicas en término de tiempos e
irradiancia, si bien varían para cada experimento y se detallarán según corresponda,
estuvieron regidas por dos protocolos principales:
El paso común a los dos protocolos es el crecimiento de las plantas antes de los
tratamientos. Primero se incuban las plantas/plántulas en luz continua por 1‐2 semanas.
En el caso de las plántulas, 1 semana de luz continua desde la germinación.
1. Pasan a oscuridad, o continúan en luz, por diferentes períodos de tiempo. En
los experimentos de intensidad de luz y de calidad, en vez de pasar las
plántulas a luz/oscuridad, se las incuba en la condición correspondiente.
2. Pasan todas a oscuridad por 48 hs. Luego de ese período las plántulas son
incubadas en luz/oscuridad por diferentes tiempos (de 3 a 6 hs ya se ve una
diferencia significativa en los efectos estudiados por lo que en general he
usado estos tiempos).
La figura M1 esquematiza los protocolos para aclarar las diferencias entre ellos.
P á g i n a | 66
El protocolo 1 es útil para analizar diferencias de base, como diferentes genotipos,
diferentes condiciones de crecimiento, etc. Fue utilizado un protocolo de este tipo (en
general con un período de oscuridad de 48 hs) para los experimentos cuyos resultados
muestran las figuras R2, R4, R5, R7, R9, R10, R13, R17, R18, R20, R21, R22, R24, R25 y la
tabla R1.
El protocolo 2 en cambio se adapta mejor a los experimentos que involucran drogas y
requieren tratamientos más cortos. Fue utilizado este protocolo para la generación de las
figuras R11, R12, R14, R15, R16, R23 y R26.
Además de semillas de Arabidopsis ecotipo col, también utilizamos: las líneas salvaje
Wassilewskija (ws) y Landsberg erecta (Ler), las sobre‐expresantes de flavodoxinas cedidas
por el grupo de Néstor Carrillo, la mutante de Kin10 (KIN10‐) y la sobre‐expresante
(KIN10+) cedidas por el Dr. Filip Rolland, las líneas mutantes obtenidas del SALK: phyA‐
211, phyB (SALK_069700), cry1 (SALK_069292), cry2‐1, y las cedidas por el grupo de Jorge
Figura M1: Esquema de los protocolos utilizados en los diferentes experimentos del Capítulo I de la tesis.
Aislamiento del ARN
P á g i n a | 67
Casal como hy5, hy4, y las dobles hy5‐hy4 y cry1‐cry2, las mutantes gun1 y gun5 cedidas
por el grupo de J. Chory, y la mutante de hexoquinasa 1 gin2 cedida por Jong‐Seong Jeon,
entre otras.
Fuentes de luz y tratamientos lumínicos
La luz blanca fue provista por tubos fluorescentes Philips o similares. Para los
experimentos en que se estudian los efectos de longitud de onda incidente sobre el
splicing, utilicé diodos que emiten luz en la longitud de onda deseada (Cavadevices). Se
usaron 3 módulos distintos de LEDs que emiten en luz blanca, de 470 nm y de 660 nm (luz
azul y roja, respectivamente). La intensidad de los mismos es cercana a los 100 µmoles de
fotón/m2seg a una distancia de 5‐10 cm de los LEDs. Para los experimentos de
intensidades de luz se utilizaron las fuentes ya descriptas y se dispusieron hojas blancas de
papel sobre las cajas de Petri con plántulas. A mayor cantidad de hojas, menor intensidad
de luz que llega a las plantas. Las intensidades fueron medidas con un luxómetro genérico
(mide en luxes) y con un fotómetro Li‐cor para evaluar los µmoles de fotón/m2seg.
Tratamientos con drogas y azúcares
Tratamiento con actinomicina D (ActD)
Medio de crecimiento
1A Micro + ½ macro componentes (Duchefa) 2,2 g/l
1x MS + vitaminas (Sigma) 1 ml
MES (Duchefa) 0,5 g/l
1 % (p/v) sacarosa 10 g/l
pH 5,7
Agar (Duchefa) 7 g/l
Se utilizaron 40 semillas por placa de Petri de 15 cm con 60 ml de medio de
crecimiento. Las plántulas fueron crecidas con la placa apoyada sobre su circunferencia
por 7 días en luz continua a ~200 µmoles de fotón/m2seg a 22 °C. Luego de ese período
P á g i n a | 68
fueron incubadas por 48 hs en oscuridad, tras lo cual se las trató con la droga y se las
incubó en luz u oscuridad por 3 y 6 hs más. Para efectuar el tratamiento las plántulas
fueron transferidas a placas de cultivo (de 12 pocillos de 6,9 ml) con 4 ml de medio líquido
con 0,5 X MS, 1 % (p/v) sacarosa, pH 5,7 y DMSO (vehículo) o 100 µg/ml ActD (A1410 de
Streptomyces sp., Sigma). Se aplicó vacío con un desecador y una bomba de agua por 10
min para acelerar la entrada del inhibidor transcripcional.
Tratamiento con actinomicina DCMU y DBMIB
Las plántulas fueron crecidas en placas de Petri de base rectangular (ver arriba) por 7
días en luz continua a ~100 µmoles de fotón/m2seg a 22 °C. Luego de ese período fueron
incubadas por 48 hs en oscuridad, tras lo cual se las trató con la droga y se las incubó en
luz u oscuridad por 6 hs más. Para efectuar el tratamiento las plántulas fueron transferidas
a placas de cultivo (de 6 pocillos) con 4 ml de H2O con etanol (vehículo) o la cantidad de
droga necesaria. DCMU y DBMIB (Sigma).
Tratamiento con azúcares
Las plántulas fueron crecidas en placas de Petri de 10 cm por 7 días en luz continua a
~100 µmoles de fotón/m2seg a 22 °C en medio agar‐(MS + MES + sorbitol o sacarosa)
(cantidades requeridas por el experimento). Luego de ese período fueron incubadas por
48 hs en oscuridad, o permanecieron en luz como control (protocolo 1). También
utilizamos el “Protocolo 2”, para lo que las plántulas fueron crecidas en agar‐agua sobre
un papel de filtro, incubadas en oscuridad por 48 hs, y transferidas posteriormente a un
nuevo medio agar‐(MS + MES + Sorbitol/Sacarosa) donde se las trató con luz/oscuridad
por 6 hs.
Tratamiento con H2O2
Las plántulas fueron crecidas en placas de Petri de base rectangular (ver arriba) sobre
un papel de filtro por 7 días en luz continua a ~100 µmoles de fotón/m2seg a 22 °C en
medio agar‐agua. Luego de ese período fueron transferidas a un nuevo medio con agar‐
P á g i n a | 69
H2O2 o agar‐agua e incubadas por 48 hs en oscuridad, o permanecieron en luz como
control (protocolo 1). También utilizamos la técnica de spray directo sobre las plántulas
sin transferirlas de un medio a otro. Se utilizó agua oxigenada genérica que se llevó a la
concentración deseada para los experimentos.
Cortes (sin empalmes) de las plántulas. Disecciones.
Para los experimentos en que evaluamos los patrones de splicing en los diferentes
tejidos de la planta (fig. R9), la disección se realizó con hojas quirúrgicas sobre un papel de
aluminio con la cara basal expuesta a una atmósfera gaseosa proveniente de nitrógeno
líquido.
Para los experimentos en que evaluamos el transporte de la señal (fig. R15 y R16) la
disección se efectuó directamente sobre el agar. Para esto las plántulas fueron crecidas en
placas de 10 cm en posición vertical (apoyadas sobre su circunferencia).
Análisis de splicing alternativo
Para evaluar la abundancia relativa de isoformas o la expresión de un determinado gen
el primer paso es la extracción del ARN total de las plántulas. La misma se llevó a cabo con
diferentes métodos según correspondiera. Utilizamos RNeasy Plant minikit (Qiagen) y
TRIzol (Invitrogen) o TRI‐Reagent (MRC). Se siguieron las instrucciones provistas por los
fabricantes. El primer paso es llevar el material vegetal a un fino polvo en un mortero con
nitrógeno líquido. El ARN purificado se sometió (en algunas oportunidades) a un
tratamiento con DNasa, empleando la enzima RQ1 RNase‐Free Dnase (Promega). A partir
de 1 µg de ese ARN (medido por fluorometría con Qubit de Invitrogen), se sintetizó ADNc
utilizando la enzima MMLV‐RT o la SuperScript III (Invitrogen), y oligo‐dT como primer
según el siguiente protocolo:
Transcripción Reversa
‐ Desnaturalización a 65 °C por 5 min de 1 µg de ARN en 5 µl de H2O.
‐ Pasaje rápido a hielo.
‐ Agregado de 15 µl de la mezcla de reacción a cada tubo.
P á g i n a | 70
La mezcla está compuesta por:
4 µl de buffer 5X de RT (Invitrogen)
0,2 µl de DTT 100 mM
0,25 µl de dNTPs 25 mM
0,5 µl de RNase OUT 40 U/µl (inhibidor de RNAsas de Invitrogen)
1,5 µl de enzima (MMLV‐RT 200 U/µl, Invitrogen)
H2O hasta completar 15 µl
‐ Incubación a 35‐37 °C por 1 hora para que proceda la retrotranscripción.
‐ 95 °C por 5 min o 75 °C por 10 min para detener la reacción desnaturalizando la
enzima.
El producto de esta reacción es el ADN copia o (ADNc) que servirá de molde para las
siguientes reacciones de PCR.
Para cuantificar la relación de isoformas de RSp31 y RCA utilizamos, en un comienzo, la
técnica de PCR semi‐cuantitativa (con radiactivo). La idea detrás de esta técnica es muy
similar a la de la PCR competitiva [Zentilin y Giacca, 2007; Zentilin y Giacca, 2010].
Brevemente, los primers utilizados son capaces de amplificar las diferentes isoformas
derivadas de un gen, se establece entonces cierta competencia de los moldes para con los
primers, por la cual más abundante será el producto de PCR específico de una isoforma en
particular cuanto más abundante sea como molde en la muestra (fig. M2). Posteriormente
pusimos a punto PCRs en Tiempo Real (qPCR) para los transcriptos derivados de estos
genes. Con esta técnica es necesario amplificar cada isoforma como un ARNm
independiente, evitando contaminaciones cruzadas con las otras (fig. M2).
P á g i n a | 71
Para obtener los patrones de splicing de los diferentes genes utilizando estas técnicas
seguimos los siguientes protocolos:
PCR radiactiva
A 2‐4 µl de ADNc resultante de la reacción de retrotranscripción se le agregan 48‐46 µl
de la siguiente mezcla de reacción de PCR:
‐ 5 µl de buffer de PCR 10 X sin MgCl2
‐ X µl de MgCl2 50 mM
‐ 2 µl de primers (directo y reverso) 20 µM
‐ 1 µl de dNTPs 10 mM
Figura M2: Esquema de las estrategias utilizadas para cuantificar la abundancia relativa de isoformas de un
evento de splicing alternativo. Se representan las estrategias de PCR radiactiva, dónde un mismo par de
primers (flechas naranjas) amplifica el ADNc derivado de las dos isoformas al mismo tiempo, los productos
deben ser posteriormente separados por una electroforesis para cuantificar la radiactividad de cada una de
las bandas (producto de PCR) y obtener las abundancias relativas de las isoformas en la muestra; y la PCR en
Tiempo Real, que utiliza diferentes pares de primers (flechas celestes y rojas) para amplificar el ADNc
derivado de cada isoforma por separado, obteniendo su abundancia (relativa a la curva patrón) en la
muestra.
P á g i n a | 72
‐ 0,3 µl de Taq polimerasa 5 U/µl (Invitrogen)
‐ 0,1 µl de [α‐32P]dCTP 10 µCi/µl, actividad específica de 3000 Ci/mmol
‐ H2O hasta completar volumen final de 50 µl
La cantidad de magnesio (X) se ajusta para cada par de primers (ver Apéndice de
primers), es decir, para cada PCR. Para RSp31 utilizo 3 µl de MgCl2 y para RCA 1 µl. De la
misma forma que varía la cantidad de magnesio a utilizar en cada PCR, varía el ciclado
térmico al que se somete la mezcla de reacción. Abajo detallo los programas a seguir para
una PCR que evalúe la abundancia relativa de isoformas para RSp31 y RCA que son las más
comunes a lo largo de la tesis.
Ciclado para RSp31
‐ 95 °C por 3 min
‐ 95 °C por 30 seg
‐ 63 °C por 30 seg
‐ 72 °C por 1 min
‐ 72 °C por 10 min
‐ 15 °C hasta retirar los tubos
Ciclado para RCA
‐ 95 °C por 3 min
‐ 95 °C por 30 seg
‐ 56 °C por 30 seg
‐ 72 °C por 45 seg
‐ 72 °C por 10 min
‐ 15 °C hasta retirar los tubos
Al finalizar la reacción de PCR radiactiva, se procede a separar los productos
corriéndolos en un gel de poliacrilamida 6‐8 % nativo. Luego de la corrida se seca el gel
sobre un papel Whatmann, se le colocan orientadores fluorescentes y se lo expone a una
película para generar una autorradiografía. De esta manera se pueden observar las bandas
correspondientes a los diferentes productos de PCR que son generados por la
amplificación del ADNc de las diferentes isoformas. Para cuantificar estos productos se
orienta la película sobre el gel ayudándonos con las marcas generadas por los
orientadores fluorescentes, se recortan las bandas correspondientes a los productos de
interés, y se cuenta la radiactividad que poseen utilizando un contador beta. Debido a que
utilizamos el isótopo 32P, que es un emisor beta de alta energía, podemos evitar el uso de
líquido de centelleo para amplificar la señal, y contamos la radiactividad con el método
Cerenkov, que es en seco.
X 30 veces X 30 veces
P á g i n a | 73
PCR en tiempo real o qPCR
Mezcla de reacción de PCR que se agrega a una dilución del ADNc:
‐ 2,5 µl de buffer de PCR 10 X sin MgCl2
‐ X µl de MgCl2 50 mM
‐ 2 µl de primers (directo y reverso) 20 µM
‐ 0,5 µl de dNTPs 10 mM
‐ 0,15 µl de Taq polimerasa 5 U/µl (Invitrogen)
‐ 0,025 µl de SyBR Green (Roche) dilución 1/30 en DMSO del stock
‐ H2O hasta completar volumen final de 25 µl
Nuevamente el magnesio se ajusta para cada par de primers (ver Apéndice de
primers). Para RCA, tanto la isoforma larga (L) como la corta (C) y el mensajero total
utilizan 2,5 µl de MgCl2 50 mM (la cantidad X de la mezcla de reacción), es decir, una
concentración 5 mM. Para RSp31 utilizo una concentración 3 mM para cada isoforma
(mRNA3 y mRNA1) y 5 mM para el total. Además se utiliza una curva de calibración
preparada con diluciones seriadas (1/2) de una mezcla de todos los ADNc que se van a
utilizar en la qPCR. El ADNc de cada muestra es diluido 30‐50 veces para que entre en el
rango de diluciones de la curva. Se utilizan 5 µl de ADNc diluido como molde de cada
reacción. Luego relativizo la expresión de una isoforma a la otra. El ciclado se realiza en
una máquina Eppendorf Mastercycler ep realplex y un programa típico sería el siguiente:
El rayo representa la lectura de
fluorescencia y el δ la curva de melting.
P á g i n a | 74
Esta es la clase de ciclado térmico que utilizamos para las diferentes qPCRs para RCA y
RSp31.
Análisis de expresión
Para las mediciones de expresión (mensajero total) utilizamos la técnica de qPCR. En
este caso se debe relativizar a un control externo la expresión del gen estudiado. Los
elegidos para tal fin fueron, Ef1c (un factor de elongación ribosomal), Ubi (ubicuitina),
Act8 (actina), que tienen niveles de expresión elevados y prácticamente constantes en
todas las condiciones probadas. Los detalles de la técnica son los mismos que para la
determinación del patrón de isoformas (ver ítem anterior).
Ensayo de GUS
Se utilizaron líneas transgénicas independientes de Arabidopsis thaliana con la
construcción promotor de RSp31 – GUS. Las plántulas fueron fijadas en acetona al 80% en
el hielo durante 30 min, se lavaron en solución de tinción de GUS (0,5 mM de ferricianuro
de potasio, 0,5 mM de ferrocianuro potásico, 100 mM de buffer fosfato de potasio, pH
7,0), a continuación, se las sumergió en la solución de tinción de GUS con 1 mM 5 ‐bromo‐
4‐cloro‐3‐indolil‐β‐D‐GlcU A, se incubaron a 37 ºC durante 24 hs. La clorofila se eliminó
mediante la sustitución de la solución de tinción con diferentes tiempos de inmersión en
etanol al 70% hasta que el color verde desapareció y la coloración azulada de GUS era
claramente visible.
Análisis de alta resolución de splicing alternativo: panel de RT‐PCR
Se utilizaron plántulas crecidas en placas de 10 cm con el protocolo de tratamiento
con azúcares. Se partió de ~100 mg de material para la extracción de ARN con el kit
RNeasy de Qiagen. Posteriormente se realizaron las reacciones de RT‐PCR siguiendo el
protocolo descripto por Craig Simpson y su colaboradores [Simpson et al., 2008]. En el
Apéndice detallo los primers utilizados (lista de primers del panel).
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P á g i n a | 77
relación de isoformas (fig. R3) sólo considero 2 de ellas, llamadas “mRNA3” y “mRNA1”,
debido a que la conocida como “mRNA2” es poco abundante en nuestro sistema (además,
actualmente sabemos que se degrada activamente por nonsense mediated decay o NMD
[Kim et al., 2009]).
Con el objetivo de verificar si este efecto de ausencia de luz era específico de algunos
mensajeros o se debía a un déficit generalizado en el splicing causado por la larga
exposición a oscuridad, probamos qué sucedía con los patrones de splicing de otros
transcriptos. En la figura R5 muestro lo que sucede en el caso de RSZ33, gen que codifica
para otra proteína SR. La misma, al ser sobre‐expresada, causa cambios en el splicing de
RSp31 [Simpson et al., 2008] lo que la convierte en un control interesante. Como se
observa, el protocolo de luz/oscuridad utilizado no genera cambios significativos en su
patrón de splicing. Lo mismo sucede con AtPP5 (que codifica para una fosfatasa de
proteínas) entre otros transcriptos evaluados (resultados no mostrados).
Figura R4: relación entre las isoformas
mRNA3/mRNA1 de RSp31 en función del
tiempo de incubación en luz u oscuridad.
Las barras corresponden a la media de 3
réplicas ± DE. Se muestra el resultado de
1 experimento típico.
Figura R5: relación entre las
isoformas larga y corta (L/C) de
RSZ33 en función del tiempo de
incubación en luz u oscuridad.
Las barras corresponden a la
media de 3 réplicas ± DE. Se
muestra el resultado de 1
experimento representativo.
0,0
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
1,2
0 0,5 1 24 48
mR
NA
3/m
RN
A1
Tiempo (hs)
RSp31Luz Osc
0,00
0,05
0,10
0,15
0,20
0,25
0,30
0,35
0 0,5 1 24 48
L/C
Tiempo (hs)
RSZ33
P á g i n a | 78
Figura R6: relación entre las isoformas
mRNA3 y mRNA1 de RSp31 luego de 51
hs de incubación en luz u oscuridad
(barras blanca y gris respectivamente) y
pasaje a luz por 3 hs luego de 48 hs de
oscuridad (barra con gradiente gris). Las
barras corresponden a la media de 3
réplicas ± DE. Se muestra el resultado de
1 experimento tipo.
En resumen, la abundancia relativa de isoformas de RCA y RSp31 es diferente en luz y
en oscuridad. Esto no es general ya que otros eventos de splicing alternativo evaluados no
presentan cambios. Se necesita una incubación prolongada (de 48 horas
aproximadamente) en oscuridad para observar efectos significativos.
La necesidad de una incubación prolongada en oscuridad planteó una serie de
interrogantes: ¿Es reversible el efecto? ¿La cinética es la misma al pasar de luz a oscuridad
que de oscuridad a luz? Como dije antes, temíamos que el tratamiento prolongado de
oscuridad causara efectos artefactuales. Si probáramos que se puede revertir el efecto
luego del período de oscuridad, al menos podríamos saber que no eliminamos las
respuestas a luz de la planta. Entonces decidimos crecer las plántulas en luz continua por
1 semana, incubarlas 48 horas en oscuridad, transferirlas a luz por diferentes tiempos y
extraer el ARN para ver las abundancias relativas de las isoformas de RCA y RSp31. La
figura R6 muestra lo que sucede en RSp31 (algo similar sucede con RCA aunque no se
muestra). Luego de 48 horas de oscuridad, la exposición a luz por 3 horas revierte el
efecto de la oscuridad en la acumulación relativa de las isoformas. Es decir, si bien se
necesitan 48 horas de oscuridad para que se haga visible un efecto a nivel de abundancia
de mensajeros, el pasaje de oscuridad a luz provoca cambios más veloces. Entonces, la
cinética no es la misma. Pero, ¿a qué se debe? Lo primero que pensamos es en la
posibilidad de que se tratara de un efecto transcripcional. En dicho caso, tomando a RSp31
como modelo, sería necesario que en oscuridad hubiera menos transcripción del gen y
0
0,5
1
1,5
2
2,5
Luz 51hs Osc 51hs Osc 48hs/Luz 3hs
mR
NA
3/m
RN
A1
Tratamiento
RSp31
P á g i n a | 79
Figura R7: muestran la expresión de RSp31 (A) y RCA (B) en luz y oscuridad relativizadas al
transcripto de la ubicuitina. Plántulas crecidas en luz continua por 1 semana y transferidas a
oscuridad por 48 horas o en luz como control. Barras: media y error estándar (n=3).
que la relación de isoformas se fuera alterando poco a poco (por degradación preferencial
de una isoforma sobre otra). En luz, debería aumentar significativamente la transcripción y
se debería generar, en proporción, más mRNA1 que mRNA3 para alcanzar la abundancia
relativa típica de esta condición en pocas horas (en luz el cociente de isoformas
mRNA3/mRNA1 es bajo). Para poner a prueba esta hipótesis fue necesaria la puesta a
punto de PCR’s en tiempo real para RCA, RSp31 y genes de expresión constitutiva con los
cuales relativizar. Como se puede observar (fig. R7 B) para RCA lo antedicho es posible;
cumple al pie de la letra con el modelo estipulado más arriba. La cantidad de transcripto
de RCA es baja en oscuridad y aumenta más de 10 veces en luz. Sin embargo, no es éste el
caso de RSp31 (fig. R7 A). A diferencia de lo que sucede con RCA, la expresión de RSp31 es
mayor en oscuridad y menor en luz. Esto último también es apoyado por el hecho de que
al generar plántulas de Arabidopsis thaliana con una construcción reportera que tiene al
promotor de RSp31 fusionado al ADN que codifica para la glucuronidasa (GUS) se observa
mayor actividad ‐y más diseminada‐ de esta enzima en oscuridad (fig. R8). Inclusive se
puede observar que, si bien en los cotiledones parece haber expresión guiada por el
promotor de RSp31 en plántulas crecidas en luz y oscuridad, en los primordios foliares
sólo hay expresión en oscuridad. Por lo tanto, un cambio en expresión como el que
propongo más arriba podría explicar lo que acontece con RCA pero no con RSp31.
A BRSp31
Luz Oscuridad0.0
0.5
1.0
1.5
2.0
2.5LuzOscuridad
Exp
resi
ón r
elat
iva
a U
bicu
itina
RCA
Luz Oscuridad0.0
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5LuzOscuridad
Exp
resi
ón r
elat
iva
a U
bicu
itina
P á g i n a | 80
En este punto nos preguntamos si las diferencias en el patrón de splicing alternativo
de RSp31 se podían explicar, en lugar de por diferencias de expresión, por splicing
alternativo específico de tejido. ¿Qué quiere decir esto? ¿Cómo explicaría las diferencias
observadas? Podríamos plantear el siguiente escenario: en el cotiledón la expresión es
constante y el cociente mRNA3/mRNA1 es bajo. En luz (donde sólo se detecta expresión
en los cotiledones), al aislar el ARN de toda la plántula observamos un cociente bajo; en
cambio, en oscuridad se expresa también en los primordios foliares o en las “hojas
nuevas” donde el cociente mRNA3/mRNA1 es alto y se ve una relación intermedia –la
abundancia relativa de las isoformas observada en la plántula entera será un promedio
pesado del cociente en cada tejido y su nivel de expresión‐. ¿Es ésta la base de los efectos
que observamos? Para responder la pregunta realizamos una disección de la plántula
previa al aislamiento del ARN separando los cotiledones del resto de la plántula. En la
figura R9 se observa que el efecto del cambio en la abundancia relativa de las isoformas
de RSp31 es común a los diferentes tejidos de la plántula. Esto indica que los efectos
observados no se deben a diferencias en el cociente de cada tejido y la expresión en los
mismos.
Figura R8: La coloración azulada
característica de la expresión de
glucuronidasa a partir del reportero
promotor-RSp31:GUS en una plántula
de 1 semana crecida en luz (A) u
oscuridad (B). Fotos de Maria Kalyna.
A B
P á g i n a | 81
En conclusión, el cambio en el cociente mRNA3/mRNA1 de RSp31 se da en las
diferentes partes de la plántula en respuesta a la incubación a luz o a oscuridad.
2. La intensidad de la luz ‐y no su calidad‐ influye sobre el patrón de
splicing alternativo de RSp31 y RCA
Hasta aquí demostramos que la luz tiene un efecto sobre la transcripción y el
procesamiento de RSp31 y RCA, sin embargo, no está claro cómo la plántula percibe el
estímulo y lo traduce en esos cambios. Dado que los efectos son a nivel de expresión
nuclear, lo primero que pensamos es que la luz debería estar siendo percibida por los
fotorreceptores, fitocromos y/o criptocromos. Con el objetivo de probar si los
fotorreceptores son los encargados de “ver” la luz y transducir la señal al núcleo,
utilizamos mutantes de los mismos que deberían comportarse como “ciegas” en respuesta
a la luz. Esto, que pareció muy sencillo en su concepción, fue bastante difícil de realizar.
Los mutantes de fotorreceptores causan problemas en el desarrollo de las plántulas y en
sus respuestas a la luz [Mazzella et al., 2001]. Sus efectos son pleiotrópicos y por lo tanto
difíciles de controlar. A pesar de esto, repetimos la suficiente cantidad de veces el análisis
como para tener confianza en los resultados. La figura R10 muestra lo que sucede con el
patrón de splicing alternativo de RSp31 en respuesta a luz en plántulas con
fotorreceptores mutados. Podemos observar que se comportan como la planta salvaje, es
decir, son capaces de “ver” la luz y transducir esta señal. Esto implica que de los
fotorreceptores; los fitocromos A y B, y los criptocromos 1 y 2; no estarían relacionados
Figura R9: la abundancia relativa de las
isoformas de RSp31 es diferente en cada
tejido, sin embargo, el efecto “luz vs.
oscuridad” es visible en cada parte de la
plántula. Plúmula: parte de la plántula que
corresponde a los primordios foliares. Las
barras representan la media de 3 réplicas ±
DE. Se muestra el resultado de 1 experimento
típico.
0,33
3,83
0,13
1,74
0,12
1,86
00,5
11,5
22,5
33,5
44,5
luz osc
mR
NA
3/m
RN
A1
RSp31plúmula plántula sin plúmula cotiledón
P á g i n a | 82
Figura R10: A) Muestra la abundancia relativa de las isoformas de RSp31 en mutantes de fitocromo B (phyB9),
doble mutante de fitocromos (phyAB) y la mutante del criptocromo 1 (cry1) en el entorno genético salvaje
Columbia (Col). B) Ídem (A) para mutantes de criptocromo1 (hy4), un factor de transcripción de la vía de
fitocromo A (hy5) y la doble entre ellos; en el entorno genético salvaje Wassilewskija (ws). C) Ídem (A) con doble
mutante de criptocromos 1 y 2 en entorno salvaje Landsberg erecta (Ler). Las barras corresponden a la media de
3 réplicas ± DE. Se muestra el resultado de 1 experimento representativo.
con la señalización lumínica que altera la abundancia relativa de isoformas de RSp31 en
respuesta a transiciones de luz/oscuridad.
En vista de que los efectos de la luz parecen ser independientes de los
fotorreceptores, decidimos ver qué sucede con diferentes calidades de luz
fotosintéticamente activas. Para ello, utilizamos como fuente de iluminación módulos de
LEDs que emiten en longitudes de onda acotada (470 nm o azul y 660 nm o rojo). Es
importante destacar que si el efecto de la luz blanca se reprodujera exclusivamente con
luz roja, nos llevaría a establecer una relación entre la luz y el splicing por medio de
RSp31
Col phyB9 phyAB cry10.0
2.5
5.0
7.5
10.0
12.5
LuzOscuridad
genotipo
mR
NA
3/m
RN
A1
RSp31
ws hy5 hy4 hy5 hy40.0
0.5
1.0
1.5
2.0
2.5 LuzOscuridad
genotipo
mR
NA
3/m
RN
A1
RSp31
Ler cry1-cry20
1
2LuzOscuridad
genotipo
mR
NA
3/m
RN
A1
A
B
C
P á g i n a | 83
fitocromos, en cambio si se reprodujera sólo con luz azul, se relacionaría con los
criptocromos. Al exponer las plántulas a las diferentes longitudes de onda y comparar con
el control de luz blanca, fuimos capaces de determinar que ambas calidades de luz (las dos
longitudes de onda) causan el mismo efecto en el splicing de RSp31 (fig. R11). Dado este
resultado decidimos que era interesante ver qué sucedía en un experimento que
combinara los mutantes de receptores lumínicos y los LEDs. Principalmente, nos resultaba
interesante ver qué ocurre con las plántulas mutantes de fitocromos al exponerse a luz
roja y con las de criptocromos al incubarse con luz azul. Como se puede observar en la
figura R12, las luces roja y/o azul, causan el mismo efecto que la blanca en las plántulas
salvajes y en las mutantes. En resumen, el efecto de las transiciones luz/oscuridad sobre el
procesamiento de los transcriptos de RSp31 no es exclusivo de una calidad de luz y no
requiere la presencia de los fitocromos A y B, y los criptocromos 1 y 2.
Para RCA fuimos capaces de establecer que las plántulas salvajes responden de la
misma manera a luz blanca, que a roja o azul, con respecto a la abundancia relativa de las
isoformas L y C (no mostrado).
Figura R11: el efecto de la luz blanca (barra
blanca) sobre la abundancia relativa de las
isoformas de RSp31 es el mismo con luz azul
(barra azulada) y/o con luz roja (barra roja)
frente a oscuridad (barras grises). Las barras
corresponden a la media de 3 réplicas ± DE.
Se graficó el resultado de 1 experimento
típico.
0
0,5
1
1,5
2
2,5
mR
NA
3/m
RN
A1
Calidad de Luz
RSp31
P á g i n a | 84
Dado que la calidad de la luz (a longitudes de onda perceptibles y utilizables por la
planta) no tiene un efecto crucial sobre los cambios en los patrones de splicing alternativo
de los eventos estudiados, nos preguntamos qué sucedía con la intensidad de la luz y el
splicing alternativo de RSp31 y RCA. Con el objetivo de determinar si diferentes
intensidades lumínicas causan efectos distintos en la abundancia relativa de las isoformas
de los genes mencionados, expusimos las plántulas a diferentes intensidades de luz
blanca. Los resultados de tal experimento (fig. R13) nos indican que a medida que la
intensidad de luz disminuye el cociente mRNA3/mRNA1 de RSp31 o L/C de RCA se hacen
más parecidos a los de oscuridad pero de manera “dosis dependiente”, siendo la “dosis” o
la cantidad de fotones que inciden en una superficie en un dado tiempo, lo que determina
la cantidad que hay de una isoforma y otra de RCA y RSp31.
En resumen, la intensidad de la luz incidente (y no la calidad) es lo que determina el
patrón de splicing alternativo de RCA y RSp31. Junto al análisis que realizamos con los
mutantes, es posible agregar que la vía regular de transducción de señales lumínicas a
cargo de los fotorreceptores no es necesaria para explicar el efecto de la transición de
luz/oscuridad sobre la expresión y el procesamiento de RCA y RSp31.
Figura R12: el efecto de la luz blanca
sobre la abundancia relativa de las
isoformas de RSp31 es el mismo con
luces de diferente longitud de onda y
en diferentes mutantes. NM: No Medido. Las barras corresponden al
promedio de 3 réplicas ± DE. Se
muestra el resultado de 1
experimento representativo.
Genotipos ídem fig. R10.
0
2
4
6
8
10
12
Col phyB9 phyAB cry1
mRNA3/m
RNA1
Genotipo
RSp31Blanca Roja Azul Oscuridad
NM NM NM
P á g i n a | 85
Figura R13: efecto de la intensidad de la luz sobre el patrón de splicing alternativo de RSp31 y RCA. La intensidad de
luz creciente está representada en la escala de grises de las barras. Las barras corresponden a la media de 3 réplicas y
el error estándar. Se muestra el resultado de 1 experimento representativo.
3. El cloroplasto percibe la luz y transmite la señal al núcleo generando
el cambio en la abundancia relativa de isoformas de RSp31
Los resultados anteriores indicarían que debemos dejar fuera a los fotorreceptores
como los principales sospechosos detrás de la vía de señalización luminosa que estamos
investigando. Entonces nos preguntamos qué otro “receptor” lumínico podría estar
funcionando para esta vía. Un candidato fuerte es el cloroplasto debido a que, como
sabemos, percibe la luz y la transforma en energía química a través del proceso de
fotosíntesis, y además tiene la capacidad de generar señales que alteran la expresión de
genes nucleares [Koussevitzky et al., 2007]. Con el objetivo de evaluar si el cloroplasto es
el responsable del efecto que observamos en el cambio de splicing sobre RSp31
comenzamos a utilizar drogas que alteran la funcionalidad del mismo. El diurón o DCMU
(3‐(3,4‐diclorofenil)‐1,1‐dimetilurea) es un herbicida que inhibe el transporte electrónico
fotosintético absorbiendo los electrones del fotosistema II antes del pool de
plastoquinonas. Al tratar plántulas de Arabidopsis thaliana con esta droga y someterlas al
protocolo de luz/oscuridad, se observa una inhibición del efecto de la luz sobre el cociente
RSp31
0.2 1 2.2 14 800
1
2
3
mol fotón/m 2 seg
mR
NA
3/m
RN
A1
RCA
0.2 1 2.2 14 800.0
0.5
1.0
1.5
mol fotón/m 2 seg
L/C
mRN
oscu
L
de la
relat
4.
D
alter
que é
prev
camb
espe
luz/o
NA3/mRNA1
ridad (fig. R
La conclusió
a señal lum
iva de las is
La seña
Debido a q
rnativo de R
ésta no pos
ia al aislam
bio se daba
rábamos,
oscuridad au
1 de RSp31
R14) a medi
ón del resul
mínica que
soformas de
al viaja de
que los clo
RSp31, es c
see cloropla
miento del A
a sólo dond
en la raíz
unque con u
. En particu
da que aum
tado anteri
posteriorm
e RSp31.
e la hoja a
oroplastos s
oherente e
astos. Decid
ARN, para s
de hay clo
también
una cinética
ular, el coc
menta la con
ior indica q
mente es tr
a la raíz
serían los
esperar que
dimos enton
separar las
roplastos. O
hay un ca
a diferente
Fig
del
de
bar
rép
1 e
ciente de lu
ncentración
ue el cloro
raducida en
responsabl
e tal efecto
nces hacer
raíces de la
Observamo
ambio en
(fig. R15).
gura R14: efe
l agregado de
splicing alte
rras correspo
plicas ± DE. Se
experimento tí
uz se hace
n de droga u
plasto sería
n el cambio
es del cam
no se obse
una disecci
a parte verd
os que, a d
respuesta
P á g
ecto dosis de
DCMU sobre
rnativo de Ronden a la m
e graficó el res
ípico. * p<0,0
más pareci
utilizada.
a el sensor/
o en la abu
mbio en el
erve en la r
ión de las p
de y así def
iferencia d
a la trans
i n a | 86
ependiente
e el patrón
RSp31. Las
media de 3
sultado de
05.
ido al de
/receptor
undancia
splicing
raíz dado
plántulas,
finir si el
e lo que
ición de
P á g i n a | 87
Figura R15: efecto del tratamiento de luz/oscuridad en hojas y raíces separadas después del mismo. Las
barras corresponden a la media de 3 réplicas ± DE. Se muestra el resultado de 1 experimento
representativo.
Este resultado plantea 2 escenarios posibles. Uno de ellos involucraría a un factor,
independiente del cloroplasto, capaz de percibir la luz en la raíz y generar los efectos que
observamos. Otro escenario posible es que la señal de luz que se está generando en los
cloroplastos sea, de alguna manera, capaz de moverse por la planta, llegar a la raíz y
producir allí un efecto similar en el patrón de splicing alternativo de RSp31 que el que
tiene lugar en las hojas. De ser esta la explicación sería esperable que, si la raíz es
separada del resto de la planta antes del tratamiento de luz/oscuridad, no se visualice un
cambio en ésta (dado que el tejido dónde se origina la señal sería incapaz de
transferírsela). Efectivamente, esta es lo que observamos al realizar el experimento; como
se ve en la figura R16, al separar las raíces del resto de la planta antes del tratamiento de
luz u oscuridad por diferentes tiempos, no se evidencia un cambio en la abundancia
relativa de las isoformas de RSp31 en la raíz como sucedía cuando se trataba la plántula
entera (fig. R16).
En resumen, se puede concluir que la luz es captada en las hojas de Arabidopsis por los
cloroplastos, éstos generan una señal que se traduce en un cambio en la expresión y el
procesamiento de RSp31 en el núcleo. Esta misma señal (u otra generada también en el
tejido verde) es capaz de viajar y transmitir la información de las transiciones de
luz/oscuridad a la raíz y los núcleos de sus células. Si se interrumpe la conexión entre el
0,00,10,20,30,40,50,60,70,80,9
2hr 4hr 6hr
mR
NA
3/m
RN
A1
Tiempo de Tratamiento (Luz/Osc)
RaícesRSp31 (disección post-tratamiento)
Luz Oscuridad
0,0
0,5
1,0
1,5
2,0
2,5
2hs 4hs 6hs
mR
NA
3/m
RN
A1
Tiempo de Tratamiento (Luz/Osc)
HojasRSp31 (disección post-tratamiento)
Luz Oscuridad
P á g i n a | 88
órgano que genera la señal y un órgano que no la genera, se anula el efecto de
luz/oscuridad sobre el splicing alternativo en el último.
5. Identificación de la señal que transmite el cloroplasto que provoca el
cambio en la expresión y el splicing alternativo de RSp31
Con la idea de identificar qué señal generada por el cloroplasto en repuesta a luz está
causando los cambios a nivel de transcripción y procesamiento de RSp31, comenzamos a
analizar las diferentes vías de señalización retrógrada conocidas (Introducción Capítulo I,
El lenguaje del cloroplasto).
a) Vía de la expresión génica y vía de los tetrapirroles.
El laboratorio de Joanne Chory aisló en los últimos años un grupo de mutantes
llamadas gun por “genomas desacoplados” (genomes uncoupled) que presentan grandes
disrupciones en la señalización cloroplasto‐núcleo [Surpin et al., 2002; Jarvis, 2007].
Decidimos probar estos mutantes bajo nuestro protocolo de luz/oscuridad.
Figura R16: efecto del tratamiento de luz/oscuridad en hojas y raíces separadas antes del mismo. Las
barras corresponden a la media de 3 réplicas ± DE. Se muestra el resultado de 1 experimento
representativo.
0,0
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
1,2
2hs 4hs 6hs
mR
NA
3/m
RN
A1
Tiempo de Tratamiento (Luz/Osc)
HojasRSp31 (disección pre-tratamiento)
Luz Oscuridad
0,0
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
1,2
2hr 4hr 6hr
mR
NA
3/m
RN
A1
Tiempo de Tratamiento (Luz/Osc)
RaícesRSp31 (disección pre-tratamiento)
Luz Oscuridad
P á g i n a | 89
Como se observa en la figura R17, los mutantes gun1 y gun5 presentan el mismo
efecto luz/oscuridad sobre el splicing alternativo de RSp31 que las plantas salvajes, por lo
tanto, GUN1 y GUN5 no están relacionadas con la transducción de esta señal lumínica.
Además, probamos lo que sucedía en la mutante abi4 (ABI4 es un factor de transcripción
“río abajo” de la señalización de los GUN) obteniendo resultados similares (no mostrado).
En resumen, la vía de señalización retrógrada defectuosa en las mutantes gun1 y gun5
no estaría involucrada en la transducción de la señal luminosa que altera la abundancia de
isoformas de RSp31. GUN 5 está relacionado con la vía de biosíntesis de la clorofila o vía
de los tetrapirroles. GUN1 en cambio, estaría involucrado en la vía retrógrada de
respuesta a la expresión génica del cloroplasto. Es interesante destacar aquí que el uso de
Tagetina (inhibidor de la ARN polimerasa III, presente en cloroplastos) no provocó
diferencias en respuesta al tratamiento de luz/oscuridad (no mostrado).
En conclusión, las vías de los tetrapirroles y de la expresión génica del cloroplasto no
son necesarias para la señalización lumínica que genera los cambios a nivel de splicing
alternativo de RSp31.
b) Vía de las especies reactivas de oxígeno.
De las señales que emite el cloroplasto (ver Introducción, fig. I10), continuamos
estudiando la posibilidad de que la causante de los efectos hasta aquí descriptos, fuera
alguna señal relacionada a reacciones de óxido‐reducción o a especies reactivas de
Figura R17: respuesta de mutantes gun en
el patrón de splicing de RSp31. Barras
claras, luz; barras grises, oscuridad. Las
barras corresponden a la media de 3
réplicas ± DE. Se muestra el resultado de 1
experimento representativo.
0
2
4
6
8
col gun 1 gun 5
mR
NA
3/m
RN
A1
Genotipo
RSp31Luz Oscuridad
P á g i n a | 90
oxígeno que son generadas normalmente en la cadena de electrones fotosintética. La
primera aproximación para probar esta posibilidad consistió en tratar a las plántulas con
peróxido de hidrógeno (H2O2) con dos métodos de aplicación distintos (fig. R18) bajo un
protocolo en el que las plántulas crecieron 7 días en luz continua y fueron luego expuestas
a oscuridad, con o sin peróxido por 48 hs. Después de ese tiempo las transferimos
nuevamente a luz ‐o permanecieron en oscuridad‐ hasta su procesamiento para aislar el
ARN (aproximadamente 6 hs).
La figura R18 muestra que la presencia de H2O2 en oscuridad simula el efecto de la luz,
provocando que los cocientes mRNA3/mRNA1 de oscuridad con tratamiento sean
similares a los de luz. Podemos concluir que el agregado de H2O2 simula el tratamiento
con luz sugiriendo un posible rol de esta molécula en la transmisión de la señal que
estamos estudiando.
Si bien el peróxido de hidrógeno, que se puede generar a partir de superóxido de una
manera poco controlada durante el proceso de transporte de electrones fotosintético o
respiración [Neill et al., 2002], puede actuar como molécula señalizadora es, además, uno
de los responsables principales del daño oxidativo. Esto último hace evidente que pueda
causar efectos a varios niveles, y por esta capacidad pleiotrópica decidimos seguir
investigando sobre esta hipótesis. Para tal fin utilizamos plántulas de Arabidopsis que
Figura R18: efecto del peróxido de
hidrógeno en el patrón de isoformas
de RSp31. Barras blancas, luz; barras
grises, oscuridad. H202: spray de
peróxido 1 % (v/v) sobre plántulas.
H2O2 W: peróxido 0,5 % (v/v) en el
agar. Las barras corresponden a la
media de 2 réplicas ± DE. Se muestra
el resultado de 1 experimento.
0
1
2
3
4
5
- H2O2 H2O2 W
mR
NA
3/m
RN
A1
RSp31
P á g i n a | 91
sobre‐expresan flavodoxinas [Tognetti et al., 2007] bacterianas que nos fueron cedidas
por el Dr. Néstor Carrillo y su grupo. Las líneas utilizadas acumulan las flavodoxinas en el
cloroplasto, las cuales tienen la capacidad de disminuir la cantidad de ROS frente a
diferentes estímulos y/o estreses, comparadas con una planta salvaje [Tognetti et al.,
2006].
Expusimos plantas salvajes (Col) y plantas sobre‐expresantes de flavodoxina (fld) a
nuestro protocolo de luz y oscuridad. Como se ve en la figura R19, no hay diferencias
mayores entre el comportamiento de diferentes líneas sobre‐expresantes y el de plantas
salvajes con respecto al cambio en la abundancia de las isoformas de RSp31.
En resumen, plántulas con una mayor capacidad de eliminar ROS se comportan frente
al efecto de la luz, de manera similar a las salvajes por lo que es poco probable que las
ROS generadas en el cloroplasto en respuesta a la luz tengan un efecto sustancial en el
patrón de splicing de RSp31. Esto es consistente con lo observado al usar metil‐viológeno
(MV), una droga capaz de generar grandes cantidades de especies reactivas de oxígeno
dentro del cloroplasto. La idea era generar H2O2 directamente en la organela para ver el
efecto del mismo en el lugar que se originaría en respuesta al tratamiento de luz. Su
utilización no provocó cambios significativos en la respuesta de RSp31 a la intensidad de
luz (datos no mostrados).
Figura R19: efecto de la sobre-
expresión de flavodoxinas bacterianas
en el cociente mRNA3/mRNA1 de
RSp31. Las barras corresponden a 1
planta (n=1) por condición. Todas las
líneas fld sobre-expresan flavodoxinas.
Col es la salvaje o no sobre-expresante. 0,0
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
1,2
1,4
Col fld 18.18 fld 18.27 fld 19 fld 42
mRNA3/m
RNA1
RSp31Luz Osc
P á g i n a | 92
En conclusión, el agregado exógeno de H2O2, bajo ciertas condiciones, produce un
efecto sobre el splicing alternativo de RSp31 que es similar al que produce el tratamiento
de luz. Sin embargo, por lo visto más arriba, no podemos descartar la posibilidad de que
se trate de un efecto indirecto.
c) Fotosíntesis y azúcares.
Dado que los productos finales de la fotosíntesis suelen modular la velocidad de las
reacciones bioquímicas en el cloroplasto modificando la expresión y actividad de las
enzimas involucradas, decidimos enfrentar a las plantas al protocolo de luz/oscuridad
agregando azúcares exógenamente. Así podríamos evaluar si estos productos
fotosintéticos están implicados en las variaciones de expresión y/o procesamiento de
RSp31.
Como muestra la figura R20, si crecemos las plántulas de Arabidopsis directamente en
sacarosa 7 % (p/v), el efecto de las transiciones luz/oscuridad sobre el splicing de RSp31 se
ve inhibido. El cociente mRNA3/mRNA1 de RSp31 en oscuridad en plántulas crecidas en
sacarosa es similar al cociente observado en luz (con o sin sacarosa). Un efecto similar se
observa si las plántulas crecen en un medio sin azúcares, y se las transfiere al momento
del tratamiento de luz/oscuridad, a un medio nuevo con o sin azúcares (no mostrado).
Todo esto implica que el agregado de sacarosa simula el tratamiento con luz en las
condiciones de ensayo.
Figura R20: efectos del agregado de
sacarosa en el cociente mRNA3/mRNA1 de
RSp31. Las plántulas fueron crecidas en
sacarosa 7 % (p/v), sacarosa 3,5 % (p/v) y
sorbitol 1,8 % (p/v) o sorbitol 3.6 % (p/v)
como control de osmolaridad. Las barras
corresponden a la media de 3 réplicas ± DE.
Se graficó el resultado de 1 experimento
representativo. 0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
0,7
0,8
0,9
1
Sorbitol ~3,6% Sor~1,8% + Sac~3,5% Sacarosa ~7%
mRNA3/m
RNA1
RSp31
Luz Osc
P á g i n a | 93
Dado que se cuenta en la actualidad con varias líneas mutantes y sobre‐expresantes
de genes involucrados en las vías de señalización por azúcares, decidimos que era
pertinente probar si alguna de ellas interfería con la señal que pretendemos describir. Las
proteína‐quinasas KIN10 y KIN11, muy conservadas evolutivamente, regulan la
transcripción en respuesta a oscuridad, azúcares y estrés en ciertas condiciones. Por
ejemplo, la sobre‐expresión de KIN10 confiere mayor tolerancia al hambreado [Baena‐
Gonzalez et al., 2007]. Decidimos entonces enfrentar líneas sobre‐expresantes y mutantes
para KIN10 a nuestro protocolo de luz/oscuridad. La figura R21 muestra los resultados
obtenidos. Como es posible observar, no hay un comportamiento diferencial de las
plantas transgénicas en comparación a la planta salvaje, es decir, la proteína KIN10 no
está involucrada en la vía de señalización que produce el cambio en el patrón de splicing
de RSp31 en respuesta a transiciones luz/oscuridad.
En las plantas, cuyas vidas giran en torno a la producción de azúcar a través de la
fotosíntesis, la glucosa se ha convertido en un regulador clave de muchos procesos vitales,
incluyendo la germinación, el desarrollo de las plántulas, la fotosíntesis, la floración,
respuestas de estrés, etc. La hexoquinasa 1 (HXK1) tiene una función única en un amplio
espectro de respuestas de glucosa [Moore et al., 2003]. La mutante glucose insensitive2
(gin2‐1) de Arabidopsis ayudó a definir las funciones de señalización y fisiológicas de
Figura R21: efectos de la sobre-expresión
y de la mutación de KIN10 sobre el
cociente de isoformas de RSp31. Ler es la
línea salvaje o control, Kin10(-) es la
mutante de KIN10 y Kin10(+) la sobre-
expresante. Las barras corresponden a la
media de 3 réplicas ± DE. Se muestra el
resultado de 1 experimento
representativo. 0
2
4
6
8
Ler Kin10(‐) Kin10(+)
mRNA3/m
RNA1
RSp31 Luz Osc
P á g i n a | 94
HXK1. Aquí nos valemos de la misma para determinar si la vía de la señalización por
hexoquinasas está involucrada en la regulación del splicing alternativo de RSp31 en
Arabidopsis thaliana. Como se puede observar en la figura R22, la mutante se comporta
de la misma forma que el control, es decir, el efecto de las transiciones de luz/oscuridad
sobre RSp31 es independiente de la HXK1.
La conclusión hasta aquí es que el agregado de sacarosa, en condiciones de oscuridad,
produce un efecto similar al del tratamiento con luz. Al agregar sacarosa al 7 % (p/v) se
inhibe parcialmente el efecto sobre el splicing de RSp31 que causan las exposiciones a
transiciones de luz/oscuridad.
d) Estado de óxido‐reducción del pool de plastoquinonas y expresión génica
del cloroplasto.
Hasta aquí descartamos 2 vías de señalización (relacionadas a la expresión de genes
del cloroplasto y a la biosíntesis de clorofila) y tenemos sospechas de un rol en la
regulación del splicing alternativo de RSp31 para otras 2 (relativas a las especies reactivas
de oxígeno y a los azúcares). De estas últimas he presentado evidencias algo encontradas
sobre su papel en la señalización lumínica. No podemos negar que el agregado de H2O2 y
el de sacarosa, generan un cambio sobre la transcripción y el procesamiento de RSp31. Sin
embargo no fuimos capaces de encontrar evidencias que sugieran un efecto directo de
estos compuestos sobre la regulación que ejerce la luz sobre RSp31. Sabemos que estos
Figura R22: comportamiento de la mutante
gin2 de la HXK1 sobre el cociente de
isoformas de RSp31. Ler es la línea salvaje o
control, gin2 es gin2-1 la mutante de HXK1.
Las barras corresponden a la media de 3
réplicas ± DE. Se muestra el resultado de un
experimento típico.
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
1,2
1,4
1,6
1,8
Ler gin2
mRNA3/m
RNA1
Genotipo
RSp31Luz Osc
P á g i n a | 95
compuestos interactúan modificando el estado redox de diferentes componentes de la
cadena de transporte electrónico fotosintético [Tognetti et al., 2006; Laloi et al., 2007;
Jeong et al., 2010]. Por consiguiente, quizás sus efectos sean consecuencia de dicha
cadena.
De lo expuesto hasta aquí surgió el interrogante de si el pool de plastoquinonas es el
responsable principal en la cascada de señalización que intentamos caracterizar.¿Cómo
abordamos esta posibilidad?
Anteriormente describí los efectos del DCMU o diurón sobre el splicing alternativo del
mensajero de RSp31 y cómo actuaba el herbicida sobre el cloroplasto (fig. R14). Existe otra
droga, llamada DBMIB (2,5‐dibromo‐3‐metil‐6‐isopropilbenzoquinona) que inhibe el
transporte electrónico fotosintético como el DCMU pero en un punto diferente. Su acción
es posterior, en la cadena de transporte electrónico fotosintético, al pool de
plastoquinonas y ocasiona que el mismo quede reducido al no poder ceder sus electrones
al complejo del citocromo b6/f (ver Introducción fig. I12).
Si el estado redox del pool de plastoquinonas está relacionado al efecto de la luz sobre
el splicing alternativo del mensajero de RSp31 es de esperar que el DCMU y el DBMIB
tengan efectos distintos. El DCMU debería inhibir el efecto de la luz, lo que ya sabemos
que sucede (fig. R14) y el DBMIB debería exagerar el efecto de la luz o no tener efecto
aparente. Esto es efectivamente lo que sucede si sometemos plántulas al protocolo de
luz/oscuridad tratadas o no con DCMU y DBMIB (fig. R23 A).
Este resultado es indicativo pero no comprueba por sí mismo de modo fehaciente la
posibilidad de que el pool de plastoquinonas esté involucrado en la regulación del splicing
de RSp31. Algunos controles realizados nos indican que el resultado es correcto ya que el
DBMIB estaría funcionando. Esta droga reprime, de la misma manera que lo hace el
DCMU, la inducción por luz del gen PORc (Protochlorophyllide Oxidoreductase c) cuyo
producto está involucrado en la síntesis de clorofila [Oosawa et al., 2000] (fig. 23 B). Es
inter
espe
L
PQ e
Figu
la e
conc
resu
resante des
ramos obse
La conclusió
es el respons
ura R23: efecto
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0
0,5
1
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2
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4
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mRNA3/m
RNA1
A
B
dado que
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(µM). Las barr
presentativo. B
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B) Ubi, ubicui
RSp3Luz
idad no ha
.
dencia de la
or la luz en l
el patrón de srol/vehículo (
nden a la medi
itina. * p<0,1.
31Osc
ay transpo
a figura R23
la expresión
splicing altern
(-) y las can
ia de 3 réplica
.
P á g
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3, es que e
n de RSp31.
nativo de RSpntidades creci
as ± DE. Se m
i n a | 96
ónico, no
l pool de
.
p31 (A) y
entes de
muestra el
P á g i n a | 97
6. Extensión del análisis:
¿Cuántos eventos de splicing alternativo pueden ser modulados por
transiciones de luz/oscuridad?
Con el fin de conocer el alcance de las señales de luz sobre la modulación del splicing
alternativo en Arabidopsis thaliana decidimos someter los ARN derivados de nuestro
protocolo de tratamiento en luz/oscuridad a un análisis de alta resolución en colaboración
con el laboratorio de John Brown y Craig Simpson en Dundee, Escocia. Utilizando su panel
de RT‐PCR [Simpson et al., 2008] evaluamos 96 eventos de splicing alternativo en
muestras derivadas de plántulas expuestas a luz u oscuridad, con sacarosa o sorbitol como
control energético y de osmolaridad.
Aproximadamente el 40 % de los eventos de splicing alternativo evaluados mostró
diferencias en respuesta a las transiciones luz/oscuridad (tabla R1 y Apéndice, tablas A‐C).
Un porcentaje mínimo de los que cambian, el 4 % , lo hacen sólo en sacarosa o sólo en
sorbitol. El hecho de que más del 80 % de los eventos afectados cambien tanto en sorbitol
como en sacarosa indica que la mayoría de los eventos de splicing alternativo que
responden a transiciones de luz/oscuridad, lo hacen respondiendo a la presencia/ausencia
de ese estímulo independientemente del nivel de azúcares, o del nivel energético de la
plántula.
Para el caso de RSp31, donde el panel no fue conclusivo, la RT‐PCR radiactiva indica
que la sacarosa al 7 % (p/v) inhibe parcialmente las diferencias entre luz y oscuridad (fig.
R22), y a un 3,5 % (p/v) de sacarosa el efecto ‐si bien más bajo‐ se observa perfectamente.
Entonces, a pesar de que la sacarosa es capaz de anular los efectos de las transiciones de
luz/oscuridad, no sería un efecto de hambreado de las plántulas lo que causa esas
diferencias, dado que es posible seguir viendo un efecto aún en presencia de sacarosa al
3,5 % (p/v).
P á g i n a | 98
Tabla R1: análisis global de splicing alternativo con un panel de RT-PCR. Para la confección de la tabla tomamos
como parámetros de cambio una diferencia entre el cociente “isoforma X/isoformas posibles” (dónde X es la
isoforma más pequeña) de luz y de oscuridad, mayor al 5 % (en valor absoluto) y con un valor p < 0,1. De los 96
eventos del panel se eliminaron los dos constitutivos del análisis y se desglosaron aquellos eventos múltiples
(combinaciones de 5’ss, 3’ss, retención de intrón, y/o exones cassette -o salteado exónico-) dando lugar a 100
eventos totales.
Tabla R1 N° de
eventos
Sin
cambio
Cambian en
las dos
condiciones
Sólo cambian
en Sorbitol
Sólo cambian
en Sacarosa
Cambian
entre
Sorbitol y
Sacarosa
Cambian
en
alguna
condición
5'ss 28 17 10 1 0 4 11
3'ss 48 27 18 2 1 2 21
Retención
de intrón
12 9 1 1 1 0 3
Exón
cassette
12 6 4 1 1 0 6
Total 100 59 33 5 3 6 41
Sería interesante ver qué sucede con los eventos que cambian entre luz y oscuridad si
agregamos DCMU y DBMIB, para determinar cuántos cambian en respuesta a señales
retrógradas y, particularmente, cuántos son regulados por la vía de señalización
relacionada el estado redox del pool de PQ.
A pesar de que estos resultados requieren análisis futuros, podemos en este punto
extraer dos conclusiones muy importantes para nuestros hallazgos sobre la regulación del
splicing alternativo en Arabidopsis thaliana en respuesta a las transiciones de
luz/oscuridad. Una de ellas es que el protocolo utilizado no altera profundamente las
respuestas de la planta, sólo causa efectos sobre algunos eventos de splicing particulares y
éstos no dependen, en su mayoría, del estado energético o de reservas de la planta. La
otra
difer
meca
T
mod
camb
respu
pued
alter
Fi
al
re
un
va
pa
ag
O
conclusión
rencias en
anismo sea
Trabajaremo
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rnativo con
igura R24: (A
lternativo en
egulador de spn 3’ss alterna
aría en respu
ara KIN11, el
gregado de sa
Osc, sacarosa o
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varios even
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os en los p
r diferentes
en las cond
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. La figura
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A-C) diferente
respuesta a
splicing) y pre
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oscuridad. Bar
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R24 (A‐D) m
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Luz, sorbitol y
rras, media ±
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plicing abrie
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de la planta
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n respuesta a
scuridad. C) Arega sacarosa
esta a luz/oscu
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z oscuridad
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eventos de
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i n a | 99
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que sean
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s de splicing
proteína SR,
12790, posee
otro 3’ss que
9160, codifica
más varía por
scuridad; Sac
g
P á g i n a | 100
Figura R25: efecto de la intensidad de la luz
sobre la abundancia de transcriptos totales
de RSp31. Se normaliza con respecto a
Ef1C como gen constitutivo (House-Keeping). La intensidad de luz creciente
está representada en la escala de grises de
las barras. Las barras corresponden a la
media de 3 réplicas y el desvío estándar
(DE) correspondiente. Se muestra 1
experimento representativo.
Algunas particularidades del evento estudiado
Debido a que la abundancia del mensajero total de RSp31 es mayor a menor
intensidad de luz (fig. R25) ‐lo opuesto a lo que sucede con el mensajero de RCA, dato no
mostrado‐, que este hecho está de acuerdo con la actividad del promotor de RSp31
medida con la actividad del reportero GUS (fig. R8), y que presenta un cambio del patrón
de splicing muy veloz (tan solo 3 horas) en el sentido de mayor “actividad transcripcional”
al de menor; decidimos evaluar la posibilidad de que una de las isoformas (probablemente
mRNA3) estuviera siendo rápidamente degradada en luz. Esto explicaría por qué
detectamos una menor cantidad de mensajero total en esta condición, y sería una forma
posible de generar un cambio veloz en la relación mRNA3/mRNA1 en condiciones de baja
actividad transcripcional.
Para tal fin utilizamos actinomicina D, un conocido inhibidor de la transcripción
[Goldberg et al., 1962; Goldberg et al., 1963]. La hipótesis de trabajo es la siguiente: la
inhibición de la transcripción provoca un efecto similar al de la luz, dado que este estímulo
parece inhibir la actividad del promotor de RSp31, permitiendo la rápida degradación del
mRNA3 para generar un patrón de splicing similar al de luz. El esquema experimental fue
el siguiente: se crecieron las plántulas en luz continua durante 7 días, se las transfirió a
oscuridad por 48 hs, al final de ese período se agrego actinomicina D o vehículo a las
placas correspondientes en oscuridad, se incubo por un período más de 2 hs en oscuridad
para permitir que la droga entre a las células de las plantas (se aplicó vacío en el comienzo
0
1
2
3
4
5
0,2 1 2,2 14 80
RSp
31/Ef1C
Intensidad de Luz (umol de fotón/m2seg)
RSp31
P á g i n a | 101
Figura R26: efecto de la actinomicina D en la
abundancia relativa de isoformas de RSp31.
Luego de 48 hs de oscuridad las plantas
fueron tratadas por 3 o 6 hs con/sin la droga.
Las barras corresponden a la media de 3
réplicas ± DE correspondiente. Se muestra el
resultado de 1 experimento representativo.
de este período para facilitar el ingreso), y finalmente fueron tratadas en luz u oscuridad
por 3 y 6 hs. Sorpresivamente, lo que observamos fue el patrón opuesto al esperado (fig.
R26). La actinomicina D inhibe significativamente el efecto de la luz sobre el splicing
alternativo de RSp31 y mantiene una relación mRNA3/mRNA1 elevada, similar a la que se
observa en oscuridad.
La conclusión más directa de este experimento nos dice que para observar el efecto de
la luz necesito la transcripción de algún gen (nuclear o del cloroplasto).
Considero que estos resultados son sujeto de diferentes interpretaciones. A pesar de
esto, cuando desgloso cada una de ellas llego a un mismo punto. Dado que uno de los
efectos de la luz sobre RSp31 es una caída abrupta en la actividad de su promotor,
podríamos pensar que el cambio en el cociente mRNA3/mRNA1 está causado por la
desestabilización de la isoforma mRNA3 bajo esta condición. Además, de ser estos efectos
mediados por un mecanismo de degradación, el mismo debe ser “activo”, ya que al
parecer, algún factor debe transcribirse para que ocurra la desestabilización/degradación
del ARN específico. Es interesante destacar que la actinomicina D aumenta el cociente
mRN3/mRNA1 por encima de los niveles “basales” de oscuridad. Esto se debe a que en
presencia de la droga el mRNA3 es “más estable” en luz, y también en oscuridad, lo que
puede deberse a que no se eliminó completamente durante el período de 48 hs de
oscuridad al factor que “lleva el mRNA3 a degradación”. Quizás la desaparición lenta de
0
0,5
1
1,5
2
2,5
3
3,5
4
sin ActD 3h con ActD 3h sin ActD 6h con ActD 6h
mRNA3/m
RNA1
RSp31Luz Osc
P á g i n a | 102
este factor en plántulas en oscuridad, y su aparición rápida en luz, explique la cinética de
los cambios del splicing alternativo de RSp31.
También pudimos evaluar lo que sucede con RCA en ausencia de transcripción.
Utilizando el mismo esquema experimental que el descripto para RSp31 observamos que,
para ver los efectos inducidos por la luz sobre el splicing alternativo de RCA, es necesaria
la transcripción. Es decir que al agregar actinomicina D no hay efecto de la luz sobre el
splicing de los transcriptos de este gen (datos no mostrados).
P á g i n a | 103
Discusión (Capítulo I)
La luz y su efecto sobre el splicing alternativo
Las figuras R2 y R4 muestran que si se exponen plántulas crecidas de 1 a 2 semanas en
luz continua a un tratamiento de oscuridad por diferentes períodos de tiempo, ese
tratamiento causa cambios en los patrones de splicing de los transcriptos de RSp31 y
RCA, a partir de las 24 o 48 hs (comparado a un control en luz continua). Esto no sucede
con otros eventos de splicing como los de los transcriptos de RSZ33 y AtPP5 (fig. R5), lo
que implica una cierta especificidad del efecto. Además, es interesante destacar que el
efecto se observa tanto en plantas juveniles de Arabidopsis thaliana, como en plantas
adultas, florecidas, y en diferentes tejidos de las mismas, incluyendo hojas aisladas
(resultados no mostrados). Es decir, el efecto no depende del desarrollo de la planta, si
bien puede presentar algunas variaciones en los distintos estadios y tejidos.
Debido a que el tratamiento en oscuridad va en detrimento de las reservas
acumuladas por la planta y podría generar un estrés energético, era importante probar
que después del mismo las plantas ‐o plántulas‐ respondieran a luz y siguieran siendo
viables. La figura R6 muestra que con 3 hs de exposición a luz blanca después del
tratamiento de oscuridad, es tiempo suficiente para que la relación de isoformas de RSp31
sea nuevamente la observada en una planta expuesta a luz continua durante todo su
desarrollo. El fenómeno es reversible. Sin embargo, la cinética de la variación en el patrón
de splicing de RSp31 y RCA en la dirección luz‐oscuridad es más lenta (de 24 a 48 hs) que
en la dirección oscuridad‐luz (~3 hs).
Esto último es muy interesante y vale la pena discutirlo en mayor detalle. Para RCA,
encontramos mayor abundancia de transcriptos en luz (fig. R7 B). Es probable que la
mayor tasa de transcripción establezca rápidamente un cociente L/C pequeño que es el
correspondiente al tratamiento de luz. En oscuridad, caería la transcripción y el cociente
iría cambiando paulatinamente hasta ser significativamente distinto del de luz al cabo de
P á g i n a | 104
~48 hs. Una leve diferencia en las estabilidades de las distintas isoformas (L y C), o un
procesamiento diferencial en las condiciones de oscuridad (que genere en proporción más
isoforma L que en luz) para los pocos transcriptos que se generen en esta condición,
podrían explicar las diferencias observadas. Sin embargo, la cantidad de transcripto total
de RSp31 es mayor en oscuridad que en luz (fig. R7 A) por lo que las deducciones hechas
para RCA no son aplicables en este caso. Es importante destacar que la actividad del
promotor de RSp31 (fig. R8) medida por su fusión a GUS, es coherente con los datos de
abundancia de mensajero total del gen medido por PCR en tiempo real (Real Time PCR). Es
decir, habría una menor tasa de transcripción en oscuridad. Cómo se explica entonces la
diferencia en las cinéticas de respuesta a la luz/oscuridad en el patrón de splicing de
RSp31. Una posibilidad es que haya algún compuesto que se sintetiza y acumula en luz, y
deja de hacerlo cuando la planta está en oscuridad, desapareciendo lentamente. Este
compuesto actuaría como una señal ‐o un intermediario de la señal‐ que gatilla los
cambios en el splicing alternativo de RSp31 en respuesta a las transiciones de
luz/oscuridad (discuto un poco esto en base a los resultados de las figuras R25 y R26 de la
sección previa de resultados).
No discutiré en detalle lo que sucede con los transcriptos de RCA, debido a que el
efecto de la luz sobre su evento de splicing alternativo ha sido marginal en la mayoría de
los experimentos. Debido a que el panel de RT‐PCR (tabla R1, fig. R24 A‐D y tablas A‐B del
apéndice) indica que numerosos eventos de splicing alternativo de Arabidopsis thaliana
son afectados por transiciones de luz/oscuridad, tomaré como modelo de los mismos al
evento del gen RSp31. Sólo mencionaré a RCA cuando le confiera un valor agregado a lo
que sucede con la regulación del splicing alternativo o la transcripción de RSp31.
El ca
tejid
E
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R9 m
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n a | 105
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La figura
gar en los
cias en el
encias de
s efectos
P á g i n a | 106
Los fotorreceptores, criptocromos y fitocromos, no están involucrados en la
vía de señalización lumínica que cambia la abundancia relativa de
isoformas de RSp31
Habiendo resuelto y confirmado que el cambio en los patrones de splicing alternativo
de RCA y RSp31 ocurre en los diferentes tejidos de la plántula en respuesta a transiciones
de luz/oscuridad, decidimos tratar de identificar la vía de señalización involucrada. La
primera vía que ensayamos la de los fotorreceptores. Es decir, nuestra hipótesis es que
algún fotorreceptor percibe la luz, transduce la señal al núcleo, y altera la
transcripción/splicing de RSp31. El corolario de esta hipótesis sería que mutantes del
fotorreceptor/fotorreceptores deberían comportarse como “ciegas” a la luz, o sea, el
cociente mRNA3/mRNA1 no debería variar entre luz y oscuridad. Además, el patrón de
isoformas de la mutante debería ser similar al que presenta la planta salvaje en oscuridad.
Como muestra la figura R10, la mutante doble de criptocromos (cry1 y cry2), la mutante
doble de fitocromos (phyA y phyB), como las mutantes simples, y una mutante doble para
criptocromo 1 (hy4) y un factor de transcripción asociado a la vía de los fitocromos (hy5),
todas ellas responden de manera similar a la planta salvaje cuando se enfrentan a nuestro
protocolo de luz/oscuridad. Esto implicaría que los fotorreceptores ensayados, y en las
combinaciones particulares probadas, no estarían involucrados en el efecto de la luz
sobre el splicing alternativo de RSp31. Tampoco estaría involucrado en esta vía de
señalización el factor de transcripción HY5. Si bien se lo asocia a la vía de los fitocromos,
HY5 es un regulador clave de la fotomorfogénesis cuya abundancia se regula a nivel de
estabilidad de la proteína. En oscuridad, HY5 es marcado para degradación proteolítica
por COP1 (una E3 ligasa de ubicuitina). En luz, este proceso es inhibido, en parte, por la
acción de CRYs, posiblemente por el purgado de COP1 del núcleo [Gyula et al., 2003].
Los factores de transcripción como HY5 funcionan como puntos de convergencia e
integración de señales de las ramas principales de todos los fotorreceptores [Jiao et al.,
2007], el hecho de que la mutante hy5 se comporte como la plántula salvaje nos permite
descartar con mayor nivel de confianza el rol de esta vía de señalización en la regulación
P á g i n a | 107
del splicing alternativo de RSp31. Resulta interesante destacar en este momento que, de
manera similar a COP1, el complejo de señalización COP9 (CSN, COP9 signalosome) es otro
regulador clave de las respuestas a luz y el desarrollo. Inclusive, las mutaciones que
causan deficiencias en COP1 o en CSN generan el mismo fenotipo de fotomorfogénesis
constitutiva típico de las mutantes cop/det/fus [Schwechheimer y Deng, 2000; Wang et al.,
2009]. Esto se debe a que la interacción de E3 ligasas de ubicuitina como COP9 con CSN es
necesaria para la actividad de las mismas, de allí que los sustratos de degradación de las
E3 ligasas se encuentren estabilizados en mutantes csn [Dohmann et al., 2008]. Si bien no
muestro los resultados, las mutantes de csn que nos cedió Claus Schwechheimer, tampoco
evidencian diferencias de respuesta (con la planta salvaje) a las transiciones de
luz/oscuridad a nivel de splicing de RSp31.
En resumen, los integradores de las vías de señalización de los fotorreceptores (ver
fig. I9), COP/DET/FUS y HY5, no participan de la señalización lumínica que causa los
cambios en la abundancia relativa de isoformas de RSp31.
¿Hay alguna diferencia en el efecto causado sobre el splicing alternativo de
RSp31 cuando se utilizan calidades de luz incidente distintas?
No conformes con esto, decidimos evaluar si alguna longitud de onda captada por la
planta era más eficiente en producir el efecto que otra, es decir, si el cambio en el splicing
alternativo de RSp31 era causado por la calidad de luz. Utilizamos módulos de LEDs para
exponer las plántulas a una longitud de onda particular y acotada. La figura R11 muestra
que el efecto de luz de 470 nm (azul) y de 660 nm (roja) de longitud de onda, es similar al
causado por la luz blanca de un tubo fluorescente o de un módulo de LEDs que emite en
blanco. Además, la mutante doble para fitocromos (phyA y phyB) “ve” luz roja, como la
mutante cry1 “ve” luz azul en lo referido a la regulación del splicing de RSp31 (fig. R12).
Como conclusión general, y a modo de resumen de lo dicho hasta aquí, el efecto de la
luz sobre el splicing alternativo de RSp31 no está mediado por fotorreceptores y –
coherentemente con esto‐ no está modulado por la calidad de la luz perceptible y
P á g i n a | 108
fotosintéticamente activa. Esto último quiere decir que si la luz tiene la capacidad de ser
captada y aprovechada por la planta, en lo que se refiere al cambio en el patrón de
splicing de RSp31, no se observan diferencias significativas entre una longitud de onda y
otra (ej.: rojo y azul).
Los cambios inducidos por la luz en el patrón de splicing alternativo de
RSp31 son modulados por la intensidad de la luz incidente
Antes de usar los módulos de LEDs utilizábamos tubos fluorescentes con acetatos de
colores como filtros para tratar las plantas con luces de longitudes de onda acotada.
Algunas veces, cuando la luz de los tubos no era muy intensa y el filtro (acetato)
bloqueaba el paso de una alícuota importante de fotones haciendo aún menor la
intensidad, no observábamos diferencias entre luz y oscuridad. Esto nos dio la pauta de
que la intensidad podía tener que ver con los efectos que estudiamos. La figura R13
muestra que, efectivamente, la intensidad de luz blanca afecta el patrón de splicing
alternativo de RCA y de RSp31 de forma “dosis‐dependiente”. De la misma forma, la
intensidad de la luz afecta la abundancia de mensajeros totales de RCA (no mostrado) y
RSp31 (fig. R28).
La evidencia reunida hasta este momento parece indicar que el mecanismo que
genera la molécula o factor que transmite la señal lumínica no diferencia entre luz roja y
azul (fig. R11 y R12); pero sí tiene la capacidad de detectar diferencias en la intensidad (fig.
R13). Además, ya descartamos a los fitocromos, criptocromos, y factores “río abajo” de los
mismos como posibles candidatos para la transmisión de esta señal. Todo nos conduce a
un nuevo sospechoso, el cloroplasto.
El cloroplasto está involucrado en la respuesta del gen RSp31 a las
transiciones de luz/oscuridad
Un primer indicio que apuntó en esa dirección provino de un experimento en el que
las plántulas crecidas en luz fueron tratadas con kanamicina. Este antibiótico inhibe la
traducción llevada a cabo por ribosomas 70S de los procariotas, y de mitocondrias y
P á g i n a | 109
cloroplastos (según la teoría endosimbiótica, de origen procariótico). Plántulas tratadas
desde la germinación de la semilla con cantidades crecientes de la droga muestran un
cociente mRNA3/mRNA1 de transcriptos de RSp31 similar al de plántulas en oscuridad
(resultados no mostrados).
La primera aproximación utilizada para investigar el papel del cloroplasto en la
regulación del splicing alternativo de RSp31 fue el tratamiento de las plántulas con el
herbicida DCMU. Observamos que el efecto de la luz sobre el cociente mRNA3/mRNA1 de
RSp31 disminuye (causando que el patrón de splicing en luz sea más parecido al de
oscuridad) a medida que aumenta la concentración de DCMU, con un efecto notorio a
partir de 1 µM de droga (fig. R14). Por consiguiente, el funcionamiento del transporte
electrónico fotosintético es necesario para que las transiciones de luz/oscuridad causen
un cambio en el patrón de splicing alternativo de RSp31. Resultados similares se
obtuvieron con atrazina, otro herbicida que al igual que el DCMU inhibe el pasaje de
electrones desde el fotosistema II al pool de PQ (no mostrado).
Como conclusión de lo dicho anteriormente se puede decir que es necesario un
“cloroplasto funcional” para observar un efecto causado por las transiciones de
luz/oscuridad. Esto sugiere un posible rol del cloroplasto y alguna señal retrógrada en el
efecto de la luz sobre el splicing de RSp31, por lo tanto, comenzamos a indagar esta
hipótesis seriamente.
Es interesante remarcar que como resultado del tratamiento con DCMU no se obtiene
en la práctica, en nuestras manos, una inhibición completa del efecto de la luz. Esto se
puede deber a un transporte residual de electrones en ciertos cloroplastos a los que no
llega la droga, o a que se requiera una mayor concentración de la misma (pocas veces
probamos más de 10 µM y no obtuvimos resultados satisfactorios), entre otras
posibilidades.
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P á g i n a | 111
Es necesario destacar que podrían superponerse a los efectos de las transiciones de
luz/oscuridad los causados por el daño mecánico sobre la plántula (wounding) al que,
RSp31 es “sensible” (comunicación personal de Maria Kalyna y Andrea Barta, datos no
publicados). Esta clase de estrés genera grandes cantidades de especies reactivas de
oxígeno en el lugar donde ocurre y además, luego de un tiempo, genera ROS a nivel
sistémico [Orozco‐Cardenas y Ryan, 1999; Orozco‐Cardenas et al., 2001; Neill et al., 2002].
Sin embargo, no observamos cambios en los controles de plántulas en oscuridad a lo largo
del tiempo en las partes cortadas y aisladas de las plántulas.
Me permito entonces, habiendo hecho las salvedades pertinentes, resumir los
resultados previos sobre la regulación del splicing alternativo de RSp31 de la siguiente
forma: la luz es captada en las hojas de Arabidopsis por los cloroplastos, éstos generan
una señal que se traduce en un cambio en la expresión y el procesamiento de RSp31. Esa
misma señal sería capaz de viajar y de transmitir la información de las transiciones de
luz/oscuridad a las células de la raíz.
Habiendo arribado a esta conclusión, decidimos tratar de identificar la/s señal/es
generada/s en el cloroplasto que puede/n alterar el procesamiento de un gen nuclear
como RSp31. Ya mencioné en la introducción de este capítulo, y también en la sección de
resultados, que se ha acumulado evidencia a favor de la existencia de, al menos, 5 vías
diferentes (aunque algo relacionadas) de señalización retrógrada (fig. I10). Sólo para
tenerlas en mente las enumeraré otra vez: intermediarios de la biosíntesis de la clorofila,
expresión génica del plástido, especies reactivas de oxígeno o ROS, señalización por
azúcares, y estado redox de la cadena de transporte electrónico fotosintético [Zhang et
al., 2010].
P á g i n a | 112
Intermediarios de la biosíntesis de clorofila y expresión génica del plástido
Se sabe que existe una señal derivada del plástido que depende de su actividad
transcripcional/traduccional y que es esencial para su biogénesis. Sin embargo, los efectos
de los inhibidores de la expresión génica del cloroplasto a nivel nuclear sólo se pueden
observar si el tratamiento se realiza dentro de una ventana temporal de 3 días post‐
germinación [Sullivan y Gray, 1999; Pogson et al., 2008]. Es probable que el efecto que
observamos al aplicar kanamicina sea consecuencia de un defecto general en el desarrollo
o la biogénesis del cloroplasto, y no a un efecto específico de la inhibición de una señal
generada por la expresión de genes de la organela. Esto se condice con el hecho de que
cuando tratamos las plántulas sólo durante el período de incubación en luz/oscuridad,
después de haberlas crecido en luz continua por 1 semana o más sin kanamicina, no
observamos diferencias entre tratadas y control. Lo mismo sucedió cuando usamos
tagetina, un inhibidor específico de la transcripción del cloroplasto, en lugar de
kanamicina (no mostrado).
Debido a que la kanamicina fue el puntapié inicial en la demostración de un rol para el
cloroplasto en la vía de señalización lumínica que induce cambios en la transcripción y en
el procesamiento de RSp31, debemos considerar la hipótesis de que la expresión génica
del plástido sea, en sí misma, causante de la señal retrógrada. Como discutimos
anteriormente, GUN1 estaría implicada en esa vía de señalización. Sin embargo, la
mutante gun1 se comporta como la planta salvaje respecto del splicing alternativo de
RSp31 (fig. R17). Lo mismo sucede con las mutantes del factor de transcripción ABI4, que
actúa “río abajo” de GUN1 (resultados no mostrados).
ABI4 también actuaría “río abajo” de GUN5. Los resultados expuestos en la figura R17
también muestran que las plántulas mutantes gun5, presentan cambios similares en el
patrón de splicing de RSp31 a los obsevados en las plantas salvajes. Este resultado es
consistente con lo observado para las mutantes abi4. GUN5 funciona junto a GUN4 en la
biosíntesis de clorofila [Mochizuki et al., 2001; Larkin et al., 2003] y es esencial en esa vía
biosintética.
P á g i n a | 113
Tomando estos resultados en conjunto podemos concluir que la vía de señalización de
los tetrapirroles (GUN5, ABI4) y la relativa a una señal generada por la expresión génica
del cloroplasto (GUN1, ABI4), no están relacionadas con la que genera la respuesta de
RSp31 a la luz.
Especies reactivas de oxígeno (ROS)
La evolución de procesos metabólicos aeróbicos, como la respiración y la fotosíntesis,
conllevan la generación de especies reactivas de oxígeno en mitocondrias y cloroplastos
[Laloi et al., 2007]. Concluimos antes que es necesario un cloroplasto funcional,
fotosintéticamente activo, para que se observe un efecto de la luz sobre el procesamiento
de RSp31. Además, la diferencia entre los patrones de splicing de RSp31 en oscuridad y luz
aumenta con la intensidad de la luz incidente (fig. R13) y es esperable que lo mismo
suceda con la producción de ROS en el cloroplasto, es decir, que se generen más especies
reactivas a mayor flujo de electrones por la cadena fotosintética. Este conjunto de hechos
e ideas relacionadas nos llevó a plantear la hipótesis de que una especie reactiva de
oxígeno fuera la causante de los efectos estudiados. Considero importante agregar aquí,
que cada vez que una réplica experimental (ej.: 30 plántulas en una placa de Petri) “luce
estresada”, con una coloración rojiza por la generación de antocianinas fotoprotectoras, o
con un aspecto deteriorado, no detectamos diferencias en los patrones de splicing de
RSp31 en luz y oscuridad (el cociente mRNA3/mRNA es similar al de luz en cualquier
condición). Se ha reportado que el estrés genera un aumento remarcado de ROS en el
cloroplasto [Laloi et al., 2007] y esta sería una correlación más a favor de la hipótesis
planteada.
Consistentemente, cuando tratamos exógenamente plántulas con peróxido de
hidrógeno vemos que el mismo simula el efecto de la luz en plantas mantenidas en
oscuridad (fig. R17).
A pesar de que hasta aquí todas las piezas parecen encajar, no debemos ignorar que el
peróxido de hidrógeno a nivel sistémico puede estar causando efectos indirectos [Noctor
P á g i n a | 114
et al., 2000] e inclusive, puede estar afectando otra vía de señalización. Por ejemplo, se ha
reportado que el tratamiento con H2O2 promueve la oxidación del aceptor primario de
electrones del pool de PQ (llamado QA) aumentando el flujo de electrones desde el
fotosistema II [Laloi et al., 2007]. Esta característica pleiotrópica del peróxido nos llevó a
analizar los posibles efectos de las especies reactivas de oxígeno con otras aproximaciones
para tener un mayor nivel de certeza acerca de los comportamientos observados.
Al utilizar plántulas de Arabidopsis thaliana que sobre‐expresan flavodoxinas no
observamos diferencias significativas entre su comportamiento y el de plantas salvaje con
respecto al cambio en la abundancia relativa de las isoformas de RSp31 (fig. R19). Las
plantas sobre‐expresantes tienen mayor resistencia a todo tipo de estrés [Tognetti et al.,
2006] probablemente por una mayor capacidad de eliminar ROS. Debido a que estas
plantas que presentarían niveles de ROS más bajos se comportan como la salvaje, es poco
probable que las especies reactivas de oxígeno sean mediadores de la señal lumínica para
los efectos sobre la transcripción y el procesamiento de RSp31. A esta línea de evidencia le
podemos sumar los datos informados personalmente por Maria Kalyna y Andrea Barta.
Ellas observaron que en hojas dañadas mecánicamente (estrés que aumenta la cantidad
de ROS en el lugar del daño), hay un incremento de la actividad del promotor de RSp31
(como sucede en oscuridad, no en luz), y el patrón de splicing de las primeras horas post‐
daño es el de un cociente mRNA3/mRNA1 elevado similar al de oscuridad (datos no
publicados, comunicación personal). El metil‐viológeno, una droga que debería aumentar
la cantidad de ROS generados en el cloroplasto [Donahue et al., 1997], tampoco produjo
cambios significativos en la respuesta de RSp31 a la luz (no mostrado). Por último, cuando
tratamos las plántulas con ascorbato, un poderoso anti‐oxidante que actuaría en el
cloroplasto principalmente en la remoción de peróxido de hidrógeno formado en el
fotosistema I por la foto‐reducción del oxígeno [Smirnoff y Wheeler, 2000; Smirnoff et al.,
2001], tampoco observamos diferencias con respecto al control en ninguna de las
concentraciones probadas (datos no mostrados).
P á g i n a | 115
En conclusión ‐y a modo de resumen‐ probamos que el agregado exógeno de
peróxido de hidrógeno, en ciertas condiciones, simula el efecto que produce la luz sobre
el procesamiento de RSp31, pero numerosos controles adicionales indican que lo más
probable es que lo haga de manera indirecta. Los resultados con las plantas que sobre‐
expresan flavodoxina (fig. R19), y los tratamientos con MV y ascorbato (no mostrados),
indican que es poco probable que una especie reactiva de oxígeno esté involucrada
directamente en la vía de señalización que le permite a la luz modular la expresión de
RSp31.
Señalización por azúcares
Es evidente que tras 48 hs de tratamiento en oscuridad, los niveles de azúcares de la
planta pueden caer. Existe una gran variedad de estudios que utilizan cultivos celulares,
raíces y hojas aisladas, que muestran que cuando éstas son incubadas en oscuridad puede
observarse la inducción de un grupo de genes llamados DIN (Dark Induced). Esta inducción
puede ser inhibida por el agregado de azúcar al medio [Fujiki et al., 2000; Rolland et al.,
2006; Baena‐Gonzalez et al., 2007]. Se ha reportado que los genes DIN son activados bajo
diversas condiciones de estrés y reprimidos por azúcares y luz. Consistentemente, DIN1 y
DIN6 son activados por oscuridad, DCMU y condiciones de inundación/inmersión, que
pueden limitar la fotosíntesis y la respiración, y por consiguiente, agotar las reservas
energéticas en células aisladas y plantas enteras [Baena‐Gonzalez et al., 2007].
Dado que RSp31 reúne varias características como para incluirlo en la categoría de
genes inducidos por oscuridad decidimos trabajar en base a la hipótesis, de que teníamos
en nuestras manos un gen DIN. La figura R20 muestra que al tratar las plantas con
sacarosa, el efecto de las transiciones de luz/oscuridad sobre el splicing de RSp31 se ve
disminuido. El agregado de sacarosa al 7 % (p/v) genera que la relación de isoformas de
RSp31 sea, en oscuridad, similar a la de la luz (fig. R20). Es decir, el agregado de azúcar
simula el efecto de la luz sobre la transcripción y el procesamiento de RSp31. El agregado
de glucosa al 3,6 % (p/v) (200 mM, la misma osmolaridad que sacarosa al 7 % (p/v)) causa
un efecto similar a la sacarosa al 3,5 % (p/v) o 100 mM. Este no es un efecto claro y
P á g i n a | 116
reproducible, pero en algunos diseños experimentales esa cantidad de azúcar es capaz de
inhibir parcialmente el aumento del cociente mRNA3/mRNA1 inducido por la oscuridad.
Esto nos introdujo en el mundo de la señalización por azúcares con la hipótesis de que
alguna vía de señalización mediada por azúcares podría estar involucrada en la respuesta
de RSp31 a la luz. Se conocen, al menos parcialmente, los componentes de algunas de
estas vías y se cuenta con mutantes funcionales o nulos de diferentes quinasas que
participan en ellas [Rolland et al., 2002; Moore, 2003; Rolland et al., 2006; Baena‐Gonzalez
et al., 2007].
De las mutantes y sobre‐expresantes probadas bajo nuestro protocolo de
luz/oscuridad (fig. R21‐22), ninguna mostró un comportamiento significativamente
distinto al de las plántulas control. En conclusión, el efecto de la luz sobre el splicing
alternativo de RSp31 no estaría mediado por las vías de señalización por azúcares que
involucran a la hexoquinasa HXK1 ni a la quinasa KIN10.
Es interesante destacar que mutantes del gen que codifica para ABI4 poseen
fenotipos de insensibilidad en la respuesta al azúcar [Rolland et al., 2002; Rolland et al.,
2006]. Cuando analizábamos lo que sucedía con GUN1 y GUN5, analizamos la respuesta
de las plantas mutantes abi4 (datos no mostrados). El resultado es que estos mutantes se
comportan como las plantas salvajes en la respuesta de RSp31 a la luz.
En resumen, no fuimos capaces de identificar/aislar el “sensor” responsable de los
efectos de luz/oscuridad que estarían modulados por sacarosa. Esto no quiere decir que
los azúcares no estén involucrados en la regulación de la transcripción y el procesamiento
de RSp31. Sólo puedo concluir que la respuesta de RSp31 a la luz es independiente (no
necesita) de KIN10 y de HXK1.
No puedo dejar fuera de discusión la posibilidad de que el efecto del azúcar sea
indirecto. Esta posibilidad explicaría la necesidad de una elevada cantidad de azúcar
(sacarosa al 7 % (p/v)) para observar un efecto. Por otra parte, se ha reportado que frente
a daño mecánico se induce la expresión de transportadores de sacarosa en la zona dañada
P á g i n a | 117
ya que esos tejidos se comportan como un lugar de destino o una bomba (sink) para el
transporte de azúcar [Meyer et al., 2004]. Como discutimos previamente, el daño causa
un efecto parecido al de la oscuridad sobre RSp31 (datos no mostrados) y el azúcar simula
el efecto de la luz (fig. R20); lo que sería en cierta medida contradictorio para postular que
el azúcar “señaliza” la luz. Pero, ¿qué clase de efecto indirecto puede explicar la
regulación que ejerce la sacarosa sobre RSp31?
Estado redox de la cadena de transporte electrónico fotosintético: pool de
plastoquinonas
El mejor truco alguna vez realizado por el diablo fue convencer
al mundo de que él no existe
Kevin Spacey, Los Sospechosos de Siempre
Los resultados hasta aquí expuestos, y discutidos con cierto detalle, nos fueron
llevando por diferentes caminos que, muchas veces, confluían en una sospecha: el pool de
PQ sería responsable de la señalización lumínica que provoca los cambios en el
procesamiento y la transcripción de RSp31. Por ejemplo, se ha reportado que el
tratamiento con H2O2 promueve la oxidación del aceptor primario de electrones del pool
de PQ (llamado QA) aumentando el flujo de electrones desde el fotosistema II [Laloi et al.,
2007], lo que podría explicar el carácter indirecto del efecto del H2O2 sobre RSp31
propuesto más arriba. Por otra parte, también sabemos que los diferentes tipos de estrés
biótico y abiótico disminuyen los niveles de NADP+, y que esto genera una sobre‐reducción
de los componentes de la cadena de transporte electrónico fotosintético [Tognetti et al.,
2006]. Quizás estos hechos explican por qué plántulas que lucen estresadas, no responden
con cambios en el los patrones de splicing alternativo de RSp31 a transiciones de
luz/oscuridad, mostrando un cociente similar al de luz en cualquier condición. Además,
existe también la posibilidad de que las señales de los azúcares y de la luz sean integradas
a nivel del pool de plastoquinonas. Según se ha planteado en trabajos recientes esto
P á g i n a | 118
podría ocurrir para los casos de la inducción de la síntesis de antocianinas y para el
transporte de azúcares [Jeong et al., 2010]. Por lo tanto, los posibles efectos indirectos
que hemos discutido hasta aquí podrían, todos ellos, ser explicados de la misma forma.
Con la intención de evaluar la hipótesis de que el pool de PQ esté involucrado en la vía
de señalización utilizamos DCMU y DBMIB, drogas que inhiben el transporte de electrones
antes y después de la PQ haciendo que el pool quede mayormente oxidado (DCMU) o
reducido (DBMIB). La figura R23 A muestra que el DBMIB no anula los efectos de la luz
sobre los transcriptos analizados. Dado que el mismo no tiene un efecto en oscuridad (no
hay transporte electrónico sobre el cual actuar) se podría pensar que no está funcionando,
sin embargo la figura R23 B demuestra que sí afecta la expresión de otros genes (PORc).
Por otra parte, el hecho de que no aumente el efecto de la luz sobre el splicing alternativo
de RSp31 puede deberse a que alcanzó un umbral, deberíamos probar lo que sucede en
respuesta a una curva de intensidad lumínica.
Las evidencias hasta aquí presentadas, indicarían que es probable que el pool de
plastoquinonas sea el responsable de los efectos de las transiciones de luz oscuridad
sobre el splicing alternativo de RSp31. Sin embargo, no podemos “descartar de cuajo”
que los azúcares y las especies reactivas de oxígeno participen de la señalización de
manera independiente del pool de plastoquinonas.
Haciendo alusión a la frase del comienzo de la sección, tenemos una señal retrógrada
involucrada en la regulación del splicing alternativo de RSp31 y un sospechoso principal
detrás: el pool de PQ. Los resultados indican que el estado redox del pool de PQ modula
los cambios en el splicing alternativo de RSp31 en respuesta a la luz. Inclusive, éste mismo
podría integrar las señales relacionadas al estado energético o de reservas de la planta, y a
la presencia/ausencia de estrés. Sin embargo, no podemos descartar que sea un conjunto
de señales separadas (ROS, azúcares, y estado redox del pool de PQ) e integradas a nivel
nuclear las que “manejen” la expresión de RSp31 y otros transcriptos con comportamiento
similar.
P á g i n a | 119
Globalidad del efecto de la luz sobre el splicing alternativo
Mientras intentábamos identificar qué señales regulan la respuesta a la luz de RSp31,
decidimos evaluar la extensión del fenómeno con un mayor número de eventos de
splicing alternativo. Además incluimos sacarosa como tratamiento extra, para identificar
aquellos eventos que podían estar respondiendo a una caída general de las reservas
producto del tratamiento en oscuridad. El abordaje experimental incluyó considerar las
diferencias producidas sobre eventos de splicing diferentes analizados en el panel de RT‐
PCR [Simpson et al., 2008] por los tratamientos LUZ/SORBITOL – OSCURIDAD/SORBITOL –
LUZ/SACAROSA – OSCURIDAD/SACAROSA.
La tabla R1 muestra que 41 eventos de splicing alternativo (de un total de 100)
evidencian cambios (mayores al 5 % en valor absoluto y con un valor p < 0,1 en un test de
student) en respuesta al protocolo de luz/oscuridad. Cinco de ellos cambian sólo en
sorbitol y otros 3 sólo en sacarosa, esto nos deja 33 que están cambiando sin importar la
presencia/ausencia de azúcares. Es decir que el 33% de los eventos de splicing alternativo
representados en el panel cambian por transiciones de luz/oscuridad, de manera
independiente a la abundancia de azúcares. Esto es sumamente importante por dos
razones:
1‐ El efecto de las transiciones de luz/oscuridad sobre el splicing alternativo no es
pleiotrópico e indiscriminado, sino que afecta a un número definido y limitado
de eventos.
2‐ Los cambios de splicing alternativo observados en oscuridad no son
consecuencia del hambreado de azúcares porque no se revierten con el
agregado de los mismos en la mayoría de los casos.
Aún más, los dos controles de splicing constitutivo incluidos en el panel sufren la
eliminación de sus intrones con una eficiencia del 100 % en cualquiera de las condiciones
analizadas.
P á g i n a | 120
La identificación de estos eventos y los estudios que vamos a realizar con ellos a partir
de ahora, nos va a permitir saber si hay otros eventos con una regulación similar a la que
sufre (o disfruta no?) RSp31. También vamos a poder estudiar otras vías de señalización
por luz, ya sea por fitocromos o por vías retrógradas, y así evaluar los efectos de la luz a
nivel del splicing alternativo. Por ejemplo, uno de los eventos representados en el panel
corresponde al splicing alternativo que sufren los transcriptos del gen que codifica SRp30,
otra proteína SR (similar a RSp31). A través de un sitio de splicing 3’ alternativo se
obtienen 2 isoformas capaces de codificar para proteínas de diferente tamaño y con un C‐
terminal distinto. La isoforma corta representa un poco más del 70 % del total en luz y cae
a un 40 % en oscuridad. Quizás RSp31 y SRp30 regulen el splicing de varios transcriptos
“río abajo” de ellas y así amplifiquen la señal lumínica.
Otro de los genes afectados revelado por el panel es el que codifica KIN11.
Previamente, hablé de esta proteína por su rol en la señalización de los azúcares. La luz
afecta un sitio dador alternativo (5’ss) en la región no traducida 5’ (5’ UTR). La isoforma
más corta que presenta una abundancia cercana al 60% en luz, en plántulas crecidas en
sorbitol, aumenta significativamente hasta un 80 % en oscuridad; pero al agregar azúcar,
la abundancia en luz es del 40 % aproximadamente y parece aumentar en oscuridad a un
50 % pero el cambio no es significativo (figura R24 D). Este gen estaría siendo regulado de
manera similar a RSp31 en los cambios que evidencia a nivel de splicing, también será
interesante ver qué señales están involucradas en su regulación y si RSp31 es uno de sus
moduladores.
En perspectiva, queda mucho por hacer pero tenemos muchos caminos “verdes” para
avanzar en nuestro conocimiento acerca de cómo es regulado el splicing alternativo en las
plantas.
P á g i n a | 121
Consideraciones finales
Deseo regresar al punto de “la extensión del período de oscuridad”, y detenerme allí
un momento. Me parece que vale la pena destacar algo evidente, es poco común que las
plantas se enfrenten en la naturaleza a la clase de estímulos a los que las expuse (7 días de
luz, 2 días de oscuridad); sin embargo, haber llevado las condiciones al extremo es lo que
nos permitió identificar los posibles modos de regulación de los que estuvimos
discutiendo en esta sección y en las previas. Seguramente podemos ahora encontrar un
marco fisiológico en el que podrían operar tales mecanismos. El trabajo realizado en esta
tesis demostró que el patrón de splicing de RSp31 es dependiente de la intensidad de la
luz que recibe la planta y los cambios en este parámetro, sí son comunes en la naturaleza.
Hay un momento en el desarrollo de la plántula en que sí se enfrenta a una transición
de oscuridad a luz similar a la de nuestro esquema experimental, luego de la germinación
de la semilla a unos centímetros por debajo de la superficie del suelo, la plántula crece en
un entorno de muy baja intensidad de luz estirándose para alcanzarla. Dependiendo de la
profundidad a la que germinó la semilla y las características del suelo en que crece la
plántula, pueden pasar muchas horas hasta que reciba la luz del sol, lo que las expone a
una situación parecida a la de nuestros experimentos. Realizamos la experiencia de crecer
una planta en oscuridad luego de la germinación y la expusimos a la luz al cabo de algunos
días. Como era de esperar observamos que el cociente mRNA3/mRNA1 en las plántulas
que no habían “visto la luz” es elevado y disminuye con el paso del tiempo en luz.
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me trataron muy bien (cosa que les agradezco profundamente), a tal punto, que muchas
veces me “regalaban” sus plantas para que hiciera algunos experimentos. Dado que
estábamos dando nuestros primeros pasos con el splicing alternativo de RCA, y sabíamos
ya, que respondía a luz, decidimos hacer una especie de búsqueda de mutantes de la
regulación de ese proceso a pequeña escala. La mayoría de las mutantes con que
trabajaban los chicos tenían algún fenotipo de respuesta a luz, y por eso habían sido
aisladas en primer momento. La figura de la página anterior muestra el resultado crudo de
una corrida de los productos de RT‐PCR de RCA en geles de poliacrilamida. Las dos bandas
de abajo son las que corresponden a los productos específicos de cada isoforma, y el
número escrito a mano debajo de cada calle, es el cociente L/C correspondiente. Como
pueden observar (sobre todo por la presencia de un círculo rojo a su alrededor), una de las
mutantes tiene una relación de isoformas L/C muy diferente a la del resto de las calles.
Tuvimos además la fortuna de que 179 (el nombre original de prmt5‐5) esté representada
en dos situaciones de iluminación distinta en las dos calles del gel, lo que daba cierta
fortaleza al resultado.
En ese entonces no se sabía de qué era mutante 179, faltaba más de un año para que
lo supiéramos. Mientras tanto pude determinar que el efecto de las transiciones de
luz/oscuridad estaba presente en esta mutante y que por lo tanto, no tenía que ver con
esa vía de señalización en particular, abriendo (literalmente) un nuevo capítulo en
nuestros estudios del splicing en plantas.
P á g i n a | 124
Capítulo II
Regulación del splicing alternativo por la metil‐transferasa PRMT5
Introducción
Desde el comienzo de la vida los ciclos ambientales más importantes del día, el mes y
el año se han enfrentado a la selección natural, con ventanas de oportunidad y riesgo que
se repiten con precisión a frecuencia predecible, y el “Demonio de Darwin” ha explotado
esa previsibilidad mediante la elaboración de programas temporales innatos que ponen
en fase muchas de las tareas en la vida de una célula u organismo (metabólicas o
comportamentales) con el momento oportuno del día [Pittendrigh, 1993]. Las ideas de
Pittendrigh que se exponen en el párrafo anterior ponen de manifiesto los avances que se
dieron en el estudio de los ritmos biológicos a lo largo de los años. Es evidente que lo más
adecuado para comenzar esta sección es hacerlo de manera cronológica así que,
comencemos con un poco de historia.
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P á g i n a | 126
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necesidad de luz solar para explicar el movimiento de las hojas de la mimosa pero hay
muchas otras variables que podrían estar causando los ciclos. Por esa época todos creían
que alguna variable externa dirigía los ritmos por lo que mucha de la investigación sobre
ritmos del comienzo del siglo XX fue una cacería de un “factor X” que modulara los ciclos
diarios [Albrecht, 2009]. Wilhelm Pfeffer trataba de demostrar que los movimientos en las
hojas de la planta de porotos (Phaseolus vitellinus) dependían de claves externas y llegó a
la conclusión opuesta, yendo en contra de su propia opinión. Una de las observaciones
cruciales fue que el ritmo no se pierde si sólo se tapan los órganos sensibles a la luz en la
base de la hoja y se permite que continúe la fotosíntesis. Posteriormente, Erwin Bunning
eliminó completamente la necesidad de un factor externo. Bunning demostró que la
periodicidad era heredable y desarrolló el concepto de fotoperíodo y el de reloj biológico
[Albrecht, 2009].
Durante esos años también se acumuló evidencia y se describieron hallazgos similares
a los descriptos para plantas, llevados a cabo en modelos animales, que confluyeron en un
simposio internacional en 1960 celebrado en Cold Spring Harbor donde, donde se dice que
nació la Cronobiología.
Además del anecdotario, considero útil que resumamos algunos conceptos que serán
importantes más adelante.
I. Los ritmos circadianos y el reloj biológico
Por definición, un ritmo circadiano (del latín circa, que significa "alrededor" y dies, que
significa "día") es aquel que persiste con un período aproximadamente 24 horas en
condiciones constantes (“corrida libre” o free‐running), en ausencia de referencias
temporales externas. Un atributo importante de estos ritmos es que, señales del entorno
(luz‐oscuridad o ciclos de temperatura) pueden “resetear”* o “entrenar” la fase del ritmo
para que coincida con el ciclo ambiental [Barak et al., 2000].
* Tomado y adaptado del inglés, debe ser entendido como llevar un sistema a sus condiciones iniciales.
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reclutados varían entre los diferentes organismos [McClung, 2006].
III. El reloj biológico de Arabidopsis
La secuenciación del genoma de Arabidopsis en el año 2000 no identificó ningún
ortólogo de la planta para genes del reloj conocidos en otros sistemas. Esto implicaba que
la composición de su reloj era novedosa.
Fue necesario el desarrollo de una nueva herramienta para abrir una ventana al
mecanismo del reloj de este organismo modelo y revelar sus componentes. Se generó una
construcción reportera que al integrarse al genoma de la planta puede emitir
bioluminiscencia por la expresión de luciferasa. Si el promotor “río arriba” de la secuencia
codificante de luciferasa es el de un gen cuya expresión está regulada por el reloj (ej:
LHCB), cualquier mutación introducida en el genoma de la planta que afecte el patrón
circadiano de bioluminiscencia emitida estará ocurriendo en algún gen relacionado con el
oscilador [Millar et al., 1992]. De esta manera se identificaron diferentes mutantes de
período más corto y de período más largo (léase, con un ciclo de expresión de luciferasa
menor o mayor a las 24 hs respectivamente). Una de las mutantes con período corto es la
de pérdida de función del gen toc1 (timing of cab expression) [Millar et al., 1995; McClung,
2006]. Esta clase de aproximaciones permitió construir un esquema del reloj de
Arabidopsis (fig. I17).
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la expresión de CCA1 y LHY [Farré et al., 2005; McClung, 2006].
Los componentes de los osciladores en las especies modelo, Drosophila melanogaster
y Arabidopsis thaliana, no muestran conservación a nivel de secuencia. Sin embargo, el
principio fundamental para generar oscilaciones auto‐sustentables de proteínas del reloj,
que a su vez transmiten los ritmos circadianos a los procesos “río abajo” dentro de la
célula, se repite de manera remarcable [Schoning y Staiger, 2005].
P á g i n a | 132
2. Metilación de proteínas
Una gran variedad de modificaciones químicas puede ocurrir en una proteína de
manera dependiente del desarrollo y del ambiente. Estas modificaciones determinan la
estructura terciaria y cuaternaria de las proteínas modificadas y regulan su actividad [Seo
y Lee, 2004]. La metilación de proteínas es una de las modificaciones post‐traduccionales
más abundante. Cerca del 2 % de todos los residuos de arginina, están di‐metilados en
extractos de proteína nuclear de hígado de rata [Boffa et al., 1977]. Aunque, desde la
década de 1960 tenemos noción de la existencia de estas modificaciones, el
descubrimiento de su función en la célula y de las enzimas involucradas ocurrió recién en
los últimos años [Lee y Stallcup, 2009].
Las metil‐transferasas de proteínas son las enzimas encargadas de transferir grupos
metilo (CH3‐) desde el dador de metilos (S‐adenosilmetionina) a aceptores específicos
como: arginina, lisina, histidina y grupos carboxilo [Lee y Stallcup, 2009]. Debido a que la
idea de esta introducción es brindar herramientas para poner en marco los experimentos
y los resultados que trataré en las secciones próximas, no deseo hacer una revisión acerca
de la metilación de diferentes sustratos, y la función de esa modificación en el contexto
celular. Espero permitan y disculpen el sesgo de llevarlos por el camino de la metilación de
argininas.
I. Metilación de argininas y sus protagonistas
El residuo arginina de una proteína puede ser mono‐ o di‐ metilado, es decir, se le
pueden agregar 1 o 2 grupos metilo. De agregarse 2 CH3‐, esa di‐metilación puede ser
asimétrica (los 2 metilos en el mismo átomo de N al final de la cadena lateral de arginina)
o simétrica (1 grupo metilo en cada uno de los 2 átomos terminales de N) [Lee y Stallcup,
2009]. Las enzimas que catalizan esas reacciones se conocen como metil‐transferasas de
arginina de proteínas (PRMTs) y pueden ser encontradas en diversos organismos como
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P á g i n a | 135
II. Las PRMTs en las plantas y el rol de PRMT5
Una búsqueda rápida en la base de datos genómica tair de Arabidopsis thaliana revela
que existen al menos 9 loci que codifican para distintas PRMTs. Las PRMTs de tipo II ‐o
simétricas‐ están representadas en Arabidopsis por PRMT5 (o AtPRMT5), y las asimétricas
o tipo I, están representadas por varias proteínas entre las que se destacan PRMT1a,
PRMT1b, PRMT4a, PRMT4b, PRMT10. Todas ellas están involucradas en el control de la
floración en Arabidopsis [Niu et al., 2007; Pei et al., 2007; Scebba et al., 2007; Wang et al.,
2007; Niu et al., 2008].
PRMT5 fue clonado inicialmente en mamíferos como “Janus kinase binding protein 1”
y al mismo tiempo se demostró que podía metilar las histonas H2A, H3 y H4 [Branscombe
et al., 2001]. Se localiza tanto en el citoplasma como en el núcleo. En el citoplasma se la
encuentra formando parte de un complejo llamado “metilosoma”, donde está involucrada
en la metilación de las proteínas Sm (componentes del spliceosoma) [Friesen et al., 2001].
Esta función dual le confiere la capacidad de controlar diferentes etapas del metabolismo
del ARN.
Durante la fase citoplasmática de la biogénesis de las “pequeñas ribo‐nucleopartículas
nucleares” (snRNP), el complejo SMN (Survival Motor Neuron) carga las proteínas Sm
sobre los sitios Sm de los pequeños ARN nucleares (snRNAs). La afinidad del complejo
SMN es mayor por las Sm metiladas (sDMA) que por las Sm no metiladas o metiladas
asimétricamente [Brahms et al., 2001; Meister et al., 2001]. La disrupción genética del
ortólogo de PRMT5 en moscas (Dart5), genera la pérdida completa de los residuos de
sDMA en las proteínas Sm [Gonsalvez et al., 2006] lo que, al parecer, no interfiere con el
ensamblado de los complejos de snRNP [Gonsalvez et al., 2008]. En células humanas,
PRMT5 y PRMT7 funcionan de manera no‐redundante en la metilación de proteínas Sm y
ha sido demostrado que su actividad es requerida para la biogénesis de las snRNP
[Gonsalvez et al., 2007].
Estas líneas de evidencia que parecen contradecirse en los diferentes sistemas, poco
revelan de lo que está sucediendo a nivel de splicing y de otros eventos del procesamiento
P á g i n a | 136
de los mensajeros. Como no deseo continuar relatando hallazgos en diferentes
organismos para no alejarnos del panorama y el marco en que se realizó el trabajo, elijo
entonces (conciente del nuevo sesgo que le impongo al lector), dejar de lado aquellos
trabajos que no sientan un claro precedente para los experimentos y resultados que
describiré a continuación.
P á g i n a | 137
Objetivo general (Capítulo II)
Identificar el mecanismo por el cual PRMT5, una metil‐transferasa de proteínas,
regula el splicing alternativo de diferentes eventos.
Objetivos particulares (Capítulo II)
Evaluar el alcance de PRMT5 como regulador de splicing alternativo, cuántos
eventos afecta.
Evaluar qué clase de eventos son modulados por PRMT5.
Evaluar una posible interacción entre el reloj circadiano y el proceso de splicing
alternativo. Identificar el rol de PRMT5 en cada proceso.
Determinar qué sustratos de la actividad de PRMT5 son responsables de los
cambios a nivel de procesamiento.
Evaluar un posible rol conservado en organismos animales.
P á g i n a | 138
Metodología (Capítulo II)
Material vegetal y condiciones de crecimiento
Las líneas de Arabidopsis usadas en este capítulo son del ecotipo Columbia. A menos
que se indique lo contrario, las semillas se sembraron en cajas plásticas transparentes (40
x 33 mm, 15 mm altura) conteniendo 4 ml de agar‐agua al 0,8% (p/v), y se incubaron por
3‐4 días a 4 ºC.
Las plantas se crecieron en macetas plásticas de 110 cm3 conteniendo una mezcla de
perlita, vermiculita y turba (1:1:0,5), y el riego se realizó con solución nutritiva (Hakaphos
Rojo, Compo) durante el período de crecimiento. La temperatura en las cámaras fue
mantenida en 22‐24 ºC. Las condiciones lumínicas en término de fotoperíodo e
irradiancia, varía para cada experimento, por lo cual se detallará según corresponda.
Las mutantes empleadas fueron: phyA, phyB (SALK_069700), cry1 (SALK_069292),
cry2, atprmt5‐1 (SALK_065814), atprmt5‐2 (SALK_095085), flc (SALK_092716), prr7 , prr9‐
1, atprmt10, atprmt11.
Fuentes de luz y tratamientos lumínicos
La luz blanca fue provista por tubos fluorescentes Philips. El azul continuo fue provisto
por tubos fluorescentes de luz blanca filtrada por un filtro acrílico azul de 2 mm de
espesor (Paolini 2031, La Casa del Acetato, Buenos Aires, Argentina). El rojo lejano
continuo fue provisto por cuatro lámparas incandescentes de 150 W (Philips R95), en
combinación con un filtro de agua (aislante térmico), un acetato rojo y seis filtros de
acrílico azul (Paolini 2031). El rojo continuo fue provisto por diodos que emiten luz en el
rango de 635‐650 nm. Para lograr las distintas intensidades de azul, rojo lejano y rojo, se
utilizaron hojas de papel blanco y liso sobre las cajas plásticas.
P á g i n a | 139
Análisis de la expresión génica
Medición por PCR en Tiempo Real (qPCR)
Los experimentos de qPCR fueron realizados sobre plántulas de aproximadamente 20
días, crecidas en macetas y según el tratamiento lumínico que se indica en cada caso. Los
pasos a seguir para la purificación del ARN, síntesis del ADNc y para llevar a cabo la qPCR
están explicados en Metodología del Capítulo I. Los genes Act8 y PP2A (Protein
Phosphatase 2A Subunit A) fueron empleados para relativizar la expresión.
Análisis global I: microarreglos de expresión en A. thaliana
Se utilizaron plantas crecidas como se indica anteriormente, pero en condiciones de
luz y temperatura constante, sin la posibilidad de que el reloj circadiano se sincronice. Una
vez que la roseta alcanzó las 8‐9 hojas, antes de que florezcan, se cosechó la parte aérea.
Cada réplica estuvo compuesta por 3‐4 plantas crecidas en macetas distintas, y se
obtuvieron 3 réplicas. Para obtener el ARN se procedió de la misma manera que para
realizar qPCR. 5 µg de ARN correspondiente a cada muestra de genotipo salvaje o
mutante, fue procesado e hibridado contra los microarreglos de expresión (Affymetrix:
GeneChip Arabidopsis ATH1 Genome Arrays), según las instrucciones provistas por el
fabricante.
Fue posible comparar la señal de los microarreglos, después de normalizarla al
promedio de la intensidad de la señal general de todas las sondas. Los datos se analizaron
utilizando el algoritmo MAS5. Fueron sujeto de análisis, aquellos genes cuya señal resultó
detectable en las 3 réplicas de al menos uno de los genotipos. La significancia estadística
atribuible a la diferencia de señales, fue calculada empleando el software SAM [Tusher et
al., 2001]. Se realizaron dos clases de t‐test no pareados sobre los valores de las señales, y
para estimar la tasa de falsos descubrimientos, se utilizaron 100 permutaciones.
La distribución de fases de genes asociados al reloj fue evaluada utilizando el software
Phaser, disponible en la web (http://phaser.cgrb.oregonstate.edu)[Michael et al., 2008].
P á g i n a | 140
La categorización funcional de genes se realizó mediante la herramienta disponible en
la página de internet de la universidad de Toronto, “The Bio‐Array Resource for
Arabidopsis Functional Genomics”. Esta provee el valor absoluto de genes pertenecientes
a cada categoría funcional, así como también la relación existente entre ese valor y el total
de genes pertenecientes a esa categoría, presentes en el genoma.
Análisis global II: panel de RT‐PCR de Arabidopsis
Se utilizaron plántulas crecidas como se indica anteriormente, pero en condiciones de
luz y temperatura constante, sin la posibilidad de que el reloj circadiano se sincronice. A
partir de 100 mg de material se aisló el ARN que fue utilizado en sucesivas reacciones de
RT‐PCR según lo indica [Simpson et al., 2008].
Análisis global III: tiling‐arrays
Para realizar los tiling‐arrays 5 µg de ARN correspondientes a cada muestra de
genotipo salvaje o mutante, fueron procesados e hibridados contra los tiling‐arrays
(Affymetrix: GeneChip® Arabidopsis Tiling 1.0R Array y Affymetrix: GeneChip® Drosophila
Tiling 1.0R Array), según las instrucciones provistas por el fabricante.
El análisis de los datos obtenidos para ambos organismos, fue realizado por el Dr.
Justin Borevitz y la Dra. Xu Zhang. Detallo a continuación la información que ellos nos
proveyeron acerca de su proceder.
El primer paso, fue transformar logarítmicamente la intensidad de la señal de cada
sonda. Luego se ajustó a un modelo lineal: intensidad= genotipo + error, donde el término
genotipo contrasta salvaje y mutante. El arreglo contra el cual fueron hibridadas las
muestras de A. thaliana, ya había sido anotado previamente [Zhang et al., 2008]. Por otro
lado, la anotación para el arreglo de D. melanogaster fue “megablasteada” contra la
versión 5 del genoma de Drosophila. Así, y restringiendo el número de oligonucleótidos
según su nivel de apareamiento, se trabajó con un total de 2.930.433 sondas. Estas se
mapearon sobre los ARNm anotados para marcar los exones, intrones, regiones
intergénicas, o comprobar si exceden los límites de anotación de esa versión del genoma.
P á g i n a | 141
Este último tipo de sondas, así como las que corresponden a regiones intergénicas, o
aquellas que hibridan con múltiples transcriptos, fueron eliminadas del análisis del
transcriptoma de D. melanogaster.
Para el análisis del splicing, se empleó la intensidad de señal de las sondas, corregida
por la media de la expresión génica. La tasa de falsos descubrimientos fue determinada
mediante 20 permutaciones [Zhang et al., 2008].
Análisis bioinformático de las secuencias dadoras de splicing
La frecuencia genómica de cada nucleótido para cada posición en la secuencia dadora
de splicing, 5’ss, fue obtenida del sitio web SpliceRack [Sheth et al., 2006]. La sub‐ o sobre‐
representación de un nucleótido particular, con respecto a la frecuencia genómica y su
valor P, fueron calculados utilizando el test hipergeométrico. La frecuencia de los
nucleótidos fue representada en forma de pictogramas, los cuales se construyeron
mediante el uso del software WebLogo [Crooks et al., 2004].
Detección de splicing por PCR radiactiva y qPCR
Ver Materiales y Métodos del Capítulo I para más información.
Para detectar las distintas isoformas del mensajero de PRR9 mediante PCR radiactiva,
se realiza una amplificación de PCR (Metodología, Capítulo I) con 2 mM MgCl2. Los primers
empleados para amplificar los mensajeros del gen per, son los descriptos por John
Majercak [Majercak et al., 2004]. Ver el apéndice con la lista de primers para más
información. Los productos de amplificación obtenidos para PRR9 se sembraron en geles
de acrilamida 8% , tras la corrida electroforética se detectaron por autoradiografía las
bandas correspondientes a las diferentes isoformas. Las cuentas radiactivas emitidas por
cada banda se miden en un contador de centelleo (método de Cerenkov).
P á g i n a | 142
Extracción de proteínas y Western blot
Para la extracción de proteínas a partir de plántulas de Arabidopsis thaliana, al igual
que para la extracción de ARN, el primer paso es llevar el tejido a un fino polvo por medio
de un mortero al que se le agrega nitrógeno líquido para facilitar la destrucción del
material. Habiendo obtenido el fino polvo se agrega un buffer de extracción que disuelve
las membranas celulares y libera los contenidos. Utilizamos diferentes recetas y buffers de
extracción pero el más usado fue:
PEB400 (Protein Extraction Buffer 400 mM KCl)
50 mM Hepes KOH pH 7.9
400 mM KCl
2,5 mM MgCl2
1 mM EDTA
1 mM DTT
0,1% Triton X‐100
+inhibidor/es de proteasas (usamos el de Roche, libre de EDTA en pastillas)
Para sembrar la muestra en un SDS‐PAGE 15‐18 % , se diluye en buffer PEB (sin KCl)
para bajar la concentración de potasio a menos de 200 mM y evitar que se gelifique
cuando se calientan (crackeado) en Laemmli buffer (por el SDS).
2X Laemmli
12,5 ml 0,5M Tris HCl pH 6,8
10 mL Glicerol
2 g SDS
1 ml β‐Mercaptoetanol
Para crackear las muestras calenté a 65 °C por 5 minutos para evitar el agregado de
proteínas por las posibles interacciones hidrofóbicas.
Después de la electro‐transferencia a una membrana de PVDF se reveló con el
anticuerpo SYM10 siguiendo las instrucciones del proveedor (Millipore).
P á g i n a | 143
Resultados
1. Introducción al conocimiento de PRMT5 y su función:
Aislamiento y caracterización inicial de la mutante prmt5‐5
El aislamiento y la caracterización inicial de la mutante comenzaron en el laboratorio
del Dr. Marcelo Yanovsky a cargo de la lic. Sabrina Sanchez. Con el fin de identificar
nuevos componentes que participen o modulen el funcionamiento del reloj circadiano, se
realizó una búsqueda a gran escala de mutantes en la especie modelo Arabidopsis
thaliana.
Al momento de realizar la búsqueda de mutantes no se contaba con las herramientas
que permitieran realizar un análisis rápido y eficiente del funcionamiento del reloj
circadiano, para lo cual se empleó una estrategia alternativa. Como se sabe, la inhibición
del alargamiento del hipocotilo durante la des‐etiolación es una respuesta controlada
tanto por el reloj circadiano como por la percepción de las señales lumínicas, y por la
interacción entre esos dos mecanismos. De esta forma, identificar mutantes cuyo
hipocotilo sea particularmente largo o corto, sugiere que el gen alterado participa directa
o indirectamente en los procesos citados anteriormente. Por otro lado, la elongación del
hipocotilo es una respuesta de simple y de rápida detección. Así, se decidió que la
búsqueda consistiría en encontrar plántulas cuyos hipocotilos fueran largos (más que el
promedio), en condiciones de crecimiento donde normalmente se maximizan las
diferencias, o sea, ciclos de luz y oscuridad, y en particular en fotoperíodos de día corto
(DC: luz blanca, 8 horas y oscuridad, 16 horas). Alrededor de 100 plántulas fueron
seleccionadas por presentar hipocotilo alargado. La siguiente generación fue sometida al
mismo análisis para corroborar su fenotipo. Así se aisló la mutante prmt5‐5 (denominada
179 en ese entonces).
P á g i n a | 144
El tiempo que tardan las plantas en florecer está regulado por distintas señales y por el
reloj. Por eso resultaba importante determinar si la mutante prmt5‐5 presentaba
alteraciones en el tiempo de floración. Para medirlo se usó como estimador de éste la
cantidad de hojas presentes en la roseta al momento de aparecer el botón floral, ya que
de esa forma se puede conocer el tiempo biológico que tarda en florecer
independizándose de los defectos en el desarrollo (en particular las plantas mutantes
prmt5‐5 crecen lento). Para ello se crecieron plantas del genotipo salvaje (WT) y prmt5‐5,
en tres fotoperíodos: día corto, día largo (DL: 16 hs de luz ‐ 8 hs de oscuridad), y luz
continua. Tal como se ve en la figura R27 A la mutante prmt5‐5, presenta floración tardía
respecto de la planta salvaje en cualquiera de los tres fotoperíodos puestos a prueba.
Con el fin de evaluar el fenotipo circadiano de la mutante aislada, se realizó un
experimento en el cual se mide el ángulo formado por el primer par de hojas de las
plántulas, y cómo éste va cambiando a lo largo del día. Tal como se ve en la figura R27 B,
la mutante prmt5‐5 presenta un período circadiano aproximadamente tres horas más
largo que el de la planta salvaje.
Fig. R27: El tiempo a floración y el ritmo del movimiento de hojas, se encuentran alterados en
la mutante. A: hojas en la roseta presentes en el momento de aparición del primer botón floral en
tres fotoperíodos distintos. B: medición del ángulo formado por el primer par de hojas (en grados)
cuando las plántulas son entrenadas en día largo y sometidas luego, a condiciones de luz continua
(H: horas). Los valores representan la media y la barra de error, + el error estándar.
24 48 72 96 120 144
50
70
90
110
130
150
170 WTprmt5-5
Tiempo en Luz Cont. (H)
Ang
ulo
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e H
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Día Corto Día Largo Luz Continua0
10
20
30
40
50
60
70
80WTprmt5-5
Hoj
as a
l Flo
rece
r
A B
P á g i n a | 145
Dado que la búsqueda de plantas con fenotipo aberrante se realizó sobre una
colección del ABRC (generadas por inserción aleatoria de T‐DNA), para identificar el gen
alterado se probaron las técnicas clásicas tales como TAIL‐PCR y PCR invertida. Sin
embargo se determinó que el T‐DNA no era responsable per se del fenotipo observado
debido a la falta de co‐segregación inserto‐fenotipo. A continuación, se realizó el
cruzamiento con la planta salvaje del mismo ecotipo (Columbia), se obtuvieron plantas
con el fenotipo caracterizado y sin la inserción de T‐DNA identificada anteriormente.
Sobre esos individuos, se determinó la presencia de otras inserciones de T‐DNA que
pudieran ser responsables del fenotipo. Debido al interés por la mutante prmt5‐5, cuyo
fenotipo estaría dado por un único gen según los datos obtenidos en experimentos de
genética clásica (que coinciden con una segregación de tipo mendeliana), se decidió
realizar la técnica de clonado posicional para determinar la localización y el tipo de
mutación asociada al fenotipo observado. Para eso se realizó la cruza de la mutante
prmt5‐5 (ecotipo Col) con una planta salvaje del ecotipo Landsberg erecta (Ler) ‐que
presenta diferencias a nivel genómico con el ecotipo Columbia‐. Se realizó un “mapeo
grueso” y se determinó que la mutación se localizaba en el brazo derecho del cromosoma
4. El paso siguiente se basó en un mapeo más “fino”, para lo cual se diseñaron marcadores
aprovechando ciertas regiones ausentes en Ler y presentes en Col. Cuando se tenía
acotado el intervalo en el cual podía ubicarse la mutación (aproximadamente 430
kilobases, que comprenden alrededor de 160 loci), se identificó un gen candidato, el
At4g31120, gracias a que la descripción bibliográfica del fenotipo de un mutante nulo para
este gen, era similar al fenotipo de la mutante prmt5‐5 [Wang et al., 2007]. A continuación
se secuenció el gen candidato completo: desde 1700 pares de bases río arriba de su sitio
de iniciación de la traducción hasta 650 pares de bases río abajo del codón de terminación
de la traducción. De este modo, se determinó que prmt5‐5 posee una mutación puntual,
la cual da origen a un codón de terminación prematuro de la traducción en el transcripto
del gen At4g31120. El locus mutado codifica para la proteína AtPRMT5 (Arabidopsis
thaliana protein arginine methyltransferase) una metiltransferasa de tipo II [Liu et al.,
P á g i n a | 146
prmt5-5 prmt5-1 prmt5-2 phyB0.5
0.6
0.7
0.8
0.9
1.0
WT
Rojo
Larg
o de
l Hip
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ilo(U
nid.
Rel
ativ
as)
prmt5-5 prmt5-1 prmt5-2 phyA0.10
0.15
0.20
0.25
0.30
0.80.91.0
WT
Rojo Lejano
Larg
o de
l Hip
ocot
ilo(U
nid.
Rel
ativ
as)
prmt5-5prmt5-1prmt5-2 cry1 cry20.2
0.3
0.4
0.5
0.6
0.7
WT
Azul
Larg
o de
l Hip
ocot
ilo(U
nid.
Rel
ativ
as)
A B C
24 48 72 96 120 14440
60
80
100
120
140
160
180
prmt5-2prmt5-1WT
Tiempo en Luz Cont. (H)
Ang
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entr
e H
ojas
24
26
28
30
WT prmt5-5 prmt5-1 prmt5-2
*****
**
Per
íodo
(h)
D E
Fig. R28: PRMT5 es el locus responsable de los fenotipos aberrantes de inhibición de la elongación del
hipocotilo y el período circadiano. Medición del hipocotilo relativizado al valor obtenido en oscuridad, en
luz roja (10 µmoles de fotón/m2seg) (A), roja lejana (15 µmoles de fotón/m2seg) (B) y azul (10 µmoles de fotón/m2seg) (C). D: Medición del ángulo formado por el primer par de hojas cuando éstas son entrenadas
en día largo y sometidas luego, a condiciones de luz continua (H: horas). E: Período del reloj circadiano
calculado a partir del ritmo del movimiento de hojas (*** P<0,001; ** P<0,01). Los valores representan la
media + el error estándar.
2010]. AtPRMT5 es la única metil‐transferasa simétrica descripta hasta el momento en
Arabidopsis thaliana.
Debido a que para realizar el clonado posicional se empleó el fenotipo de floración
tardía, fue necesario evaluar si los fenotipos de fotomorfogénesis y reloj circadiano se
debían también a la alteración en el gen determinado. Para eso, se trabajó con otros dos
alelos mutantes del gen At4g31120 disponibles en el ABRC: SALK_065814 (prtm5‐1) y el
SALK_095085 (prtm5‐2), ambos descriptos anteriormente como alelos nulos. Se realizaron
experimentos con el fin de evaluar la inhibición del alargamiento del hipocotilo durante la
des‐etiolación y el período de movimiento de las hojas. En la figura R28 (A‐C) se muestra
el resultado del alargamiento del hipocotilo, relativizado a la oscuridad. Tal como puede
P á g i n a | 147
observarse, el fenotipo hiposensible de prmt5‐5 a las tres calidades de luz empleadas, es
similar al que muestran los otros alelos mutantes de PRMT5. En la Fig. R28 (D‐E) se
muestra el ángulo formado por el primer par de hojas en condiciones de luz continua
(plántulas entrenadas en días largos) y la estimación del período, tanto para plantas
salvajes, como para los dos alelos en estudio. Tal como puede observarse, no hay
diferencias significativas entre prmt5‐5 y los mutantes prmt5‐1 y prmt5‐2.
Estos resultados, en conjunto, sugieren que el producto del gen PRMT5 estaría
involucrado no sólo en la floración, sino también en el control del reloj circadiano y la
respuesta fotomorfogénica.
2. Caracterización de la mutante prmt5‐5, su efecto sobre la
transcripción y el splicing alternativo
a. Análisis inicial, los primeros blancos del efecto de prmt5‐5.
En paralelo a los resultados que se mostraron previamente (Fig. R27 y R28), en nuestro
laboratorio determinamos que la mutante prmt5‐5 presentaba alteraciones importantes
en los patrones de splicing alternativo (fig. R29) de los genes RCA y RSp31 (ver capítulo 1,
fig. R1 y R3). La figura R29 muestra, además, que dicho efecto es específico ya que RSZ33 y
AtPP5 (una fosfatasa de proteínas de Arabidopsis thaliana) no tienen alteraciones en las
relaciones de sus isoformas detectables a través de la técnica de RT‐PCR radiactiva y
posterior electroforesis en geles de poliacrilamida.
Figura R29: Efectos de la mutante
prmt5-5 sobre el patrón de splicing alternativo de varios transcriptos. Se
grafica el cociente entre la isoforma
que da el producto de PCR largo y la
del producto corto (mRNA3 y mRNA1
en el caso de RSp31) en función del
transcripto analizado. Barras: media ±
DE (n=3). Se grafican los resultados de
un experimento representativo 0,0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
0,7
0,8
0,9
RCA RSp31 RSZ33 PP5
Isof
orm
a La
rga/
Cor
ta
Col prmt5-5
P á g i n a | 148
A sabiendas de que el patrón de splicing alternativo de RCA y RSp31 es modulado por
luz, decidimos verificar si la respuesta al estímulo lumínico estaba alterada. La figura R30
muestra lo que sucede con RSp31 en respuesta a transiciones de luz/oscuridad en plantas
control y en la mutante. Como se puede observar la magnitud del efecto de oscuridad es
el mismo en las plantas control y en la mutante prmt5‐5 (fig. R31). Para RCA se observa
algo similar (datos no mostrados). Analizados en conjunto, los resultados indican que la
vía de señalización responsable del efecto de las transiciones de luz/oscuridad no es
interferida por PRMT5. Dicho de otra manera, el efecto de la luz es independiente de
PRMT5.
Figura R30: Efectos de la mutación
prmt5-5 sobre el cambio en splicing
causado por la transición luz/oscuridad.
Se grafica el mRNA3 y mRNA1 de RSp31
para la planta salvaje (wt) y la mutante
(prmt5-5) en luz y oscuridad (osc). Las
barras representan la media ± DE (n=3).
Se grafican los resultados de un
experimento representativo.
Figura R31: Efectos de la mutación
prmt5-5 sobre el cambio en splicing
causado por la transición luz/oscuridad.
Se graficaron las “veces de cambio” del
cociente mRNA3/mRNA1 de RSp31 para
la planta salvaje (wt) y la mutante
(prmt5-5) en luz y oscuridad (osc). Las
barras representan la media del cociente
mRNA3/mRNA1 que se normalizó a 1
para el tratamiento de luz en cada
genotipo. 0
1
2
3
4
5
6
7
wt prmt5-5
vece
s de
efe
cto
(mR
NA
3/m
RN
A1)
Genotipo
RSp31luz osc
0
1
2
3
4
5
6
7
wt prmt5-5
mR
NA
3/m
RN
A1
Genotipo
RSp31luz osc
P á g i n a | 149
Posteriormente nos interesó evaluar si otras metil‐transferasas de argininas de
proteínas caracterizadas en Arabidopsis son capaces de modular el splicing alternativo de
los eventos que estamos analizando. Con tal fin, estudiamos lo que sucede con el patrón
de splicing alternativo de RCA y RSp31 en diferentes mutantes de genes que codifican para
distintas PRMT’s (fig. R32). De las mutantes testeadas, sólo los diferentes alelos mutantes
de PRMT5 alteran el cociente de isoformas de RCA de forma significativa (resultados
similares se obtuvieron para RSp31 pero no se muestran). En conclusión, el efecto de
PRMT5 sobre el splicing alternativo de RCA y RSp31 es específico de esta metil‐transferasa
y no lo causa cualquier enzima con esa función. En otras palabras, los efectos sobre el
procesamiento de estos genes no se deben a una caída en la metilación general de
histonas y otras proteínas, sino a la pérdida particular del tipo de metilación (sobre el
blanco particular) que causa PRMT5.
b. Regulación de la transcripción y del splicing.
La función bioquímica de PRMT5, su capacidad de transferir grupos metilos a las
argininas presentes –potencialmente‐ en cualquier proteína celular (tanto en núcleo como
en citoplasma), convierte a esta enzima en un poderoso factor de regulación. Se probó
que es capaz de metilar histonas, y que esto controla epigenéticamente la expresión del
gen FLC (Flowering Locus C) [Wang et al., 2007; Schmitz et al., 2008]. La diversidad de
fenotipos observados en la mutante podría deberse, a que existe una gran cantidad de
genes regulados por PRMT5, ya sea de forma directa (a través de la metilación de las
Figura R32: Cambios en el splicing
alternativo de RCA en mutantes de
diferentes PRMTs. Se grafica el cociente
de isoformas larga (L) y corta (C) de RCA
para la planta salvaje (wt) y las
diferentes mutantes mantenidas en luz
continua. Barras, representan la media ±
DE (n=3). Se grafican los resultados de
un experimento típico.
0,0
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
1,2
Col prmt5‐5 prmt5‐1 prmt10 prmt10 prmt11
L/C
Genotipo
RCA
P á g i n a | 150
histonas asociadas a sus promotores) o indirecta (regulando factores de transcripción y
otras proteínas). Con la intención de identificar cuáles son los genes cuya expresión está
controlada por PRMT5 y mejorar nuestro entendimiento sobre el rol de la misma a nivel
celular, decidimos analizar los cambios globales en la expresión génica en la mutante
prmt5‐5 comparándola con la planta salvaje. Para ello, en el laboratorio del Dr. Yanovsky
se llevó a cabo un experimento de microarreglos de expresión. El mismo reveló que 355
genes aumentan su expresión en la mutante prmt5‐5 mientras que 190 genes evidencian
niveles de expresión más bajos (tablas D‐E en el Apéndice). Las tablas R2 y R3 muestran
aquellos que cambian más de 3 veces, ya sea, hacia mayor (R2) o menor expresión (R3).
Tabla R2. Affymetrix ID Locus Aumento en expresión
(prmt5‐5 vs. wt)
266720_s_at AT2G46670;AT2G46790 6.45
255939_at AT1G12730 5.62
256096_at AT1G13650 4.68
256459_at AT1G36180 4.32
256851_at AT3G27930 4.16
266651_at AT2G25760 4.11
244966_at ATCG00600 3.98
245008_at ATCG00360 3.91
254286_at AT4G22950 3.69
244933_at ATCG01070 3.65
244995_at ATCG00150 3.60
245449_at AT4G16870 3.54
262244_at AT1G48260 3.48
261431_at AT1G18710 3.42
252415_at AT3G47340 3.42
257075_at AT3G19670 3.41
252508_at AT3G46210 3.40
259329_at AT3G16360 3.37
258137_at AT3G24515 3.32
258627_at AT3G04460 3.26
266652_at AT2G25760 3.26
246700_at AT5G28030 3.15
250476_at AT5G10140 3.11
251095_at AT5G01510 3.07
260500_at AT2G41705 3.07
253563_at AT4G31150 3.05
Tabla R3. Affymetrix ID Locus
Disminución en expresión
(prmt5‐5 vs. wt)
245928_s_at AT5G24770;AT5G24780 0.18
266142_at AT2G39030 0.21
259802_at AT1G72260 0.23
249917_at AT5G22460 0.25
250942_at AT5G03350 0.26
250445_at AT5G10760 0.26
252170_at AT3G50480 0.27
248062_at AT5G55450 0.27
254255_at AT4G23220 0.27
247684_at AT5G59670 0.28
265837_at AT2G14560 0.29
257793_at AT3G26960 0.32
255595_at AT4G01700 0.33
262408_at AT1G34750 0.33
Tablas R2 y R3: Cambios en los niveles de
expresión génica entre plantas mutantes prmt5-5 y plantas salvajes. Muestran los genes cuya
expresión cambia más de 3 veces (en valor
absoluto) entre la mutante y la salvaje.
P á g i n a | 151
También se analizó si alguno de los genes asociados al reloj circadiano, que pudiera
explicar los fenotipos circadianos asociados a la mutante, presenta diferencias
significativas en su expresión entre la mutante prmt5‐5 y la planta salvaje (Apéndice, tabla
F). Los únicos 2 genes de esta categoría afectados resultaron ser PRR7 y PRR9, ambos con
un aumento de expresión en la mutante prmt5‐5 (Introducción, fig. I17). La bibliografía
disponible a la fecha indicaba que sobre‐expresar PRR9 [Matsushika et al., 2002] genera
plantas de período corto, tanto en caracteres moleculares como fisiológicos. Esto aparecía
como contradictorio con lo que observamos en la mutante prmt5‐5, la cual posee un
período largo a pesar de que sobre‐expresa PRR9 y PRR7.
Por otro lado, utilizando microarreglos del tipo tiling array que cuentan con sondas
prácticamente solapadas en toda la extensión de los genes, fuimos capaces de determinar
que 471 intrones muestran mayor señal de hibridación en la mutante que en la planta
salvaje (Apéndice, tabla G). Tal señal está normalizada a la de los exones vecinos, por lo
tanto, esos intrones se están reteniendo más (o no están siendo eficientemente
eliminados de los mensajeros) en la mutante prmt5‐5. En conclusión, el splicing de varios
intrones está afectado en la mutante. Dado que diferentes bases de datos sobre el
transcriptoma de Arabidopsis thaliana muestran que PRR9 posee más de un ARN
mensajero maduro, decidimos evaluar la posibilidad de que el patrón de isoformas de este
gen estuviera alterado en la mutante prmt5‐5 y eso explicara por qué una mayor
expresión de PRR9 no causa un fenotipo de período más corto.
Existen dos eventos distintos de splicing alternativo que al combinarse dan origen a
las cuatro isoformas reportadas para PRR9: un sitio dador 5’ alternativo en el segundo
exón y la posible retención del tercer intrón (fig. R33 A). Diseñamos primers que nos
permitieran amplificar todas las isoformas codificadas por el gen PRR9. Los resultados de
las RT‐PCR correspondientes se muestran en la figura R30 B. Es evidente que, a pesar de
un gran aumento en la expresión de PRR9, la cantidad de isoforma activa (capaz de
generar la proteína completa) es menor en mutantes de prmt5. Dato que fue confirmado
por PCR en tiempo real (Real Time PCR) o qPCR para prmt5‐5 (fig. 33 C).
P á g i n a | 152
En conclusión, hemos demostrado que PRMT5 regula la expresión de numerosos
genes (directa o indirectamente) y su procesamiento (altera el splicing). Además, la suma
de estos efectos podría mediar el fenotipo circadiano de la mutante prmt5‐5 por su acción
sobre PRR9. Decidimos indagar sobre estas cuestiones.
c. Regulación circadiana del splicing alternativo por PRMT5.
A partir de los datos publicados [Edwards et al., 2006] teníamos evidencias de que la
cantidad de mensajero de PRMT5 oscila de forma circadiana (fig. R34), y decidimos
evaluar el splicing alternativo de alguno de los mensajeros de los genes bajo estudio para
ver si se pueden observar oscilaciones asociadas durante el transcurso del día en tal
proceso, y si las posibles oscilaciones se ven anuladas en la mutante prmt5‐5.
Como se puede observar en la figura R35, el patrón de splicing alternativo del
mensajero de RCA varía a lo largo del día (en un día con 8 hs de luz y 16 hs de oscuridad,
día corto) en plantas salvajes o control. Como esperábamos, las oscilaciones se ven
Figura R33: A) Esquema de las isoformas que presenta el gen PRR9. B) Foto de un gel representativo con 3
réplicas biológicas de plantas salvajes (WT) y mutantes (prmt5-5). La isoforma A (subrayada en rojo) es la
única que da la proteína activa. C) Análisis por PCR en tiempo real de la abundancia de isoforma activa
con respecto al total. *** p < 0,05
P á g i n a | 153
Figura R35: Cambios en el patrón de
splicing de RCA en función de la hora
del día. Las plántulas fueron mantenidas
en condiciones de día corto (8:16) desde
su germinación. Se muestran los
resultados de un experimento tipo con
n=3. Puntos, media ± ES.
Figura R34: Expresión relativa de
PRMT5 según los datos de Edwards et al,
2006. Las plántulas fueron crecidas bajo
un fotoperíodo de 12:12 (horas de
luz:oscuridad) y al octavo día fueron
transferidas a luz continua. Se
recolectaron muestras cada 6 hs.
disminuidas en la mutante de prmt5‐5 y el patrón de splicing es muy distinto al de la
planta salvaje (WT).
Posteriormente decidimos ver si el evento de splicing alternativo de RCA es regulado
por el reloj circadiano. Para tal fin evaluamos lo que sucede con el patrón de isoformas de
RCA en condiciones de “corrida libre” (free running) en luz continua (LL). Como se observa
en la figura R36, si bien las oscilaciones son menores bajo las condiciones de este
experimento, el patrón de splicing alternativo de RCA en la mutante prmt5‐5 es diferente
al de la planta salvaje (WT) en cada punto, y las oscilaciones en la abundancia relativa de
las isoformas de este gen se ven disminuidas. Algo similar se observa para RSp31 y otros
genes regulados por PRMT5 y el reloj circadiano (Apéndice, fig. A para RSp31). También
encontramos ejemplos de genes regulados por PRMT5 a nivel de su procesamiento que no
0 4 8 12 16 20
0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
1.2 WTprmt5-5
Tiempo en Día Corto (hs)
RC
A (
L/C
)
26 34 42 50 58 66 74
0.6
0.8
1.0
1.2
1.4WT: Col
Tiempo en LL (hs)
PR
MT
5(N
ivel
de
Exp
resi
ón)
P á g i n a | 154
presentan oscilaciones en su patrón de splicing alternativo a lo largo del día (ej.:
At5g57630, Apéndice fig. B).
Hasta aquí comprobamos que PRMT5 regula la transcripción y el splicing alternativo
de PRR9, la transcripción de PRR7, y también regula el splicing alternativo de RCA siendo
necesaria para las oscilaciones de éste a lo largo del día y en respuesta al reloj (fig. R35 y
R36). Sin embargo, no sabemos si la regulación del splicing de RCA por PRMT5 en
respuesta al reloj circadiano es directa, o si involucra a PRR7 y a PRR9.
La figura R37 muestra que las oscilaciones en el patrón de splicing alternativo de RCA a
lo largo del día se ven reducidas en una mutante sin PRR7 ni PRR9. Sin embargo, el
cociente L/C de transcriptos de RCA de esta mutante doble, no se ve tan fuertemente
afectado como el de la mutante prmt5‐5 al compararlo con el de la planta salvaje. La
ausencia de PRMT5 anula las oscilaciones y cambia drásticamente el patrón de splicing de
RCA, ya sea en el contexto genético de la planta salvaje (prmt5‐5 vs. Col) o en el de la
mutante doble prr7;prr9 (prr7;prr9;prmt5‐5 vs. prr7;prr9). En conclusión, PRMT5 regula el
splicing alternativo de manera independiente de PRR7 y PRR9, y de modo directo. La
regulación de las oscilaciones en la abundancia relativa de isoformas de RCA en respuesta
al reloj podría, en parte, estar mediada por el circuito al que pertenecen PRR7 y PRR9.
24 28 32 36 40 44 48
0.0
0.5
1.0
1.5
2.0
2.5WT
prmt5-5
Tiempo en LL (hs)
RC
A (
L/C
)
Figura R36: Cambios en el patrón de
splicing de RCA en función de la hora del
día subjetivo. Las plántulas fueron
mantenidas en un régimen de 12:12
(luz:oscuridad) desde su germinación y
fueron transferidas luego a luz continua. Se
muestran los resultados de un experimento
típico con n=3. Puntos, media ± ES.
P á g i n a | 155
Figura R37: relación de isoformas de RCA en condiciones de free-running (luz constante) luego de haber
entrenado las plantas con un fotoperiodo de 8:16 (Luz/Oscuridad). En el eje horizontal se representa el
horario aparente, barra gris: noche subjetiva, barra blanca: día subjetivo. Se compara el cociente L/C de
transcriptos de RCA en la planta salvaje (Col) y en las mutantes prmt5-5, en la doble mutante prr7;prr9, y
en la mutante triple (prmt5-5;prr7;prr9). Cada punto representa la media ± ES (n=3).
Es interesante remarcar en este punto, que también fuimos capaces de demostrar que
el efecto de PRMT5 sobre el período (ej,: movimiento de hojas) ocurre a través de PRR7 y
PRR9. El fenotipo observado en las plantas mutantes prmt5 de un período más largo no se
evidencia al comparar la doble mutante prr7;prr9 con la triple prr7;prr9;prmt5‐5
(Apéndice, fig. C).
d. Alcances de la regulación del splicing alternativo por PRMT5.
De lo expuesto anteriormente se puede concluir que PRMT5 es un regulador del
splicing alternativo en Arabidopsis thaliana y está íntimamente conectado al reloj
circadiano, siendo su expresión y su función, reguladas a lo largo del día. Entonces, nos
cuestionamos acerca del alcance de PRMT5 como modulador del splicing alternativo.
Abordamos el problema mediante dos enfoques diferentes. Por un lado, utilizamos la
tecnología de microarreglos, en particular el sub‐tipo de tiling arrays. Los mismos, como
expliqué más arriba, permiten observar la expresión de un gen con mayor resolución y,
por ejemplo, evaluar si un intrón y/o exón “se expresa” en una dada condición (es decir, si
24 28 32 36 40 440.0
0.5
1.0
Colprmt5-5prr7;prr9;prmt5-5prr7; prr9
Tiempo en luz continua (LL)
L/C
RCA
P á g i n a | 156
está incluido/retenido en el mensajero maduro). La figura R38 muestra un ejemplo del
análisis utilizado, el locus At2g43430, que según lo predicho codifica para una glioxilasa
mitocondrial GLX2‐1, muestra una mayor retención (mayor señal) de su primer intrón.
Si bien esta aproximación es muy útil para el fenómeno de retención de intrones, no
es sencillo definir otros tipos de eventos de splicing alternativo. Sin embargo, como
expresé antes fuimos capaces de determinar que 471 intrones, de un total de 67791,
tenían significativamente más señal en la mutante prmt5‐5 que en las plantas salvajes o
WT. De lo anterior se deduce que el efecto de PRMT5 no es sobre el splicing en general
sino que es específico de algunos eventos particulares.
Debido a los límites que posee esta técnica, es que decidimos realizar un análisis de
alta resolución con un panel de RT‐PCR similar al descripto previamente (Capítulo I,
Extensión del Análisis [Simpson et al., 2008]). En este caso analizamos cerca de 300
eventos de splicing alternativo comparando la mutante prmt5‐5 con el control WT. La
tabla R4 muestra los genes/loci con eventos de splicing alternativo que presentan
diferencias mayores al 5 % (valor absoluto) en la abundancia relativa de la isoforma más
pequeña, a la que llamamos X, con respecto al total de isoformas analizadas para tal
evento. Observamos que, 44 de los 288 eventos analizados presentan diferencias entre la
mutante prmt5‐5 y el control, y PRR9 (At2g46790) es uno de los eventos analizados que
muestra una de las diferencias más grandes.
Intensidad de la se
ñal (log)
Figura R38: Análisis de retención de
intrones por tiling arrays del locus
At2g43430. Las plántulas fueron crecidas
en luz continua. El análisis lo llevó a cabo
Xu Zhang en el laboratorio de Justin
Borevitz de la Universidad de Chicago.
P á g i n a | 157
Tabla R4: eventos de splicing alternativo alterados en la mutante prmt5-5. Se muestra la
diferencia entre el cociente de la abundancia de la isoforma X sobre el total de isoformas del
evento analizado para prmt5-5 y el control. Mediante un test de Student se determinó la
significancia de tales diferencias como valor p de la prueba
Locus Evento de splicing
Tamaño de isoforma X (pb)
Tamaño de otras isoformas detectadas (nucleótidos)
Diferencia entre “isoforma X/Todas” de prmt5-5 vs. WT (%)
Valor- p de la prueba
At1g01060 Ret. Int. 160 330 -5.691 0.001
At2g43410 Ret. Int. 406 540 -7.092 0.009
At1g49730 Ret. Int. 238 342 -8.918 0.000
At5g37055 Ret. Int. 355 524 -9.750 0.009
At4g23260 Ret. Int. 285 401 -28.459 0.000
At5g25610 Ret. Int. 231 607 -71.686 0.006
At2g46790 Ret. Int./5' SS 244 252, 332 & 339 -56.828 0.001
At5g24270 Ret. Int./5' SS 308 337, 416 & 445 -24.585 0.000
At3g16800 Ret. Int./3' SS 367 385, 572 & 590 -31.590 0.000
At5g05550 Exon Skipping 210 308 32.721 0.000
At5g48150 Exon Skipping 204 284 18.657 0.000
At3g23280 Exon Skipping 128 201 18.213 0.000
At4g24740 Exon Skipping 143 309 16.068 0.003
At3g20270 Exon Skipping 195 217 8.514 0.005
At3g25840 Exon Skipping 283 341 6.506 0.000
At3g01150 Exon Skipping 166 268 -13.698 0.000
At1g54360 5´SS 129 152 39.213 0.001
At5g57630 5´SS 210 254 31.070 0.006
At4g32730 5´SS 184 199 30.926 0.001
At2g27230 5´SS 208 246 27.230 0.000
At2g15530 5´SS 222 241 21.124 0.000
At1g53650 5´SS 177 195 18.934 0.000
At5g13220 5´SS 173 226 16.355 0.001
At4g38510 5´SS 216 232 & 289 15.530 0.003
At2g04790 5´SS 167 190 11.140 0.002
At5g18620 5´SS 213 222 9.278 0.000
At1g49950 5´SS 238 193 & 400 7.699 0.004
At2g39730 5´SS 247 258 5.571 0.000
At1g72650 5´SS 183 201 -7.475 0.003
At2g38880 5´SS 310 372 -10.439 0.001
At3g12250 5´SS 220 329 -16.288 0.000
At3g23900 5´SS 118 125 -16.766 0.002
At3g29160 5´SS 159 307 -18.240 0.008
At3g19840 5´SS 171 207 -26.201 0.001
At2g33480 5´SS 400 487 -27.161 0.002
At1g76510 5´SS 189 212 -28.000 0.000
At4g02430 3´SS 153 163 27.455 0.010
At3g62190 3´SS 144 334 15.035 0.000
At4g31720 3´SS 189 206 12.374 0.000
At1g60850 3´SS 108 119 12.348 0.001
At3g53270 3´SS 264 360 11.739 0.002
At3g12570 3´SS 159 188 10.177 0.009
At2g37340 3´SS 123 341 -6.472 0.007
At4g12790 3´SS 212 341 -9.041 0.009
P á g i n a | 158
El hecho de contar en el panel con diferentes tipos de splicing alternativo nos permitió
evaluar la pregunta de si algún tipo particular de evento se encuentra en frecuencia más
afectado en la mutante prmt5 que otro. La respuesta a tal pregunta podría acercarnos al
mecanismo molecular por el cual PRMT5 regula al proceso de splicing. Con este objetivo
evaluamos las diferencias entre representación en el panel de cada tipo de splicing, y
respuesta (leída como cambio en el patrón de isoformas) a la mutación prmt5‐5 de cada
evento. La figura R39 muestra los resultados de tal análisis. Se observa una sobre‐
representación de los 5´ss o sitios dadores y una sub‐representación de los 3’ss o
aceptores. Esto indicaría que la modulación de PRMT5 sobre el splicing alternativo tiene
que ver con la elección de los sitios dadores (5´ss), más que con los aceptores o el proceso
global de splicing.
Tomando los resultados de esta sección en conjunto podemos concluir que PRMT5
colabora en el reconocimiento de 5’ss débiles. Esta hipótesis se basa en la mayor
representación de 5´ss afectados en la mutante prmt5‐5 y la menor representación de
3´ss, y en el hecho de que de todos los intrones analizados a nivel genómico (67791) con
los tiling arrays de Affymetrix, es decir los 471 intrones “alterados”, muestran mayor señal
en las plantas mutantes prmt5‐5 que en la planta salvaje.
5'SS 3'SS Ret. Int. Exon skipping0.0
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
0.6Totalprmt5-5
RF=1,85p=5,0.10-4
RF=0,44p=4,0.10-5
RF=1,64p=0,072 RF=0,92
p=0,49
Fre
cuen
cia
del e
vent
o
Figura R39: Representación de los eventos
de splicing alternativo en el panel versus
frecuencia de cambio. Se grafica la
frecuencia de cada evento, o tipo de
splicing alternativo, representado en el
panel (Total), y la frecuencia de los mismos
que presentan diferencias entre la mutante
(prmt5-5) y la planta salvaje. RF: factor de
representación, o frecuencia de eventos
con cambio en prmt5-5 sobre su
frecuencia en el panel; y el valor p
correspondiente. Exon skipping, salteado
exónico.
P á g i n a | 159
3. Descifrando el mecanismo de acción de PRMT5 sobre el splicing
alternativo (parte I).
A partir de los resultados previos decidimos que el paso siguiente debía ser la
búsqueda de una característica común entre los eventos de splicing alterados en la
mutante prmt5‐5. Ya contábamos con la información de que los sitios dadores (5’ss) son
los más afectados por la mutación en PRMT5, entonces pensamos que era lógico iniciar la
búsqueda allí.
La comparación entre los 5’ss de los eventos de splicing más afectados (a partir de los
datos de los tiling arrays) en la mutante prmt5‐5 y la secuencia consenso para el 5’ss de
Arabidopsis thaliana (obtenida del SpliceRack [Sheth et al., 2006]), revela una disminución
importante y significativa en la frecuencia de la G dominante en la posición ‐1 y una
tendencia a la aleatoriedad en los nucleótidos presentes en las posiciones ‐2, ‐1 y +5 en los
eventos afectados (fig. R40).
Concluimos entonces que PRMT5 colabora de alguna manera con el reconocimiento
de estos sitios 5’ss débiles (alejados del consenso). Dado que estos 5’ss que se alejan del
consenso abundan en la juntura exón‐intrón de eventos de splicing alternativo, esta
característica convierte a PRMT5 en un poderoso regulador de este proceso.
Figura R40: Diferencias en los sitios
dadores (5’ss) de los eventos de splicing
alterados en la mutante prmt5-5. Los
pictogramas muestran la distribución de
nucleótidos en un 5’ss usando WebLogo
[Crooks et al., 2004]. RF: factor de
representación, o frecuencia de un
nucleótido particular; y el valor p
correspondiente a un test
hipergeométrico.
P á g i n a | 160
Figura R41: Análisis de los patrones de metilación de
proteínas celulares en plantas salvaje y mutantes
prmt5-5. Western blot revelado con el anticuerpo
SYM10 que reconoce argininas simétricamente
dimetiladas. Comparación de un extracto proteico
total de una planta salvaje (WT) y una mutante
prmt5-5. Las flechas indican bandas
correspondientes a proteínas que pierden su
metilación en la mutante.
Dado que PRMT5 tiene la capacidad reportada en células de mamífero y en Drosophila
[Gonsalvez et al., 2006; Gonsalvez et al., 2007] de metilar, entre otras, histonas y
proteínas Sm, que en conjunto podrían afectar la transcripción y el procesamiento de
diferentes genes, decidimos evaluar qué sucedía en Arabidopsis thaliana. Los reportes
indican que la metilación de histonas en este organismo, mediada por PRMT5 causa la
inhibición de la expresión de FLC [Wang et al., 2007; Schmitz et al., 2008], pero ¿qué
sucede con la metilación de las Sm?
Como muestra la figura R41, el patrón de proteínas con argininas di‐metiladas
analizado por Western blot con el anticuerpo SYM10, es muy diferente entre la planta
salvaje y la mutante prmt5‐5. La diferencia es muy evidente a pesos moleculares bajos,
donde se encuentran o “corren” las proteínas Sm y simil‐Sm (Sm‐like proteins, Lsm). En
conclusión, estos resultados indican que la dimetilación simétrica de las argininas de
proteínas Sm y relativas, entre otras proteínas celulares, se ve fuertemente reducida en
las mutantes que carecen de la enzima PRMT5 funcional.
P á g i n a | 161
4. Evidencias de un rol conservado: Drosophila melanogaster.
Debido a que hay una abundante bibliografía sobre los efectos de PRMT5/Dart5 en
moscas, a la posibilidad concreta de una colaboración con el grupo de Fernanda Ceriani
(experta en cronobiología de moscas), y a que podíamos contar con moscas mutantes
para PRMT5 (dart5 y csul); nos pareció interesante aprovechar estas ventajas y evaluar si
los hallazgos realizados en el sistema de plantas están conservados en un sistema animal.
Un primer paso fue la determinación de un fenotipo circadiano en las mutantes dart5
de Drosophila melanogaster. El grupo de Fernanda Ceriani llevó a cabo una serie de
experimentos, tras los cuales demostraron que las mutantes dart5 son arrítmicas
(Apéndice, fig. D). El segundo paso consistió en evaluar si existen cambios en diferentes
eventos de splicing alternativo de genes relacionados, y no relacionados, al reloj biológico
de Drosophila. Un experimento de microarreglos similar al llevado a cabo para Arabidopsis
(tiling array) evidenció que 418 intrones son retenidos en mayor proporción, y 30 en
menor, en las mutantes dart5 de Drosophila. Entre ellos están representados los
transcriptos de diferentes genes relacionados al reloj (Apéndice, tablas H‐I).
Con los primeros pasos dados, lo siguiente fue validar estos resultados a través de la
técnica de RT‐PCR radiactiva, para algunos de los candidatos seleccionados a partir de los
microarreglos, y para otros de interés que no habían aparecido en el análisis. La figura R42
muestra que algunos de los eventos analizados presentan oscilaciones (ej.: takeout) que
son anuladas por la ausencia de PRMT5/Dart5. Otros no presentan cambios evidentes en
los dos momentos seleccionados, pero de todas formas, el patrón de splicing alternativo
de la mutante dart5 es diferente al de la mosca salvaje (wt). El caso de per es
paradigmático (fig. 42E), se puede observar que la marcada oscilación en la abundancia
relativa de sus isoformas durante el día subjetivo se anula completamente en ausencia de
PRMT5/Dart5.
P á g i n a | 162
Figura R42: A-D) Relación de isoformas de los transcriptos de diversos genes en dos momentos del día subjetivo
(CT, circadian time) en condiciones de free-running. TO o takeout, CG8266, CG14180, CG7199 son genes que
fueron identificados por el microarreglo y validados por RT-PCR. takeout es un gen relacionado al reloj
circadiano. CT2, comienzo del día subjetivo y CT14, comienzo de la noche subjetiva. Barras, media ± ES (n=4)
E) Relación de isoformas de period (per), otro gen del reloj, en condiciones constantes (free-running). Se graficó
el cociente entre la isoforma de retención de un intrón en el 3’UTR y la que lo procesa totalmente (llamadas
también A/B’, [Cheng et al., 1998]). Puntos, media ± ES (n=4).
TO
CT2 CT140.00
0.01
0.02
0.03
0.04
0.05
0.06wtdart5
Hora del día
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CG8266
CT2 CT140.0
0.1
0.2
0.3
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Hora del día
L/(L
+C
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CG14180
CT2 CT140.0
0.1
0.2
0.3
0.4
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0.6wtdart5
Hora del día
L/(L
+C)
CG7199
CT2 CT140.0
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
0.6wtdart5
Hora del día
L/(L
+C)
A B
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0
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P á g i n a | 164
5. Descifrando el mecanismo de acción de PRMT5 sobre el splicing
alternativo (parte II).
-Ha!
Lana Turner, El Cartero Siempre Llama Dos Veces
La “frase célebre” de arriba hace alusión a que la suerte de haber encontrado que la
mutante “179” presenta un fenotipo a nivel de splicing alternativo volvió a golpear la
puerta. Expliqué más arriba que la mutante prmt5‐5 se debe a una mutación puntual en el
gen que codifica para la enzima PRMT5. La mutación es un cambio de base donde la G que
ocupa el extremo 3’ del exón 20 es reemplazada por una U, generando un codón de
terminación o stop prematuro (GGA—UGA). Esto hace que no haya proteína funcional. Lo
interesante (y afortunado a la vez) es que por esa misma mutación, ese 5’ss se hace débil
al cambiar la G en la posición ‐1 del consenso (pasa de ATGgtacctg a ATTgtacctg). Como
consecuencia de todo esto, el intrón “río abajo” de la mutación comienza a ser retenido
en la mutante (fig. R44). Es interesante ver cómo la banda correspondiente al producto de
RT‐PCR (señalado por la flecha) de retención del intrón 20, que está “río abajo” del cambio
de base aparece en la mutante prmt5‐5 pero es eliminado en la planta heterocigota.
Col Col H H prmt5 H Col prmt5 prmt5 Col
Figura R44: RT-PCR (ID 315 –apéndice, primers del panel) que amplifica una región que contiene la
mutación en los transcriptos del gen que codifica para PRMT5. Col, es la planta salvaje; H, heterocigota;
y prmt5, la mutante homocigota prmt5-5. La flecha roja señala la banda correspondiente al producto de
RT-PCR de retención del intrón 20.
P á g i n a | 165
Este resultado refuerza la evidencia (fig. R39, R40 y R43) de que PRMT5 funciona
colaborando con el reconocimiento de sitios débiles 5’ss o dadores de splicing.
Discutiremos esto en la próxima sección junto con otras evidencias que podrían apuntar
en el mismo sentido.
P á g i n a | 166
Discusión (Capítulo II)
PRMT5 y la regulación del splicing
En esta sección discutiré las distintas evidencias que convergen hacia la elucidación
del mecanismo de regulación de PRMT5 sobre el proceso de splicing alternativo. Los
primeros ítems serán útiles para regresar sobre los resultados, y tener un panorama más
completo a la hora de profundizar sobre el mecanismo que subyace a la actividad de
PRMT5 como un regulador del proceso de splicing alternativo.
1. Especificidad La figura R29 constituye la primera pista sobre la especificidad del efecto de PRMT5
sobre el procesamiento de los mensajeros. En esta figura podemos ver que, si bien el
splicing alternativo de los transcriptos de RCA y RSp31 se encuentra alterado, los eventos
de splicing alternativo que sufren RSZ33 y AtPP5 no evidencian ningún cambio.
Posteriormente investigamos si otras metil‐transferasas de proteínas eran capaces de
provocar cambios semejantes a los gatillados por PRMT5. Probamos a PRMT10 y a
PRMT11, dos metil‐transferasas del tipo I o asimétricas. PRMT11 es capaz de metilar
histonas y otras proteínas de extractos celulares. Además, puede interactuar con MBD7
(Methyl‐DNA‐Binding) que sería uno de sus sustratos asociando, posiblemente, la
metilación de argininas a la metilación del ADN [Scebba et al., 2007]. PRMT10 es todavía
más interesante ya que metila a la histona 4 en su arginina 3 (H4R3), el mismo sitio que
utiliza PRMT5, y se sabe que mutantes nulos de PRMT10 en Arabidopsis thaliana generan
un fenotipo de floración tardía, de la misma forma que los mutantes para PRMT5
(actuando sobre FLC) [Niu et al., 2007]. La figura R32 muestra que las mutantes prmt10 y
prmt11 de estas metil‐transferasas asimétricas no presentan diferencias significativas con
en los patrones de splicing alternativo de RCA con respecto a la planta salvaje (resultados
similares se obtuvieron para RSp31).
En resumen, podemos concluir que la metil‐transferasa simétrica PRMT5 modula los
patrones de splicing alternativo de RCA y RSp31. Tal efecto es específico ya que no
P á g i n a | 167
modifica a otros eventos de splicing como los presentes en los genes AtPP5 y RSZ33. Otras
metil‐transferasas, PRMT10 y PRMT11, no generan esta clase de respuesta a nivel del
splicing de los eventos ensayados. Por lo tanto, el efecto de PRMT5 sobre el splicing
alternativo es específico de esta metil‐transferasa y no es un mecanismo común a esta
familia de enzimas.
2. PRMT5 no afecta los cambios sobre el splicing alternativo gatillados por transiciones de luz/oscuridad
Las plantas mutantes prmt5 muestran alteraciones en las respuestas a la luz,
presentan floración tardía, crecen más lento y alargan más su hipocotilo en diferentes
condiciones de iluminación. Todo esto hizo que nos planteáramos la hipótesis inicial de
que la misma es una mutante de la señalización lumínica. Esta condición la hace
interesante para nosotros, dado que además modifica la abundancia de isoformas de
RSp31 y RCA, eventos que responden a los cambios en la iluminación (Capítulo I).
Decidimos entonces, evaluar si los cambios gatillados por transiciones de luz/oscuridad
sobre los patrones de splicing alternativo de los eventos mencionados están alterados en
la mutante. La figura R30 muestra que, si bien el cociente mRNA3/mRNA1 de RSp31 es
diferente entre la mutante prmt5‐5 y la planta salvaje, la magnitud del cambio del splicing
alternativo entre luz y oscuridad es similar para los dos genotipos. La figura R31 muestra
que al relativizar a 1 los valores del cociente mRNA3/mRNA1 de RSp31 correspondientes
al tratamiento con luz en cada genotipo, el efecto de la oscuridad (o las “veces de efecto”)
es prácticamente idéntico entre la planta salvaje (wt) y la mutante prmt5‐5.
En conclusión, PRMT5 altera la abundancia relativa de isoformas de RSp31 y de RCA
sin modificar la respuesta a transiciones de luz/oscuridad de los mismos. Esta conclusión
es importante también en el marco del capítulo I, ya que al ensayar una mutante con
fenotipo circadiano como es el caso de la mutante prmt5‐5 se sigue observando el efecto
de luz/oscuridad. En este nuevo marco que proporciona el capítulo II podemos establecer
que más allá de la regulación circadiana sobre la transcripción y el procesamiento de RCA
y RSp31, la luz ejerce otro efecto independiente del reloj biológico que se hace evidente
con nuestro protocolo de transiciones de luz/oscuridad.
P á g i n a | 168
3. Efectos de PRMT5 sobre el transcriptoma de Arabidopsis thaliana Los diferentes y variados fenotipos de la mutante [Pei et al., 2007] nos llevaron a
pensar que PRMT5 debía alterar la expresión y el splicing alternativo de muchos genes.
Para analizar la extensión de estos efectos realizamos un análisis de expresión por
microarreglos. El mismo reveló que 355 genes aumentan su expresión en la mutante
prmt5‐5 mientras que aproximadamente 190 genes evidencian niveles de expresión más
bajos. Las tablas R2 y R3 muestran aquellos loci para los que se detectó un cambio de más
de 3 veces, ya sea, hacia mayor (R2) o menor expresión (R3). En el apéndice (tablas D‐E) se
encuentran todos los que presentan un cambio significativo. Dado que no es el foco de
interés de la presente tesis estudiar cómo se regula la transcripción de los diferentes
genes en respuesta a PRMT5, sino que estamos interesados en la regulación del splicing
alternativo por PRMT5, no discutiré en detalle estos resultados. Sí me parece importante
destacar que la mayoría de los genes que pertenecen al grupo de los que más cambian en
su nivel de expresión entre la mutante prmt5‐5 y la planta salvaje, poseen 1 o más eventos
de splicing alternativo (por ejemplo, los primeros 6 loci de la tabla R2 sufren splicing
alternativo según la base de datos tair –www.arabidopsis.org‐), abriendo las puertas a una
posible interacción entre estos procesos que podría subyacer al mecanismo íntimo de
acción de PRMT5.
El análisis llevado a cabo sobre tiling‐arrays nos permitió observar que 471 intrones se
retienen más en la mutante que en la planta salvaje (Apéndice, tabla G). Este hecho es
muy importante, dado que nos arroja las primeras pistas sobre un posible mecanismo de
acción general detrás de la función de PRMT5. El hecho de que todos los intrones que
presentan diferencias de retención entre la planta mutante y la salvaje, se retengan más
en la primera, nos dice que la ausencia de PRMT5 disminuye la eficiencia en el
reconocimiento y/o eliminación de ciertos intrones (son sólo 471 en más de 60000
analizados). Volveré sobre esto más adelante en la discusión.
4. Efectos circadianos de PRMT5 El análisis de microarreglos nos permitió identificar qué genes del reloj están
alterados en la mutante prmt5‐5 que nos acerquen al entendimiento de sus fenotipos
P á g i n a | 169
circadianos (Apéndice, tabla F). Sorpresivamente, sólo PRR9 (APRR9) y PRR7 (APRR7) se
sobre‐expresan más de 2 veces en la mutante que en la salvaje o wt (además de FLC).
Cuando PRR9 y PRR7 son sobre‐expresados en Arabidopsis thaliana se obtienen plantas
con período más corto. Mientras que cuando estos genes sufren mutaciones que anulan la
función de la proteína, las plantas tienen períodos más largos [Matsushika et al., 2002;
Farré et al., 2005; Nakamichi et al., 2010]. La mutante prmt5‐5 tiene una elevada
expresión de PRR9 y PRR7 comparada con la planta salvaje, pero conlleva un fenotipo de
período más largo. Esta paradoja se resuelve con los resultados que muestra la figura R33.
A pesar del aumento en la expresión de PRR9, prácticamente no se sintetiza la isoforma
que genera la proteína activa, debido al dramático cambio en el patrón de splicing
alternativo. Posiblemente, la suma de los efectos sobre el splicing alternativo de PRR9 y la
transcripción de PRR7 justifiquen parcialmente el fenotipo de período más largo.
Además de modular la expresión y el procesamiento de estos componentes del reloj,
sabemos que PRMT5 regula el splicing alternativo de otros genes. Nos pareció importante
determinar si el patrón de splicing alternativo de algún evento regulado por PRMT5
presenta oscilaciones circadianas. Este interrogante surge a partir de los resultados
anteriores, y del hecho de que el mensajero de PRMT5 oscila a lo largo del día en
respuesta al reloj (fig. R34). Es decir que PRMT5 modula la expresión de algunos
componentes del reloj circadiano, y este último regula la expresión de PRMT5.
Comenzamos nuestra búsqueda estudiando el comportamiento a lo largo de un día del
patrón de splicing alternativo de RCA. La figura R35 muestra que el patrón de isoformas de
dicho gen oscila a lo largo del día en la planta salvaje o WT (se muestra un día corto
porque las oscilaciones son más pronunciadas). Más interesante aún es el hecho de que
dichas oscilaciones se ven muy atenuadas o (prácticamente) anuladas en la mutante
prmt5‐5. Estos resultados se repiten en condiciones de corrida libre (free running) o
condiciones constantes (fig. R36). Por consiguiente, las oscilaciones en el patrón de
splicing alternativo de RCA a lo largo del día están reguladas por el reloj circadiano. A
esto último se le debe agregar que PRMT5 es necesaria para que se observen esas
oscilaciones circadianas, ya que en la mutante prmt5‐5 no están presentes. Con RSp31,
P á g i n a | 170
entre otros, se obtienen resultados similares (Apéndice, fig. A) y también hay ejemplos de
genes que no presentan oscilaciones circadianas en la abundancia de sus isoformas que de
todas formas son regulados por PRMT5 (Apéndice, fig. B). Es decir que la actividad de
PRMT5 no está limitada a la regulación del splicing alternativo de genes modulados por
el reloj. Sin embargo, debemos responder un interrogante relacionado con estas
evidencias: ¿PRMT5 regula el splicing de RCA de manera indirecta a través de PRR9 y
PRR7?
Para esto fue necesario trabajar con las plantas mutantes simples prr7, prr9 y prmt5‐
5, para obtener la mutante doble prr7;prr9 y la mutante triple prr7;prr9;prmt5‐5. Con las
mismas somos capaces de evaluar si PRR7 y PRR9 son necesarios para los efectos de
PRMT5 sobre el patrón de splicing alternativo de RCA. La figura R37 muestra que los
efectos de PRMT5 sobre el splicing alternativo de RCA no requieren de PRR7 y PRR9. La
mutante doble (prr7;prr9) altera el patrón de splicing de RCA con respecto al día, al
compararlo con el de la planta salvaje (Col). Pero, si comparamos su efecto sobre el patrón
de splicing de RCA con el de la mutante prmt5‐5, podemos observar que los cambios en
esta última son más fuertes. Además, en la mutante triple (prr7;prr9;prmt5‐5) el efecto es
el mismo que en la mutante simple prmt5‐5, lo que demuestra que PRMT5 no requiere de
PRR7 y PRR9 funcionales para ejercer una regulación sobre el splicing alternativo de RCA.
En conclusión, PRMT5 regula el splicing alternativo de RCA de manera independiente de
PRR7 y PRR9, tiene un efecto directo sobre la abundancia de isoformas de RCA.
Resultados similares se obtuvieron con RSp31 (Apéndice, fig. A). Además, el hecho de que
las oscilaciones en el patrón de splicing de RCA se vean disminuidas en la mutante doble
(prr7;prr9) sugiere que los efectos circadianos podrían estar mediados ‐o asociados‐ a las
funciones de PRR7 y PRR9. En este camino de razonamiento, fuimos capaces de demostrar
que los efectos de la mutante prmt5‐5 sobre el período se producen a través de PRR7 y
PRR9 (Apéndice, fig. C). Si estos factores están mutados (prr7;prr9) adicionar la mutación
prmt5‐5 (prr7;prr9;prmt5‐5) no genera mayor alargamiento del período. Este dato es muy
relevante para poner en marco todos los resultados y sugiere, en conjunto con los datos
previos, que PRMT5 podría ser una parte integral del “circuito de los PRRs” del reloj
P á g i n a | 171
circadiano de Arabidopsis thaliana (Introducción, fig. I17; [Farré et al., 2005; McClung,
2006; Nakamichi et al., 2010]).
5. PRMT5 y su relación con los sitios 5’ dadores de splicing Hasta aquí he venido haciendo un racconto de los resultados y las conclusiones de la
sección pasada sin detenerme demasiado en ninguno. En este ítem en particular trataré
de desarrollar con mayor profundidad nuestros hallazgos y sus posibles interpretaciones
dado que son el fundamento del presente capítulo.
Al encontrarnos estudiando los efectos de una metil‐transferasa (que afecta las
histonas) en el splicing alternativo, no podemos eludir considerar el modelo cinético. En
nuestro laboratorio, como así también en otros, se ha ido acumulando evidencia a favor
de la regulación del splicing alternativo por la cinética de la ARN polimerasa II (pol II) sobre
el molde que está siendo transcripto [de la Mata et al., 2003; Alló et al., 2009; Schor et al.,
2009; Schor et al., 2010]. El modelo cinético plantea que la velocidad de elongación de la
polimerasa afecta el momento en que diferentes sitios de splicing se presentan como
posibles sustratos competidores frente a la maquinaria de splicing (Introducción, fig. I6).
Brevemente, un avance veloz y sin pausas de la polimerasa provocará que sitios débiles
(alejados de la secuencia consenso) puedan competir con otros más fuertes,
disminuyendo así su reconocimiento por la maquinaria de procesamiento [Fededa y
Kornblihtt, 2008; Kornblihtt et al., 2009]. Además de los factores que modifican
directamente la actividad de la polimerasa, aquellos que modifican la estructura
cromatínica, también pueden afectar el avance de la ARN polimerasa a través del molde
[Orphanides y Reinberg, 2000; Schneider et al., 2004; Ingvarsdottir et al., 2007]. Sabemos
que PRMT5 regula la actividad transcripcional de más de 500 genes de Arabidopsis
thaliana (Apéndice, tablas D‐E) y, se ha reportado que la marca de dimetilación sobre la
arginina 3 de la histona 4 (H4R3) que causa esta enzima, es responsable de la represión
transcripcional de FLC [Wang et al., 2007; Schmitz et al., 2008]. En base a todo esto,
podríamos explicar los efectos de PRMT5 sobre el splicing alternativo a través del modelo
cinético. Discutamos en detalle nuestros hallazgos, prestando especial atención al ajuste
de nuestras conclusiones e interpretaciones con este modelo.
P á g i n a | 172
Como expresé más arriba, 471 intrones se retienen más en la mutante que en la
planta salvaje (Apéndice, tabla G) según reveló el análisis de microarreglos. El hecho de
que todos los intrones que presentan diferencias de retención entre la planta mutante y la
salvaje, se retengan más en la primera, nos dice que la ausencia de PRMT5 disminuye la
eficiencia en el reconocimiento y/o eliminación de ciertos intrones. Es interesante
destacar que la retención intrónica se diferencia mecanísticamente del resto de los tipos
de splicing alternativo en que no involucra una competencia entre distintos sitios dadores
y aceptores de splicing (Introducción, fig. I5). Esta falta de competencia junto a lo
expresado más arriba, debilita la hipótesis de que el efecto global de PRMT5 ocurra a
través de la cromatina (por la modificación en H4R3) y de acuerdo al modelo cinético.
Dado que el análisis de estos tiling arrays no nos permitió ver qué sucede con otras
clases de eventos de splicing alternativo diferentes de la retención intrónica, decimos
utilizar el panel de RT‐PCR ya descripto (Capítulo I, Extensión del análisis) para evaluar los
efectos de PRMT5 sobre los diferentes eventos. La tabla R4 muestra que todas las clases
de splicing alternativo (retención de intrones, salteado exónico ‐exon skipping‐, 5’ss y 3’ss
alternativos) presentan alteraciones en la mutante prmt5‐5 respecto de la planta salvaje.
Sin embargo, un análisis más profundo muestra una sobre‐representación de eventos 5’ss
alterados (fig. R39). Al comparar la distribución de frecuencias de representación de cada
clase de evento en el panel con la frecuencia de eventos que presentan cambios, se
observa un enriquecimiento en sitios dadores (5’ss) alterados. Además, hay una sub‐
representación de aceptores (3’ss), y una distribución pareja con respecto a las
retenciones intrónicas y a los eventos de salteado exónico (Exon skipping). Nuevamente,
estos resultados descartarían al modelo cinético como marco de la regulación que efectúa
PRMT5 sobre el splicing alternativo. De ser éste el mecanismo involucrado, no habría por
qué esperar esta distribución particular que le otorga cierta preferencia a los eventos 5’ss
en la regulación del splicing alternativo llevada a cabo por la acción de PRMT5.
Este último resultado acerca de una mayor cantidad de eventos 5’ss alternativos
afectados por PRMT5 derivó en la búsqueda de una característica común a los sitios
P á g i n a | 173
dadores de splicing alternativo afectados. Volviendo a los resultados obtenidos de los
microarreglos, tomamos los eventos más afectados en la mutante prmt5‐5, y comparamos
sus secuencias en el 5’ss con la secuencia consenso para este sitio en Arabidopsis thaliana
[Sheth et al., 2006]. La figura R40 muestra que los sitios afectados en la mutante prmt5‐5
son débiles, están alejados en su secuencia del consenso. Esto nos lleva a plantear la
posibilidad de que PRMT5 colabore con el reconocimiento de sitios dadores de splicing o
5’ss débiles. Este resultado genera una nueva hipótesis, PRMT5 favorece el
reconocimiento de los sitios 5’ss débiles. Evaluemos si esta hipótesis se ajusta a nuestros
resultados, volviendo a analizar los datos del panel de RT‐PCR.
Hay un enriquecimiento de sitios 5’ss alternativos alterados en la mutante prmt5‐
5 con respecto a la planta salvaje. Al mismo tiempo, hay una sub‐representación
de eventos 3’ss alternativos.
La distribución de intrones retenidos y exones cassette alternativos no muestra
diferencias respecto de su frecuencia de representación en el panel. Dado que
estos eventos pueden combinar 5’ss y 3’ss débiles es de esperar que algunos
estén afectados y otros no.
Aquellos sitios 5’ss que presentan una base distinta a la G en la posición ‐1 (la
última base del exón en la juntura con el intrón) son menos reconocidos en la
mutante prmt5‐5.
Es de esperar que los intrones que tienen sitios 5’ss débiles sean retenidos. Todos
los eventos de retención de intrón del panel muestran mayores niveles de
retención en la mutante que en la planta salvaje. Aún más, todos los intrones que
presentan cambios en el análisis de microarreglos se retienen más en la mutante
prmt5‐5.
Dado que los exones cassette alternativos pueden presentar sitios 5’ss débiles, es
también un hecho relevante a esta discusión, que la mayoría de los eventos de
saltado exónico (exon skipping) que cambian en el panel se incluyen menos en la
mutante prmt5‐5.
P á g i n a | 174
El cambio T por G en la última base del exón 20 del gen que codifica para PRMT5,
mutación puntual que dio origen a la mutante prmt5‐5, provoca un alejamiento
de ese 5’ss del consenso (debilitamiento) y concomitantemente, una mayor
retención del intrón 20 (la G que cambia es de la posición ‐1). Como muestra la
figura R44, la retención de ese intrón desaparece en presencia de PRMT5 (el
heterocigota tendría 1 alelo sano del gen que codifica para PRMT5).
Si bien nada de lo antedicho descarta la posibilidad de que la regulación del splicing
alternativo que lleva a cabo PRMT5 ocurra por su rol de metil‐transferasa de histonas que
afectaría la estructura cromatínica, y provocaría cambios en la elongación de la pol II, es
difícil entender cómo el modelo cinético podría explicar todos los resultados que apuntan
a un sesgo especial en la modulación de PRMT5 sobre eventos 5’ss alternativos. Repito
(como dice Residente de Calle 13), si bien no podemos descartar al modelo cinético en el
rol de PRMT5 sobre la modulación del splicing alternativo, decidimos generar un nuevo
paradigma en el que los distintos resultados puedan ser entendidos.
6. PRMT5, los 5’ss y las proteínas Sm PRMT5 fue clonado inicialmente en mamíferos como “Janus kinase binding protein 1”
y al mismo tiempo se demostró que podía metilar las histonas H2A, H3 y H4 [Branscombe
et al., 2001]. Se la puede encontrar tanto en el citoplasma como en el núcleo. En el
citoplasma forma parte de un complejo llamado “metilosoma”, donde está involucrada en
la metilación de las proteínas Sm [Friesen et al., 2001]. Durante la fase citoplasmática de la
biogénesis snRNP, el complejo SMN carga las proteínas Sm sobre los sitios Sm de los
snRNAs. La afinidad del complejo SMN es mayor por las Sm metiladas (sDMA) que por las
Sm no metiladas, o metiladas asimétricamente [Brahms et al., 2001; Meister et al., 2001].
Mutaciones en el ortólogo de PRMT5 en moscas (Dart5) generan la pérdida completa de
los residuos de sDMA en las proteínas Sm [Gonsalvez et al., 2006] lo que, al parecer, no
interfiere con el ensamblado de los complejos de snRNP [Gonsalvez et al., 2008]. En
células humanas, PRMT5 y PRMT7 (otra metil‐transferasa simétrica, tipo II) funcionan de
manera no‐redundante en la metilación de proteínas Sm y ha sido demostrado que su
actividad es requerida para la biogénesis de las snRNP [Gonsalvez et al., 2007]. Nosotros
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Es posible pensar que la metilación de las proteínas Sm genere algún cambio de toda
esta estructura cuaternaria que afecte el reconocimiento de los sitios 5’ss. En el 2001, el
grupo de Michael Rosbash demostró que en levaduras Sm B, Sm D1, y Sm D3 hacen
contacto directo con el pre‐ARNm cerca de 5’ss. Ensayos bioquímicos los llevaron a
proponer que esto funcionaría, al menos en parte, para estabilizar la interacción U1
snRNP‐pre‐ARNm [Zhang et al., 2001].
Reuniendo toda esta evidencia me permito plantear un nuevo modelo para la
regulación del splicing por PRMT5, el cual contempla la posibilidad de que la metilación de
las proteínas Sm afecte el reconocimiento de los 5’ss en Arabidopsis thaliana. La figura D5
esquematiza el modelo planteado en el cual el efecto principal de PRMT5 sobre el splicing
alternativo ocurre a través de la metilación de las proteínas Sm y su acción en el
reconocimiento de sitios dadores (5’ss) débiles.
Figura D4: figuras de los resultados de la cristalografía del snRNP U1 humano. En el texto desarrollo el
contenido de a-d. Se remarcó la presencia de Sm D3 con el círculo rojo aunque estaría allí formando
parte del anillo de proteínas Sm. Se conserva el idioma original de la publicación. Extraído de [Pomeranz
Krummel et al., 2009].
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P á g i n a | 178
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retienen menos, ver Apéndice, tablas H‐I).
Es interesante resaltar el caso de per. Como muestra la figura R42, la abundancia de
sus isoformas (retenido/procesado, más conocidas como A’ y B) oscila en moscas salvajes
(WT) en condiciones de libre corrida (a lo largo del día subjetivo). Esto implica que el
splicing alternativo de dicho evento está controlado por el reloj circadiano. Sin embargo,
las oscilaciones se ven completamente anuladas en la mutante dart5. En conclusión,
PRMT5 regula el splicing alternativo de diferentes genes en Drosophila y en Arabidopsis,
y ajusta al día las oscilaciones en la abundancia relativa de las isoformas de los mismos
(ej.: RCA y per).
Decidimos entonces evaluar si el efecto también está relacionado con el
reconocimiento de los 5’ss. Haciendo un análisis similar al llevado a cabo para Arabidopsis
demostramos que la situación en Drosophila melanogaster es muy parecida (fig. R43) y
que en este sistema también hay una mayor representación de sitios 5’ss alejados del
consenso entre los eventos alterados en la mutante dart5. En conclusión, el modelo de
la figura D5 es aplicable a lo que sucede en Drosophila melanogaster.
A pesar de estas similitudes en el mecanismo íntimo por el cual PRMT5 regula el
proceso de splicing, tenemos evidencias de diferencias en cuanto a su influencia a nivel
del reloj circadiano. Por un lado, el mensajero de Dart5/PRMT5 en Drosophila no oscila a
lo largo del día. Además los efectos de la mutante dart5 sobre la expresión de genes
centrales del reloj son leves en Drosophila, mientras que son más marcados para algunos
genes del reloj de Arabidopsis (Apéndice, fig. E‐F).
Reuniendo todas estas evidencias podemos concluir que el proceso de splicing
alternativo está implicado en el ajuste fino de los relojes biológicos de plantas y animales
(Arabidopsis y Drosophila) y que la capacidad de PRMT5 de poder controlar la
transcripción de los genes (modificando histonas) y el procesamiento (modificando
P á g i n a | 179
Figura D6: esquema simplificado del reloj de Arabidopsis thaliana (A) y Drosophila melanogaster (B).
Las flechas en negro destacan las interacciones entre los componentes del circuito central (ver la figura
I17 en la introducción del capítulo II para entender el contexto).
proteínas Sm) la hace una herramienta muy útil para modular estas respuestas finas de
ajuste de los organismos a su entorno.
La figura D6 esquematiza un modelo propuesto de las funciones de PRMT5 en el reloj
circadiano de los diferentes organismos y resume un poco las ideas que hemos discutido.
P á g i n a | 180
Conclusión general
Existen eventos de splicing alternativo en Arabidopsis thaliana que
responden con cambios en la abundancia relativa de isoformas a las
variaciones en la luz incidente y a la metilación de proteínas.
Conclusiones (Capítulo I)
Los eventos de splicing alternativo presentes en RSp31 y RCA son regulados por
transiciones de luz/oscuridad.
El efecto es específico, ya que no afecta a otros transcriptos, como los de RSZ33 y
AtPP5, y es reversible.
La reversión del efecto de oscuridad tiene una cinética más veloz en relación al
cambio en la abundancia relativa de los mensajeros estudiados.
El análisis de aproximadamente 100 eventos de splicing alternativo de Arabidopsis
thaliana demuestra que aproximadamente el 40 % de estos responde a las
transiciones de luz/oscuridad. También demuestra que el efecto no es pleiotrópico
e indiscriminado, y que no es consecuencia del hambreado de azúcares en la
mayoría de los casos.
El efecto de la luz en el splicing alternativo de RSp31 es independiente de
fitocromos y criptocromos, y de los integradores de las señales de estos
fotorreceptores, como el factor de transcripción HY5 y las proteínas de la vía
COP/DET/FUS.
Longitudes de onda distintas como luz roja y luz azul, ambas fotosintéticamente
activas, causan el mismo efecto a nivel del splicing de RSp31 y RCA que la luz
blanca.
P á g i n a | 181
La intensidad de la luz incidente altera los patrones de splicing alternativo de RCA y
RSp31 de forma “dosis‐dependiente”. De manera similar, a mayor intensidad de
luz, mayor abundancia de mensajero total para RCA y menor para RSp31.
Para que la luz cause un efecto sobre el splicing alternativo de RSp31 es necesario
el transporte electrónico fotosintético, es decir, un cloroplasto funcional.
La señal generada en el cloroplasto en respuesta a la luz modula el splicing
alternativo de RSp31. Esta señal es capaz de viajar y transmitir la información a
tejidos que no poseen cloroplastos activos.
El agregado exógeno de H2O2 simula el efecto de la luz sobre el procesamiento de
RSp31. Sin embargo, diferentes controles realizados indicarían que éste es un
efecto indirecto. Varios resultados sugieren que es poco probable que una especie
reactiva de oxígeno (ROS) esté involucrada directamente en la señalización
retrógrada que modula el splicing de RSp31.
El agregado exógeno de sacarosa simula el efecto de la luz sobre el splicing
alternativo de RSp31.
La respuesta de RSp31 a las transiciones de luz/oscuridad es independiente de las
vías de señalización por azúcares que involucran a la hexoquinasa 1 y a KIN10.
Tratamientos con inhibidores que actúan en distintos puntos de la cadena de
transporte electrónico fotosintético sugieren que el pool de plastoquinonas es
responsable de la modulación del procesamiento de RSp31 por la luz. Esto podría
explicar otros tipos de señales como las de estrés mediadas por ROS, y las
energéticas mediadas por azúcares.
Conclusiones (Capítulo II)
La metil‐transferasa de proteínas PRMT5 de Arabidopsis thaliana modula el
splicing alternativo de muchos eventos, entre los cuales están los de RSp31 y RCA.
Si bien la mutante de Arabidopsis que no tiene enzima funcional (prmt5) tiene
respuestas alteradas a la luz, no afecta la respuesta de RSp31 y RCA a las
transiciones de luz/oscuridad.
P á g i n a | 182
El efecto de PRMT5 sobre el splicing alternativo es específico de algunos eventos
de splicing como RSp31 y RCA, y no de otros. Y también es específico de esta
enzima ya que otras metil‐transferasas (PRMT10 y PRMT11) no provocan tales
alteraciones.
PRMT5 regula la expresión de más de 500 genes en Arabidopsis thaliana. Su efecto
sería reprimir a la mayoría (355 genes aumentan su expresión en la mutante
prmt5‐5).
De más de 60000 intrones analizados, 471 se retienen más en la mutante prmt5‐5.
PRMT5 modula la expresión de algunos componentes del reloj circadiano.
El reloj circadiano regula la expresión del mensajero de PRMT5.
El patrón de splicing alternativo de RCA presenta oscilaciones circadianas. PRMT5
es necesaria para que se observen estas oscilaciones moduladas por el reloj.
PRMT5 regula también el splicing alternativo de genes no relacionados con el reloj
circadiano.
El mecanismo por el cual PRMT5 regula el splicing alternativo es independiente de
PRR7 y PRR9.
Existe un enriquecimiento de eventos dadores de splicing alternativo regulados
por PRMT5. Es probable que su función sea colaborar en el reconocimiento de
sitios 5’ dadores de splicing débiles o alejados del consenso. Podría llevar a cabo tal
función a través de su efecto en la metilación de las proteínas Sm, componentes
del spliceosoma.
El rol de regulador del splicing alternativo de PRMT5 está conservado en
Drosophila melanogaster. También afecta el reloj biológico de la mosca a través de
este proceso, sin embargo, los efectos no parecen ser a nivel del oscilador central
en este sistema.
P á g i n a | 183
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Apéndice de tablas Tabla A: muestra el valor del cociente entre la isoforma más pequeña (isoforma X) y el total de isoformas del
evento para cada tratamiento. Sor, sorbitol; Osc, oscuridad; Sac, sacarosa. Se presenta (p) el valor p de un
test de Student realizado para la diferencia entre el cociente en luz y en oscuridad (Luz-Osc). El ID está
relacionado con el par de primers utilizado y nos sirve para encontrar en la tabla C qué gen está
representado por cada evento.
ID Sor Osc ES Sor Luz ES Luz‐Osc p Sac Osc ES Sac Luz ES p Luz‐Osc
3 0.40 0.104 0.80 0.017 0.401 0.067 0.41 0.027 0.71 0.039 0.002 0.297
13 0.18 0.018 0.25 0.002 0.074 0.018 0.21 0.010 0.26 0.004 0.028 0.044
19 0.36 0.015 0.29 0.021 ‐0.065 0.035 0.42 0.005 0.31 0.018 0.014 ‐0.113
23 0.46 0.015 0.56 0.002 0.098 0.009 0.47 0.006 0.54 0.008 0.001 0.064
30 0.61 0.023 0.71 0.013 0.098 0.053 0.74 0.016 0.79 0.013 0.087 0.048
36 0.63 0.018 0.53 0.020 ‐0.106 0.034 0.59 0.026 0.51 0.017 0.072 ‐0.087
42 0.54 0.021 0.57 0.009 0.029 0.164 0.57 0.000 0.58 0.017 0.601 0.006
43 0.87 0.036 0.84 0.041 ‐0.033 0.577 0.82 0.032 0.60 0.042 0.031 ‐0.214
47 0.33 0.019 0.35 0.010 0.024 0.072 0.34 0.021 0.26 0.044 0.052 ‐0.077
48 0.73 0.030 0.85 0.006 0.126 0.024 0.83 0.008 0.85 0.028 0.240 0.026
49 0.85 0.002 0.88 0.024 0.027 0.666 0.88 0.003 0.91 0.015 0.148 0.023
50 0.30 0.024 0.41 0.042 0.105 0.067 0.35 0.019 0.40 0.016 0.170 0.041
59 0.52 0.124 0.30 0.069 ‐0.219 0.097 0.52 0.087 0.26 0.091 0.021 ‐0.259
63 Control ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐
66 Control ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐
68 0.23 0.040 0.17 0.003 ‐0.058 0.134 0.12 0.002 0.12 0.005 0.037 ‐0.002
70 0.13 0.023 0.13 0.003 ‐0.007 0.674 0.12 0.002 0.12 0.005 0.649 ‐0.002
72 0.63 0.097 0.64 0.008 0.009 0.368 0.62 0.020 0.63 0.008 0.482 0.013
75 0.41 0.021 0.38 0.006 ‐0.026 0.114 0.50 0.009 0.39 0.008 0.008 ‐0.107
89 0.29 0.043 0.39 0.011 0.098 0.072 0.34 0.012 0.36 0.008 0.162 0.023
102 0.93 0.127 0.86 0.119 ‐0.064 0.450 1.00 0.000 0.83 0.019 0.005 ‐0.165
105 0.35 0.006 0.22 0.004 ‐0.124 0.002 0.35 0.006 0.25 0.015 0.003 ‐0.101
107 0.30 0.012 0.24 0.021 ‐0.053 0.095 0.30 0.013 0.28 0.035 0.232 ‐0.026
108 0.64 0.022 0.50 0.012 ‐0.135 0.018 0.61 0.004 0.50 0.004 0.001 ‐0.108
110 0.52 0.128 0.17 0.015 ‐0.349 0.045 0.42 0.025 0.17 0.034 0.017 ‐0.249
113 0.91 0.151 0.41 0.135 ‐0.507 0.045 0.93 0.129 0.63 0.030 0.083 ‐0.298
127 0.13 0.004 0.09 0.009 ‐0.040 0.025 0.12 0.008 0.09 0.006 0.054 ‐0.033
128 0.48 0.067 0.53 0.033 0.055 0.659 0.49 0.026 0.50 0.018 0.718 0.011
133 0.44 0.027 0.37 0.020 ‐0.073 0.322 0.45 0.003 0.40 0.007 0.012 ‐0.052
136 0.04 0.025 0.05 0.028 0.014 0.266 0.15 0.036 0.18 0.122 0.689 0.024
137 0.50 0.019 0.46 0.008 ‐0.043 0.269 0.53 0.018 0.49 0.019 0.258 ‐0.032
142 0.14 0.025 0.17 0.013 0.023 0.185 0.17 0.032 0.20 0.039 0.211 0.028
144 0.52 0.046 0.41 0.011 ‐0.110 0.032 0.42 0.020 0.39 0.050 0.224 ‐0.033
P á g i n a | 194
146 0.87 0.010 0.85 0.002 ‐0.022 0.084 0.87 0.002 0.84 0.010 0.046 ‐0.031
148 0.28 0.037 0.27 0.023 ‐0.015 0.469 0.27 0.010 0.30 0.021 0.199 0.028
149 0.25 0.027 0.26 0.014 0.014 0.291 0.24 0.006 0.26 0.007 0.085 0.023
152 0.38 0.039 0.31 0.007 ‐0.065 0.105 0.38 0.002 0.34 0.008 0.006 ‐0.043
154 0.22 0.121 0.14 0.045 ‐0.079 0.277 0.08 0.015 0.05 0.017 0.076 ‐0.027
158 0.24 0.081 0.38 0.044 0.143 0.067 0.37 0.060 0.53 0.043 0.092 0.159
165 0.47 0.075 0.43 0.019 ‐0.042 0.385 0.46 0.054 0.40 0.013 0.247 ‐0.060
168 0.35 0.000 0.38 0.020 0.032 0.229 0.41 0.044 0.37 0.054 0.244 ‐0.036
169 0.33 0.007 0.27 0.009 ‐0.062 0.014 0.35 0.021 0.32 0.003 0.200 ‐0.026
170 0.17 0.015 0.11 0.006 ‐0.058 0.036 0.20 0.006 0.11 0.009 0.011 ‐0.082
171 0.80 0.022 0.69 0.006 ‐0.106 0.016 0.77 0.005 0.72 0.003 0.001 ‐0.052
174 0.74 0.017 0.77 0.032 0.030 0.497 0.79 0.017 0.79 0.017 0.970 ‐0.001
179 0.41 0.052 0.40 0.016 ‐0.002 0.938 0.41 0.008 0.39 0.021 0.093 ‐0.023
181 0.62 0.030 0.65 0.009 0.035 0.116 0.63 0.014 0.63 0.025 0.864 ‐0.002
182 0.34 0.011 0.33 0.016 ‐0.010 0.458 0.35 0.008 0.36 0.013 0.244 0.005
188 0.29 0.032 0.17 0.008 ‐0.125 0.023 0.29 0.019 0.18 0.001 0.010 ‐0.110
189 0.98 0.029 0.94 0.010 ‐0.042 0.149 0.92 0.004 0.88 0.027 0.091 ‐0.043
191 0.04 0.001 0.02 0.001 ‐0.011 0.009 0.03 0.010 0.02 0.003 0.396 ‐0.008
198 0.44 0.074 0.72 0.021 0.281 0.033 0.41 0.048 0.68 0.038 0.017 0.266
205 0.79 0.078 0.86 0.022 0.069 0.326 0.75 0.063 0.88 0.015 0.083 0.124
217 0.22 0.006 0.19 0.014 ‐0.022 0.139 0.25 0.025 0.22 0.006 0.260 ‐0.031
223 0.71 0.091 0.73 0.051 0.022 0.816 0.75 0.024 0.77 0.032 0.370 0.018
224 0.65 0.086 0.64 0.032 ‐0.011 0.846 0.63 0.078 0.64 0.016 0.842 0.009
227 0.38 0.034 0.25 0.026 ‐0.126 0.014 0.30 0.002 0.21 0.029 0.031 ‐0.092
229 0.46 0.064 0.78 0.106 0.326 0.014 0.54 0.031 0.67 0.014 0.008 0.132
239 0.68 0.009 0.56 0.006 ‐0.121 0.002 0.65 0.019 0.55 0.011 0.016 ‐0.102
246 0.59 0.012 0.47 0.027 ‐0.115 0.014 0.60 0.004 0.48 0.011 0.001 ‐0.126
249 0.26 0.039 0.27 0.011 0.008 0.801 0.30 0.005 0.28 0.003 0.025 ‐0.017
254 0.65 0.011 0.54 0.051 ‐0.111 0.053 0.70 0.022 0.57 0.003 0.008 ‐0.123
264 0.25 0.069 0.19 0.010 ‐0.056 0.340 0.21 0.022 0.21 0.032 0.639 0.007
270 0.22 0.005 0.33 0.003 0.111 0.001 0.26 0.016 0.33 0.004 0.021 0.076
272 0.24 0.077 0.30 0.011 0.064 0.011 0.24 0.012 0.32 0.011 0.002 0.075
275 0.51 0.026 0.23 0.018 ‐0.272 0.009 0.51 0.008 0.24 0.001 0.000 ‐0.264
277 0.75 0.013 0.67 0.014 ‐0.076 0.026 0.74 0.004 0.68 0.039 0.032 ‐0.062
285 0.37 0.015 0.54 0.014 0.177 0.069 0.49 0.023 0.59 0.039 0.021 0.100
288 0.91 0.070 0.95 0.018 0.031 0.488 0.85 0.027 0.85 0.110 0.997 0.000
289 0.54 0.014 0.58 0.056 0.036 0.056 0.57 0.017 0.66 0.011 0.020 0.087
291 0.31 0.020 0.47 0.028 0.157 0.027 0.30 0.025 0.49 0.012 0.012 0.188
292 0.25 0.016 0.17 0.008 ‐0.079 0.024 0.26 0.007 0.19 0.016 0.006 ‐0.075
298 0.45 0.024 0.70 0.042 0.245 0.022 0.55 0.053 0.75 0.018 0.014 0.204
314 0.37 ‐ 0.31 0.013 ‐0.059 ‐ 0.27 0.022 0.29 0.007 0.280 0.020
P á g i n a | 195
315 0.99 0.000 0.99 0.001 ‐0.001 0.961 0.99 0.003 0.99 0.003 0.742 ‐0.001
322 0.84 0.017 0.78 0.013 ‐0.055 0.032 0.82 0.009 0.77 0.042 0.467 ‐0.045
326 0.87 0.021 0.95 0.008 0.078 0.015 0.91 0.010 0.96 0.007 0.044 0.044
327 0.91 0.002 0.93 0.014 0.025 0.105 0.88 0.021 0.92 0.027 0.060 0.047
333 0.97 0.005 0.97 0.005 0.000 0.398 0.98 0.002 0.98 0.003 0.184 0.003
338 0.32 0.037 0.24 0.009 ‐0.085 0.039 0.36 0.053 0.21 0.015 0.057 ‐0.156
342 1.00 0.000 0.91 0.010 ‐0.094 0.004 0.99 0.012 1.00 0.000 0.423 0.007
343 0.81 0.101 0.58 0.023 ‐0.228 0.037 0.50 0.049 0.39 0.039 0.077 ‐0.105
344 0.07 0.005 0.08 0.019 0.010 0.366 0.06 0.002 0.05 0.011 0.155 ‐0.016
346 0.10 0.092 0.37 0.007 0.267 0.034 0.21 0.022 0.32 0.025 0.044 0.103
373 0.86 ‐ 0.81 0.027 ‐0.051 0.111 0.85 0.019 0.82 0.043 0.480 ‐0.031
374 0.90 0.086 0.80 0.013 ‐0.099 0.193 0.85 0.004 0.85 0.028 0.927 ‐0.002
375 0.51 0.000 0.76 0.022 0.249 0.046 0.52 0.037 0.73 0.050 0.022 0.210
378 0.49 0.076 0.73 0.023 0.232 0.048 0.54 0.048 0.69 0.024 0.009 0.151
380 0.35 0.047 0.40 0.128 0.047 0.656 0.28 0.012 0.32 0.012 0.122 0.036
381 0.55 0.202 0.37 0.010 ‐0.184 0.258 0.31 0.022 0.30 0.014 0.321 ‐0.011
383 0.13 0.019 0.15 0.009 0.027 0.190 0.11 0.005 0.15 0.003 0.020 0.039
393 ‐ ‐ 0.42 0.160 ‐ ‐ 0.38 ‐ 0.46 0.103 ‐ 0.082
Tabla B: clave del código de colores de la tabla A.
RNA Binding, processing
Transcription factors
Stress related; ABA
Sarah Assman; Stomatal ABA signalling
also involved in stress
Flowering Time
Miscellaneous
Transcription factor; Nucleolar mis‐splicing database
Stress related; Nucleolar mis‐splicing database
U12 intron
Controls
P á g i n a | 196
Tabla C: clave del código ID de la tabla A. Permite asociar cada evento de la primer tabla con el locus
correspondiente y la clase de splicing alternativo que sufre. 5’SS, dador alternativo; 3’SS, aceptor
alternativo; int ret, retención de intrón; y Exon S, salteado exónico o exón cassette.
ID Locus Descripción Tipo de evento
3 At1g09140 SF2/ASF‐like splicing modulator (SRp30) 3'SS
13 At1g79650 DNA repair protein RAD23 3'SS
19 At2g32320 Unknown protein 3'SS
23 At2g39730 Rubisco activase (Auxin regulated) 5'SS
30 At3g53270 Unknown protein 5'ss & 3'ss
36 At4g12790 Unknown protein 3'SS
42 At5g04430 Putative RNA binding protein 3'SS
43 At5g09230 Transcriptional regulator (Sir2) 3'SS & Int. Ret.
47 At5g20250 Seed Imbitition protein‐like (DARK INDUCIBLE 10) 3'SS
48 At5g35680 initiation factor 1A putative 3'SS
49 At5g41150 Repair endonuclease (RAD1) 3'SS
50 At5g43910 Unknown Protein (pfkB‐type carbohydrate kinase family protein) 3'SS
59 At5g66010 Putative protein (RNA binding / nucleic acid binding / nucleotide binding) 3'SS
63 At3g12110C Actin 11 (ACT11) Constitutivo
66 At4g02560C Ld.1 LUMINIDEPENDENS (LD) Constitutivo
68 At1g23970 Unknown Protein (Auxin regulated) 5'SS
70 At1g54360 TATA binding protein associated 6b (TAF6) 5'ss
72 At2g04790 Expressed protein 5'SS
75 At2g36000 Expressed protein 5'SS
89 At4g38510 vacuolar‐type H+‐ATPase subunit B2 5'SS
102 At1g27370 squamosa promoter‐binding protein‐like 10 (SPL10) Exon S, 3'SS & 5'SS
105 At1g33060 no apical meristem (NAM) family protein 3'SS
107 At1g59750 auxin‐responsive factor (ARF1) 3'SS
108 At1g30200 F‐box family protein 3'SS
110 At1g72050 zinc finger (C2H2 type) family protein Exon S
113 At1g72650 myb family transcription factor 5'SS
127 At2g43010 phytochrome‐interacting factor 4 (PIF4) 3'SS
128 At2g15530 zinc finger (C3HC4‐type RING finger) family protein 5'SS
133 At2g32250 far‐red impaired responsive protein, putative 3'SS
136 At3g07740 transcriptional adaptor (ADA2a) 5'SS
137 At3g14740 PHD finger family protein 3'SS
142 At3g12250 bZIP family transcription factor 3'SS
144 At3g23280 zinc finger (C3HC4‐type RING finger) family protein Exon S
146 At3g24120 myb family transcription factor 3'SS
148 At1g76510 ARID/BRIGHT DNA‐binding domain‐containing protein 5'SS
149 At2g27230 transcription factor‐related 5'SS
152 At3g58030 zinc finger (C3HC4‐type RING finger) family protein 3'SS
P á g i n a | 197
154 At4g01060 myb family transcription factor 3'SS
158 At4g32730 myb family transcription factor 5'SS
165 At4g16420 transcriptional adaptor (ADA2b) 3'SS
168 At5g18240 myb family transcription factor 3'SS
169 At5g24520 transparent testa glabra 1 protein (TTG1) 3'SS
170 At5g28770 bZIP transcription factor family protein 3'SS
171 At5g18620 DNA‐dependent ATPase, putative 5'SS
174 At5g13220 expressed protein 5'SS
179 At5g48150 phytochrome A signal transduction 1 (PAT1) Exon S
181 At5g05550 expressed protein Exon S
182 At5g16820 heat shock transcription factor 3 (HSTF3) 3'SS
188 At5g02840 myb family transcription factor 3'SS
189 At5g43270 squamosa promoter‐binding protein‐like 2 (SPL2) 5'SS
191 At5g18830 squamosa promoter‐binding protein‐like 7 (SPL7) 5'SS
198 At4g36690 U2 snRNP auxiliary factor large subunit 3'SS
205 At3g61860 arginine/serine‐rich splicing factor RSP31 3'SS
217 At1g16610 arginine/serine‐rich protein, putative (SR45) 3'SS
223 At2g29210 splicing factor PWI domain‐containing protein 3'SS
224 At1g15200 atPinin 3'SS
227 At4g24740 protein kinase (AFC2) Exon S
229 At4g35785 transformer serine/arginine‐rich ribonucleoprotein 3'SS
239 At1G31500 endonuclease/exonuclease/phosphatase family protein 3'SS
246 At5g59440 Thymidylate kinase like 3'SS
249 At1g72560 tRNA export mediator exportin‐t 5'SS
254 At5g50240 L‐isospartyl methyltransferase 3'SS
264 At5g65430 GF 14 Kappa isoform 3'SS
270 At1g53650 RNA‐binding protein 5'SS
272 At3g23900 RNA recognition motif (RRM)‐containing protein 5'SS
275 At5g19030 RNA recognition motif (RRM)‐containing protein 3'SS
277 At3g23830 glycine‐rich RNA‐binding protein, putative 3'SS
285 At3g19840 WW domain‐containing protein 5'SS
288 At3g12570 expressed protein 3'SS
289 At3g12570 expressed protein Exon S
291 At2g46270 G‐box binding factor 3 (GBF3) 5'SS
292 At4g36730 G‐box binding factor 1 (GBF1) 3'SS
298 At5g09880 RNA recognition motif (RRM)‐containing protein 3'SS / Exon S
314 At2g43410 FPA int ret
315 At4g31120 SKB1 Methyltransferase int ret
322 At2g33480 putative NAM (no apical meristem)‐like protein;COLD 5'SS
326 At1g69250 NTF2 (RRM)‐containing protein;COLD int ret
327 At5g59950 RNA and export factor binding protein, putative;COLD int ret
P á g i n a | 198
333 At3g16800 protein phosphatase 2C, putative / PP2C, putative;COLD int ret
338 At5g57630 CBL‐interacting protein kinase 21 (CIPK21);COLD 5'SS
342 At3g01090 putative SNF1‐related protein kinase (KIN10);Dark, sugar, hypoxia 5'SS
343 At3g29160 SNF1‐like protein kinase (AKin11);Dark, sugar, hypoxia 5'SS
344 At3g29160 SNF1‐like protein kinase (AKin11);Dark, sugar, hypoxia 3'SS
346 At4g23260 protein kinase family protein;COLD int ret
373 At3g13224 RNA recognition motif (RRM)‐containing protein int ret
374 At4g36960 RNA recognition motif (RRM)‐containing protein int ret
375 At3g20270 lipid‐binding serum glycoprotein Exon S
378 At3g62190 DNAJ heat shock N‐terminal domain‐containing protein 3'SS
380 At5g08185 npcRNA 78; MIR162a Exon S, 3'SS
381 At5g53450 fibrillin fused protein kinase 3'SS
383 At2g43640 signal recognition particle 14 kDa family protein / SRP14 family protein 5'SS
393 At2g26150 HsfA2 Exon S
Tabla D: genes cuya expresión aumenta en la mutante prmt5-5 con respecto a la planta salvaje. Se muestra
el locus y la intensidad del efecto en veces de cambio ([expresión en prmt5-5]/[expresión en wt]). En los
casos donde hay más de un loci, se debe a que las sondas que reconocen más de un gen, razón por la cual no
se puede asegurar cuál de ellos está alterado y se señalan ambos.
Locus Veces de cambio
AT2G46670;AT2G46790 6.45
AT1G12730 5.62 AT1G13650 4.68 AT1G36180 4.32 AT3G27930 4.16 AT2G25760 4.11 ATCG00600 3.98 ATCG00360 3.91 AT4G22950 3.69 ATCG01070 3.65 ATCG00150 3.60 AT4G16870 3.54 AT1G48260 3.48 AT1G18710 3.42 AT3G47340 3.42
AT3G19670 3.41 AT3G46210 3.40 AT3G16360 3.37 AT3G24515 3.32 AT3G04460 3.26 AT2G25760 3.26 AT5G28030 3.15 AT5G10140 3.11 AT5G01510 3.07 AT2G41705 3.07 AT4G31150 3.05 AT3G04810 2.98 AT1G44780 2.98 AT2G26810 2.97 AT3G44990 2.96 AT1G03750 2.95 AT5G42690 2.89 AT3G13225 2.86
AT5G47240 2.85 AT3G28130 2.78 AT5G50550;AT5G50650 2.76
ATCG00680 2.76 AT1G68820 2.73 AT2G25740 2.72 AT2G32150 2.71 ATCG00690 2.69 AT3G12170 2.66 AT3G22190 2.63 AT2G39250 2.61 AT1G51280 2.60 AT2G18770 2.60 AT1G61660 2.58 ATCG00500 2.57 AT1G73980 2.55 AT1G53885 2.54
P á g i n a | 199
AT2G18600 2.54 AT1G74810 2.48 AT2G05540 2.46 AT4G34650 2.44 AT1G32090 2.44 AT1G68190 2.43 AT1G61890 2.42 AT3G02740 2.40 AT4G34140 2.39 AT5G42400 2.39 AT1G70700 2.39 AT2G26770 2.38 AT5G02810 2.38 AT1G77890 2.38 AT3G20910 2.37 AT3G20450 2.35 AT2G42160 2.35 AT5G44660 2.32 AT5G06190 2.32 AT3G61570 2.31 ATCG00140 2.31 AT3G16690 2.30 AT1G02205 2.29 AT3G14660 2.28 AT1G80800 2.26 AT2G47410 2.26 AT5G44750 2.26 AT3G19350 2.25 AT4G33790 2.23 AT1G19340 2.22 AT5G41140 2.22 AT3G54230 2.20 AT1G08890;AT1G08900 2.19
AT3G53920 2.18 AT4G18750 2.18 AT5G05600 2.16 AT4G17150 2.15 AT1G14660 2.15 AT2G27480 2.14 AT5G50160 2.14 AT5G08500 2.14 AT2G24120 2.13 AT5G11800 2.12 AT4G16566 2.12 AT1G19690 2.11 AT4G21170 2.11 AT5G11950 2.11 AT5G09410 2.10
AT5G60890 2.10 AT1G62510 2.07 AT4G29100 2.07 AT2G32700 2.07 AT2G34780 2.05 AT1G09440 2.05 AT3G47530 2.05 AT5G40910 2.04 AT3G16840 2.03 AT3G53370 2.03 AT3G20440 2.02 AT4G14970 2.02 AT2G01860 2.02 AT1G61400 2.02 AT1G20030 2.01 AT3G18500 2.01 AT5G02940 2.01 AT2G43430 2.01 AT1G15960 2.01 AT2G02710 2.00 AT1G62290 2.00 AT1G12350;AT5G02080 1.99
AT5G25270 1.98 AT5G57100 1.98 AT2G31530 1.98 AT1G53710 1.98 AT1G53440;AT1G53450 1.98
AT1G70570 1.97 AT1G77080 1.97 AT1G71720 1.96 AT5G19210 1.96 AT3G23480;AT3G23470 1.96
AT1G73920 1.95 AT3G51530 1.94 AT3G59300 1.93 AT1G79700;AT1G79690 1.91
AT5G56380 1.91 AT3G48110 1.91 AT2G22190 1.89 AT2G33820 1.89 AT3G01490 1.88 AT1G28340 1.88 AT2G22840 1.88 AT1G05200 1.88 AT2G17340 1.86 AT5G24740 1.86
AT4G30330 1.85 AT5G05040;AT5G05060
1.85
AT1G26190 1.85 AT5G05310 1.84 AT3G16750 1.84 AT3G07590 1.84 AT2G22830 1.83 AT5G45300 1.83 AT5G57660 1.83 AT1G10320 1.83 AT3G50430 1.83 AT2G15690 1.82 AT1G03160 1.81 AT1G26770 1.81 AT3G09560 1.81 AT3G59430 1.81 AT3G50240 1.81 AT3G13340 1.80 AT5G35910 1.80 AT5G23690 1.80 AT3G16340 1.79 AT5G39060;AT3G29120;AT1G62766;AT1G08105
1.79
AT2G28360 1.79 AT3G26690 1.79 AT3G01150 1.78 AT1G42470 1.78 AT1G29750 1.78 AT5G50730 1.78 AT5G52100 1.78 AT1G08810 1.77 AT4G16770 1.77 AT3G02890 1.77 AT3G48200 1.77 AT2G38760 1.77 AT1G30550 1.77 AT1G10570 1.76 AT5G03200 1.76 AT4G37460 1.76 AT5G06970 1.76 AT1G54440 1.76 AT1G60860 1.76 AT2G25710 1.76 AT3G48500 1.75 AT5G57960 1.75 AT5G65205 1.75 AT1G34340 1.75
P á g i n a | 200
AT5G16970 1.75 AT3G15590 1.75 AT1G32640 1.74 AT4G32910 1.74 AT4G33490 1.74 AT1G56300 1.74 AT5G63530 1.74 AT5G50740 1.74 AT2G33830 1.73 AT5G63700 1.73 AT2G19080 1.73 AT2G02740 1.73 AT4G16590 1.73 AT5G18630 1.73 AT1G22740 1.72 AT5G48640 1.72 AT3G43220 1.72 AT5G58390 1.72 AT3G27690 1.72 AT5G57630 1.72 AT1G80050 1.72 AT3G06380 1.72 AT2G18440 1.71 AT1G80920 1.70 AT1G28330 1.70 AT3G22660 1.70 AT2G43360 1.70 AT1G73750 1.70 AT5G01370 1.70 AT3G28530;AT1G36770 1.70
AT4G21470 1.70 AT5G13740 1.70 AT3G06530 1.70 AT5G51660 1.70 AT2G40435 1.69 AT5G39350 1.69 AT1G47500;AT1G47490 1.69
AT4G32320 1.69 AT1G63680 1.68 AT1G14040 1.68 AT3G29320 1.68 AT5G64220 1.68 AT5G04490 1.68 AT5G60120 1.68 AT5G53050 1.68 AT2G46610 1.68 AT4G02020 1.68
AT5G51940 1.68 AT3G61780 1.67 AT5G62990 1.67 AT5G40500 1.67 AT5G15320 1.67 AT4G32880 1.67 AT2G40960 1.67 AT3G27610 1.67 AT1G09660 1.66 AT1G73660 1.66 AT2G15960 1.66 AT1G50730 1.66 AT5G43790 1.65 AT5G01390 1.65 AT2G22990 1.65 AT1G72450 1.65 AT3G53800 1.65 AT5G63780 1.65 AT2G16940 1.65 AT3G63520 1.65 AT2G22980 1.64 AT2G28550 1.64 AT5G23330 1.64 AT1G76360 1.64 AT4G00620;AT4G00600 1.64
AT3G09310 1.64 AT5G11040 1.63 AT5G51410 1.63 AT1G06780 1.63 AT4G08310 1.63 AT3G06500 1.63 AT2G40316 1.62 AT3G62550 1.62 AT5G16000 1.62 AT3G10520 1.62 AT3G20430 1.61 AT4G39900 1.61 AT5G66540 1.61 AT2G30600 1.61 AT2G02170 1.61 AT5G18640 1.61 AT2G15890 1.61 AT1G61065 1.61 AT2G26870 1.61 AT1G08660 1.61 AT2G21380 1.61 AT1G71440 1.61 AT5G19180 1.60
AT1G69523 1.60 AT3G04610 1.60 AT2G43400 1.60 AT3G15840 1.60 AT2G16630 1.59 AT1G78080 1.59 AT2G29210 1.59 AT2G44650 1.59 AT1G72090 1.59 AT5G08400 1.58 AT3G62220 1.58 AT3G45240 1.58 AT4G00180 1.58 AT1G32750 1.57 AT1G54260 1.57 AT1G42540 1.57 AT3G18110 1.57 AT4G01510 1.57 AT4G38110 1.57 AT5G59130 1.57 AT2G42270 1.57 AT5G41870 1.57 AT4G17960 1.57 AT1G77480 1.57 AT2G34640 1.56 AT2G03530 1.56 AT1G74950 1.56 AT5G52380 1.56 AT1G19970 1.56 AT1G76730 1.56 AT3G20720 1.56 AT3G10140 1.55 AT3G16000 1.55 AT3G60180 1.55 AT1G60490 1.55 AT3G50440 1.55 AT1G34150 1.55 AT4G18270 1.55 AT3G33530 1.55 AT5G06750 1.55 AT5G09880 1.55 AT1G19750;AT1G27840 1.54
AT1G52880 1.54 AT3G56070 1.54 AT5G44250 1.54 AT5G22280 1.54 AT1G27520 1.53 AT5G47220 1.53
P á g i n a | 201
AT5G42030 1.53 AT1G17680 1.53 AT3G16940 1.53 AT1G53590 1.52 AT3G54720 1.52 AT3G19510 1.52 AT4G16146 1.52 AT4G04340 1.52
AT4G27820 1.52 AT5G56750 1.52 AT5G55700 1.52 AT5G37850 1.52 AT1G73350 1.51 AT5G61830 1.51 AT1G48460 1.51 AT5G10940 1.51
AT1G22335 1.51 AT2G23930 1.51 AT1G59750 1.50 AT4G05040 1.50 AT4G10920 1.50 AT1G18620 1.50
Tabla E: genes cuya expresión disminuye en la mutante prmt5-5 con respecto a la planta salvaje. Se muestra
el locus y la intensidad del efecto en veces de cambio ([expresión en prmt5-5]/[expresión en wt]). En los
casos donde hay más de un loci, se debe a que las sondas que reconocen más de un gen, razón por la cual no
se puede asegurar cuál de ellos está alterado y se señalan ambos.
Locus Veces de cambio
AT5G24770;AT5G24780 0.18 AT2G39030 0.21 AT1G72260 0.23 AT5G22460 0.25 AT5G03350 0.26 AT5G10760 0.26 AT3G50480 0.27 AT5G55450 0.27 AT4G23220 0.27 AT5G59670 0.28 AT2G14560 0.29 AT3G26960 0.32 AT4G01700 0.33 AT1G34750 0.33 AT5G60900 0.34 AT2G40100 0.35 AT1G09740 0.36 AT2G32160 0.36 AT3G50280 0.37 AT1G56500 0.38 AT1G76020 0.39 AT1G26260 0.40 AT3G48080 0.40 AT3G56710 0.42 AT5G25440 0.42 AT1G69730;AT1G69720 0.42
AT5G18690 0.42 AT2G33810 0.43 AT5G53370 0.43 AT5G58770 0.43 AT1G08450 0.44 AT5G58120 0.44 AT4G21650 0.44 AT3G57700 0.45 AT5G08100 0.45 AT1G22550 0.46 AT5G37600 0.46 AT4G02330 0.46 AT4G32870 0.47 AT4G00050 0.47 AT2G17220 0.47 AT5G40780 0.47
AT3G26200 0.47 AT5G64550 0.48 AT2G39210 0.48 AT4G02420 0.48 AT3G29030 0.49 AT1G62500 0.49 AT3G14620 0.50 AT3G53970 0.50 AT3G16770 0.50 AT3G52470 0.50 AT1G07000 0.51 AT4G08470 0.51 AT1G12110 0.51
AT5G47550 0.51
AT5G48540 0.51 AT5G39020 0.51 AT1G56430 0.51 AT2G25590 0.52 AT1G74210 0.52 AT2G17120 0.52 AT1G59960 0.52 AT1G72910;AT1G72930 0.52 AT5G02230 0.53 AT5G23850 0.53 AT1G03370 0.53 AT5G64120 0.53
AT3G26170;AT3G26180 0.53 AT3G10620 0.53 AT5G19240 0.53 AT2G14900 0.54 AT5G36220 0.54 AT5G52540 0.54 AT4G38220 0.54 AT2G20630 0.54 AT4G03200 0.54 AT5G46420 0.54 AT5G48830 0.54 AT1G16260 0.55
AT4G21860 0.55 AT5G52810 0.55 AT4G13510 0.55 AT1G71040 0.55 AT2G25850 0.56
P á g i n a | 202
AT4G26070 0.56 AT2G30695 0.56 AT1G06830 0.56 no_match 0.56 AT5G01810 0.57 AT3G28940 0.57 AT4G17090 0.57 AT5G46780 0.57 AT1G04040 0.57 AT4G35090 0.57 AT3G07990 0.57 AT1G77760 0.57 AT3G04480 0.58 AT1G05630 0.58 AT2G35960 0.58 AT2G37970 0.58 AT4G14365 0.58 AT5G51830 0.58 AT3G49720 0.58 AT5G37260 0.58 AT3G16700 0.59 AT1G63260 0.59 AT2G41310 0.59 AT1G72800 0.59 AT2G23600;AT2G23590 0.59 AT5G11970 0.59 AT1G16670 0.59 AT4G39710 0.59 AT4G17890 0.59 AT2G15320 0.59 AT2G31880;AT2G31890 0.59 AT1G04530 0.59 AT1G04350 0.60 AT1G03820 0.60 AT4G33050 0.60 AT2G32580 0.60 AT1G18010;AT1G18000 0.60 AT1G55840 0.60 AT2G48030 0.60 AT1G14890 0.60 AT3G50960;AT3G50950 0.60 AT5G59030 0.61 AT1G53000 0.61 AT2G42610 0.61 AT1G02500 0.61 AT5G53120 0.61
AT5G51560 0.61 AT2G01540 0.61 AT1G62660 0.61 AT5G48485 0.61
AT2G37710 0.61
AT5G06310;AT5G06320 0.61 AT3G62290 0.61 AT1G20830 0.61 AT4G37800 0.61 AT1G35720 0.61 AT1G28680 0.62 AT4G26480 0.62 AT4G26940 0.62 AT4G36660 0.62 AT5G62140 0.62
AT4G20070 0.62 AT5G40850 0.62 AT3G11280 0.62 AT5G23760 0.62 AT2G14530 0.62 AT1G64740 0.62 AT4G17070 0.63 AT1G31690 0.63 AT2G19130 0.63 AT2G03550 0.63 AT3G23600 0.63 AT5G19250 0.63 AT2G39780 0.64 AT5G47560 0.64
AT5G21100 0.64 AT2G19940 0.64 AT1G66970 0.64 AT1G64230 0.64 AT1G72770 0.64 AT2G32080 0.64 AT2G38010 0.64 AT4G25900 0.64 AT3G27110 0.64 AT3G57790 0.64 AT1G73650 0.65 AT2G19460 0.65 AT3G14220 0.65 AT4G32590 0.65
AT5G49630 0.65 AT1G78300 0.65 AT1G04680 0.65 AT3G23810 0.65 AT5G44130 0.65
AT1G19140 0.66 AT1G04620 0.66 AT5G21090 0.66 AT4G25450 0.66
AT4G29810 0.66
AT4G28400 0.66 AT4G19880 0.66 AT4G39730 0.66 AT4G14410 0.66 AT1G55000 0.67 AT1G05810 0.67
P á g i n a | 203
Tabla F: expresión de los genes del reloj en la mutante prmt5-5 con respecto a la planta salvaje (prmt5-
5/WT). Se muestra el locus, el nombre del gen y el efecto sobre la expresión.
Locus Nombre prmt5‐5/WT
AT2G46790 APRR9 6.452789006
AT5G10140 FLC 3.112795227
AT5G02810 APRR7 2.378587694
AT1G22770 GIGANTEA 1.603213802
AT5G24470 APRR5 1.467408812
AT2G40080 ELF4 1.303192227
AT5G60100 APRR3 1.303121888
AT2G44680 CKB4 1.272015759
AT2G31870 TEJ 1.228709965
AT2G21070 FIONA1 1.064196713
AT3G60250 CKB3 1.023464374
AT5G59560 SRR1 1.009499579
AT5G57360 ZTL 1.00329631
AT1G10470 ARR4 0.999703521
AT5G61380 APRR1/TOC1 0.981512433
AT2G46830 CCA1 0.97181703
AT2G46340 SPA1 0.932983438
AT3G22380 TIC 0.927199743
At5g08330 CHE 0.926412588
AT5G64813 LIP1 0.915418621
AT2G25930 ELF3 0.885075825
AT3G46640 LUX 0.877506862
AT1G09340 CRB 0.722319719
AT1G01060 LHY 0.689107513
AT5G37260 CIR1 0.584675909
P á g i n a | 204
Tabla G: intrones mayormente retenidos en la mutante prmt5-5 con respecto a la planta salvaje. Se muestra
el locus y las sondas que reconocen a los intrones.
AGI Intrón afectado
Sonda 1 Sonda 2 AT5G42030 gcctcttccttgttctgtgaaaaaa taagggcggattatgattgaacgga AT1G71695 cgattccgtcgtcctagtaaccaca caaaccattagtctacaagtcacac
AT4G39900 gaagtgggaaaacatctgcatcgca catgatacactgatttagaagagca
AT5G58140 cattgcgcctgtatagtgatgcatt gtgtttcagtttattcatggtttac AT5G02160 tcatagtttattgtccggttcaaca gattgtacattgtgagtttaagctc AT2G17340 gcttccagaaactactcttgatgta taaataaggtcggaagagagaagta
AT1G03160 tatcgtgatgctcgtgaggtttatc tatgtcttttccttgatagtctctg AT1G78630 gaagaagctaatggccctgtaacga ggcttgaaacctttattgagtgtat AT1G76730 ggctaactgcaccaagaattcaaat ttcgctaactaaggcaaaacctaga
AT4G27520 gcgtagctaaaatctgcaagaatcg gaaatgacacaaacgggtaagagag
AT2G21370 tatgtccctcacagtacagcttttt cggttaagtgtatagctgagatata AT1G69620 ttggtttgtttgtgcttattgacgg agttgtttcagccattttccttcag
AT2G43430 tataagatagccaaacaaagactac ggctaaatctggtaccaaccacaaa
AT3G14660 tccgtagtcccagtttagctttatg ggttctgaaccaatttgtgtcctct AT3G48110 gaaaggaaatgaagcagttctcagg tagtggtccatatttaaagcatcca AT5G04490 caaaatgtctccttcttgacgacga gaactgagatgagtttgctactaaa
AT5G58870 tgtactctgtgtatacctcacagct gtgcacatggccttaacttaaacaa AT4G17150 gtatacctgttctctttcttgctag ccgttgcttggtctatcccttttga AT4G01690 gaccgtcacctccagtgtgtattct tctgctcatgttcttagagtttggc
AT4G25170 cacttgaaaatgtgtgattctttgg tgtgttctgtttacgtgttggagta
AT3G53920 attgatagttcggattattgatgac cagaaacaataaaggaaaacaagtg AT1G29750 aatcctgctgcattgtttaaaacca gaacaacagattccaccgtaataag AT1G13650 taacatatatcctaacatgaagatc tgaaaaacagtttattgccgtttga
AT1G68190 cttataaccggtgtaagatctcggg tatagctgatgtaccgatgattttg AT1G17580 gactggtgaagctatttaagcgaac catttcctcatctcgcatttttata AT2G35040 gattcaattaaagcccgattatttg aacgtaactgaaaatcgatcactga
AT2G19950 tactgaattaaaacccgtggccaga gacaacttcccaatatgactttgat AT2G47410 taacttttgcatgcaattcatctga taccctaggtctttgattaagtaga AT5G57960 tacttgaacagcaaatactaatttc taagcacttttctccgtttccgagc
AT3G23700 gaatattagttacacactggaacca caaagagctgactaggactgcatag
AT1G31970 tttcctttgtcgtaagcagcagaac caacgggaatcatattttcgagtta AT3G54840 gctttgtttcttcactgattcctgc taccactaacttttggattcacttg AT2G28360 gactctgattcaagtacaaaggttg ttttttcttattcggtagcctctca
AT1G09440 gcaagactgcacatgaaaacaaaac cagcagaacatatgtgaaacaccaa AT3G19670 cacagtcttactggatttaaaagga aagtattggaatcagaattttctgg AT4G37300 caaactcatgttcggttatctctaa tcttcacataaaccaacatctttcg
AT3G59300 tatagccgggaaacaacacaaacca gagtatgcgtgaacacggtattcat
AT5G54440 cctgtcaatctagggttggtgcaca tatcgatcacagtgtccttttctcc AT3G19670 tcccactaccttgctagagagcaga tgtcagtacaatgtagcagcagaag
AT4G24750 tgtcactagatcctgctatcacata gttatcgatgttgtagaatcttgca
AT1G11060 cacattttgacttccgctcgttcta tctgattactggttggactgatggc AT1G02205 tatcgtcactgagcccatcacttgt cctaactagtagcttttatctgtat AT2G43360 tgtctatgaacctgagcctgaaacc tagagtagctagaacaacaaagaga
AT1G68820 gccatatgggaaacacttcctgtaa taacttgtctctgcaggttgtctct AT3G01590 ccacaggtttggcatctcagatcat tgaataaccctttgctctagtttcg AT5G25270 aggtaacacaaaggtaaggtgagca cacactggtaatggtgaaagaaagt
AT2G35630 tgcaatgacggtgactcatctaaaa ccgtcttatcagtttccaacagtga
AT1G07110 taatacaattttgacgggaatggtg taaaagacctgcagaaactatgacc AT4G02700 aattggtctcatcctctccgtacgt tttcattacttactcttctgtgcca AT1G59750 aaatggtccaaaacacatcagttgc cattttgctgcaaatccaggctgac
AT3G04610 gccatgactagagcgctgacataaa gcgaggaaccctagaattgacaatg AT5G08600 atttcgcagtcccaagataaaaagg ctttgctcgctttgtgtatttactc AT3G33530 cggctcgttgaggttactgtgtatg acttctgcgatctttaatttccaac
AT5G22080 tcttaagctcttctgcatttcacag gaaggttgtcgtcacgactcacgag
AT1G06550 tgtagaatctgtcctcattcaagct gcggatatatttacatcctgaatca AT4G24750 ttccttcccttaactatgcaaacaa catgaaccataatcactccaatgtt
AT2G17320 cagccttcaagaaatcccgcatatc gacccatgagcagtatctaaatgag AT2G48020 caacacccttgcaacataaatatca caattgcatgattttgttggaacag AT1G08190 gttgaaccttttatttgtcttcgca cataagcctggaaaatcttgttcga
AT4G21960 ctacctacaccaaccccacacagtt aaaacagcatgcagttttgtcacca
AT2G46915 tacagggaaaagctcactggcagaa gacactcatgatgtagatgtactat AT1G28090 gtctcccgctcttttccgctttgaa cagttccatcttctatatttccttc
AT2G26280 tgacccactgggttcctgtttcatt tgtttcggataaaagatcatgttac
AT5G25610 gtaataatacaagtcaaacacatct aaaaaacagttaattatggagagag AT5G10940 taagatgtagcagacagtgagcttg tagagtatcttaatatcaatcaggc AT3G50240 gatgagcttcttgaacttccctgca ttggatcttagtgtggaaatatgga
AT2G35390 caaacaaatgtattctgaagaaaga tcaatctaggaacctcaaatccgga AT1G05270 tcaacgaagacaacctgtgatatca caaacctcagtcctcaatgaacaca AT4G36210 gagtagatgagttcactttttgcac taaggagcgtttacaatgtcactgg
AT5G65010 gtcgctgtcactgtactttctcttg aagtgttggcctttgttccttgctg
AT1G68890 tcccccttttatgcgtgaagaagta catttactcatgtgttttgtttaca AT3G44670 actggtttgtcctcttgatttctac gaccattttgtcataacggttgtat AT4G20150 cacatgctcccacggatctaacata tagcatttttcgattggtggacgac
AT3G16030 tctgaatctcatagtccatgtaatg tgttaatattctcagcttgccttct AT2G33040 ggtttttccatcaagtaacgctaga tcaatattcaataccgatgcaagcc AT4G34140 ccattttccttctaaccgagccttg aacctggtgtgctctgttatatggg
AT5G08650 gatatggatcataataactgcagca catactgttttctctagaaaaggca AT2G39250 ggtcgtacgctctgatatgtatttg taagtcaactaatatttctctaaag AT2G27860 aaaaccaacgcattacacaatcatc catcaccgatctcaatacattgcga
AT4G18270 gccagaatacacatccatcatcagg tgtgttgcgattgtgagttaagaaa
AT4G20970 tcttcctcatcattcttctacggtt tccatgtatgggtgatgatcttaat AT1G65470 tctcgtctacaacatcaaataaaca cattaaatgacatcaccaaagagta AT5G44650 aagtcgcggtttgttcccatatcac gattgatatttctcctgccttttgt
AT1G22730 tattatttgtttctttgcgatttta cagatttggttattgaatccgttga AT3G02860 acagctcaagcccaatccccagaac ggaattgtagaaacccagaagtgac AT3G18520 aaacaaatctgtaagctgcccaaat ttttgtgagttgaccttgtttgaac
AT2G17787 gagtcagccccttgatggtaggcat ggtctgtttgcttatggtgtcattc
AT5G20280 catgtagaatttggaggtctgagta tctcattaaggtgatatagattgct AT1G15030 gacatgcgtatgtactttgttccac gcattgtctctcttagaatccatta AT3G14720 tttggacggtatgcacccttgtcta tgtcagaattggtcgctcaatattc
AT1G50140 gaattcaaaggtacacagtttacca atacaaactagcaattttcaaaaag AT5G13700 tacctctgaaattagtagtataaag caatcaatctgcgacattattatca AT1G50120 aattggctgtttcatctcttctcac cattgcctgcatctgacaactgttt
AT3G51830 taaaaatctgtatgcacatcgacgc cctcgatcgtacacatcaaattaat AT4G39850 catgtttaatcttctatacttcaag cacagtacaattctttcggtctggt AT3G47930 gcatatgtttctctcccttgtgtga ttcgtctttatcttgtgctttgagg
AT3G18580 caaaaacacaactcggcctgtaagg aatggagttttaggggttgagccat
AT1G10360 cagagataaaccacttccattcata cccggtatactttattacatgcaat AT2G05590 gaggaaatatcaggcaggctagcta tctctttaggtgtttttgatgatag AT3G22760 tgtctgttcgacttttcttcattga caaagtgtttttttgtgcaatgcag
AT1G60990 tcccttcacaaacgagcagatagat taccaatcacagaggcaacaatata AT5G17510 cacaggttgtaagaatacacgcaat tatactaattgctgcggctttgatg AT1G12730 cagttactcgtaagcagttgttgga tgtagtacgctcatccctgtcgttc
AT4G16770 catctccttggaatcacctgtttgt caatttcatgagctattatactatc
AT4G32330 gaaagcgctgatgggtattgagtcc tgtcatctagaccttggtgctaagt AT2G18770 gcattcgcattcgttttatgatcgg tattgtctgatcttaatagtggtaa
AT3G45740 tatgttcacattttttcctcatttg tgcatgattgagtttgaatacatac
AT2G32700 aatctgggatgcttctgatgtatac gactaactactaccaatttgtgcag AT4G10340 cggattggtacattactctctagtc gctattactcatgggaaaatgacta AT3G60150 tcatctctctcagtcatgttcctaa gaatcaattaatggtgctttttgca
AT2G21380 tgcaaaactgccttagaagaacaac gataacatctctagtcacctaacct AT3G16170 gaagcagaaggaaagtttctaggta taatttttgccaccttacctcaagc AT4G29010 gaaataactgagaattcacacaacc gtgcatgatctaatcaatcacagag
AT5G07660 agtttctgtgccttgtgattgttcc catgcgtttatctcttattgataca
AT5G39790 tgaacagctttagtgggagaaaaaa tcattccagggatttgatgagcgcc
P á g i n a | 205
AT1G25420 tctggtgtcaatcgtactgttagta tatcttgagagatgcattttggaag
AT1G14270 actgcctgggaacaaaattaatctc ccataacagagagattatctttcag
AT5G48220 tatagttcaagataacattgcccac ggttcacctgatcttagctcccatg AT1G61210 ttgtctctgctattattctttttaa cgtgtctttttttcctgcttgtgag AT1G19690 catcacagttaagacagtgttatca taagctctaatgataaaagctggag
AT1G02120 aatgtctcgttctttgtcttatcag cattgactggatgcagaagtttcat AT4G33620 gaatgcctacaagccaaaagcaagg cataacctagttcgaagcagcttgt AT4G39745 tctctgtgatcgtcatcggattcat gcgatcgcactaatcgttggtttta
AT3G48360 tcatcctccgtcaaactaaaacaga attgtgtagtaccggaaataaccat
AT5G62000 tcggaggcaatttgaggtgaaattg taatgtcaaggagctaaactagtgg AT4G18240 gcttttgttgtacggcttgatctta cgtaattcattttgtttaggataca
AT2G24350 gctccttcaggtactattttgcttc gatcttctgaatatatgacgagtga
AT1G60200 ggataccggagaagccctgcataaa tagttccccttcactactttaagca AT2G45990 gctgcagtaactcacgttctatata ccattagtttacaatccctatgcat AT4G27830 aattgactttgctagatcagaatct ggctttagtagcgatgtaaaccaaa
AT2G34890 catcatagttcaaatacggatctag aatggctttaggttgagtgccccac AT4G32660 ctgtagcatgtctgtgaattgttcc tatgtcccggttcagcagctgtagt AT3G14910 gtttcatgggtctttaatccctaca ccatctgtggtgcttaactttgtta
AT3G16840 taagagcgtgctaagttcctgcgga catcaacatataattcgtaatacga
AT2G44350 gtctcgcgtcgtaagtatttgaaaa taatcgattgattggtgatcgaatc AT1G64150 gcaaatcggttccaccaaacctgtg cattgacgttcagcatcatcatgga AT4G39680 tgaacacatctatcaaacaaagctt taagagatggaaacatacatagagg
AT2G47960 tctgcttcttcctcagtccttcggg tctctctttcgtttctcctgcagat AT1G53210 tccatgtggttagaaagactgttga gacttgggtcacaaaacttatctgg AT3G17510 aatccgtcatcctaaaatgccaaag gctgtgatatgctatggttttaaga
AT5G12130 ttttcgcagggtgtgtagagcttac gattttcacttaactcttcaaggag
AT1G10760 tgagggaagtgccaacacagtttaa taacaggtgtattaaattcttgaga AT1G49580 caagccttgagtcagtcatttttaa tagttttatgtctcctgtcttttgg
AT5G37130 actagtctgctctgttggtgctgaa actatggatggtgctgaatgtttaa
AT4G34960 gatattgatggccaacgcttaggta tgttgatttcgctttctgtgattga AT3G19800 tctgtcgacctctctgtccaaaggg gaagctgtcttctctcttacctaat AT5G18100 tgttatcaattttagttctgctgag taaaggaaccatttggatagctgat
AT5G35170 gttatggtcaaggtactaggcaatt tgtggtttggtatcatctcattcga AT2G42220 caggtaatactagttccctcaactg gactcctttgtataattcgccaagt AT5G10520 tcactgttcttgttatctgttaatg aagtcagttctataacatgtctgcg
AT1G80760 aactctcccacctgtaatcttgtga gacgtccaaaatttcaagactcttc
AT3G45240 taacgaaacctacaagaaacattga caaaatccaaactcaagagtaccaa AT3G18390 cattgcaatgcaacgccacgaggtt gatgatcacagggttcttttatgac AT3G09800 gacttgagatgtacctgaaacagtg tcaagactcaaataggcagcaatgg
AT3G01150 cccaatttctagctcccgggatttg gactcttcaagctttcgttttggcg AT3G21070 cggcgattactacacgatcagaaat gagagtgagtataacagaatcggca AT1G53590 cagcggtatccgtgtctaagaaata gctggtattgacatctattacgatt
AT1G04200 ggtaagcaacctctacacatatcca gctcttatctttcttccacttttct
AT5G61120 tccaccagaggcaatgaaaaacaag tgatttagaaaaagaaggaattagc AT1G03380 tgtttctgcccctaaaatattcttg tctagggtcgttttaattcaagcca
AT4G24280 tatgaggtacagttaatttttccag gacttagtactttcacaagcatctg
AT1G71691 aatacttatatcagcctcgttccag ggaaaacttattataatgcatagag AT5G52100 cacagggtgagatgagatactcgca aaatctaatttcgtctctgcttgcg AT1G21170 tttatcaatagatctttctttgcca tgaaccctgccgtttgttccttgca
AT4G17150 gacctcattctcaagtgctatgcgg taattgcggtttttatgttcaagca AT3G53970 tgggaccaccacacccgtaaaatca cacacacatagagatacacagccat AT4G21660 gcaaaaatgaaaccccgctgagatg atatacaatagatatctacacaacg
AT1G22490 tacggtggattttcttgttaatata taagaatgaccctgaccaaatgata
AT3G21465 gatcagtttgttgctcatttttcag gctctgatttccatggcttattaat AT5G65960 gagtgaggtttgacattgatgatga gatacacgcttcattcttctcacct AT5G59650 cactaggttcgtaagcttattagcc taaaatgactttccttctggtggac
AT1G31660 catcatctcagaaacttgagaacca tcgcagaaggaatggatagaacaaa AT4G34830 tttgcataggcctttacaaaacagc tctgagcctcaaagaatgaggaaag AT1G26940 tcttgatcgccaggtcagattgcta gactattggctttatcttaagatga
AT3G46210 gaactgcttctagctcaacagtagg ggacacacgaatcaacacagagcta AT1G70100 caggtataacagagacatgcatcac tattactcatcgtgtcttgtttgaa AT4G31130 ccagatgttatcctacacgacaata aatggtctagctactgtgttcttga
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AT1G58060 caaacatatattcatgatggtggaa caactcggaaattttagtgcaacag AT4G23380 tatccatctgcctgtttaaatcaat tatatctcactaagaccatgccaag AT3G60920 tcaaaatacatggaagaagcactac tggcatcccaaaaggcacgcgtaaa
AT1G76730 tcacctacatttacacaacacaatg caattttgcggccaaatgtttgaag AT1G18700 taaaatcttttttcaacatcgtcca agttcttgtctccttcctgattaga AT1G70740 tctaccatgaaacaccaacaaacaa gacacaagaagatatgtaaatgagc
AT2G36390 catttgcgcttttgttcagtattac tgatacctctctccggttctctcaa
AT5G41350 aacccattctcgcagtcatgtaagg tatgtttttgagatgtgggaaaggc AT3G48000 gcaacattgcccctacaaaaacatt caagaactagctaggaaaatgagtc AT1G19130 taactgcagagattcagaaaaatat caaaggaagacatagatagatgcaa
AT4G19410 gatattaagcaacactgactttagg catggttgaagagaattagcaattg AT2G36900 ttctgcaacaaaactcccaaacttg catagatcatccaaatttgcttgcg AT2G29550 tgtgagtgaagtttcaatactaatc ttgactcataatcgaagaacattgg
AT2G42040 cgtctcttcaatacaaggtacacca tagttgcaccattcaccgtttgtat
AT2G22870 atcagttttctttggctaaatttgg tcttgctttcagataaacgttatta AT1G17830 cctaaatccgcattaaaagttcaag tcgaggccagaaaccaattgcaaat
AT2G41460 tacggttctgtctgaaatcttttaa catttagctgatgtttggaatctca
AT1G17760 ccttttgcctgctcacatgattaga caacaaagccaagagaatgaagttc AT3G58080 cagcaaacacttggttacaaacacc tgccattaaagtcatagtcatatat AT3G48120 tccgccatcgaggtttactgagtca tcagagcttcagacagtttatatgg
AT1G42430 taacattccctttaccagatatagc cagttttcgcgctgctagattctta AT5G38070 tacaacgttgcaggcaagagagggt aacttgttcctttatgctctatttg AT5G65440 tatgtactctctagttgtcttccaa tctggtttttgttctcacagccacc
AT3G26840 taccttctcgttgccctttcgaagc gatagttaatgcgagttaaagcctt
AT1G11930 caaagtgaagcctttgctatgtaaa tattgagttactaaattgggtgtaa AT5G47010 gatgaacaaggtatcacatttcagt gtgaccatagcttttactctttttg AT5G58370 cctgtctgagaactacttgcttgta taataacaaagggtttatgaagtgc
AT5G18630 catatggtagaggtggtaatgcaac gaggctacgaaggagttaagactga AT2G47410 agcatcaggtttgtcttctctcccg catcttgctgttatccttgcttgcc AT5G23690 ccaattcaggtaaatggaatcaggg gtctctttgttgcaccttattacta
AT1G18700 tctttcaccaccttgaactgagtgt gataatgcatgattaggaaactgat
AT5G60990 aatctggattgcaagttctctggag caaagtaaacactagaagaaactag AT4G30870 catttgatttcttggatagatgtca tcggaattacggagaataattggaa
AT1G71720 gaaaacgtaaagcaagagtttcatc ggctttactgttctgcgttttctca
AT5G19350 aaagcttactgatgtgatgtatgac tgctgtgttcactgaatgtggttga AT2G36390 ggctcccgtgtgaaggttacatgtt cgtacttttgattgtatgtcatgca AT5G49340 cttcctggtaataacctttcctgca gaaggtttttctcatagttcacata
AT3G01310 gagaaatgtcctccctgcatatcaa taatgtgactcttcccaaggactac
P á g i n a | 208
Tabla H: intrones mayormente retenidos en la mutante dart5 con respecto a la mosca salvaje. Se muestra el locus y las sondas que reconocen a los intrones.
Locus Intrón afectado
Sonda 1 Sonda 2Dmel_CG8266 AAGATACTTAAAGGCCGGCGGGCAC TTTACACGAGCAGCACGAAGGGACA
Dmel_CG1578 CATAGCGTTAGTAATCGATTTAGCA GCCCAATGAAAGTGATAGCATAGAG
Dmel_CG33208 TATCATTTTGAAAACGGCAAATTGC GGGCACGTAATTGCACCCGTCACTT
Dmel_CG11255 TACCAGTCAACATTGCGTTCAACCA AGTCTTCTTACACTTTTCTATTTGG
Dmel_CG4268 TATTAATCTCAATTGAATGAAACAC GATGGGACGGACACCACTTAAAGCA
Dmel_CG9163 GGGTAATGCTACAATATCACACAGT TAGAGTATGACACTGTTTTGTGAAC
Dmel_CG15899 GCGGTTCGTTCGATGGTTCATTGGA TAACGAACGGAAGGTATAATTGAAT
Dmel_CG1909 TGTTTAAATCTCAAACTCATTGCGC AAGAATGTTTTCAATGTTTTAACAA
Dmel_CG8108 CTTTTATTGGAGTCTTGAGTTATTC TAACACCATTTCCTCATTGATCCGC
Dmel_CG40045 GAAAAAGAATACAATGTTCATAGCA GTAATGGGAGTTACATACAAGTGAC
Dmel_CG12020 TCCTTTTCTGTTGGAGGTTTCAATA TGATAGTTTCTCTGTTTCTTCTGCA
Dmel_CG1099 GACGAAAAAGATGTTGGTTCATTAA AAATGAAGTGGTAACGGGCTGTGTC
Dmel_CG9086 GAAGAGATTACACGCTTCATTAGTC TAGGTGTTCACCTAACGTTGGCAAG
Dmel_CG8177 TTTTGTACTCCGCTCCACGAGCTAG GATTATACCCTACTTAAATTGAATT
Dmel_CG11798 CATTGCGTTTTCGTTGGTTTTCACT GACATTTTTATTCACTTATCCTTGC
Dmel_CG11853 TAAAACAAGACCTTGCCAATGAAGT CCTAGATAGACACCTACCTCTACTT
Dmel_CG17698 GTTCTACTCACAATATTCCAATCCA CAAATACCCGTATACACGAAGATCC
Dmel_CG18646 AAGGGTTTTCATTCGGTGCAATGCA TCGATAACACCATCACCGACTGGCG
Dmel_CG6706 TAACCAAAGATTATACTACGCGGTC TACAAAACTTCCTTACTACCAGTCT
Dmel_CG14180 GAGGCACCACTGTAGTCTAGCGGAG GAGCGCTTTATCCAAATGTGAACAA
Dmel_CG3540 GAGAAGAGGGTTGATATTTGTTTAG TGTTGTAACTGTGTGATTAGCGTAC
Dmel_CG34405 TTCTGGTGGATGTTCAGATGCAGCT TCAACACCTGAGATATTATTAATCA
Dmel_CG7199 ACAAAAGTTGATGAGAACGGAAGGC TTGGTTATAGCTTGAGACGACGACT
Dmel_CG9366 ATAGAGGCGTCACAATCGGGATTGC CGAGGATGAACTTAGTGGGATACGA
Dmel_CG2818 TATGTACTGACCGACCCTATACGAG CCAATAACATTGCTAAGAGATTCCC
Dmel_CG9176 CATCGTTGTGAGAACGTTGAACATT GGCCGATCTGAAACAGATATATTTA
Dmel_CG33518 ATTTGAGGTTAGCAAGAAGAAAGAG AATCTTGTTCAGTGCCATCTATATA
Dmel_CG1522 CATTTTGAATTTATCGAATTCATCA GAGCGGATTGAGTGATGGAATATTT
Dmel_CG10693 TTTTGCATTGTACAAAATAAGTTTG GGGCGATCGGGAACTGATTAACTTT
Dmel_CG7535 TATGCTTCTTAACCACGTATAAATG AAACATCTTCCATCACATGCAACAT
Dmel_CG2818 TATTTACGTCATCCACTGATAAGGG TAGCTAAGGATTATATATAGATATT
Dmel_CG15307 TAATGTATTGTGTGTACGAAGAACG CTGCTCGAAGGACCACAAACGTAAA
Dmel_CG15611 TAAGTACAGCTGAGAGTGTCATAGC AGTAATGACCATCCACTTTGTCCAG
Dmel_CG12071 CGGAAGGGTAACAGAATACAGAATG GTTGCTGTGGTTTCAGTTCATTTGG
Dmel_CG41439 CGACCACACACGTACTCAGTATGGA TATCGTATTGGACTTGTCGTTAAGG
Dmel_CG8408 AATGGATTTCAATTGGGTCAAGGTA TGTACTTTTGGATTTGGTAAAAGGA
Dmel_CG1086 TTATTTGCCATGTTGTGTAATTAAA CCCGCTCCCCCGCTGAATTGTTCAC
Dmel_CG3126 GAGTGGTGTTAGAAATGGTCAAAAA TAATAAGCGGGATTTTAAGTACGAT
Dmel_CG11473 GATTGAAAAAAGGTGGAAGGTGAAA TTGCTCTGTGCAGTCCTGCTCCCGA
Dmel_CG17761 GATTAGTTTGCGAGGCGAAGGACTC GGGCAATCCTTGTAGCGAGTATATC
Dmel_CG34405 TAGCCGTAGGATCTCGCCAAAAGCT CAATTCAAAGAACACTGCTGACTAT
Dmel_CG9412 GATTTAATTATTGGAATTGCTAAGG TCTCCTTACTTTTACTGTGATCAGA
Dmel_CG8253 ATGCCCATGTCCATGGGCAGGAACA GCATCTTGCATCTATCGATTAGTAA
Dmel_CG4294 ATAGTAGCATAGAGCTCCACCCGTT CACGCCGTTCTGGTTGCTGTTGTGG
Dmel_CG32717 TACGGTTACCCCATTACCCATTATC TCTTCTTTTCGATCCGCTCGATACG
Dmel_CG8639 TTTGCAGGCCCACCAACAATCCAAT GCCCAGCACCCTGTGACTTATGAAG
Dmel_CG12746 GACGCCTGGCTTGTTAAATCCATCG TAATGACTCGTCGTTTGGTTATCTC
Dmel_CG4699 TAAACATGACGAAATTCGATAATTG TCTCCGTTTCGTCCCCGTTCCGCAT
Dmel_CG31203 TCGTTTTGTGTATCCGTACAGCGTT GAATAAGCTTGCTAGATTCTGGTAT
Dmel_CG11248 GCTGGTTTGCATACGCCCACAAAAG CACAAACTCACCCTCCTAAAATAAA
Dmel_CG9813 GATTAGAGCCTAAGATTCGATTGCA CACGCCAACATTGATGCGAATGCAA
Dmel_CG33472 GAGTCCATTGCATTTCCAAACCAGA GCGTACTATAACCAGAAGTTGACAA
Dmel_CG12295 CACCCACTTCCGGTTACATCCATTT GGATTCTTTTGACGCTGGAAATTTG
Dmel_CG6477 TGCGATGGATTACAAAAAGGCATGC AGTAGGCGAAGTCCAAATGCACGAC
Dmel_CG12090 TACGTAACAAAACCAAAGGAAATGA GCCTTAGATATATTTGTTGGAGTCG
Dmel_CG9734 GGAATTAAGTCCATTTACTTCGGTC GCCCGCTGCTTTGCGGCTCTTTTAT
Dmel_CG31973 AGTAAGAAAATCATAGCAGATGGAT GAGACCCTCGAAAATGGCAACACGG
Dmel_CG10077 TCGAATTTGAAAATTGAAGAATGTG CATTTAGGGCCCCACAAAGGCTACG
Dmel_CG4019 GAGAAGCGCTTGAATAATGCCACAC TTGAATTTCTTTGGTTTCGAGTGCC
Dmel_CG17510 CAATAGGTACGCATTCTGTCTGGTC TTTATAACAATCAGAACTAAAATAA
Dmel_CG3707 TTAGAAGGTTGTGCAGTTTGATGGA GATGGATTAAGCTATCGATCTGAAC
Dmel_CG32019 GTAAGTCGTTTCAAGCCATTTGTTG TAGCATTAACCGTGGAATATGTCAA
Dmel_CG15270 TAGTTGTTGGTTGGATAGATCGATG TACTTCTCGCTTTTTGTGCGGCACA
Dmel_CG8266 GTCTTATCAGTCGAAAAAGAAAAAC TCTGGGAACCATTTGAGGTGTATTC
Dmel_CG15096 GGGTTTAGTCAAGGCATTCAATAAA CTGACAAGGATATCAGGCAAGGATA
Dmel_CG2621 TCAATTGAATCTGGCGCTAAAAGTA TAACAATGACACTTTCCCTTCACAG
Dmel_CG9734 GTTGAAAACTGAGCGCGGGCAAATT AGAGTTTGGACAGAGGCGTAGTTCA
Dmel_CG31772 GATCCGATACGTACTCGTACCCGTA TCTCAATGATCCCTATTAACTAAGG
Dmel_CG8421 AGTAAAATATCTAATTGCTTGTTGG AAATGGTTTTCTTATTTGTTGCTAA
Dmel_CG11783 TGGGTGCAGACAAGATTTCATCGTT GCTCACCTATGAACGACTTGAATCT
Dmel_CG1522 TGTTTTTCGGTTTTCGATTCAATGG GAACAGTTTGGTAAACTTTGAATTG
Dmel_CG11325 AAGACCACCACATTAGGTACCGGGA CCAGGTTGTAAAATGCTGGTCGGAA
Dmel_CG30048 GAGGGCTAAATATCACTGGAGTCTA TGGGTTAAGTGAGTAGTTCCGTGTA
Dmel_CG32490 TAACTATATCCATGAATATATCTTG CAATGAGGTAAAGTATAAGAATACA
Dmel_CG31814 TTCATTAGAAAAGTACGCTGTATAG TATGCAACTCTTGCAATGTGGCAAA
Dmel_CG32387 GAAATGGTTAGCTAACTCGGAAAAT TGTTTAGCTTTTGCGATGGGTACGC
Dmel_CG9042 GAGTGTTGTTCGCTGGTTGCCAATC TTCCTTATCACAGTAATTAGAAAAG
Dmel_CG6866 AATTTCGGCGAGAGTGTCAACTGGA CGCTATTCGTCGGTGATGTATCGAT
Dmel_CG8034 CAATCGTGTGTTAGAAATTCCAATC TGAATATTTCTACTCCCGGATGACG
Dmel_CG5125 TGTTTGAAGCCCTGTGAAGTGGATA CATTTTATGATAGACCCAATTCCCA
Dmel_CG17927 TAGAATTTTCATGCATTTTGGACTT GATTATCATCATCTATATGTGACCA
Dmel_CG10384 AAAAGTGCGGCCTACTTCTAAAAGA TTTGATGGTAGTAAAAGTATAACCG
Dmel_CG18076 ATTAGAAGTTCTTCAAACCCGGTGA GATATGGATGATTTTGGAGGATTTC
Dmel_CG8604 TTTGCAGATGATGTAATTATATAAC TATTGAGTTCAGTTCTTTATTGCCA
Dmel_CG7971 AAGAAAAAGTATGTGCCTCAATCAT TCTGGTTCCCCCCTTCATTAAGTGG
Dmel_CG32387 ATGTGGTGGCAAGAGGTCACATTAA TTTTGCCCACTAATATTTACAGCTT
Dmel_CG8166 TGCATTTCCCTCAAAGGCTTCCGAG CTTTTGATTTCTAAACTGCCTGTGC
Dmel_CG33217 GGTTTGTTACTTTCTGGAACTACAA GGTTTGTTACTTTCTGGAACTACAA
P á g i n a | 209
Dmel_CG17364 GTGTCAGCCAGTTGAATCGATGTGG GAAAGATCTAGAGTTTAGAGATAGA
Dmel_CG13506 CGTATCCTCGCACTATCACTCAGTT CCATTTTCCCACACGATCTTTATCT
Dmel_CG11848 ATCTACACTAGCCTGTTTAAAACAA CATACATGAAAGAGTATGAATTTAC
Dmel_CG5748 AATAATCATCGAGTCGGACAAACGG CAAGAAATTCTACTCAATGTTGATA
Dmel_CG17077 AACATTAGTTATATTGTAATACAAC AAAAAACATGAAAGTGCGGACTGTA
Dmel_CG8002 GAAATCTCGATTAGCGAAGGTCTTA CAAGATTTAAGTCAAATTATGTACA
Dmel_CG4128 AAATTGGATTAGTGAGCTTCGGGCA AGAGAAATAAGCGTAATGAGGTTTG
Dmel_CG11661 TTTGCAAAAAGTCTGCGGGGCTATG TTTTGCATCATGTGGAATTCCAGGA
Dmel_CG6695 GAGAGAGTGGTAAAGTAGAACAGCC GGGCCTGTATCCTTGTAATTGTAAT
Dmel_CG1049 TAAGTAGTCAAGAGTTAGGATGCAA GTTGAATAGCCCAACTAATCGGGAA
Dmel_CG2040 GCGGGAAATAAGAACACTGGGAAAA CCGTCCAGTGAGTGAAGGTCAAACG
Dmel_CG4128 CGCAATTTAAATCAAAGTCGAACGC GGTTCTGTGTTTGGACTAACGCGAT
Dmel_CG3164 GGTGTTAAGCAGGTTATTAGCACGT GTTATCAAATTCTTCCTCTCGGGCT
Dmel_CG6584 GCCATTTCGTGGGATTAATTGGATA GATGGATCCGCCTTCGATGGCGTCG
Dmel_CG9181 AATCAAATGTTCTAATTAGTCGCGG AAACGCCGACCGCTGGTCGCGCATA
Dmel_CG10691 TGCGTGTTTTTATCCCCTGTTCTTC ACGCAGTTAGCTCGGCTCGCTCATA
Dmel_CG32018 CATCATTTGGAAGTTATAATCGTAA TCAGACAGAAATATACTCCAGAGTA
Dmel_CG10693 TGTTGTTTATCCATACCAGAAATTA TACACACCGAATCTGATTTACCGAG
Dmel_CG1544 TTCCCATACCCCTCCCGAAATCGTC CCGGCTGCGTGTATTTGTCTTGTGA
Dmel_CG10353 TTAGTCGGAAGTACTGGCACTCGCA GCATGACAACGGGTGCGATTTTCGA
Dmel_CG8532 TTGCTGCCGCTAAAGTTGTCGTTGC TTTCGCGAAATGAAACATTGAAATA
Dmel_CG2086 CTGATTCATGCCGTAATGTGTGCAA TAATTGTGAAGTTACTAAGCCTGCC
Dmel_CG3191 TACGGGTATGTATGTTTTTGGAACA GGAAAGGGAATCTTTTCTCCCAATA
Dmel_CG13503 TAGCTGAATTCATTTTAGGTCCTCC GCTGGATTACTAGGGTGTTACTGAA
Dmel_CG1056 TCACCTTTGAATACAGATTGGCAAG GAGATTCACATATAAAACTCATAGA
Dmel_CG10537 ACGATACGATAACGATTTTGATATT CGCTCAATGGATTGTCGGTGGTTTG
Dmel_CG34405 CTCTAGCATTCTCCGGCGAACTTTC GATATTTGGGAGTTACTAATCCTAT
Dmel_CG18646 AAGAATGTGAGTTTCGATTTGGATC GATTCGGATGCCACAGTGTCCAATA
Dmel_CG2534 TAACACATAATTAAAGGGATGCGAT CCTTTAGTCCACAGCTTCACATTAT
Dmel_CG3625 AAGAGCATTTGACGTGTGTGAGATA GAGTGAACTTTAAACCACGCTGCGT
Dmel_CG9473 CCAGGATCAGTGTTGGGAAGGCTAC CAATCTCTTACAGCATCTAACACAA
Dmel_CG32019 TGAAAACCTCCTTGCGAACAATGCT AACTGTATGCAATCATCCTAACCTA
Dmel_CG10537 TGGAATGAAGATCAGGATTCGATCG CGCCGCATTATGTACGATCTTTACC
Dmel_CG9057 CATTAACGAGGGAAGCAAGCAATTG GTTACGGGTTATAAACAAGTCATTG
Dmel_CG4829 GAAAAGTGCTCTAAAAGTGTCTAAA CATACTTTTGTGAATAGAACTCGAT
Dmel_CG10693 CAGAGATCAGGCCACTCACCTAAGA TCTAAATTACGTCTCTAACCCATAG
Dmel_CG5695 CACAGGAATCGCAAGAACAATTAGC GGTGTTAGTAATTTAGTTAGTATGA
Dmel_CG32809 AACACACAATTAGGCGGTAAAACAC CGTTTTCTCTCCAGGCACTTCGGAT
Dmel_CG9936 GACATCGTGTTAGTGAAACAAGCTG GGTTTTTGGGTCGTCACTTTCACTC
Dmel_CG33208 AAAGAAGAAGTATTGATTAAATTTA TAATATAGCATTATTGATCCCCGGC
Dmel_CG9907 GGTATTTGGTTTAGGGCATTCATTA GCTAAGCACATTCCAGCTAGAAATA
Dmel_CG6859 GATGAGTGGAGGACGCTCCTCTGTT CACCCTACGCACACAGGTGAACTTT
Dmel_CG6238 AAATGAAAATAAGTTGTCGCTGATT TCCCAGGATATCAATAGTGTGGCCT
Dmel_CG1830 CTAACTGATCTTGATTGCGACCATA CATCATGTAATCCTTCACTAACCAA
Dmel_CG17212 CAAAGTAGGGATCGTGTAAACATTA TAAATTGCGGTTTCCAGCTGACTGA
Dmel_CG5958 TAGTTTTTCCTAATCCACTGATTGC CTTGCCCGATCATTTGGGTTAGAAA
Dmel_CG4019 TCTGTGTCTATATAATATTGCGTAA ACCAACTTTCTGTTTCACTGTGTTA
Dmel_CG8779 TATAATCTTTCTTAGACTTCATGTC CATAACCCCTTAAAAATTTGACAGC
Dmel_CG32046 GCAAAGCGGTTAGAGGAAAAGCGAT CGAAACTCCGAACGACTATTCAAAA
Dmel_CG9990 TGGCATGCACCACGTGGCTAACCCG CCATCTGTTTGTGGTTTTGAACTGG
Dmel_CG7007 TATTTCGCGGCTTGAGTTTGACTGA TCCGTCGCGAGTGCTATTTTCTTGA
Dmel_CG3725 GGAAGAGTGTGGTCGTAACTAAGTT GGTGGGTTTCTTTGTGCTGCTGCAC
Dmel_CG32698 TAAGATCGATCTTCTACTTCATCAC TCACTCATTTTCCATCGCTCTTCTG
Dmel_CG10693 GTAAGTCACGCAGCTGGCAGTTTTC TACTTTAGCGAACTTACTAAATGCC
Dmel_CG34405 TCAAAACAACCACACCGACTCATTA GTTACTGTTATTCCAACTACTAAAC
Dmel_CG9057 CACATTACGATGAAAAATACGGATT CACCCGGAGGAGGTCTTATTTTCAT
Dmel_CG4999 TTGCGCGCGCTCAATCAAAACAGTG GTGCTCTTCTGTCCGCTCTACCAAA
Dmel_CG1522 TCGAAAAATTACTTCCCTGTGTGCT TGATTTTTGATTGAGCTTGTTGGAC
Dmel_CG15015 AACGAAATATTTGAAGAAGTTGCAA TAATGTATGTGGGTGAAAGATATAT
Dmel_CG9932 AAATAAGTCAACAATTAGTATAGCT GGCGGCTCGCTTCGGTTTTTCAATG
Dmel_CG1770 CAGGTTAGTTACTCATTCCTATCAT AAAACCATGGGCTAATGAACTTGAC
Dmel_CG2999 TTTGATTTGGGTTTTTAGACATTCC CAACAGAAAACTAGGACGGTGAGAG
Dmel_CG7149 TACAGATCGCAATTTGAAAGATTCA CCCATTGCGATAATCACTTCAGTAC
Dmel_CG8176 ATTTTTCATTTACATCGTTGTATGG CATCCATCAACCACTGCTCATCCAA
Dmel_CG9042 GAAAGTTATCGGGAACGGGCAACAA GTTTGATATAATAACTATGCATCTC
Dmel_CG2146 ACAGCAATTGACTAACCCTAAACGA ACACACGACCTACTAATTTCGCCTA
Dmel_CG2165 GCATTCCAATTGTTGCCTTTGTGAG TGTTTCACTGTTTCTAATAATACGA
Dmel_CG5594 GGTCCATATCCGAAGCGACTCTCAC CATACTCCTCATGGTGACATTTTCA
Dmel_CG6671 CAATTGCCAGTTAGTCTCTTCTTCG CAAATTGCATAAGGATCTTAGTAAT
Dmel_CG9795 TGTGTGCCAAATTCCGCTGAGACGC GCTTAACAATACTTAACTATCCGTA
Dmel_CG16932 GGTTTCTCGATCAATAATTAGGCTA TACAGAAATCATGAGAAACTGAAAC
Dmel_CG17759 TGTGTGCAGTTTACTATCATAGGAT TCAAACTAACTACGCCTTCTTTTCT
Dmel_CG1871 GGAACATTAATGTTATTGGCGGTGA TAGTGTGCGTTTCATTACATTACGT
Dmel_CG3620 GTACTGAACGAAACACGGCCGCAGA CCAAAATCCAACTGCCGCTTCAAAA
Dmel_CG11148 AAGTTCTATACTGTTGTTCAATAAC TGTGCTCATATGTGTAGGAGTAAAA
Dmel_CG33513 AGGCCCGGTGCTCATTTTGACTACA CGGATGCAAGCATGCAGAGCACACA
Dmel_CG1318 TAAGGCAATGGTTCAGGAAAGAGGC ATGTTTTCCGTTGACTCTATGAGTA
Dmel_CG8233 TAATTAGTGTTTAATACCGACAAGA TGATATGATGCCTTTAGTTTAAACA
Dmel_CG5215 CAATGGAGAAAATGTGACAAAGACG TCAGACTGCAGGAGGCTGGACTTGT
Dmel_CG34240 CAAAAATGTCGTAGTATTATTGTTA CCTAACCGCTCTATTTGATTGAAAT
Dmel_CG5455 GAGTGAGCGTGCTTTGTCGGATCCA CGTCAAGGTGCCGTTCCAGTCGGTC
Dmel_CG32387 GGGATCAGCCAAGGATTGATGAGCC TTCGGCTTCTCCTTTCACATACTAA
Dmel_CG15078 TATGAGTGTTGATTTTCGTAGTACT GGAGTTGCGTGTTAGGTGAAATAAC
Dmel_CG33092 AAATATTGAAACTATTGCATCACAA CACATATTTTCTAACATTCAATCTT
Dmel_CG9042 CCATCGCCAGATGCACTTACATAAT TTTTAATCTAAACCTTGCGCCCTTG
Dmel_CG1333 AAGATTCCGGGTATTTCCATCGCTA CTGACTTCCTCATCTGCATCTTGTA
Dmel_CG11066 CAAATCAAATCAGGGATAGTCAATC TCGAAATTTGTGGTCCACAGTTAAT
Dmel_CG5237 GTTTTGGCATCAAAGCCCAGAGGCG CCGGATCGAGGATCTTGCTGAGCAC
Dmel_CG15817 GCCGTTCTAGACACCTGCACATGTT AAAATACTAATAATCCTGTTCCTTG
Dmel_CG8877 TAGACAAAGTACATCATGTGGTCAT GATTTTAGAATGGTAATTTTTGAAG
Dmel_CG10737 TCTCCGTCAGCTTTTCATCCTTTTC CCAATACCCAATACTAATTTATTGA
Dmel_CG18076 TTGTTTTGGGAGGGGCGGTGGTGTC TTTGATTCGATGAGATGCCTTAATA
Dmel_CG8604 TTTGAAACTAACAACTAAGTAACTA CATAAATACCGACTAATGGCAAATC
Dmel_CG9425 CCGGAGTTTACAAGAGCTTATCCCT GCAATCATTACCCTTTTCCAACTTT
Dmel_CG31149 TGGACCACAGTGAGTACCTCTAATG AACAGCTGCCCATTTGACTATGTGA
Dmel_CG10209 ATTAGCAATCCCACATTCCAATGAA GAATCGGACGATTCGTAATTTTTGG
P á g i n a | 210
Dmel_CG1799 CGTTATCCAAATCTCATGTCATTGC TCCGAAATTCCCGACAATCCCGAAA
Dmel_CG7047 AATTCGTTAGAACACGGTTGCCAAA TCATAGCTGGCTAGGTCTGAGACCA
Dmel_CG32018 ATTAAATCAAACATTCAAAGTCGTG ATATTTTCACTCCTTAACATTAATG
Dmel_CG17927 TATACAACATAATTAATACACTAGC TATGATCGATTATTAACGTGTGAAT
Dmel_CG9291 TAATAGTTAAAGAAACGACTTTTGA GGCTGTGCCTTTGGTGGAGCCAAAC
Dmel_CG5670 TCACTAACCTCAACCTTTAAAAGGA ACCACCACAAACGTTTGCACGTTTA
Dmel_CG7293 TTGCTCATTAGCTCAAGTGGCTGAC TGCGTCAGGAGGGAATTATTGATTT
Dmel_CG30165 TGTTATGGAGTATCAGTCCGTAGGT GGAGAAAGAGGACTTGATCCTTTTA
Dmel_CG32423 CACAGGTGGGTTAAATAGCATTCCG TGGAAGCCCATTCAGATATGTTATG
Dmel_CG11098 TTGGACCTCCGGCACAGCCATGTCT CATAATTAATTTTGCGTTTGTCTGG
Dmel_CG32387 TTGGAGGAGCGTGGAAAAATGAAAA CCAGTGGATAGCATCGATTTGCGCC
Dmel_CG4128 TGAAAAATACAATAACAACCACACA CGTACTTTAAGCTATAGCGTTTTAA
Dmel_CG9042 GAATGTTTAACATTCCCCAAAGAAA TTCCATCCATTACAAATTAGTTTCC
Dmel_CG4481 AAATGAATACTGGCTTAAAAGTGGC TCCAAGCATTGATTCTAATCCACGC
Dmel_CG5444 ATCCAACCACCATGCTGTCACCCTG GACTTTGAAAATGTGATGAGATGAA
Dmel_CG10023 TAAAAAGGATTTGTTACTCGCGGCT GATTGCTGTCATCTAATCCTACGGC
Dmel_CG17603 TTATTATCCTTACTTCGTGTTTGTG GAGTACGCTCTTTCTAATGCGTGTT
Dmel_CG11051 TAATTATAAAGCAATCATATCAAAA GTATTTTCCATAAAGTATTTACGAA
Dmel_CG1517 TAGTATGTTGAATATGTGATTATCC AATATAAGACTTTCCCTTTCGGCAG
Dmel_CG7971 GCCTTTAAGGATAAGTATTTCACTT ACATAAGCTATTAAAAGCGTGGTAC
Dmel_CG32464 CAGTCGACACTGTTGACTTTTAATG AGAAGATGTTTGTATTCCACCTGAC
Dmel_CG17762 GAACATTAAGATCGACAGAGCATAT TTGTATTCTGCAGACTTGTTGGTAT
Dmel_CG3028 GGATATGTTAACTATATGTTAACCA TACATTTTTCTGACTCATCCGATAT
Dmel_CG13320 CAAATTTGTCTGGAATGTATGTGTA AACTCGTATCCTCCTTTACCATTTC
Dmel_CG1522 CACGATTCAGATATCGGTAAAGAAT GAAATCAGGATTTCCGGTTTTGACT
Dmel_CG9065 GATAAGAATTTTGTTGTTAGCCATG CATGGGATGCAAAAGGTGCACACTC
Dmel_CG9499 TAATTAGCTATGTCTCTTAATACAT CAAATTACGGGATTATAGAAGCTAT
Dmel_CG33203 CAGAGGGTTAATGACCATATTAGCG CCAGCCAAAAACGTACAGTTATAGA
Dmel_CG2467 CGATTTAGGTTGTGCGCATATAGGA TGAGAAGTAATTGGGATTCGATTCG
Dmel_CG11352 GATAAGAGGTTATTATTCAAGGATG CTTAAGCGTAACAGGATGGAATTCA
Dmel_CG4533 GCTTTGATCAAGAAACGAGACGATA TCTTCACTGTTCAATAAATTCCGCG
Dmel_CG4596 AAAGCCCCATCTATTCATGTTCTAA ATGTTTTTGTGGTTATAAGGATTAT
Dmel_CG6588 GAAAATCTATACTGTGCATAGGGCA CGAGGAAATGCTGTTTGTCGTCGGC
Dmel_CG15441 TGCAACACAGAGGTCATAATCAAGT AAGATGGAAGTTGCCCTCATCCCTA
Dmel_CG17193 AAATCTGGGTAAATCAAAACCGGCA TTACATGGGCCATATGGCTAAGGGC
Dmel_CG2671 TGTACAGATATAATGTGGGCCCGTG GTAGATACGTACAAAACAGCAAATT
Dmel_CG33141 TAATTATTGCAACATAACATACATA TATAGTACAGGGTACAGGGCGGACC
Dmel_CG18319 TCTAAAAACCATTGTTTTTGTCCAA TGGTTAACTTCACTCCGATCTCGTT
Dmel_CG8002 TAAATAACTTTGTAACATCTTGCAT TACTCTTTCAAATTCGTGGGACACG
Dmel_CG8390 TACCCAAAGGAGTTGTGTTCTTTAA CGGCTAATTACGGTTAAGAATTGTA
Dmel_CG2818 TGAGTCCTTGAATTAATTGCCAAAC GCTATCATTAACTTTGTACTCCATT
Dmel_CG6236 GCAAATATCGGACCAGACACATGAG TTCGCATTATTGCTGCACATACAGC
Dmel_CG34313 GTTCAACCCGCGGAGTAAAACTCCA CACTGAACATACTACAGTTTCCACA
Dmel_CG8095 AAAGAACCTCTTGTTCGCAAATGGA TTTTACATCACAACTATATACAGTG
Dmel_CG1553 CAAATAAACATAGATGTAAGTACGG CTAGTTTTTCTGTTTCGGCTATACA
Dmel_CG9572 CGTATTCGTAGTCTTACCGCACCAG GTGCATCACCTCACCGCCTGTGCCT
Dmel_CG2999 TAACAAAATAGAATTAACAAGATAT GCAGGATTACTTTAAGTTTCACTTA
Dmel_CG7720 GAAGAAACAGTTTGATTTGTTAATT GCGATAGTAGTTGGCTTCCGTTTTC
Dmel_CG9911 CATATGTACGATTGTAATGTGTTAT CCAAATCGCCTTGCCTAAATATAAG
Dmel_CG1643 GGAACCAACAGTTTGTGTACCCTAG TACACAAACTGGTATGGCGATTTCT
Dmel_CG16833 AATGCCTTTTTGTTAATTGTCCTGC GTTCCCCATGTTGTAAATAACCGCC
Dmel_CG5794 AAATGTAGGAAACTTTGAACACACG GAATGGTTGTTTGATTGATTAAAAG
Dmel_CG34405 ATTGACAAGTGCCTATTCACCCACC GATTGCCTGACACTAATGCGTACAT
Dmel_CG1513 GGGTAATGCAAATTGAGCTTTCGCA GCTTGACCCTGGCTCGATGACCAGT
Dmel_CG32490 TGTGACCAGGTTGTTTTGATTGGCA TACTAATTTCTTCTACTTCCCCGAC
Dmel_CG11284 GAGATCTGAGATCATTGATCACTTG TATTTGGCGAATTCTAATGTCGATG
Dmel_CG34403 TAGATTGTCGGGTTAGCAGGCATTT TACGGAATGCAAATACTTGGCACTC
Dmel_CG32000 GAACGCATCACATTGCCTTAATATT ATCTATTTACGAATTTTCAGAGTGT
Dmel_CG1903 TTTTTGCAGCAAGTTGTTTTGGATA CATGTTCATGTATCCGTGCTCTTGA
Dmel_CG3902 GATAACGATAAGGTTTTAGTTTGAA GAAAACGAAGCTAGGGGGTATAATC
Dmel_CG3606 TGTTATCCACTTTTAGTATTTCGCT CCATACTGCATTAAAACCAAAATCA
Dmel_CG11051 TAAAATGCTCAAAGTCCTGGCACAC GCAGGACCTATTTTCAGAGATAAAC
Dmel_CG9565 CAAATGAAGTAGCTACCATATGGTA GATTATTAGATACACGTTGGTAGGC
Dmel_CG10155 AATGAATCAGGTTTAGTCATCATAA TAGTTGGGGCTCAGCCATGAGGATT
Dmel_CG9578 TTGGTATAGCCCAGTTCCAATGGCC ACACTCAATGTAATCCCGTCCTGCA
Dmel_CG9009 CATATAAGAAAGCTTTTAAAATACG AAAGGTCTTTATAATCTAGTAATAC
Dmel_CG8408 ACCGAGACGAGGTGTAAACACAGTC GAGGCCACTTAACACCTTACAGGTG
Dmel_CG33543 AAGTATGTTAAGTGCACTTCGACCG TATTGATAAGTATGCCAATAAATTG
Dmel_CG6292 TAGGAATTAACGACTCTTTCTAGGA GCGATCTCTAGGAGGGATTACACCA
Dmel_CG34356 CTGCACACACTTTGGGTTTTGTTGT TATAATGCCGAGTAATAAGCTTTTG
Dmel_CG8440 CATATGATTATACAGTAGAAGTTCG CATATTGAATGTCTACCTTTTCCAT
Dmel_CG5473 GAGATTATGTATGTCGCATTCATCA GAACTGCGTAACAACTAAACACTAA
Dmel_CG33547 TGGTTGGTTGTTGTCATAAATTTTG ACGAACGAACGCAAAATGGAAACCA
Dmel_CG8085 ATGGAATGGAAAAAATAACACACAA TCTCTCCGCGTTCCTATGGTTGAGT
Dmel_CG12085 ATTGGGAAGAGGGATTAGTGCATCT TTTTTTCAATATTAGATACTGCATA
Dmel_CG7583 TTTTACGCAATCTGAGTTGGCGCCG TGAATGTGATCGCAACTAATGAATG
Dmel_CG32296 AGAAAAATCATATTTCGGAGACGGA GATCCTTCAAGAGCGGCACACAACT
Dmel_CG6498 TAAAGTTCCAAATCGAGTGTTAAGC TGAGAACTTAGAGCTGGGAAGCGCC
Dmel_CG18646 TAAGTTTCAAACTGGCAATGCTGTA TCCAACCTCAGACAAAAAATAACAC
Dmel_CG16704 TTTTTAGCACAACACAGCGAGACCA TGATCGCTTTCTCCGTTATTACTTA
Dmel_CG10289 GCGACGACGCGTAACTGAGACATTT ATCAGCACGGATCGAGTCAACCTAC
Dmel_CG10693 TATAAAAACTATAATTAAATCCTAT TGGCACCTCTCAATCAATCTAAATG
Dmel_CG6174 CATTAAATGCGGGTAGCTTTGTGCA TAAAATAAGCTGACGCAACTAACTA
Dmel_CG1507 TCATCTGATTAGAATTTTGTTATCA AAATTCACAACCATGGAACGTTATG
Dmel_CG5723 TATTCGGCATAGATTCCGACAACGA ACAATATTTTGTTCTTGACTATAAA
Dmel_CG2252 CGCGGCGTGGAGAGAGGGAATGGAA GCCCTGACATTGAGTCACTGGATTT
Dmel_CG31973 TTGGGAACACATTTTGGAATCACGA GCCTCCATTTGTATTTCTAGCAGAG
Dmel_CG13778 TTTTACCGCTCGCATTCACCGTTAA TCAGAATTAAAAACTATTAGCAACT
Dmel_CG11328 GGTGTTTTCTAATTAATGCGGAATA AATTTATCATTAATCTTTGAAAAGG
Dmel_CG2252 TTTCAAACCAATAGAGCGACGATGG TAGTTACAAACTTACAATATGGCTT
Dmel_CG7555 GCACTTGTAGTCTCAAACCTTGGTT TGAATAAAATAATCGATCCACCAAT
Dmel_CG33013 GGCTCCGTGCTTTTACTTTTGTGGG GGTTGGCTGCCTCGTGATGTTAACA
Dmel_CG31771 TGTATCGGTTTAACCATTATCATTC CATACACACAACAGGCATAGAGGCA
Dmel_CG11348 CCGAAAATTATAACCGAATCACAAC GTGTGTGTACACTCTTCCGTTGTTT
Dmel_CG5627 GAATCGATCCCACCACGCTTTCATG TACGAATTCGTTTTCGGATCCATAG
Dmel_CG1511 TAATAAAATCCGTTCAAATATCTTG TAATCACATTCATGCTTATACAAAG
P á g i n a | 211
Dmel_CG4894 TAAAAGTCATTGGTAAAGGGTATCT CCCTGACGTTCCAAATCATTTCCAA
Dmel_CG9317 TAATTATTTCATCAGTTATTTCAAA AATGGGCTGACTTGATTGCCTTAGC
Dmel_CG11155 AATTTATTGTTGCTTCTATAAACCT TAAGAGATTAATATACTTTGTAACA
Dmel_CG1965 AGAGGGACCAAGTCCGATTTGTGAC TTAACCTTTGCTCACTCCTCTGCAG
Dmel_CG14372 TGTTGGAATTAAAAAGTACGACGTC GTCCATTATTTATTGACCCCAACAA
Dmel_CG1848 TCAATAATTAGCAAAGTGTTACTAC TGCTTTTAATTCAACTCAGGCACAT
Dmel_CG1715 GGTTAATCGGTGTCAAGTCTTCGCA CGCTTCGATCTGTTTATTTCGGCCT
Dmel_CG17816 TATAAATGGTAGTTCTGCTCAGTTT GTTTATTGAAGAGTTTGGTTTTTGA
Dmel_CG6703 TCAATTAGCGCGTGAACAAAGACAG TTTGGGCGTAATGGGATGAGGAAGA
Dmel_CG11023 AATATATTGATGTCTTTCGTACCCA AACGTTGTGGTGCTTGCGCTTTAAA
Dmel_CG4700 TAAGCCCACCGACTTTCGGAGCGAT TTTACTTTTTATCCCGCGCGCGCAG
Dmel_CG9834 CAGAGGGCAGAAAAAGACCGTGAGT TGCAATAAGGAAACCCCATCAAATC
Dmel_CG10076 AACAGCACGTAAAACCGTAATGCAT TGACTGAATGCGTTCTCCTCTCTTT
Dmel_CG5554 CGAAAGGGTGGCTCTGAGTAGTCCC TCGGCAGCTGTGTTAAACATATGTT
Dmel_CG10975 TATTTCTGCCCCCATAAAGATGGAA TCTGATCATTTTTCGATCTTTTCAG
Dmel_CG34405 CAACAGTTTTAACTCCGAGGAGCTC TAATGTTATGCCATCTCTGACGCAA
Dmel_CG2086 GAATTCAGACAATTAGATCGTTGTT CAGAGCACTACACGGAATGGTTCTT
Dmel_CG11473 TGCAGTAGTAGAGGCGTTAATAGGT TCGTCTTACTTAACTCAGTCTCGCT
Dmel_CG2082 GTTGGTTGGTTGTTAGGTTCAAACA AATGGCCCAGTAAAGCTGGCGCGGA
Dmel_CG7524 TAATATTAAGATGCTAGATTAGCTC AATTAAATTGTAATGGATGCAGGGC
Dmel_CG11111 ACATTTTTCATCTGCGGCCTGGAAA TCCTTTGCGCTTTGGACCTTACTCT
Dmel_CG4898 AATTTGCTACCCCTTGGTTTGGGCA GGTTCTTTCGACCATCGAACGTTTG
Dmel_CG8400 TATTGGTTAATTGACTCAGGCAGCG TCCAGATCCAGCAGGATCCAGTAGA
Dmel_CG7875 TGTTTATAAATTCAAGCAGGGTACT CAGTTCCTTAATGTGCACGGATTAG
Dmel_CG32019 TGCAAATGAATTAGTGTTCCAGAAA AATTAATATTCATAACATTTGCGTC
Dmel_CG12253 GACTCGCGAATTTGTATGTACATCA TGAAAACTAAGATTTGTTACTAAAT
Dmel_CG8727 GATAACGCAAGGAGAAAACTTAAGT GAATCTCACACTTTCGCATGGCCAC
Dmel_CG5945 TGCACTATGAAGAACGATGCCTGCT TTAATGCACATTCTAACGCTTGTGA
Dmel_CG8201 GCGTAAGTCCCACTTTGGGGCTAAC AAGTACCCATTTTAATGTACGATAA
Dmel_CG1506 GTAATCAAGGCGGACGGTTATCAAT CCAACTTATCTGTAGTGGTTAGGCA
Dmel_CG12071 TATTGCACATAGTGTGTAGTATTAC GCTTTTCTCTGGACTTTCTCATGTT
Dmel_CG1976 GCGTCCGATTGATTTCCTACCCCAG CAAAGCGCGTCCACATTAATATTGA
Dmel_CG11883 GAGTCGTGGCTTTTCATTTGCATAA CGTTTTCAAGCAACTATTACCCCAT
Dmel_CG3525 CATTTAAGTTTACAGAATTCGAGTA CATATACGTATGTTGTCTCGTTACC
Dmel_CG13363 GGGATTTCGATTAATATGAATTGCA CACCACAGAGGCGAGTAACCATGCT
Dmel_CG1695 GTGAGTGTGCTCATCCCGAAAGTAT TTTCTTTGTCATCCCCGAATCGCAG
Dmel_CG1522 CGATTCGATCCAGAAACGATTCAGT TGGAAAGACAACAACGACATGTAGA
Dmel_CG34405 ATTGGCCTATGCTCCTGCCCGGTCA CATAACTGTGGATTGTATATATATA
Dmel_CG18815 GTAAGTGGGGTCATCCTCATTCAAA ACTGCAAACAAAACTTACCTAAGTA
Dmel_CG7535 TTTAAACTCCAAACAGCTTATGGTT ACTTTCATGTCAAACGGCGTCGCAA
Dmel_CG32387 AAGATCAGGCGAAACGGGTTAAGAT GATTCGAAGGACTCGAGTTCCTCAT
Dmel_CG11111 CGTAGTTGCCCGCTAAGAAAGCAGC TTAAATTCGTATTGCCAACTAACTG
Dmel_CG17759 TGCTGCCAGTTCTGTGTTTGGTCAG CTAATAAAACAACGATCTCTTGGTA
Dmel_CG4532 CATGAAATTTATCAAAAGGATCGTT TGTTTGTGTTGCCATTTTCAGCAGT
Dmel_CG6775 TTCACACATAATTCTCTTCGGATGT CTTCCTTCCACTTCTAACTCTAATA
Dmel_CG2999 AATACACATAACTATTAAAATTAGG ACAATTATTTGTGCTCTGCTAAGAA
Dmel_CG7892 CAGCGCTGAAGAGTGAAAATTGGGC AACTCTTCCCTCTTCGAATCGATCA
Dmel_CG6634 TGTGGTACTGAGATACTCAGATGCG CAGCTATGTAAATTTCAATCGACTT
Dmel_CG32484 AACCCCCTTTTGACTTATGTGGATC CGTAATCCGATTATCAGTCTTGTGT
Dmel_CG2505 GGCCAAGAGTGCATGGTCAATGTCG GTCAGTCTGTCTACTATTATCCCCG
Dmel_CG8325 TATATTAGTTCTTTCGACAAAAGCT GATAGTGAGATATGAATAAGTCAGA
Dmel_CG32335 TGGAAAGCTTTATTTGACGTATCCG TTTTATCAGCTATTCCACGCGGGAG
Dmel_CG1862 TGAAAAAGATGTACCAAAAAAGGAA ACGGCTACAGCGTTTTGTTGTAAAA
Dmel_CG10541 CATGGTGGAGTCATGGCAACTATCA GAAACCCCAACATGTGTGATTGACA
Dmel_CG17248 AAAATGATGCAAGAATTAGTAGGGC AATAAATAAAAGATTGCTCTCGCTG
Dmel_CG8770 GCTTATATTAATTACCAAGAACAAC GTATTCATTACACCCACCCAATTAT
Dmel_CG17686 GTCGATTAGTTAGCGAAGGCAACGG CTCGCCAGGCTACCCTAGACAAAAT
Dmel_CG3664 TTATAATGGAGACGGATAAAAACGA TACACTTTTACCGATGTCCCACAGA
Dmel_CG16926 TGCAAAATTGATGCGTATGAGCTCC GATCGAGATCGTGGATCGTCATGTG
Dmel_CG13654 TTAATTGACATTGCAGCGGAACGTA CATTGTGTTTAGACTGCATATGCAT
Dmel_CG7875 ATACAAAGTGTACGGAACCCAAGAG GAGCAACTGCATCCCTACACCACCC
Dmel_CG2519 CGTTTACCGTTTCATGATTCATTGG AACGACGCTGTCTCGTGACCGCAAA
Dmel_CG33547 TGCATCAGATGGTGGCATGGAAAGT TGGCCATTTTGTTGGGTGGTTCGTT
Dmel_CG8884 CACTTTGATTGGTAACCAAATTACA CGTCAGTGGAGTGAAACTTATCGCA
Dmel_CG5098 ACCGTCGAGATCAAGCTGCCAGTTA ATACTGGCCAATCCGTTTTAACTAA
Dmel_CG34408 GAGCTCTTGAACTCATTCCATTTTG TGTATTATTTAATTGCCCACCTTTT
Dmel_CG2910 TAAAAACGATCTGAATTGCTCTGAT TGCATTTCGCCCGTACTTTCACAAA
Dmel_CG8739 TTTTAGCTCACTGCACCAGATATCT CAGTTAGACACAGCACTATGTTGTA
Dmel_CG7555 TCTGTATTCCCTAGGGTGCACGTTT GAATTTTAGATGTGTAGACGTCTAG
Dmel_CG34126 TTTTGGTGCGACATTTTTCCTTTTA GCACGATATGCTTTCTAACCCCTTC
Dmel_CG7611 CTTAGCAGACTTGATGCACCAAAGC TCACCTAACTCCAATAGAGCACAAT
Dmel_CG5247 GGGTTTTAATGTGCGAAGTCTGTTC TAAATATATAGCAATCCGTACACTA
Dmel_CG1522 TACGATAGTTAAATGCATTGAACAA GAAGTGGCTTCATCGTTAAAATAAA
Dmel_CG9163 GGCCATCGGGTTACCCACATTCACG ACCTTAGACACAGGGAGAAGTTTCT
Dmel_CG17058 GACACTTATGGACACATCAAGTTAG GTTCCTAACAGTTGCACAGTGTGTA
Dmel_CG32464 CACCAACTGGTTTTGTGGTCCGAAA TCCCTTTTGGATCCCTTTGCCAGAT
Dmel_CG8739 AATGTGTTAGTATTGAGACCGAAAC TACTAGTCAGAGTTTACTAATATGG
Dmel_CG33514 TAAGGATTTTGACGCCAGCTAACTA TATCAATGCAATTCTGTCAATTCAG
Dmel_CG12072 TCAAACGAAAATTGTCACACGCTCA CGTTGCATTTTCACCAGGCATTTTC
Dmel_CG6214 TATGTCCGATACAAATCGCCATCGC CACGCTTTTGCCTAGAAAATCAATT
Dmel_CG8421 TAAGTGTTAGCCATAGGATATACAA GAAAACAATTTGTTCTAATTCAGAT
Dmel_CG32169 TGCAATTTTAAACTTTGCCCAGGGA CGAGGGAGAGGTTTGCGCTTTAACT
Dmel_CG33130 TACGAAAAGTCACAAAAACAGAAAA GATAAATGCGATGCGGTGCAAAGTT
Dmel_CG4086 GAACAGACACTCAAGGTTAAAAGAT GATTACTTGACCCTGGTTAACTTAC
Dmel_CG8996 GATTATGTAAGATTATCTATCGCAC CCACCCTAATGTGAGACTTCTTGGG
Dmel_CG32387 CCGAATGGGAATTGGTAAGTTCTAC CCTTTCTCCGGACATATTTTCTCAT
Dmel_CG16899 TATGTCTTCCAGAAGCACAAGACGA GACGATCAGTCTACATAATTTACTT
Dmel_CG4532 CTTTATATTCCACCGCCCAGGCACT GGAGAATATATTGACTAACATTACC
Dmel_CG33275 AACTGTGCTACTTCTTCTAGGCCCC TATCCAATATGTGTAAATATCCCCC
Dmel_CG10693 TCTACTGTTACCAATAAGCATACGA ACTCCTATTTATATGTCTCTGTGTG
Dmel_CG8929 CAACTACCAGCAAGCAACTGCATAG GCTTACCTTTTACCTCTCAACCTTG
Dmel_CG4376 TTTTATTTCAGGAGGGTTGTTGTTG AAGTGTATCGTGGTGAAGTTTAGTC
Dmel_CG4894 GAAAGAATCCCTCCAAAATCCTCTG CCCAATCGAATATTGGCAATAAATA
Dmel_CG1200 TAAGAAGCAATCTGGCGAAGCTTGC AGTTCAGTTTCATCAGTAAAGCCCT
Dmel_CG9163 GAATACTCAAACGATTGTGAGACTA TCTCTATGCGAACATCACCTGCTCT
Dmel_CG33995 CATACCGACCTACTCAGAATGATAT CAGTGACTCATCGATTTCTGCATTT
P á g i n a | 212
Dmel_CG4662 AAAGCGTTAACAAGTGTGCTAAGTG GATTAATCTCTTCCAACATCCTCGA
Dmel_CG9765 CGAGAAATTTATACATAAACTTGGA TTTTCTACCTTAAGAGATTTCTGGG
Dmel_CG33208 GCAGTGTTTGTAGGCGTGTTTTGGG CGTGCAAAGCGAGAACGGGAGATTC
Dmel_CG34363 TCCACCAAGTTTGGCGATCGTTAGT TGTGTGGGTGTAATAGGAATAATAG
Dmel_CG32031 TCTGCTCTGCTTCTGGTCTGCAGAA TACTTGAACGTCTGAAATTTTCACT
Dmel_CG1522 TAGTAAGCCAACTCCATGGTCACCA GTTTAAGGGGCTGAATAAATGGTTA
Dmel_CG11943 TTCTCCTTGATTTTGGCATTTAGCA GCATTCCACATTTGGCTGATCCATT
Dmel_CG31149 GCCTTCTTTTGCCTAAGTTTACGTA TTATGTATTCTGTGCTCTTGCTCTC
Dmel_CG18375 CAAATGGGCGATGGTACTTTGTGCT TGTTGCGACTTTAATTTTCTGCCAG
Dmel_CG18250 TTTTGGGTTAGTCACAGCGAATGAG ACCGAAACAAATATGGCGAATTGTC
Dmel_CG31092 GATCAAGATCATGGAAATACGTAAT TGTGAGATGGAATAATTCATTCTTT
Dmel_CG34231 CAGAGATGGCTTCAAAAAGTATGAT CAAGATCTTTTTTATATAGTGTTCC
Dmel_CG14741 TAGTTTGCTTTACACTCGGCGAAGA GAATGTGAATTGAAGGACATGCAGC
Dmel_CG6123 CACCGATTCCTGATATCTGATTCCA TGTTCTCAGTGTTTGATTCAATGGA
Dmel_CG31211 TGGGCGGCAGGGTTAACTGACTCTC TGCAGGCTGTCGATTAAACATTCCC
Dmel_CG4952 AACCTTATTTGAAAACTCGTGTATA TAAATTATCTTGTAGATTACAATGC
Dmel_CG1976 CCAAAACAAAACAGCCGAAGACGCG CAACTTTGCGGGAATTCCCCTGCTC
Dmel_CG11199 CAAGGTATGCACTCGAACTAATATG CATTAAACTCGCTGGCTGAAACCAT
Dmel_CG1354 TAGTTTTCCATTGCTTGTAACAAAA CACAATCGAAAGTAATAAGTATTTA
Dmel_CG7555 TATCATCCGCTATGCGCTAGCAGCA TACGTTGTGCTCTATCTTTCATGAC
Dmel_CG2534 ACGAAATAAGTGGATTCGGACGAGA AACCTGGCCTTTTTAGGCCGCTCAC
Dmel_CG2999 CTCTTCCTTAATATTAACGTAGCGA CCACCATATGTTAACATTTTGATAA
Dmel_CG7050 CATTGATATACACAATACAACTTTT TGTATCCCTGATTTGGTAAATAATC
Dmel_CG1693 GTGGCGACGGTTTTCAGTAAAAGTC TGCATTGTTTGCTTAGGGTTGCATA
Dmel_CG1417 AAATGCCAACAAGTAACCGAAATAC CAACAACCAACCATCGATTGATCCG
Dmel_CG9364 GCCTAAACAAATGTGCACATAGTTC GAGCTATAGATACTTCCTGTTTTTA
Dmel_CG4952 AAGTATCAGTATAATCATTCCAAGC CAAGATAATATGTTTCAGGCTCTCA
Dmel_CG3302 AGAATAACAGAAATATACAACTTTA CACTTCATTCCTACTTATTTTCTTG
Dmel_CG10895 TTTTATTTGGGTTCGAATGTGTTGC TACGACTACTGCGAACACATCAATC
Dmel_CG34114 GTTGATTTGTGGCACCTCGGCACAC GCACTCACCGACTGTTTTTCCCGTT
Dmel_CG32647 AAATGAAGGGAAATGTGAAAACAAA GTCCTTTTTACAACCGACTGTTTGC
Dmel_CG2139 CTGTCGGAATGATAGAAGCGAGAGC GGGGAGGGGGCCTCTGCGAAAGACA
Dmel_CG2041 GATATTTATTAAAATACACCATAAA AAATAAAATTGGTAACTGACATTAA
Dmel_CG4128 TATATAGATTGCTCGATGGTCTCAA TTTAGGTTTATGATTTATGATGGCG
Dmel_CG32346 TCCATTTTTGATGTGCTACAGTTGA TATCTAACACAGAATAACGATTCCC
Dmel_CG5621 TTGAGTTACATAAGCAGGAATTTGC GAAAACTAGTGTCACTCTCTCAGAA
Dmel_CG15666 GAAAGGATTTGGTACATAGTAAACG CATAAGAGATCTTCAATTCTTTGTA
Dmel_CG34387 GATGCTTGTTATGTCGATCCTGCAA CATTTTCCAAATCTCCGACTTGCAG
Dmel_CG9847 CATTAATTTAATTGTAGCTACTTTA TGTAACAAAAGTGCGATCCATACAT
Dmel_CG33950 TCGTCAATAGGACACCAGATACACA AGCTTTTGCGGTGAGGATAGAGACA
Dmel_CG1511 TGTTGCTCTTATTTTCAATTTTTAT TTATGTACCGATACAAAATATCTCC
P á g i n a | 213
Tabla I: intrones mayormente retenidos en la mosca salvaje que en la mutante dart5. Se muestra el locus y
las sondas que reconocen a los intrones.
Locus Intrón afectado
Sonda 1 Sonda 2
Dmel_CG31660 GATTACATATGCAATGATAGACTGA TGATTATTTATGACACAACGCAATT
Dmel_CG10833 GTTTATTCAAAACTTATCTCGTGCT GGCCCTGATACCCTTATCAATTGAA
Dmel_CG4795 ACGAGAAAAACATGAGACATGGCAA AACTGCCTCTTAGGTAAGTCAATCC
Dmel_CG3159 GCTTTGGTGTTAGGGGACAATGTTT ATAGGTTTTTGGACGTGCAGGGATC
Dmel_CG8665 TAAATAAGTCGCTTTAAGAATAAAC TGTTCCTTTTTATTTCAATGCGCTT
Dmel_CG3835 GCAGATGCTGATATTGTTTTCGCGC CCTGGTGTCCCTGCTATCAGTGCGA
Dmel_CG5020 TAAGCGGTGACCTCGAAAGGATCAC TTGAGCCCTTTTACTAACGCGTTCC
Dmel_CG3036 GCAAATGTTGCTTACAATCTGATTC TAAAATTCGTCTAACCTCTGGTATA
Dmel_CG3743 TCGGAGGACTGATAGCCACCGGAAT GCGGGCCCGGCCCTATTAATCTGTA
Dmel_CG18466 AATTGAATGAGATTACACTGTACTA TTAGCCAATTTTCACTAGCAGCATA
Dmel_CG4244 TCTTTCTGGCGTGCGTTACATGACC GGTAATCTGTAAACCTAGCAAAAGT
Dmel_CG3036 TGTGATATGATAGGTGCCCACCCAA CCAATGCCTTGGATTCTATTATTAA
Dmel_CG7635 GGCGGAAACGGTGTATACTATAGAT CATATTCATATTCCTAACATCCCAT
Dmel_CG8591 GTTTTGGTGGCGACCCACAGCGGAT TGTAATCCCGCTTGATTCAATTCAC
Dmel_CG1851 GAATTGGATTGAACTCGGATTAGTA TTGAAGATAATGAAACAATCGGGCA
Dmel_CG4894 CATACAACTCCAGCTGGAGAACGAA TGCATTTCCCTTCGTACCACGACAG
Dmel_CG17998 TCTCATTAATCAGCTTGAAATCACC CATTTGGTAATTCGAATTATGTATC
Dmel_CG3469 CGTGCGGGCGCAACATCATTGGAAG CACCCATAAGTTCCTCATTTAACAA
Dmel_CG31022 AAATGCATGCGAGAAGTAAGGAAGT GATACTCACTGACCAAATTTATTAT
Dmel_CG4269 CCTGTCCCTGAATTCGATTGCTCGA CAATTAACGAATTCCTCAACTCTCG
Dmel_CG6772 ATTGATGGCATTCGCAATGACGGTC CAATAATCTGACTTAGTTTTCTAAA
Dmel_CG31324 AAATCTCCCGGCATTAGCATCAGCA TCAATTAATCAACGCGGCGGCTAAT
Dmel_CG9395 TACTGGTTTTTCCTGTGGATTCTCC TGGCGGAGATGACGATACACTGCAT
Dmel_CG17800 GGTGGAGAGAATCAAAAGTAAAGTA TGAAATCAAATACAAAACTTAAAGC
Dmel_CG14616 TATTACCGATTATTTCATAGCTACA GGTGAGGTGACTATCCAATTTCTGC
Dmel_CG4019 CCAATGGTAGGGAACGAGGTTAATA GGCAGGTAAGGATTAGCCAACTGTT
Dmel_CG14322 AAAGTTCTCTAGAAAGTAAAATGAA TATGTAATATTAAAAAACGGATCCA
Dmel_CG16974 GTGTTATAATCAACTATGTTCACTT CCCAATAAGCTAGTCACTCAATAAA
Dmel_CG34365 CGTTTACAGTTGTTTGCCGCGCGTC ACATTTGTTGTAAGTCCAGTGAGTG
Dmel_CG31760 CTCTTAACCCATTAAGGGGGCCAGA TAAGGTGTATTTTTTAAATCCATAT
P á g i n a | 214
Apéndice de figuras
Figura A: El splicing de RSp31 y la oscilación del mismo están alterados en la mutante prmt5-5. Relación
entre dos de las isoformas (mRNA1 y mRNA3) de RSp31 en plantas salvajes (A), prmt5-5 (B), prr7;prr9 (C),
y prr7;prr9;prmt5 (D). Ambos ARNm fueron medidos por RT-PCR radiactiva en plántulas entrenadas en
ciclos de luz-oscuridad y luego sometidas a condiciones de luz continua. Los datos fueron normalizados al
máximo detectado para prmt5-5, representan la media, y la barra de error, + el error estándar (n=4). El
tiempo se considera 0, cuando comienza el período de luz continua; H: horas. Las barras blancas y rayadas,
indican el día y la noche subjetiva, respectivamente.
P á g i n a | 215
Fig. C. PRMT5 afecta el funcionamiento
del reloj circadiano a través de PRR7 y PRR9.
Período circadiano (H: horas) calculado a
partir del movimiento de las hojas en
condiciones de libre corrida, en plántulas
salvajes y en las distintas mutantes. Los valores
representan la media y la barra de error, + el
error estándar. ***P <0,05 n=6.
Figura B: regulación del splicing alternativo de At5g57630 por PRMT5. Relación entre la isoforma que
emplea el sitio 5’SS distal y el total de mensajeros detectados. Las distintas isoformas fueron medidas por RT-
PCR radiactiva en plántulas entrenadas en ciclos de luz-oscuridad y luego sometidas a condiciones de luz
continua. . Los datos fueron normalizados al máximo detectado para la planta salvaje (WT). Puntos, media +
error estándar (n=4). El tiempo se considera 0, cuando comienza el período de luz continua; H: horas. Las
barras blancas y rayadas, indican el día y la noche subjetiva, respectivamente. Ver apéndice de primers ID
338.
P á g i n a | 216
Figura D: alteraciones de la actividad locomotora en la mutante dart5/prmt5 de Drosophila melanogaster.
A) Actograma representativo. Las moscas se mantuvieron en un fotoperíodo de 12:12 por cuatro días
después de la eclosión, y luego se las transfirió a condiciones de libre corrida (oscuridad continua), lo que se
indica con una flecha. Las barras blancas y negras superiores, indican el día y la noche respectivamente. Las
barras negras y grises inferiores, indican la noche y el día subjetivo, respectivamente. Porcentaje de moscas
rítmicas (B) y FFT (fast Fourier transform) promedio, como medida de la robustez de los ritmos (C),
calculados para ambos genotipos en condiciones de oscuridad continua. Barras, media + el error estándar;
n=70; ***P <0,001; **P<0,01.
P á g i n a | 217
Figura E: expresión circadiana de genes centrales del reloj biológico de Arabidopsis en la mutante prmt5-5. Expresión de
CCA1 (A), LHY (B), TOC1 (C), PRR3 (D), PRR5 (E), PRR7 (F) y PRR9 (G) medida por PCR en Tiempo Real en plántulas
entrenadas en ciclos de luz-oscuridad y luego sometidas a condiciones de luz continua (corrida libre o free running). Los
datos fueron relativizados a la expresión del gen Actina (ACT) y normalizados al valor máximo de cada gen. Puntos, media
+ error estándar (n=4). Tiempo 0 al comienzo de la oscuridad. H, horas. Las barras blancas y rayadas, indican el día y la
noche subjetiva, respectivamente.
P á g i n a | 218
Figura F: expresión circadiana de genes centrales del reloj biológico de Drosophila en la mutante dart5.
Expresión de per (A), clk (B), tim (C), y Pdp1 (D) medida por PCR en Tiempo Real a partir de cabezas de
moscas entrenadas en ciclos (12:12, L:O) y sometidas luego a oscuridad continua (corrida libre o free
running). Los datos fueron relativizados a la expresión del gen rp49 y normalizados al valor máximo de
cada gen. Puntos, media + error estándar (n=4). Tiempo 0 al comienzo de la oscuridad. H, horas.
P á g i n a | 219
Apéndice de primers
… y condiciones
Aquí detallo los primers que utilicé en la tesis, sus secuencias, la concentración de
magnesio usada con los mismos, y la temperatura de anillado (annealing).
PCR radiactiva
primer ID directo reverso MgCl2 (mM)
Annealing (°C)
RSp31 CGGTTGTTCGACAAGTATG TGTAGGCTTCAGATTTGAAG 3 63
RCA TGTCAAGAGAGTCCAACTTG AGGTTTACTTGCTGGGCTC 2 56
RSZ33 TCCTTCAATCCCCAGCTTG TCTTGCATCATCAGCATCAC 2 60
AtPP5 GCTGTCGCCAAGATTGAATC TATGCCATAGGCTTCACATC 2 60
PP5 juntura TTCAGTAGCTGAGTCCATTG TGAGAAGATCGTAGAACTGAC 2 60
PRR9 TGATGTCTTCTCAAGATTC ATTTGCCATTCTCCATCAG 2 58
PRR9 E2‐E4R TTTTGCTCTGCTTGCTTTGG ATGAGCAGTAGGATCATCAC 2 58
PCR en Tiempo Real
primer ID directo reversoMgCl2 (mM)
Annealing (°C)
RCA L GCGGAACTTTCTACGGTAAAACAG GGATCAGTACACCCTTCAGGAAC 5 68
RCA C GTCCAACTTGCCGAGACCTACC TACTTGCTGGGCTCCTTTTCCG 5 68
RCA TOTAL CTTGTGTTGTGACGCATACTCG CGTTGCTCTTCTTGTTGCTCTG 5 68
RSp31 mRNA3 AGTGTTCGTCGGCAATTTCG GCAGGAAGAAGAAGAAGATGGC 4 68
RSp31 mRNA1 AGTGGACATGAAATCTGGATATGC CTTTGCCCATTCAACTGATAACC 4 68
RSp31 total TGTGTATCGTAGGCGTCCAAGT TTGGGACTGGAGAACGACTTC 5 68
PORc total CTGCCTATTCTCTTCTTCCTTCTACC TTCTGTCTTCTCTGTTCCTTGATGG 5 68Ubi (cx1580‐1630) TGCTGCCCAACATCAGGTT GGGCACTCAAGTATCTTGTTAGC 4 68
P á g i n a | 220
Primers del panel de RT‐PCR
ID Primer directo o forward Primer reverso o reverse Locus 1 GGCCCCCGCTCGAAGTCAAGG GGTAGAGGAGATCTTGATCTTG AT1G02840
2 GGAAGAAAGAAGAGTCAAG GGATTATCCTCAATCCTTAGG AT1G04400
3 CCTGCTAGATCCATTTCCCC GATCTTGATCTTGATTTTG AT1G09140
4 CGCCTCCACAGATCTAATCGC CCATCTTCGTGTTGACAAC AT1G10590
5 CCAAAACTGGCAAGCACGGTC CCATCCTCAGTGATATCAATC AT1G26630
6 CCCGTTGCAGACTGCTTCTAGCC CCATCAACAAAGGCCTTTCC AT1G52500
7 GGAAGTCGTTTGAGCAGTTTGG GGTTTCTTTCTGTTCTCTTCTG AT1G55310
8 CCTTCAGCCTCGGTTTCAGC CCTTTCCATTTAGGATCAGAGTC AT1G63970
9 CCCTGCTACAACTGGAACAACC CCCTCTGACAATTGTACAAAAG AT1G65480
10 GGATATATGACTAATGATG GGTTCAGCCTCTATCTCTCCAGG AT1G71696
11 GGGATTATAATAGAAAGAGCATG GGTACAAGCAACCGATGATAG AT1G71696
12 CGTCAACTGTGTTTTTGCATCC CATCAAATCCACGGTTACCC AT1G72320
13 GGAGAACAAAGTTACGGAGG GGAACAGGTGAAGACTGGG AT1G79650
14 GGAGTGTTTCCAATTCATTTG GGCCAATCTGTATCAATGGCCG AT2G09960
15 GGAAAACAGGGAAAGTTACGG GGCAGCAACAAGGTGATCATAAG AT2G16060
16 CCATGGATCTACCAAGGTTGAC CCATTGCAGACATCATCAGATC AT2G20820
17 GTCAGACTCGTCGTGCTTGCGG GGTCTCCAAGTGAAGATCCAAG AT2G29930
18 CCGTCTCTGATCTTTCGCC CCGTACTTAAGAAGCTTGTTAC AT2G32235
19 CTTTTGGAATGAGCACTCC CCGTAGGCAAAGGCAATATCC AT2G32330
20 GGGATAATTGATGATTATTTTG GTTCTGAACAACACTACACGG AT2G37290
21 GGACCCGAGACCTTGAACG GGTAATGTCTTGCATCATCAG AT2G37340
22 GGAGACTACATGGAAGCCTATG GGCGAATCGCGCCACGAGG AT2G38860
23 CCTCCCGTGTTCGAGCAACCC CCGTTGGATCAAAGTTTTCAGCC AT2G39730
24 GGAGGGATCTGAAACAAG GTGCTACACATGCGCATAGG AT2G40910
25 GATCCACGATCCGATTCTGG GGTCTCTAACAGTTTGTCCG AT2G43160
26 GGTTATCGATGGAGAAAGTACGG GGTGAACTTAGAGAGGAACTG AT2G46130
27 GGGAAGCTGGAAGGAAATTTG GGAGCCAAAACGGTATGTGG AT3G13170
28 CTGTTGATACTACAAGCCAGC CCCCTGCTGCTTGTGCTAC AT3G18520
29 GGAGAAAAGGGCACGGCTTGG GATCTCAGGGTCTTCGATGG AT3G51800
30 CCAACATCATCATCTTCTC CCACAAACTCGTCTATCAGC AT3G53270
31 GGCGACATACTTGCAGTATTG GGATCAGTACATGTCTCAAG AT3G54380
32 CCTTTTCTTCTTCCAGCCTC CCAACGAACAAGTCTGGACC AT3G54790
33 GGTGGTAAGACTACCTAAAGG GGTTATCGCTGAGCGCGGGAG AT3G57520
34 GGATCATATGATTTCATAGG GAATTTTGCATGTAGTAGGAG AT3G60130
35 CTCTCCTTCTCACGCCATACCC CCCGTAAGCCATGGAATAC AT4G00550
36 GGTTTTGAGAGCAAAGAAAAACG GGTTAACAACATGCATTGTTCG AT4G12790
37 CCATATCTTACATTGTTCCC CCATTGCGATATAGTCATTCC AT4G14160
38 GATCTCTAAAGAGATTTATCG GGCTTCATAGGTTTCCACG AT4G20260
39 GTCTATCTCCTCAATTTGG GCACATTAGATGCTCCTCTAGG AT4G20380
40 CCATCAAAAGCTACAAGGGC CCTTCTCGGAATATGCTATAC AT4G25080
41 GGCCTTGGTTCGAAGGGCTG GCTTCTCAGCAGCAAGAGG AT4G30480
42 CCTTCGAGGAGCAGATGCGGGC CCTCCAGAACCGTTGGGTGC AT5G04430
43 CATCCGCCATTAACGACCTC CTCACAAACCGTCTGCATCC AT5G09230
44 GGGTACCAAGGCAAAGGTTTG GCAATCTCTTCACAGCTTGG AT5G13730
45 CCTCTTGACCCTCATTGTCC CCAGTTGTTGTAGCAGGAGC AT5G15230
46 CCATGTTTGGAGCAGATCATC CCAAGACATTCTGGATTTCGACC AT5G19660
47 CCATTCAAATCTCACATTCCC CCCGTCGGAAATACGAACCGCC AT5G20250
48 CCTAATCACTTTCAACAACTC CCGTCAATGCACATAACGTC AT5G35680
49 CCATCCTGACATGGGTTTTGTC CCAGTTCCTTTCTTCCGCCTGC AT5G41150
50 GGTTGTGTGATGCTTGAGAG GGTTGTGTCTATGAGTTCCG AT5G43910
51 GGAGAAAGTTGTTGTAGGAG GGTGGAGGTACATCACTGTGG AT5G45510
52 CCGTCTCTCACTTTTTCGCC CTCTCAGGACCATATTTCTCC AT5G50850
53 CCTCGCCAATCCGATTACGC CCTCCAGCATAAGGACTCTC AT5G53300
54 GGAAGTTTCAGGTGAAGGATGG GGTCCATACAGAGCGAGACGG AT5G56180
55 CCTTCCATGATTCAATCTGCC CTTCGAAGTGTAGTTCATGCC AT5G59090
56 CCTTCGTGAATTCGATTCC CCCATAACCATAATCATCAGTCC AT5G63770
57 GGTCCAAGATCCAAGCTTTGG GGGAAGGAGGTAGATTCCATG AT5G63870
58 CAAAGATCATTGATCGTTAC CTTCACTTCCCCCATCATTAGTTC AT5G65050
59 GGCGGCAGGTCATGTACGG GGGAAGACCCCTGAGGCGAACG AT5G66010
60 CTGGTTTCGCTGTTTCGTTCC CTACATCCATTGGTCCACC AT5G46800C
61 CTCGCCATTGAGGGTCCCTCC CAACACCACCAAGAGCAACGCC AT1G79900C
62 GGACAAGGAAGGCATTCCTCCGG GACGAAGCACCAAATGAAGGG AT5G03240C
63 GGCTCCTCTCAACCCCAAGG GGTAATCAGTAAGGTCACGG AT3G12110C
64 GTCACCGGAGGTGAGGTCGG GATGACTAGAGCCGCTGCGG AT5G60670C
65 CAGGGTCAGTCATATACTCC CCTATTCCTGGGATAGTCCCC AT5G13480C
66 CGCAAATTGATTCGCAGAGTC CCACCATCTGTACTTTCCTGC AT4G02560C
67 GGCTAAAGGAGCAGGGCGTGG GCTACAGACTTGTTCTTGGGG AT1G20693
68 CTTGCACATGATCCCGATCC CCATCGCCCAATGCGCCACC AT1G23970
69 CCTCAGATCTCACGTCCGATC CCTTGTCCAAATCCAGCTGC AT1G29040
70 CCTTCCATTCCACAGAATTC CCAGATTGAGTCAAAGCCCAC AT1G54360
71 GGACAACAATGAGGCTGAGG GAGTACACTAATACATATTG AT1G78810
72 CCCTGAAAGCATAGAAGCAGC CCCATGACTTATTAAACTCC AT2G04790
73 CCGGAACTTGAGAGAGAGAGC CCATGAGGGCTTGGCTCGTC AT2G21620
74 GAGCGAGAGCATAGCGGTGG GGAACGGCGATACATGAATG AT2G35550
75 CTCGTTTAGTTTGGAGAATC CTTCATCAGCATTCATTAC AT2G36000
76 GGGGAGATCTAACCATGGGG GCTCTTGCTCCTCACAAGG AT2G36340
77 CCCTTATTCACAATCTCCTGCC CTTCCTAAGTGGGTTTGAACC AT2G41070
78 GGAAGAAATTGAGGTCGGAG GGTGCAATATAGTGAACGAGG AT2G48060
79 GAATAAAGACCATGAAGAGG GAAGCATTTCCACAATCAATG AT3G03890
80 GGTTAATAATAGTCCTGTCG GACCTCTTGGCATATGCGGG AT3G10770
81 CTCATAAATTCTTCAAAGC CTCTTCTTTAGTCCAGCTACC AT3G11280
82 CCTTTCGTCTTCACCGCAAC CCAAGCCATTCTCGGGAGCC AT3G14230
83 GGCTTTGTAGCATCTCGCCG GGAGAATCCAACTTAGGTGAG AT3G25585
84 CGATGTCCGAGAGAGATTCC CCCTAGAGAAGAAATACCAC AT3G55630
85 CCTTCTGAGCTAGCTCAGCTC CGTTCGAACACTATCATTTCC AT4G16280
86 GGATTGTTCTTGTCCATTTTG GCAAGCTCTGTTGCCTCGGG AT4G16845
87 CCACCACAACATTGTCTTTTC CCAGCGTTAGGAATAGATCTC AT4G35450
88 GATGGTGGTGGAGTCAGAGG GGTCGACCGGTCTCGTCCGG AT4G37070
89 CCTCTACACAGATCTTTGGATTC CTTGACCACGTCGGGTAGTTCC AT4G38510
90 GGTGCTTTGTCGGCGGCCTTG GGCTTTCTCGTCCTTGAAGG AT4G39260
91 CCATTTATAAATTTCTTCAC CCGATCGCAGTGAACTTCAC AT5G05270
92 GGAAAGACCAGGCCAACCTG GGAGATGCAGTATTGTTGTTG AT5G16540
93 GTCGGGATTCTACCACGCGG GGACTGACCACCTCACCTGCG AT5G27290
94 GTCTCATGGGTCAAACAGAAG GAATTGTACAGAGTTGATTGG AT5G37850
95 GAATCGCAAAACCAAATTTGG GTCCGGAGGGAAGTGAATGG AT5G41700
96 GCGAAATTCAAAGGGTAAGG GGCGCGAATATGCATCCCGG AT5G63090
97 GCGAATTAAGATAAAGATGAGG GGAAAATTGTCGAGTTTGCG AT3G61860
98 GTGCTCGAAGCCCAGAATACG GGTCATAACCAGGGCTCCTTTG AT3G61860C
99 GGAGTTAGCTGCGGAGCACGAGG GGGATGGTAGTGGAAACTGG AT1G20440C
P á g i n a | 221
100 GGTGATGATGAATATCTTGATGG GGCGAATCCTTACCGAGAACAG AT5G52310C
101 CCTAGCTGAAGTCTATGCTCC CTCTCGTCTAGTTCGCGAAC AT1G54390
102 CCTCCTTCTCACTCTCGCTC CCCACGGGAACGAAGATACC AT1G27370
103 CCAACCACCAATCCCTTCTGC CTTGCTCTTGATTGTCTGCGCC AT1G30500
104 GGTTGGAGAATCCTGGGAGG GGATACCCCAATTTGCAGCTG AT1G57820
105 GGCTAATTTAAGTGCTCAGGGG GCTACATTTCGCATCACTTG AT1G33060
106 CCTTGTATTCGCATTAACCC CCAGGTCCATGCTTTATAACTCC AT1G49950
107 CCGTCTTCACAACCTCAGCC CCCACCATGACCAAACGTAGC AT1G59750
108 GGAACCGTTTGGGACTGTG GCAGATTCATTCGACGCAGG AT1G30200
109 GATCTTGAAGAAAAAATTCAG CCTAGCTCTACTTACGGACAG AT1G77080
110 GGTTGATGAGGAGTCTTCAAG GGACACTTAAAGAGCTTCCC AT1G72050
111 GGACATGGTCTATGTCTCGTCC GCTTTAGAGTCTCCAAGCTG AT1G61660
112 CCGTCTTGTGCGTCGATTTG CCTGTCTTGAGCAGATTCAAGC AT1G09530
113 GGTTTATTGCATTCTGATAATG GGTGGACTTGATCCTCCTC AT1G72650
114 CCCTTGCTGGATCTGAAATTG CCAACAAACTTGCTTACTGAG AT1G72650
115 CTTAAGAACATGACTAAGTC CCTCCTCCGTTGGATGAAACC AT1G79580
116 GGATTCACCTTTAGTGACTG GAGACTCTTTGAATGATTGG AT1G18660
117 GAAACTGAAGATCATGAAGGG GAGACGAAATATCTTGAAGG AT2G22670
118 GGGGAGCTTTCACCAATTAG GCCTTATCATTAACCACCGG AT2G02960
119 GGTTGCTGATGCTGCAGAG GGCCAGAAAACTGCATATTGG AT2G36960
120 GGCTGCTGCTAGAGCTTACG GGTCCAGGCATACGACTGG AT2G41710
121 GGATGCAATAAGGTCACAGG GGTCTAACGGAAACAATGG AT2G18300
122 CCAAAGATGGAATGCTGGACC CTCAGGTCTCTTAATCTTTCC AT2G36010
123 GGTTCCTTGAACTTTAAGG GGTTATACTGCCCCGACTGG AT2G42830
124 CCCTCTCTGCCTCCTCTCTTCC CCCATTAGCAGGAAGACCTC AT2G37060
125 GGATTTGCCATCTATATCTGG GCTTTGAGCATGAGCAGTAGG AT2G46790
126 CCGCTATGAACAGCCGGTCC CCATGGGTGGTTATGCTCAG AT2G34830
127 CCGGTTATGGATCAGTCTGC CCGTCGGTGGTCTTCGTCGGC AT2G43010
128 CCCAGAAATTGAAACTACC CCCTTGCATTGGATTCATACC AT2G15530
129 CTAGGGTTTCTCATTCCGATCC CCGTGAAGGCGGACAGCACGC AT2G40830
130 GCTTGATTACTCAGAACCAGGG GAACCGCAGAACCTTGTGG AT2G38185
131 GGCAACATTAGGATTTGAGG GGAAACAATAAACCAAACG AT2G38880
132 CCAACAGCAGCAGCAGCAAC CCAAAAGGTTTCTTCTACGTACC AT2G31370
133 CCCATCGATTTCTTCCATCC CTTCGATGTCATAGCAGCC AT2G32250
134 CTATCAGAGTTCCTTGGTGGCC CATTGAGTTTCTCCTGTGTCC AT3G08505
135 GGAGTTACATGAGATCTCAAAG GATAAATCCTTGACAAAACGG AT3G54480
136 GGGAAGAAGTGCGAGCTTGG GGTGGAAATTGATGCCGCAG AT3G07740
137 CCGGAAGTTTACTTTGAGGATCC CAACAATCTTGTACTTTCC AT3G14740
138 GGAATGGGCTGATGATGAAGG GGTCCGATTCGATATCCAGTGG AT3G10490
139 GCACTGCAAATGCAAATAGAGG GGCAGCTTCGATCCCAGCTG AT3G04030
140 GAAGAGGAGCAGCACGACGG GGCCATTGACTACACAAACCG AT3G15030
141 GGGAGTGATGAATCTGAAAAG GGATCTGCAGTTAAGCTTGAG AT3G51880
142 GGACAACCTTTTACTCAGACAGG GGTATCAGCCATACTAGTTTCTG AT3G12250
143 CCCTCTAGTGTGAAACTCTGC CCTTTGATCGATCACTGGAATC AT3G12250
144 GCACAGTGATGCCTTTGTGG GGCTGTCACCTTCAGTCGAAGG AT3G23280
145 CCAACGACCCAATGGGAACTC CGTTTAGCTGTAGAGACTCC AT3G17609
146 CCAAGTCACCGAAGCTCTAC CCAGCAAAAGTAGCAGCTTGC AT3G24120
147 GGGAAATTGCACAATTAATG GGTTTCTATTTACAGAACTCTGG AT3G02290
148 CCGTTTCTCGCTTCTTTTTCTC CCTCTACAACACCTTTGGTACC AT1G76510
149 GGCATGTCGGAGTATGATCG GACCTTAAAGCTTCTCTTAG AT2G27230
150 CCTGATTACTGTTTTGTCGG CCTGACTAGAGTTGCAGAGC AT3G20810
151 CCTTCTTCGTGCTGCTGGTTTTC CCTTAACGGAGAATCATTGCC AT3G47550
152 CCATCTCTATTCGTAATTAGC CCCAAGATTCAAATCCAGGTTC AT3G58030
153 CCATCCCGGTTTAGTATGTC CCTATTTTACCCATATGAAGACTGTC AT3G59060
154 GGTGCCGTTTGACATGGATAACC GTCACCGACAAGCTTATGCATTC AT4G01060
155 GGTTCTTTCTTTGTGAACAAC GGGAAACTCCTTAGACAGCAG AT4G27050
156 GGGCTTCCATTAAATCTCTTCACAG GGAGACCTCTTCTGCTTTTTTG AT4G34430
157 GGGAACTCGGGTGCTGCTTTTAG GGTAGCCTCGGTCTGAAGAGTCTG AT4G38900
158 CTCAGCGTCTTAATTACTTCAG CCTTGGAGACTCTCTAGTGGAG AT4G32730
159 CGAGGATCAAAGACAATCATTCC GGTTTTGCCCTTTCAACATC AT4G37180
160 CCTTCTCTCGACGATGATTTCG CCAATACTAAAGACTTCATCTGG AT4G14410
161 CCATGCTGGATGATGTTATAG CCTAGGGAAAGGTATGAATGC AT4G28790
162 GGAGACGGATATCACCGATG GGAAGGAGTTCTTGCAAAGCC AT4G28790
163 CCTCCTCACTAACTCGGAGAC CCTCTCCTCCCCCTCGCAGC AT4G13100
164 GGGAGACTCTTTGAGTTCCTTAAG CTTAGTTCTTAGATAGATGTTCTC AT4G09960
165 GCAGAACATGAAAGAAGAGTAC GCTCAGCATCATTGTCATATTC AT4G16420
166 GTTCGGAGAAAGTGGTATGAGAG CGTAGACCACTTAAATTCCTTG AT4G25990
167 CCGATCATTGCATCACTACTAC CCTTATGAACAACATGCTGC AT4G18020
168 CCCATAAGTGATGCCCTTCAAATG CCCAGCTGCACCTAGGTTCTG AT5G18240
169 GGTCTTCTTCGCAGCCTGATTG GGAGCGCAAACCAAACCTAC AT5G24520
170 GGTGTTTCCGTCTCCTCTCC GGAAGAAGCAAGAGAGGCTTG AT5G28770
171 CCATCAAAACGACCTTCGGG CCTTGTCTCTAAGGAGCTTC AT5G18620
172 GGTACAGGTGCCATCGCTATATC GGGCGAAGAGAACGACCAACGC AT5G60580
173 CCATGGACATGACTTAGCCTCC CCAACGGTACATGTTGTTGTTATC AT5G23260
174 CCCATCGCAAGGAGAAAGTC CCAAATCCAAAAACGAACATGG AT5G13220
175 CACAACTTCACAGAGAGAGAG CCATGATAATATCTGTAAAAGG AT5G56420
176 CCACGTCTTTGCAGTTGTAG CCATCTGTTGAGACTGATGTTC AT5G06960
177 GGACCGTGGACAGAACAGGAGG GGCGTGAAGCTCAAGGACTAAAC AT5G59780
178 GCGAATCACATTTGATCTATG GCTTAAGAACTCCAGCTTTAAG AT5G67580
179 CCTTGTCTCCGACAACTTTC CCTAAGCTTCTCAACAGAGTTAG AT5G48150
180 GGTACATTCGAAGAAGTTCC GGAAGTTAGTCTTCGCGCTC AT5G25390
181 GGAGAAGCAGAGAATGGAAG GGATCCTCCAATTTCAATGAG AT5G05550
182 GGAGAATAATGACTTGGTATTGG GGTAAATCTTTTATGTTTCTTC AT5G16820
183 CCTGAAACAAACAATGAGCAC CCTTCTTCCTATGCTCCACAC AT5G22000
184 GGAGAGAGAAAATCCCTCCG GGAAGAGAAGCGTCTTCCTTGG AT5G23090
185 GGATCCAATGGATATAGTCG GGAGCAATCGTCCGTTTATCC AT5G23090
186 GGATTGATGGGAGCATATGG GGCACGTGCTTTTCTTCGCC AT5G12840
187 CAGTTTGTTTGTTTGTTTATAG CCAATTTCAGAATCATCATC AT5G02470
188 GCTGTTGATGAGAAACCTCAC GCTGGTAGAGAGTTGTTGCG AT5G02840
189 CCTCTGGGATCCATAAGTTTTG CCATCAATTTCCCACTCCATTG AT5G43270
190 GGGCAAAATGTCAAATTAGG GGAAGCAATGACAGTATGCGC AT5G56370
191 GGAGCCAGACAGTCTTGTTCAC GGATCAGTCTCTTTTCCGCC AT5G18830
192 CCTTTTTTCTCTCTCTCTCTCTATCC CCACAGTTTTGTAAGTAAATGGC AT2G46370
193 CCTTGTCCTGGACCCATGGAC CTCGAGCAGTTCTCAGCCCC AT1G07350
194CCTCCGAGTATTGTTGGCTTCAGACC CCTAATGTCACCGGGCAAGTTACC AT3G49430
195 GGCCAAAGAAGCACTGGAAGG GGGTTCTGCCAACCTGCTGGTGG AT3G01150
196CCATGAGATTGTTAACAATCAGAGTCC CCAGCAGCTTTCTCAAATGTGGC AT3G01150
197GGAATTTCGACTATGATACTCGCCATTCG GGCCCATTCAACTGATAACTTGCG AT2G46610
198 GGATGAGCTTAGAGATGATGAGG GGCCTGCCACTGGCTGACCATTGG AT4G36690
199 GGGAGATGGAGAGAGAGTTGTGG GGCTCCTTTCGGGCCTTCTTGG AT1G79880
200 GGCCTCCTCCTTCAACGAAG GGCCATCTTTGCTCTTGGTG AT1G79880
201 GGAGAAGTTTGAGAAACTTGAAGG GGACGTAGGGCCTGGCCTGAGG AT5G27640
202 GGAGGCCATTTGAGCAGTTTGG GGTTTTCTTCAGCAAATACGACAG AT3G13570
203 CCAGAGCTCTGCTGCAGGGGTAAC CGCAAACAACAAGCAGAGTGAC AT1G11650
204 GGAAACACTCGCCTCTATGTTGG GCGTCATCAGCATCACGAGG AT3G53500
205GGCAATTTCGAGTATGAAACTCGCCAGTCGG GGAAAATTGTCGAGTTTGCGAATAG AT3G61860
P á g i n a | 222
206 GGCGTCCGGTGATGTTGAGTATCGG GGCTTTCTCATCCTTGAAGG AT2G21660
207 GGCGTTTAAGACCTTTAAGCACAAAGG
GGTTTTGGACAAAGAGAATATTATTTGG AT2G47580
208 CCGTCGGTTGTACTGTATATCAAAAACC CTGCATTAGCCTCACACCAAGAC AT1G09230
209 GGAGTCAGGAAAGAGAAAAGCTTGG GTTCTCTGATCTCTTTCAGG AT2G16940
210 CACATGCGTAAAGGAGGAGAAG CCGAACATATTCATGAGAAAAC AT4G02430
212 CCTGCAAAATCTACATCGAGATCTCC CTGTCCTAGCTCGATGGGTCC AT4G02430
213 GGATGTTGTGGGGAATGTTCTTCTGG GGTATCCGGCTGTCTTCTCGAAAG AT5G53180
214 CTCGCTTCGACCTCTCTTTC CTAACCACAGAGACTTTGTTCC AT1G31600
215 GACCATGTCCTGACCTTAAAGG GGTAACAAGAAAAGCCCTGG AT1G31600
216 GTACACTTACAAGATGCTGGTGG GGAAGGGAACGATGTGCAATGG AT2G42890
217 CCTAAACCTGTCTCAGCTGCACC CCTTCTAGGTGATAAGCCTCTCC AT1G16610
218 CCACCGAATCAATCAATCTACATCC CAGTGACTTCACTAAAAGTAACCC AT2G30260
219 GGTGACCTGGAACGACTATTCAGG GCGGTCAAGTGCTCGGATGG AT4G25500
220 CCCTTTGAGAGGTTTGGACC CCTGTTCATGCTTCTTTGAGCC AT3G55460
221 GAATCCAAAGCAAGATCTGCATGG CCTCAACATCAAGTTCCTCAAGTGCTCC AT5G23080
222 GGAGCCACCGTCCAGCAAGG GTCGCAGTCTGGCCACCAAGCGCTG AT5G06160
223 GCAAATGAAATAATGAAGAAGAGGG GTCAGCCCTTCTCCCATCCTCTGG AT2G29210
224 CAAAAGAAATTGGAATTGCTTTTCC CCTCACTTGTATCTTCTTCC AT1G15200
225 CCGGCGATCAAATTACGACAGCGAC CCGATGAGGGAATTCAACATTCC AT3G53570
226 GGTGTGAAGAAATACCGTGAGG GGAGACTAACAGAATATTTTCTGG AT4G24740
227 CCTCATACTCACATGGATCGTCGTCC CCATTTCCTTCCTCTCCCTATCCC AT4G24740
228 GGGGTGCTGAGAAATATTTCAGG GCTGTGAGACGCTCAGATGG AT4G32660
229 GGTGCATTAAATATCTCAACCAG GGAGCTTTTCAAGCCAAGATAGTGG AT4G35785
230 GGCAGCTGAGGCGGAAAGTGG GGAGAGCGCGAGAGAGAACCC AT3G11930
231 CTTACGTTGCTTCATGTTCACC CCCGTGTGAATAAGTTTGTC AT3G58450
232 CCACGGCGGCGCGTCTCCTCCGCC CCAACGAGAAGCATCGAAGCACC AT1G48960
233 GGTGGAGATGATGATGGAGATG GGTGATATATTACTTAGATCCCACG AT5G54430
234 CTACATCAATGGATTTTCTTGCC CCAACTTTAACTCTTCAGTTTCACC AT1G55870
235 GGAGAAGACGAATCTTGTG GGCATGTTGTTTCTTCTGG AT1G69080
236 GGATCTTCGTCGCTCAACG GGAGCAAGCATAAGAGCAGCTTCAGG AT1G04950
237 CCATTCTCTGTGGCCGTCACCGTCGCC CCGAATCGTCGAGGCAGCTGCTGC AT1G07830
238 GGCAAGCTAGTTTTCTGACTGG GTGGATAGTCGTATCTCCGG AT1G08750
239 CTACAACTCTGCATCATCTTCC CCTTCAACAGATTCAAATTTGC AT1G31500
240 CCA ACA CTC ACC CTG CGT CC CCTTGAGAAACGAGAATTATC AT1G54260
241 CAAAAAACATCGTAAGGAAGC CCCATCTTCTTCGTAGTCC AT1G02090
242 CTAAATTGCTCAATTCTCTCGGCC CCGGCAGGGACGTCAGGGAGATC AT1G60850
243 CCGGACCTAAACCGGAGCATGGCC CCGATCCTGGCGTCGTCGGAGTTCC AT2G33830
244 CATACAGTTCTGGTTTCAAACC CCTGGTTGTGCTGCAGTGAACC AT5G09230
245 GGCGATCAACGGAGGAGAGAAAAG GAAGAATCCAGTGACTAGCCATGG AT5G46110
246 GAAACGGATCTGCTCGGTTTCAAG GGTTCTGACACCAGAAGAAAAG AT5G59440
247 GGAAGAGGATATCCAGATG GGCGAATCGCGCCACGAGG AT3G13170
249 GGCTTCAACAAAACGGGAGTCACG GGATGGTGAAAGCGAACCTTG AT1G72560
250 CCTTCAATCTTTCGTTGTTC CCTTTAAGTTGTATATCAGAGAC AT1G37150
251 GGACAAAGAGTGATTGCTGAAG CCATCAGGATGAAGCTCATAC AT1G37150
252 CCATAGATTGATAAAGAGATGACC CATTCTTCTAAGAGAGTAAACC AT2G03810
253 CGAGAAGATAGAAGAAGCTGCAAAGCC CTCTGTCGCTACATTGAGATTCC AT2G26980
254 CCGCTACAATTCATCATCATC CCTCTATCTAAAGCCTCCATAAC AT5G50240
255 CTACTCTCAGTAGCCGTCTCC CATCAAGCTCAGGATCAGCTCC AT1G23380
256 CCAGAGGTTACTGATGCAGC CCATCAGAGCTATGTTTGTCC AT1G54080
257 GCAATCTCGCCTCCCTCGGTGG GGCTGCGATTGCGGTTGTGG AT3G54770
258 CCCTAATAAGATCAATTTCAC CATTCTCTATTGCCATACTCC AT3G09150
259 GGGACTTTTGTTGGTGTTTACG GGTATTTCTTGCCACAGCTCTG AT3G17090
260 CCAACTATTCTTCTTCCTCTTCC CCACTGATTACTTCGCATGC AT3G26740
261 CTCATGTGTGTGGTATTCACC CAGTGTTAGATCAGGCACACC AT4G10100
262 CCGGAGTCTCTAAGAATGAGC CCACGCATGAAGCTTCACTC AT5G20040
263 GATGATGAAGAATCAAAGCCTGG GGATCTGGTCACATATGTCG AT5G26570
264 CCGATCAGGCTTGGTTTGGC CCGTCTTTTCTTCCATTAGACC AT5G65430
265 GGAGACTAGGAAGTTCTTCAAG GCTCAGGTGTGTCATAACGG AT4G35790
266 GGCAGCTAAACTTGCAACAG GTAAATTACCAACTCCGGTTGG AT5G26040
267 CAGGGTACATATGGGACTCC CCCTAATTAATCTTCTTACGC AT2G42245
268 CCGTTGCAAGTTAAGTATGC CCCTCTTAGAATCTGTAGATCC AT1G03457
269 GTTCGATAGAAGCAGAGAGAAAG CCTAACTGGTCTCCCTACCCTTCTTTCTG AT3G21100
270 CCATGTTCAAGAAACTCAATCC CCTTAGAAGCTCTTCCAGGTAACC AT1G53650
271 CCGAAGCGAAATCCCTAATTTCC CCTCCTCCACTTCATCCTCC AT4G00830
272 GGATTATTCTTAAGTCATAGG GGAGTGAAGGTGGTTCTTGG AT3G23900
273 GCTAGAAGTTCATCTCCAGG GGAAAAGAAGATAATCTAAAAG AT3G07810
274GGTTTTCGGATTCAGTGAGTGAAGG GGCTTCGACAGCCGACTGTG AT5G19030
275GGACTCGGCAGTCACTAGGATACGG GGAAATCGGAATGTGGTCTCCGG AT5G19030
276 CCTAATGTTGCTGAAAGAGTC CCAGGTGATCCCTGAAGGCTGC AT5G47620
277 CCTCTTTTCTCACTCACTGTTAC CCATTTGAGCTCTGAGAAACCCC AT3G23830
278GGCAGCTTTTGTCAGAGGATCCTAGG GGAGTTGCTTCAGCACTAACTCCGG AT2G02570
279 GGAGAGATTTTAGAAGAAGATGGG GTTAGACTGCCTGCTGTTTGACGG AT3G25840
280GGTACGTGGGAATACACAGTTCTGG GGAGATGGTTCAATCTGTTGTAG AT5G11200
281 CCAAAGTGTTTGAGTCCATGCAAC CCACCTCTCCCGTTGTACCTC AT5G47210
282 GGTGACAAGACCCAATCGG GGTTCGACCAATCCTATGG AT5G63120
283 CCAAGTACCACCACCTCTAATGTCC CCTACCTTGCATAGCAATGGGCC AT3G01540
284 GGAGAAGAAGCTGAAGAAGAGG GAAAAGCTTTTATCTTTTTGAG AT4G33060
285 CCATATTCTGGTTCTCATCC CCAGGCATCTAACCGATTTCC AT3G19840
286 GAACTCGATCCTCCTCCATGG GAGGGCTAGCTTTTTCCAAG AT1G67210
287 GCGGGAAAAAGAAAGCTCGG GGCTACGGCTACGATGCCTCGG AT3G63400
288 CCATGTGTTGTACTAGTGCC CCATGGATAGCAGTGTTGAC AT3G12570
289 GGGATCATTTTGATAGGAGCG GGTGATAGTTCTCCATAGACAGG AT3G12570
290 GGGAAGTTCTTGAGCTCAATG GGCTGATCTATCAGTCTCTTG AT5G08470
291 CTCATTTCATTCTGTTTCTCC CCTTAATCTTGACCTTCTAGC AT2G46270
292 GATGAAAGTGTCACAGCGGG GGCTTCATGGGCACCGAACCTTGG AT4G36730
293 CCGATGATGATTATGTCAACAACC CCATAGAAGGAAGAAGCTTC AT2G20180
294 GGTCTATCACCCCAACGCACTTAGG GGTGTAGACGAGCCCGAAGG AT3G26520
295 GGCTTGATTATGAGTATATACCAG GGTAACAAAGGTGGCTCAGGG AT2G02390
296 CACAAGATTAATTTTATCCATTCC CCTTCACCAATTTTAGAAGCC AT1G67980
297 GGTGGATGTTTCGTATTGTCGG GGTCAAGTGTAAAACATCTGG AT3G44300
298 GGGATGTGCGATTGATCATGG GGGCTTAACCATCACAGG AT5G09880
299 CCTCAGGCTCGGCAGATCATC CCGAATCGAAGACAAACACCC AT5G11330
300 CCGAAAATTCACAAAATCAGAACC CAGGAGGTCCGATAATGGTAAC AT5G59300
301 CCCATTGTTGTTCGTGTCCCC CCGTTAATGCAGAAGCAAGTGTTCC AT5G09790
302 CATCCTCCTGGTGATGATCC CCTCAACGTTTGCTGGAGATTC AT5G09790
303 GGACTCAGTGGAGAAGAAGAAG GAGGAACGCAACATTCTCCGG AT3G46460
304 CCGATCATCAATGGCCGCCGTGCC CCACTGAGAATGATTTCCAAC AT5G18800
305 CCCGGTGAGATGATAAGTC CCATCTTTGATCTCCCCAAAC AT1G01060
306 GGACTGAGGAAGAACATAATAG GGTTTACGCTTAGGCCGTGG AT2G46830
307 GAGAAGGCTGCACTTGAGAGG GAATCTGGATCTATCTTAAGG AT3G11540
P á g i n a | 223
308 GGAGGAACACCTTGAGACTG GAGTCACCGGAAGATTGTCGG AT5G10140
309 CAAGGAGTTACTAGAAATAGTCC CCCGTGACATTCCTCTGTCACC AT5G65060
310 CCGTCGCTCTTATCATCATCTC CCGGTGACATTGCTCTTGCATCC AT5G65070
311 GTCAACTCTCAATTCTCTGTGG GTGGCCAGAGCTATTTTCCGG AT5G65080
312 GGGTTACTTAAGAAAGCTCG GTAGGATGGAACATAGTGGG AT5G13790
313 GGAAGAGATGTCGAACCGTCG GCTGCTTTCAAGTAAGTCGG AT5G37055
314 GGGCTGGCTCTTACGATAACAG GATGGCCTCCTCCAGTTTGG AT2G43410
315 CTCAACGAAAGTCAACAACC CCAACCCAGTACGAACGGCC AT4G31120
316 CGAAATTGGTAACTCCGGTTCC CCAAGAGTAAAGTTGATATC AT2G28550
317 CTTGGGAATCTCTTTATCGACC CCCCAGTTACTCATCATCCC AT2G28550
318 GGACGCTCTTGTGTCAAAGG GTTGAGATTCATTGTTGGGG AT5G48560
319 CCTCTGGTCAGAAACTCACC CATTGTTCAATCTCCAAGCC AT5G65640
320 CCCTGAGGTTACAACCACC CCACATCCTTTCGTCATAGTTTCC AT5G24590
321 CGATCTCTACAAGTTCGATCC CTTGTAAATTCGACACAACACCC AT4G27410
322 CCGATGTTTGTAAATCCGATCC CTGTCTCTTTCTCATTCTCC AT2G33480
323 GGGTAACTACGCGTCAATGG GATTCAACTCTTTGCAAATCGTGG AT1G76580
324 GGGATCCATAAGTTTTGAG GCTTGAAGAATACAGAGAGG AT5G43270
325 CCACGGATGTTCCTCCTCTGCC CGAACCTTGCGTGATTCATACC AT2G47890
326 GGTCCTATCAAAGAAAACGGG GGTCTGCAAGCATGAAGGGCG AT1G69250
327 CTGCTCCATACCAATCAGCC CCACTTCTATCAAAATGAAC AT5G59950
328 GGTCAATGAGAAGGATCAAG GATTGTGGTGACTCTTCAACGG AT5G52310
329 GCAGTTCGGTTGTTGATGATGG GGGGTGGAAAACATTGAGTG AT4G17615
330 CTCCTTATGTATCTATTCACC CCGCTTCTGTCCTTATCAAACC AT3G10300
331 CTTCACTTTTCTTTAGTCTTC GGTAAAACAGTGAGCATGAAG AT3G10300
332 GAATATTCATATCAGAGAAG GGCTATCACATGTCCCCATGG AT3G16800
333 CCCGGTTCAGCTCTCGGTAGAC CCTCTTACTATCTCCACTGCC AT3G16800
334 CCATCATTGCATGTGGTAGAGC CAGTATTCCAGACTACATCC AT1G01140
335 CAAAGACGGGTACATAACGCC CCTCTTGCATCTAGTGCACC AT5G66210
336 GTTGAAGTTGATCCTACTGG GAGCCTCTCTAGCTCTTGAGG AT5G28080
337 GTCAAGATTGGAGATCTTGG GAGTCTAAGGGACACTGTGG AT5G28080
338 CAGATGCTAGAAAACTTTTCC CCATACATCTACTGCTGCTCC AT5G57630
339 GTAGATACTTGTTCTTCAAGG GGATGATTTAGCTTACGAAG AT4G13020
340 CGAGTTTCTTCGAGTCATACC CTGCGTCGTAACGACGATTCC AT5G63990
341 CACTATCGCTGCTAAGAACC CTACGAAAGCAATCCATTTACC AT2G15970
342 CCGAATTTTCTCCTCCGCC CCAATACCAAGAGTTCTCCC AT3G01090
343 CCTGACTCAGCTCTGCGTCACC CCCAATTCCAAGAGTTTTACC AT3G29160
344 CCTGTTATTGGATAACCGGTTCC CCAAGAGCCCATTTTCGATCAAC AT3G29160
345 CTAAGCTGCATCACCGTAACC CTTGATTTAATATCTCTATGAC AT1G49730
346 GGGAAGTGTATCCCTTCTCTGG GGAAAAGTTGCTTGTCGCCG AT4G23260
347 CCAACTCCAGGTCTATCAGCC CCTGTACACAAGGCACTTCC AT4G34460
348 CGCCTCCAGCTCCTCGATACC CTTGAGATGCACTGACAATCC AT4G34460
349 CTTTAGGAGGTGACAAAGCCC CCCTGGGTGAGTTCATCATCC AT5G40280
350 CAGCGGTGAGGCTAAGAAACC CAGGATCCACCGTGAATAGCTCCC AT1G77740
351 CACTAGCAGAGCTATCTTCC CGCTGAGAAGTCAAATTCCC AT2G18960
352 CTTACCGGAATTTTCTCTCC CCCAGACTCCACATCGCCTCC AT5G57110
353 CGAAGCACTTCGAACTCTTTGCC CTCACCAAAGTATGCTTATCC AT1G27770
354 CTTTTGCTGATACACTTCTCTCC CGTCTAAGCGACTGTTGTGCC AT5G23450
355 CTCTCTTTGTGGTCCGAACACC CCCAAATCGATCGTTGTGTGTCCC AT3G16785
356 CACTAAATGTATCATGTATCC CGTTGAGAAGCTTGCACCAC AT3G56860
357 CATTTCTTCGATACGATCAACC CCATATTTTAGCTGCTTCCTC AT1G54100
358 CCGTTACAGATAAATAACACC CCATTACCAGGACTTTCGTC AT1G09000
359 GGAAATGCAGCTGAACATGCTGG GGACCAGTCCCTTCATGTAG AT2G38170
360 CTCTACCAATGGGTGTATTCC CCCGATTCACTGTATTCATC AT3G06510
361 CCTTAAGGGATGCTTTTGCTC CCTCCTCTGTTTAGAAACCACC AT4G13850
362 CCTTCAAACTTGCTAATCAATC CCTGCGTCGGTGAAGTAAGCC AT4G26070
363 GAGTTTGGTGAATTTGTCCGG GGCAAAGTCATGTTCTTGATG AT5G24270
364 CCATCGATGCTTGACTGGGTCC CCGAAACGCAACAATCGTCGCC AT5G67030
365 GGTGCAGTTCTGGAGAAAGTG GCATCCCATTCCCCATGGCTGG AT4G34000
366 CCTCTGATCTGTCTTCTTGGTTC CCAACGTTCACGGCGGTTCC AT5G25610
367 CCACCTAGTCTCGGCCCAATC CCCTCTCTAAGCAGACGAACC AT1G71860
368 CTTCCCAAGAAGATCAAATCC CCTATGGTTCATGATTTCTC AT1G78290
369 CGTCTCAGCTCAATTCTCTTCC CTCTTAGCCAAGTAGTGCTCC AT4G31720
370 CAGCAGAGTTTTCTTGTCCACC CCAAGGATCTTTCTTGATTCC AT5G35410
371 GGACGGATGACGACAATGGG GGGCAGTGTCTTCTGAGCCACGGG AT5G37370
372 GGTCGATCCAAAGGATATGG GGAAGTGGTTGCTGATACGG AT1G76460
373 GTTGGTGGTATACCCTCAACGG GGGTGACTACCGTAAGAAGG AT3G13224
374 GTTTAGGGCATCCTTGTGGG GTAATCCTTAAGCCCATCGG AT4G36960
375 CTCAGGGATTACTTACTACC CTCCGCGGAATAAATTAGCCC AT3G20270
376 GGGAGAAGTAGCTTCATCCGG GAGTAGATCCTAGCTGAACAACG AT1G64625
377 CCGTCGTCGTATGTCTCTCTC CCCATACTCCAACATAAACACC AT3G51530
378 CCTGATGATCAGAAGCTTGTTGCC CCGAGGAACCCCAGTCTTGAC AT3G62190
379 GTTTGTTGTGTGTGAGACTTTGG AGATGAGCTTTCTTCCATGG AT5G04275
380 GTCCATTTGGTTTCATAAGG GCTTTCCCAGAAAAGTAATCGG AT5G08185
381 GGGAAAGAATCAAACTTTTG GGTTTCGTTTATAACCAATG AT5G53450
382 GCAAAATTCAAGATAGACTGG GGCTGTAAGGATGCCTGCAG AT1G44910
383 CCTTTTTACCGAAGAGACTCC CCCTTCTCTTTGCTTTTCTC AT2G43640
384 GTGTCACCATATCGATGAGG GACATCTCTATGCTGAGTGG AT4G02200
385 GGCTGCTTCATCGAGCGGAAG GTTGAGCTTGACAACAACTGG AT2G43810
386 CCGGTAGCGTCACTAGCAAACCC CTTGTTTACGGGCTAAACAACC AT4G01250
393 GGAAATGGAGGAAGAAACGG GCCTCAACCTAACTACCTCAG AT2G26150
411 GGAGAAATAGTGACGGTGAG GATCTTGTGGATGTGGTTGG AT3G26744
412 GGATTCAGCAATAATCTCAAG GCTCAGCTGATCATCAGCTGG AT4G29810
413 CCTTCTTCTAACAACAAGTTTACC CCATATCTCTTGTTGAAATCC AT2G33120