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Regolazione dell’Espressione Genica
Puo’ essere regolata in una delle seguenti sei fasi:
DNA RNAtranscript
mRNA mRNA
inactivemRNA
protein
inactiveprotein
NUCLEUS CYTOSOL
trascrizione Maturazione trasporto traduzione
degradazione
controllo dell’attivita’
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Metodi per studiare l’espressione dei geni• Northern blot• Trascrittasi Inversa -PCR (RT-
PCR)• Ibridazione In situ• Trascrizione In vitro• DNA Microarray
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Purificazione dell’RNA
• Procedura – Lisi delle cellule con un reagente
che dissocia le nucleoproteine e inibisce la RNAsi
– Rimozione delle proteine– Precipitazione specifica dell’RNA
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Northern blot
• Per determinare la dimensione e la quantita’ di specifici mRNA
• Studi sull’espressione genica
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Northern blot– Elettroforesi dell’RNA in gel
contenente formaldeide per mantenere l’RNA in forma completamente lineare
– Trasferimento dell’RNA su una membrana
– Ibridazione con una sonda marcata
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100V 0,2A
+-
generatore di corrente
gel di agarosio
scatola elettroforetica
tampone elettroforeticoes. TAE (4mM Tris-acetato, 1mM EDTA, pH 8.0)
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Gel Elettroforesi-
Separa le molecole in base alla dimensione
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Trasferimento su supporto solido
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Trasferimento dal gel alla membrana
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gel
membrana
Dopo il trasferimento
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Preparare la sonda per il Northern Blot
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Ibridazione
• La sonda marcata e’ aggiunta ad una soluzione contenente il supporto solido che lega l’RNA da analizzare
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Lavaggio
• Rimozione della sonda non legata al supporto solido
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Rivelazione degli ibridi
• Esposizione di un film se la sonda e’ marcata radioattivamente
• Se la sonda e’ marcata con un enzima si procede alla reazione enzimatica che produce colore direttamente sul supporto solido
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Northern blot
• La rivelazione avviene usando:– DNA marcato con
radioattivo(32P)
– DNA marcato con un enzima che catalizza una reazione che produce luce o colore
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Fig. 5. Northern blot analysis of E. lagascae total RNA from leaves (L), germinating seeds (Se), roots (Ro) and stems (St). The blot was hybridized with probes for ElLTP1 (top panel) and ElLTP2 (middle panel). The bottom panel shows ethidium bromide staining of the gel before blotting. The numbers to the left indicate approximate transcript sizes in kb
Northern blot
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Svantaggi del Northern Blot
• Richiede grandi quantita’ di RNA
• E’ un processo lungo e laborioso
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AMPLIFICAZIONE IN AMPLIFICAZIONE IN VITRO DEL DNAVITRO DEL DNA
““REAZIONE A CATENA REAZIONE A CATENA DELLA POLIMERASIDELLA POLIMERASI
(PCR)”(PCR)”
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• Inventata da Kary Mullis negli anni ‘80 (premio Nobel 1993)
• Serve per ottenere una grande quantita’ di una specifica sequenza di DNA in vitro
• Puo’ amplificare un tratto di DNA per piu’ di 1 milione di volte
PCR: reazione polimerasica a catena
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ELEMENTI NECESSARI ALLA REAZIONE:
1- DUE OLIGONUCLEOTIDI COMPLEMENTARI A DUE REGIONI CHE SI TROVANO SU FILAMENTI OPPOSTI DEL DNA STAMPO AI LATI DELLA REGIONE CHE SI VUOLE AMPLIFICARE
2- DNA STAMPO CHE CONTENGA LA REGIONE DA AMPLIFICARE
3- POLIMERASI TERMOSTABILE (NON VIENE DENATURATA SE PORTATA A 95° C)
4- I 4 DESOSSINUCLEOTIDI TRIFOSFATI
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IL PROCESSO DI PCR PREVEDE UN CERTO NUMERO DI CICLI. OGNI CICLO CONSISTE DI 3 PASSAGGI:
1- DENATURAZIONE: TEMP. 95°C. IL DNA STAMPOVIENE DENATURATO, I DUE FILAMENTI SI SEPARANO
2-APPAIAMENTO: 55°C CIRCA. I PRIMERS SI APPAIANOCON IL DNA STAMPO
3- SINTESI: TEMP.72°C E’ OTTIMALE PER IL FUNZIONAMENTO DELLA Taq (Termus aquaticus) POLIMERASI
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PCR: Reazione a catena della polimerasi
Metodo di amplificazione del DNA usando una polimerasi termostabile quale la Taq DNA polimerasi, uno stampo di DNA, un eccesso di primers e dideossinucleotidi (dNTP) in un buffer.
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PCR: Reazione a catena della polimerasi
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PCR: Reazione a catena della polimerasi
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PCR: amplificazionePCR: amplificazione
n.ro cicli
1
3
10
15
20
25
30
n.ro sequenze bersaglio
0
2
256
8192
262.144
8.388.608
268.435.456
La sequenza bersaglio è la sequenza di DNA sintetizzata tra i due primers
Occorre ~1g di DNA per l’analisi di una sequenza o una digestione con enzimi di restrizione tali da poter essere visibili in elettroforesi. Se vi sono ~5 pg di DNA/cellula umana (5x10 -12g) allora ~1 g of DNA potrebbe essere isolato da 200.000 cellule ma avremmo un miscuglio di tutti i geni.
In 1 g di DNA genomico, una copia singola di un gene (300 bp) equivarrebbe a ~0.1 pg di DNA.
Questo 0.1 pg di DNA potrebbe essere amplificato mediante PCR producendo 0.8 g in 25 cicli e 27 g in 30 cicli.
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PCRVANTAGGI:• Sensibilita’• Rapidita’• Si presta all’analisi simultanea di molti campioni (high throughput)• Si presta all’analisi simultanea di diverse sequenze sullo stesso
campione• Si presta all’analisi di DNA degradato o incluso in mezzi strani, o
fissato• SVANTAGGI:• Sensibilita’ (rischio di contaminazioni-falsi positivi)• Variabile efficienza di amplificazione a seconda della sequenza• Richiede conoscenza di base delle sequenze da amplificare e messa a
punto per coppie di oligonucleotidi di innesco (primers)• Può sintetizzare frammenti relativamente corti• La sintesi è imprecisa e introduce errori nella sequenza (la Taq pol
non possiede attività 3’->5’ esonucleasica)
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Esempi di utilizzo della PCR
• Su DNA:– segnalare la presenza o meno di sequenze specifiche (mutazioni,
inserzioni virali, micro-organismo patogeni) -> PCR DIAGNOSTICA
– Amplificare frammenti specifici da usare in seguito come sonde oppure da “clonare”
• Su RNA messaggero (RT-PCR):– segnalare la presenza di specifiche molecole di RNA (espressione
genica, presenza di RNA di micro-organismi infettivi)
– Amplificare frammenti specifici da usare in seguito come sonde oppure da “clonare” - isolare cDNA specifici per determinati geni.
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Trascrittasi Inversa-PCR
• Rivelazione di mRNA molto rari• Analisi di RNA con pochissime
quantita’
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Procedura• Purificazione dell’RNA• Aggiungere i primer• mescolare RNA con la trascrittasi
inversa per effettuare la sintesi del primo filamento di cDNA
• Aggiungere la DNA polimerasi termostabile per effettuare la sintesi del secondo filamento di cDNA e per amplificarlo con i cicli della PCR
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AAAAA5’ TTTTTPrimer 1 3’ 5’
reverse transcriptase(RNA-dependent DNA polymerase)
AAAAATTTTT
mRNAcDNA
mRNA
Remove RNA(RNase A)
TTTTT 5´cDNA
Add PCR primers
Trascrittasi inversa - PCR (RT-PCR)
TTTTT5’3’
5’ 3’Primer 2Primer 3
5’3’ 5’
3’
3’
3’
Add Taq polymerase. Run PCR
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RT-PCR semi-quantitativa:Selezione del numero di cicli
necessari per trovarsi nella fase di amplificazione esponenziale
Nu
mb
er
of
mo
lec
ule
s
Number of cycles
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RT-PCR in tempo reale
• Utilizza particolari combinazioni di coloranti fluorescenti la cui fluorescenza viene smascherata quando la catena di DNA viene sintetizzata oppure che vengono intercalati nella catena nascente durante la reazione di amplificazione.
• L’utilizzo di appositi apparecchi permette la misurazione della fluorescenza accumulata in tempo reale, proporzionale al numero di molecole amplificate e quindi al numero di molecole presenti in partenza
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Polymerase Chain Reaction: resa• Resa teorica: 2n
P=(2)n T Il prodotto (P) incrementa esponenzialmente con il numero di cicli di PCR (n)
Il prodotto di PCR dipende da T,numero di copie di template di partenza
Lo
g[D
NA
]
N° ciclitermici
EsponenzialeEsponenziale
LineareLinearePlateauPlateau
Prodotto Prodotto variabilevariabile
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Perché Real-Time?
Misura l'amplificazione in tempo reale durante la fase esponenziale della PCR, quando cioè l'efficienza di amplificazione è influenzata minimamente dalle variabili di reazione, permettendo di ottenere risultati molto più accurati rispetto alla PCR tradizionale "end point"
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RT-PCR quantitativa
PlotPlot linearelineare
Incremento diIncremento difluorescenzafluorescenza
Cicli di PCR Cicli di PCR
•Rilevamento della fluorescenza associata all’amplificazioneRilevamento della fluorescenza associata all’amplificazione •Il prodotto di PCR non viene analizzato su gel di agarosioIl prodotto di PCR non viene analizzato su gel di agarosio
•Analisi del prodotto di fluorescenza tramite computerAnalisi del prodotto di fluorescenza tramite computer
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Analisi tramite software
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•La fluorescenza si genera durante la PCR per
effetto di diverse possibili reazioni chimiche
•Le chimiche principali sono basate sia sul
legame di coloranti fluorescenti che si intercalano
nella doppia elica di DNA, come il SYBR Green,
sia sull'ibridazione di sonde specifiche.
Chimiche fluorescenti Chimiche fluorescenti per PCR Real-Timeper PCR Real-Time
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SYBR Green ISYBR Green: principioUtilizza una molecolaUtilizza una molecola fluorescente non specifica che si fluorescente non specifica che si
lega al solco minore del DNAlega al solco minore del DNA
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All’inizio del processo di amplificazione, la miscela di reazione contiene DNA denaturato, primers e la
molecola fluorescente
SYBR GreenSYBR Green
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SYBR GreenSYBR GreenDopo l’annealing dei primers, si legano poche molecole fluorescenti alla doppia elica.
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SYBR GreenSYBR GreenDurante l’elongazione si verifica un aumento di fluorescenza che corrisponde all’ aumento del numero di copie dell’amplicone
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l l se r st l se r st pl
+ + + + - - - - RT
Reverse transcriptase-PCR (= RT-PCR)
Epoxide hydrolase
831947
19042027
564
1584
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Ibridazione dell’RNA in situ
Rivelazione di mRNA direttamente su tessuti messi su vetrini da microscopio
Preparation of RNA probe with in vitro transcription
T7/T3 or SP6 promoter
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Fig. 7. RNA in situ hybridization with antisense (a-c) and sense (d) RNA probes for ElLTP1. E. lagascae seedlings were collected 7 days after sowing. co Cotyledon, en endosperm, hy hypocotyl, am apical meristem, ro root
RNA in situ hybridization
Colour substrate:
nitro blue tetrazolium (NBT) + 5-bromo-4-chloro-3-indolyl phosphate (BCIP)
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• Il livello di RNA presente nella cellula non necessariamente riflette direttamente i livelli di trascrizione del gene
• Per poter asserire che un gene viene attivato TRASCRIZIONALMENTE occorre poterne visualizzare l’attivita’
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Il saggio di “run-on” permette di determinare il livello di
trascrizione di un gene
1) Purificare i nuclei2) + NTP, 32P GTP3) Trascrizione: la catena nascente e’ radioattiva4) Estrazione dell’RNA5) Ibridazione a cDNA immobilizzato
su filtro
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Sintesi differenziale di 12 geni codificanti mRNA epato-specifici analizzata tramite run-on
LodishFigure 10-23
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Northern blottingProbe labeling
pBS-SemaIII
dATP
dGTPdTTP
dCTPRNA isolation
AAAAAA
Gel electophoresis
Blotting
Hybridization
Autoradiography
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reverse Northern blotting
Down-regulation of transcripts
Up-regulation of transcripts
**
labeled (specific) probe
target
Northern
**
specific probes
labeled target
reverse Northern
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cDNA arrays (continued)
• macro-arrays– low-density
– filter-supported
– radioactive probes (duplicates)
– low sensitivity
– only cDNA clones spotted
– cheap
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cDNA arrays (continued)
• micro-arrays– high-density
– glass-supported
– fluorescent probes (single slide)
– high sensitivity
– ability to spot oligonucleotides
– very expensive
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Tessuto della prostata, normale
Tessuto della prostata, tumorale
Un microarray è un supporto solido sul quale sono stati posizionati diverse migliaia di cDNA in spot separati. Ciascuno spot rappresenta un gene, in quanto contiene numerose copie di un cDNA corrispondente a tale gene.
I microarrays
In questo esempio i cDNA sono stati posizionati su di un vetrino, simile ai normali vetrini usati per l’istologia.
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Microarray technology
http://www.ym.edu.tw/excellence/HBP/HBP_CP4/procedure.htm
Microarray synthetized by photolithography or EST/oligo “linking”
Probes
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si confrontano i profili di espressione genica di due campioni differenti.E’ necessario estrarre le molecole di mRNA dai due campioni.
Tessuto della prostata, normale
Tessuto della prostata, tumorale utilizzo dei microarrays
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ArraysProbe DNAs are “spotted” onto a glass slide
Each spot corresponds to a particular gene e.g. β-actin
Each array will have thousands of spots (typically 3000 to 30000)
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TargetsRNA is extracted from tissues or cells
testreference
mRNA
cDNARNA is copied to DNA
labelled DNA is fluorescently labelled
pooled Samples are pooled
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Hybridisation
Labelled target DNA hybridised to array
Fluorescence of each spot indicates how much of particular RNA was present in both samples
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Data ProcessingHybridised Hybridised
ArrayArray
ImagesImages
Scanner
RatiosRatios
Spot-finding
Normalisation
Normalised Normalised RatiosRatios
Furtheranalysis
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Cy5Cy5Cy3Cy3 Cy3 Cy5test reference
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Spot-finding (1)
Software identifies grid of spots and maps individual spot locations
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Estrazione dell’mRNA dai 2 campioni di cellule che si vogliono confrontare
Conversione in cDNA
Marcatura con 2 fluorocromi diversi
Riconoscimento tra i cDNA
Eccitazione della fluorescenza tramite laser
Immagine a colori raffigurante il microarray
provenienti dai 2 campioni e quelli già presenti sul microarray
(1)
(2)
(3)
(4) (5)
(6)
Confronto dei profili di espressione genica in due campioni cellulari diversi
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STUDIO DEI PROMOTORI: siti di legame dei fattoridi trascrizione
EMSA
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Trans Factor Methods: EMSA
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Trans Factor Methods: EMSA
Electromobility“Shift”
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Trans Factor Methods: Consensus Sequence Capture
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Il saggio EMSA identifica interazioni tra DNA e proteine
anticorpo
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Il saggio EMSA identifica interazioni tra DNA e proteine
LodishFigure 10-7
• Competizione con stesso sito, sito analogo, sito mutato• Identificazione dei fattori coinvolti tramite “supershift” con anticorpi
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Il footprint con DNasi I permette di localizzare il sito di interazione
tra proteina e DNA
LodishFigure 10-6