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Internationale Vorschriften für die Prüfung von Saatgut 2016Validierte Methoden zur Gesundheitsprüfung von Saatgut

Inklusive Änderungen und redaktionelle Korrekturen verabschiedet auf der ordentlichen Generalversammlung 2016, Tallinn, Estland

Gültig ab 1. Januar 2017

7‑013a: Nachweis von Ustilago nuda an Samen von Hordeum vulgare (Gerste) durch Embryo‑Extraktion

Règles Internationales pour les Essais de Semences 2016Méthodes validées pour analyse sanitaire des semences

Inclus les changements de règles et corrections éditoriales adoptées lors de la réunion annuelle générale 2016, Tallinn, Estonie

Effectives au 1er janvier 2017

7‑013a: Détection d’Ustilago nuda sur semences de Hordeum vulgare (orge) par méthode d’extraction d’embryons

International Rules for Seed Testing 2017Validated Seed Health Testing Methods

Including changes and editorial corrections adopted at the Ordinary General Meeting 2016, Tallinn, Estonia

Effective from 1 January 2017

7‑013a: Detection of Ustilago nuda in Hordeum vulgare (barley) seed by embryo extraction

7-013a-2 Gültig ab 1. Januar 2017

Internationale Vorschriften für die Prüfung von SaatgutValidierte Methoden zur Gesundheitsprüfung von Saatgut

Validierungsstudien

Siehe Literaturquellen. Kopien sind erhältlich per E-mail [email protected] durch das ISTA-Sekretariat.

Kommentare, Empfehlungen oder Berichte zu Problemen betreffend dieser Methode sind bitte an das ISTA Seed He-alth Committee über die Adresse des ISTA-Sekretariates zu richten.

Haftungsausschluss

Obgleich die ISTA mit Sorgfalt auf die Richtigkeit der in die-ser Methodenbeschreibung angegebenen Methoden und In for mationen achtet, haftet sie nicht für jeglichen Verlust, Schaden etc., der aus der Verwendung dieser Methode resultiert.

Sicherheitsmaßnahmen

Der sichere Umgang mit Gefahren im mikrobiologischen Labor und die Berücksichtigung entsprechender Vorsichts-maßnahmen, insbesondere während der Herstellung der Kulturmedien, dem Autoklavieren und Auswiegen der Be-standteile, sind zu gewährleisten. Es wird vorausgesetzt, dass diese Arbeitsschritte in einem mikrobiologischen Labor durch Mitarbeiter durchgeführt werden, die mit den Prinzipi-en der Guten Laborpraxis, Guten Mikrobiologischen Praxis und der sterilen Arbeitstechnik vertraut sind. Alle Abfallstoffe sind auf geeignete Weise und entsprechend der vor Ort üb-lichen Gesundheits-, Sicherheits- und Umweltbestimmun-gen zu entsorgen (z. B. durch Autoklavieren, Desinfizieren).

Herausgegeben von der:Internationalen Vereinigung für Saatgutprüfung (ISTA)Zürichstr. 50, 8303 Bassersdorf, Schweiz

©2017 International Seed Testing Association (ISTA)

Online ISSN 2310-3655

Titel der englischen Originalausgabe: International Rules for Seed Testing

Alle Rechte vorbehalten. Kein Teil dieses Werkes darf in irgendwelcher Form oder durch irgendwelchem Verfahren, sei es elektronisch, mechanisch, durch Fotokopie oder Tonauf-nahme oder durch irgendein anderes Verfahren reproduziert, gespeichert oder verbreitet werden, ohne vorherige schriftliche Genehmigung der Internationalen Vereinigung für Saatgutprüfung.

Anmerkung zur Benutzung der Übersetzungen

Die elektronische Version enthält die englische, französische und deutsche Version der ISTA-Vorschriften. Bei irgendwelchen Fragen bezüglich der Interpretation der ISTA-Vor-schriften ist die englische Version die massgebliche Version.

7-013a-2 Effectif 1er janvier 2017

Règles Internationales pour les Essais de SemencesMéthodes validées pour analyse sanitaire des semences

Études de validation

Voir Références. Les copies sont disponibles au secrétariat de l’ISTA par courriel [email protected].

Merci d’envoyer les commentaires, suggestions ou signa-lement de problèmes sur cette méthode au responsable du ISTA Seed Health Committee, c/o Secrétariat de l’ISTA.

Limitation de responsabilité

En dépit du soin pris par l’ISTA pour assurer l’exactitude des méthodes et des informations contenues dans la descrip-tion des méthodes, l’ISTA décline toute responsabilité pour toute perte ou dommage, etc., résultant de l’utilisation de la présente méthode.

Sécurité

Assurez-vous de connaître les risques et prenez les me-sures de sécurité appropriées. Il est supposé que cette méthode est pratiquée dans un laboratoire de microbiologie par des personnes familières des principes de bonnes pra-tiques de laboratoire, de bonnes pratiques de microbiologie, et des techniques d’asepsie. Tous les déchets doivent être traités d’une manière appropriée (par exemple autoclavage, désinfection) et selon des règlements locaux de sécurité.

Éditées par :L’Association Internationale d’Essais de Semences (ISTA)Zürichstr. 50, 8303 Bassersdorf, Suisse

©2017 par l’Association Internationale d’Essais de Semences (ISTA)


Titre de l’édition originale anglaise : International Rules for Seed Testing

Tous droits réservés. Aucune partie de cette publication ne peut être reproduite, stoc-kée dans le système de récupération ou être transmise sous aucune forme ou par aucun moyen, électronique, mécanique, photocopiant, enregistrant ou autrement, sans permis-sion antérieure par écrit de l’ISTA.

Remarque sur l’utilisation des traductions

La version électronique des règles inclue les versions en anglais, en français et en alle-mand. Pour toute question d’interprétation des règles, seule la version anglaise fait foi.

Chapter 7: Validated Seed Health Testing Methods International Rules for Seed Testing

Effective 1 January 20177-013a-2

Validation reports

See References. Copies are available by e-mail from the ISTA Secretariat at [email protected].

Please send comments, suggestions or reports of problems relating to this method to the ISTA Seed Health Committee, c/o ISTA Secretariat.

Disclaimer

Whilst ISTA has taken care to ensure the accuracy of the methods and information described in this method descrip-tion, ISTA shall not be liable for any loss or damage, etc. resulting from the use of this method.

Safety precautions

Ensure you are familiar with hazard data and take appro-priate safety precautions, especially during weighing out of ingredients. It is assumed that persons carrying out this test are in a laboratory suitable for carrying out microbiological procedures and familiar with the principles of Good Labo-ratory Practice, Good Microbiological Practice, and aseptic techniques. Dispose of all waste materials in an appropriate way (e.g. autoclaving, disinfection) and in accordance with local health, environmental and safety regulations.

Note on the use of the translations

The electronic version of the International Rules for Seed Testing includes the English, French and German versions. If there are any questions on interpretation of the ISTA Rules, the English version is the definitive version.

Published byThe International Seed Testing Association (ISTA)Zürichstr. 50, CH-8303 Bassersdorf, Switzerland

©2017 International Seed Testing Association (ISTA)


All rights reserved. No part of this publication may be reproduced, stored in any retrieval system or transmitted in any form or by any means, electronic, mechanical, photocopying, recording or otherwise, without prior permission in writing from ISTA.


Internationale Vorschriften für die Prüfung von Saatgut Validierte Methoden zur Gesundheitsprüfung von Saatgut

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7‑013a: Nachweis von Ustilago nuda an Samen von Hordeum vulgare (Gerste) durch Embryo‑Extraktion

Wirtspflanze: Hordeum vulgare L.Krankheitserreger: Ustilago nuda (Jens.) Rostr.

Erstellt durch: ISTA-PDC Method Validation Sub-committee

Autoren: ISTA-PDC Method Validation Sub-committee

Revisionsstand

Version 1.0, 2001-11-202001-11-20: Revision J. Sheppard, V. CockerellNachdruck 2003Version 1.1, 2008-01-01: “Behandeltes Saatgut” überar-

beitet; “Berichterstattung der Ergebnisse” überarbeitetVersion 1.2, 2012-01-01: zu 7-013a umnummeriertVersion 1.3, 2013-01-01: Definition des ProbenumfangsVersion 1.4, 2014-01-01: Positivkontrolle hinzugefügtVersion 1.5, 2017-01-01: „Berichterstattung der Ergebnis-

se“ überarbeitet

HintergrundDie Methode ist im Original zunächst veröffentlicht wor-den im ISTA Handbook for Seed Health Testing im Novem-ber 1964 als S. 3 Nr. 25 und wurde 1988 von W J Rennie, Agricultural Scientific Services, East Craigs, Edinburgh, Scotland überprüft. Die Methode wurde 2002 in die neue revidierte Fassung des Anhangs zum Kapitel 7 der Aus-gabe von 1999 der ISTA-Vorschriften übernommen. Die Methode wurde im Jahr 2006 durch das ISTA-Seed Health Committee überprüft (Cockerell & Koenraadt, 2007) und für weitere 5 Jahre anerkannt.

SicherheitsmaßnahmenDie Herstellung der wässrigen Natriumhydroxid-Lösung muss in einem gut belüfteten Raum stattfinden, wobei das Personal Schutzkleidung zu tragen hat.

Bei der Untersuchung gebeizter Proben sind die ent-sprechenden Sicherheitsdatenblätter der verwendeten Che-mikalien zu beachten. Inhalation, Hautkontakt und Aufnah-me in den Magen-Darm-Trakt müssen vermieden werden.

Behandeltes (gebeiztes) SaatgutDie Methode kann zum Nachweis von Ustilago nuda an unbehandeltem und behandeltem (gebeiztem) Saatgut ver-wendet werden. (Definition „Behandlung“: jegliches Ver-fahren physikalischer, biologischer oder chemischer Natur, dem eine Saatgutpartie unterzogen wurde einschließlich Saatgutumhüllungen; siehe dazu 7.2.3).

MaterialReferenzmaterial: infizierte Körner oder anderes geeig-

netes Material.Inkubator: Temperaturbereich 20 ±2 °C.Messingsiebe: 1 mm Maschenweite (2 zusätzliche Siebe

mit einer größeren Maschenweite können nützlich sein (siehe 2.3).

Mikroskop: Durchlicht; ×25 und ×50 Vergrößerung.5 % Natriumhydroxid-Lösung: siehe Seite 2–3.Milchsäurelösung: siehe Seite 3.AbzugGlycerin

ProbenvorbereitungDer Test wird an einer Untersuchungsprobe wie in Abschnitt 7.4.1. der ISTA-Vorschriften beschrieben durchgeführt.

Die Methode erfordert die Untersuchung von 2000–4000 Samen und 1000 Embryonen. Die Samen können durch Auswiegen oder Auszählen vorbereitet werden. Die Methode kann bei unbehandeltem und gebeiztem (behan-deltem) Saatgut angewendet werden.

Methode1. Probenumfang der Embryo-Methode1.1 Zwei Wiederholungen von jeweils 100–120 g abhängig

vom 1000-Korn-Gewicht, 2000 bis 4000 Körner.

2. Extraktion und Klärung der Embryonen2.1 Saatgut in 1 L frisch zubereiteter 5-prozentiger Na-

triumhydroxid-Lösung (NaOH) bei 20 °C für 24 h schütteln.

KKP: Eine schwächere NaOH-Lösung oder eine niedri-gere Temperatur erschweren die Extraktion.

2.2 Nach dem Einweichen die gesamte Probe in ein geeig-netes Gefäß überführen und mit warmen Wasser wa-schen, um sie vom aufgeweichten Perikarp zu trennen.

Effectif 1er janvier 2017

Règles Internationales pour les Essais de Semences Méthodes validées pour analyse sanitaire des semences

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7‑013a : Détection d’Ustilago nuda sur semences de Hordeum vulgare (orge) par méthode d’extraction d’embryons

Hôte : Hordeum vulgare L.Pathogène(s) : Ustilago nuda (Jens.) Rostr.

Auteurs : Sous-Comité de Validation des Méthodes de l’ISTA-PDC

Préparé par : Sous-Comité de Validation des Méthodes de l’ISTA-PDC

Historique de la révision

Version 1.0, 2001-11-202001-11-20 : Révision J. Sheppard, V. CockerellRéimpression en 2003Version 1.1, 2008-01-01 : « Traitement des semences »

révisé ; « Indication des résultats » réviséVersion 1.2, 2012-01-01 : renumérotée de 7-013 à 7-013aVersion 1.3, 2013-01-01 : Définition de la taille de

l’échantillonVersion 1.4, 2014-01-01 : Ajout de contrôle positifVersion 1.5, 2017-01-01 : « Indications des résultats »

révisé

HistoriqueCette méthode a été à l’origine éditée dans le ISTA Hand book on Seed Health Testing, novembre 1964, S.3 no 25, et révisé en 1988 par W.J. Rennie, Agricultural Scientific Services, East Craigs, Édimbourg, Écosse. La méthode a été incorporée à l’annexe révisée du Chapitre 7 en 2002 à partir de l’édition 1999 des Règles ISTA. La méthode a été révisée par le Comité d’Analyse Sanitaire des Semences d’ISTA en 2006 (Cockerell & Koenraadt, 2007) avec la recommandation de l’accepter pour les cinq années à venir.

SécuritéEn préparant la solution aqueuse d’hydroxide de sodium, il est essentiel que l’opération soit effectuée dans une salle bien-aérée ; l’analyste devrait porter des vêtements de protection.

Ce procédé peut comporter la manipulation de semences traitées chimiquement. Les analystes devraient se familia-riser avec les risques attribués aux traitements chimiques en se référant aux fiches techniques de sécurité. Le contact

par inhalation, absorption par la peau ou ingestion doit être évité.

Semences traitéesCette méthode peut être employée pour détecter Ustilago nuda sur semences non traitées et sur semences sur les-quelles un traitement chimique de semences a été appliqué. (Définition de traitement : Tout de processus, physique, biologique ou chimique, auquel un lot de semences est sou-mis. Voir 7.2.3).

MatérielMatériel de référence : semences connues pour être in-

fectées ou autre matériel appropriéÉtuve : capable de maintenir une température de 20 ±2 °CTamis : maille de 1 mm (2 tamis additionnels d’une plus

grande maille peuvent être utiles (voir le point 2.3)Loupe : avec éclairage par le dessous, ×25 et ×50Hydroxide de sodium 5 % : voir la page 4Solution d’acide lactique : voir la page 4SorbonneGlycérol

Préparation de l’échantillonL’essai est effectué sur un échantillon de travail, comme décrit dans la section 7.4.1 des Règles ISTA.

La méthode nécessite l’examen de 2000–4000 se-mences et 1000 embryons. Les semences peuvent être pré-parées soit selon un poids soit selon un comptage.

Méthode1. Échantillon de travail pour méthode sur embryon1.1 Deux répétitions de 100–120 g contenant, selon le poids

de 1000 semences, 2000–4000 semences

2. Extraction et séparation des embryons2.1 Placer les semences dans 1 L d’une solution à 5 % de

l’hydroxide de sodium (NaOH) nouvellement préparée et maintenir à 20 °C pendant 24 h.

CCP : une solution plus diluée de NaOH ou une tempé-rature plus basse rendent l’extraction difficile.

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Chapter 7: Validated Seed Health Testing MethodsInternational Rules for Seed Testing

Effective 1 January 2017

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7‑013a: Detection of Ustilago nuda in Hordeum vulgare (barley) seed by embryo extraction

Host: Hordeum vulgare L.Pathogen(s): Ustilago nuda (Jens.) Rostr.

Prepared by: ISTA-PDC Method Validation Sub-committee

Authors: ISTA-PDC Method Validation Sub-committee

Revision history

Version 1.0, November 20, 2001Revised 2001-11-20 J. Sheppard, V. CockerellReprinted 2003Version 1.1, 2008-01-01: Treated seed revised; Reporting

results revisedVersion 1.2, 2012-01-01: Renumbered 7-013a following

introduction of method 7-013bVersion 1.3, 2013-01-01: Definition of sample

preparationVersion 1.4, 2014-01-01: Examination: comparison with

positive control addedVersion 1.5, 2017-01-01: Reporting results revised

BackgroundThis method was originally published in the ISTA Hand-book of Seed Health Testing in November 1964 as S.3. No. 25 and revised in 1988 by W J Rennie, Agricultural Scientific Services, East Craigs, Edinburgh, Scotland. The method was incorporated into the newly revised An-nexe to Chapter 7 in 2002 from the 1999 edition of the ISTA Rules. The method was reviewed by the ISTA-Seed Health Committee in 2006 (Cockerell & Koenraadt, 2007) with the recommendation to accept for a further five years.

Safety precautionsWhen preparing the aqueous sodium hydroxide solution, it is essential that the operation is carried out in a well-ventilated room; the analyst should wear full protective clothing.

This procedure may involve the handling of chemi-cally treated seed. Analysts should familiarise themselves with the risks attributed to chemical treatments by refer-ence to the material safety data sheets. Contact by inhala-tion, skin absorption or ingestion must be avoided.

Treated seedThis method can be used to detect Ustilago nuda in un-treated seed and in seed where a chemical seed treatment has been applied.

(Definition of treatment: any process, physical, bio-logical or chemical, to which a seed lot is submitted. See 7.2.3).

MaterialsReference material: seed known to be infected or other

appropriate materialIncubator: operating at 20 ±2 °CBrass sieves: 1 mm mesh (2 additional sieves of larger

mesh size can be useful; see point 2.3)Microscope: with substage illumination, ×25 and ×50

magnification5 % sodium hydroxide: see belowLactic acid solution: see belowFume cupboardGlycerol

Sample preparationThe test is carried out on a working sample as described in Section 7.4.1 of the International Rules for Seed Testing. The method requires 2000–4000 seeds, and 1000 embryos are examined. Seed can be prepared either by weight or by counting. This test can be completed on both treated and untreated seed.

Method1. Working sample of embryo method1.1 Two replicates of 100–120 g containing, depending on

1000-seed weight, 2000–4000 seeds.

2. Extraction and clearing of embryos2.1 Place the seeds in 1 L of a freshly prepared 5 % aque-

ous solution of sodium hydroxide (NaOH) and main-tain at 20 °C for 24 h.

CCP A weaker solution of NaOH or a lower tempera-ture makes extraction difficult.

2.2 After soaking, the entire sample should be transferred to a suitable container and washed in warm water to separate the embryos, which appear through the sof-tened pericarps.



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2.3 Auffangen der Embryonen in einem Sieb mit 1 mm Maschenweite. Mit zusätzlichen Sieben mit größerer Maschenweite können Teile des En do sperms und Sa-menschalen aufgefangen werden.

2.4 Überführung der Embryonen in eine Lösung beste-hend aus gleichen Teilen Wasser und Glycerin zur weiteren Abtrennung der Embryonen von anderen Kornbestandteilen.

2.5 Überführen der Embryonen in 50 mL Milchsäurelösung und anschließende Klärung durch 5-minütiges Kochen in einem entsprechenden Gefäß unter einem Abzug.

2.6 Zur Auswertung die Embryonen in frisches Glycerin überführen. Das Scutellum wird transparenter und es erleichtert die Untersuchung, wenn die Embryonen für 1–2 h in Glycerin verbleiben.

3. Auswertung3.1 Bei 16- bis 25-facher Vergrößerung die Embryonen mit

Durchlicht auf das Vorhandensein des charakteristi-schen Myzels von Ustilago nuda untersuchen.

3.2 Das Myzel ist ungefähr 3 µm dick, von gold-brauner Farbe und auch ohne weitere Anfärbung zu erkennen (Abb. 1). Es können einzelne Hyphen bis hin zur voll-ständigen Besiedlung des gesamten Scutellums auf-treten. Gelegentlich taucht auch Myzel anderer Pilze auf, doch ist dieses meist deutlich dunkler und scharf abgegrenzt. Bei Entfärbung der Zellwände kann es zu einer Verwechselung mit Myzel von U. nuda kommen; in diesem Fall die Embryonen bei 50-facher oder höhe-rer Vergrößerung mikroskopieren (Abb. 2). Mit Positiv-kontrolle vergleichen (Referenzmaterial).

Allgemeine MethodenBerichterstattung der Ergebnisse: Der Ergebnisbericht

einer Gesundheitsprüfung von Saatgut sollte den wis-senschaftlichen Name des Krankheitserregers und die verwendete Methode enthalten. Bei Berichterstattung auf einem ISTA-Bericht sind die Ergebnisse unter ‚Wei-tere Untersuchungsergebnisse‘ einzutragen. Der Prüfbericht muss die Anzahl untersuchter Samen angeben. Im Falle eines negativen Ergebnisses (Krankheitser-reger nicht nachgewiesen), müssen die Ergebnisse als „nicht nachgewiesen“ berichtet werden. Im Falle eines positiven Ergebnisses sollte der Prüfbe-richt den Prozentsatz infizierter Samen angeben.

QualitätssicherungKritische Kontrollpunkte (KKP)

Die Stellen, wo die Originalfassung des ISTA-Working Sheet auf kritische Arbeitsschritte hinweist, sind hier mit KKP gekennzeichnet.

LösungenNaOH‑Lösung 5 %

Eine ganz genaue Einstellung der Konzentration der NaOH-Lösung ist nicht notwendig.

Methode A

NaOH-Pellets: 50 gKaltes Leitungswasser: 1 L

Herstellung

1. 50 g NaOH-Pellets abwiegen2. NaOH-Pellets in 1 L kaltem Leitungswasser lösen.

Es ist sicherzustellen, dass die Pellets komplett gelöst sind. Dazu muss die Lösung permanent mit einem Magnet rührstäbchen gerührt werden.

Methode B

NaOH kann auch als 50-prozentige Stammlösung erwor-ben werden.

NaOH 50 %: 100 mLKaltes Leitungswasser: 900 mL

Herstellung

– 100 mL einer 50-prozentigen Stammlösung zu 900 mL kaltem Leitungswasser geben.



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2.2 Après le trempage, l’échantillon entier devrait être transféré dans un récipient approprié et être lavé dans l’eau chaude pour séparer les embryons, qui sortent par les péricarpes ramollis.

2.3 Rassembler les embryons dans un tamis de maille de 1 mm. Des tamis additionnels avec de plus grandes mailles peuvent être utilisés pour récupérer des mor-ceaux d’endosperme et de balles.

2.4 Transférer les embryons dans un mélange de glycérol et d’eau à quantités égales, pour une séparation des embryons et des balles.

2.5 Transférer les embryons dans un bécher contenant 50 mL de solution d’acide lactique et effectuer un net-toyage des embryons en maintenant la solution d’acide lactique au point d’ébullition pendant environ 5 min sous une sorbonne.

2.6 Transférer les embryons dans une nouvelle solution de glycérol pour la lecture. Le scutellum devient plus transparent quand les embryons sont laissés dans le gly-cérol pendant 1–2 h, facilitant la lecture.

3. Lecture3.1 Examiner les embryons au grossissement ×16–25 avec

une lumière par-dessous, pour le mycélium brun doré caractéristique du U. nuda.

3.2 Le mycélium a environ une épaisseur de 3 µm, est de couleur brun doré et observable sans coloration (Fig. 1). L’infection peut varier de quelques hyphes courts à l’invasion des tissus du scutellum. De temps en temps des champignons autres que U. nuda se trouvent dans le scutellum mais sont habituellement plus foncés et distincts. Quand leurs parois se décolorent, ils peuvent être confondus avec le mycélium d’U. nuda, mais ceci peut être vérifié par observation au grossissement ×50 ou supérieur (Fig. 2). Comparer avec le témoin positif (matériel de référence).

Méthodes généralesIndication des résultats : Le résultat d’un essai de qua-

lité sanitaire des semences devrait indiquer le nom scientifique du pathogène détecté et la méthode d’essai employée. Les résultats sont écrits dans « Autres déter-minations » dans le Bulletin ISTA. Le rapport doit indiquer le nombre de semences testées. Dans le cas d’un résultat négatif (pathogène non détec-té), les résultats doivent être rapportés comme « non détecté ». Dans le cas d’un résultat positif, le rapport doit indiquer le pourcentage de semences infectées.

Assurance qualitéPoints critiques de contrôle (CCP)

Lorsque la méthode signale qu’une action est critique ceci a été identifié par CCP.

SolutionsHydroxide de sodium à 5 %

La concentration exacte de la solution d’hydroxide de so-dium n’est pas critique.

Option A

Granules d’hydroxyde de sodium : 50 gEau du robinet froide : 1 L

Préparation

1. Peser 50 g de granules d’hydroxide de sodium.2. Dissoudre les granules d’hydroxide de sodium dans 1

L d’eau du robinet froide. Il est important de s’assu-rer que tous les granules sont complètement dissous et ceci nécessite une agitation constante avec une tige en métal.

Option B

(L’hydroxide de sodium peut être acheté en tant que solu-tion courante à 50 %)

Solution d’hydroxide de sodium à 50 % : 100 mLEau du robinet froide : 900 mL

Préparation

Ajouter 100 mL de solution courante à 50 % à 900 mL d’eau du robinet froide.



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2.3 Collect the embryos in a sieve of 1 mm mesh. Ad-ditional sieves of larger mesh can be used to collect pieces of endosperm and chaff.

2.4 Transfer the embryos to a mixture of equal quantities of glycerol and water in which further separation of the embryos and chaff can be made.

2.5 Transfer the embryos to a beaker containing 50 mL of lactic acid solution and clear them by maintaining the lactic acid solution at boiling point for approximately 5 min. in a fume cupboard.

2.6 Transfer the embryos to fresh glycerol for examina-tion. The scutellum becomes more transparent when embryos are left in glycerol for 1–2 h, making exami-nation easier.

3. Examination3.1 Examine embryos at ×16–25 magnification with ad-

equate substage illumination for the characteristic golden brown mycelium of U. nuda.

3.2 Mycelium is approximately 3 µm thick, is golden brown in colour and visible without a stain (Fig. 1). Infection may vary from a few strands of short hyphae to complete invasion of the scutellum tissues. Occa-sionally fungi other than U. nuda occur in the scutel-lum but are usually darker in colour and quite distinct. When cell walls become discoloured they may be confused with mycelium of U. nuda, but this can be checked by examination at ×50 or higher magnifica-tion (Fig. 2). Compare with positive control (reference material).

General methodsReporting results: The result of a seed health test

should indicate the scientific name of the pathogen detected and the test method used. When reported on an ISTA Certificate, results are entered under ‘Other Determinations’.The report must indicate the number of seeds tested. In the case of a negative result (pathogen not detected), the results must be reported as “not detected”. In the case of a positive result, the report should indi-cate the percentage of infected seeds.

Quality assuranceCritical control points (CCP)

Where the wording of the original Working Sheet suggests that an action is critical this has been marked with CCP.

Solutions5 % sodium hydroxide solution

The exact concentration of the sodium hydroxide solution is not critical.

Option A

Sodium hydroxide pellets: 50 gCold tap water: 1 L

Preparation

1. Weigh 50 g sodium hydroxide pellets.2. Dissolve sodium hydroxide pellets in 1 L of cold tap

water. It is important to ensure that all the pellets are completely dissolved and this necessitates constant stirring with a metal rod.

Option B

Sodium hydroxide can be purchased as 50 % stock solution.

Sodium hydroxide 50 %solution: 100 mLCold tap water: 900 mL

Preparation

Add 100 mL of 50 % stock solution to 900 mL cold tap water.

Rules changes for 2017

7-013a: Reporting results revised


Internationale Vorschriften für die Prüfung von Saatgut Validierte Methoden zur Gesundheitsprüfung von Saatgut

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Abb. 1a, b. Infizierter Embryo; Brandpilz-Myzel im Scutellum mit S gekennzeichnet.

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Abb. 2. Brandpilz-Myzel im Scutellum.

Milchsäurelösung

Glycerin: 333,3 mLMilchsäure (90 % rein; Mindestanforderung 88 %

Reinheit): 333,3 mLWasser: 333,3 mL

Herstellung

1. Gleiche Teile Glycerin, Milchsäure und Wasser voll-ständig mischen

2. Die fertige Lösung sollte klar und nahezu farblos sein. Ältere oder dem Licht ausgesetzte Lösungen werden gelblich. Die Lagerung erfolgt in braunen Flaschen unter Vermeidung von Lichtkontakt.

Effectif 1er janvier 2017

Règles Internationales pour les Essais de Semences Méthodes validées pour analyse sanitaire des semences

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Figure 1a, b. Embryon infecté, mycélium de charbon (S) dans le scutellum

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Figure 2. Mycélium de charbon dans le scutellum

Solution d’acide lactique

Glycérine : 333,3 mLAcide lactique (pureté 90 %, minimum 88 %) :

333,3 mLEau : 333,3 mL

Préparation

1. Ajouter à parts égales la glycérine, l’acide lactique et l’eau. Mélanger complètement.

2. La solution finale devrait être claire et presque sans couleur. La solution tournera au jaune avec le temps et l’exposition à la lumière. Conserver dans une bouteille colorée et éviter l’exposition à la lumière.

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Chapter 7: Validated Seed Health Testing MethodsInternational Rules for Seed Testing

Effective 1 January 2017

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Figure 1. Infected embryo, smut mycelium at S in scutellum

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Figure 2. Smut mycelium in scutellum

Lactic acid solution

Glycerine: 333.3 mLLactic acid (90 % pure, minimum assay 88 %

purity): 333.3 mLWater: 333.3 mL

Preparation

1. Add equal parts of glycerine, lactic acid and water. Mix thoroughly.

2. Final solution should be clear and almost colourless. The solution will turn yellow with age and exposure to light. Store in amber bottle and avoid exposure to light.



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LiteraturquellenDie folgenden Quellenangaben stammen aus dem ISTA Handbook on Seed Health Testing, Working Sheet No. 25, W. J. Rennie, 1988.

Cockerell, V. & Weinhappel M. (2007). Modification to ISTA Method 7-013 Detection of Ustilago nuda in Hordeum vulgare. ISTA Method Validation Reports, 4.

Fenwick, D. W. (1940). Methods of recovery and counting of cysts of Heterodera schachtii from soil. Journal of Helminthology, 18, 155–172.

Grainger, P. N. (1962). An embryo separator for use in determining true loose smut, Ustilago nuda of barley. Proceedings of the Association of Official Seed Analysts, 52, 94–96.

Hewett, P. D. (1970). A note on the extraction rate in the embryo method for loose smut of barley, Ustilago nuda (Jens.) Rostr. Proceedings of the International Seed Testing Association, 35, 181–183.

Hewett, P. D. (1972). Resistance to barley loose smut (Ustilago nuda) in the variety Emir. Transactions of the British Mycological Society, 59, 330–331.

Joelson, G. (1968). Laboratoriemetod for bestämning av naket sot hos korn. Redogörelse för verksamheten vid Frökontrollanstalten i Skara 1967–1968, anstaltens 91:a verksamhetsår p. 18–22. Skara.

Laidlaw, W. M. R. (1961). Extracting barley embryos for loose smut examination. Plant Pathology, 10, 63–65.

Marshall, G. M. (1959). The incidence of certain seed-borne diseases in commercial seed samples. I. Loose smut of barley Ustilago nuda (Jens.) Rostr. Annals of Applied Biology, 47, 232.

McFadden, A. D., Kaufmann, M. L., Russell, R. C. & Tyner, L. E. (1960). Association between seed size and the incidence of loose smut in barley. Canadian Journal of Plant Science, 40, 611–615.

Morton, D. J. (1960). A quick method for preparing barley embryos for loose smut examination. Phytopathology, 50, 270–272.

Pedersen, P. N. (1956). A routine method of testing seed barley for loose smut Ustilago nuda (Jens.) Rostr. Proceedings of the International Seed Testing Association, 21, 181–183.

Pedersen, P. N. (1967). On the relations between the placement of the flower in ears of barley and its susceptibility to attacks of loose smut (Ustilago nuda). Acta Agriculturæ Scandinavica, 17, 39–42.

Rennie, W. J. & Seaton, R. D. (1975). Loose smut of barley. The embryo test as a means of assessing loose smut infection in seed stocks. Seed Science and Technology, 3, 697–709.

Rennie, W. J. (1978). Working group on temperate climate cereals. In Report on the 16th International Workshop on Seed Pathology. ISTA-PDC. pp. 31–33. Karlsruhe.

Russell, R. C. (1950). The whole embryo method of testing barley for loose smut as a routine test. Scientia Agricola, 30, 361–366.

Russell, R. C. & Popp, W. (1951). The embryo test as a method of forecasting loose smut infection in barley. Scientia Agricola, 31, 559–565.

Simmonds, P. M. (1946). Detection of the loose smut fungi in embryos of barley and wheat. Scientia Agricola, 26, 51–59.

Tempe, J. de (1976). Working group on temperate climate cereal. In Report on the 15th International Work shop on Seed Pathology. ISTA-PDC, pp. 17–19. Paris.

Validierungsstudien

Ermittelt in Internationalen Vergleichstest: 1960, 1963, 1964, 1979.

Vergleichstests, welche vom ISTA Komitee für Pflan-zenkrankheiten organisiert wurden, ergaben eine ange-messene Übereinstimmung der Ergebnisse zwischen den verschiedenen Laboren, die Erfahrungen mit der Methode besitzen, bei Proben mit mehr als 1 % befallener Körnern (Rennie, 1978; Tempe, 1976).



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RéférencesLes références suivantes sont extraites du ISTA Hand book on Seed Health Testing, Working Sheet No. 25, W.J. Ren-nie, 1988.



















Études de validation

Étudié dans les essais comparatifs internationaux : 1960, 1963, 1964, 1979

Les essais comparatifs organisés par le Comité des mala-dies des plantes de l’ISTA ont donné une concordance raisonnable entre les laboratoires lorsque des échantillons contaminés à plus de 1,0 pour cent avaient été testés par des stations expérimentées sur la méthode (Rennie, 1978 ; Tempe, 1976).



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ReferencesThe following references are extracted from the ISTA Handbook on Seed Health Testing, Working Sheet No. 25, W. J. Rennie, 1988.



















Validation reports

Studied in International Comparative Testing 1960, 1963, 1964, 1979.

Comparative tests organised by the ISTA Plant Dis-eases Committee gave reasonable agreement between sta-tions when samples with more than 1.0 per cent infection were tested by stations experienced in the test procedure (Rennie,1978; Tempe,1976).

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