REFERAT

Tehnici de identificare a drojdiilor si mucegaiurilor din alimente

Student: BORDEA EDUARD-DANIEL Anul: I- MASTER

1. Ce sunt mucegaiurile ?

Mucegaiurile sunt fungi filamentoşi care cresc sub forma unei mese încolăcite şi se

răspândesc rapid putând acoperi o suprafaţă de mai mulţi centimetrii în numai 2-3 zile.

Întreaga structură sau numai o porţiune din aceasta este denumita miceliu. Un miceliu

este format din ramuri sau filamente denumite hife. Cele mai importante se înmulţesc prin

ascospori, zigospori sau conidii. Ascosporii unor genuri se remarcă prin gradul lor ridicat

de rezistenţă la temperaturi ridicate. Un grup formează picnidii sau acervuli (celule mici în

formă de flacon, iar corpii de fructificare sunt conidiofori). Artrosporii rezultă din

fragmentarea hifelor din unele grupe.

Cele mai importante observaţii din ultimii douăzeci de ani referitoare la sistematica

fungilor transmisibili prin alimente sunt despre descoperirea înmulţirii sexuate sau

perfecte a câtorva specii şi genuri binecunoscute. În această privinţă starea de ascomicet

este considerată de micologi ca fiind starea reproductivă cea mai importantă a unor fungi,

stare denumită teleomorfă. Numele de specie dat unei ciuperci teleomorfe are prioritate

faţă de cel ce defineşte starea anamorfă (denumire dată stării imperfecte sau conidiale).

Termenul holomorf arată că sunt cunoscute ambele stadii, dar este utilizat termenul

teleomorf.

Evoluţia tehnicilor de recoltare şi transformare a produselor agricole, transportul

alimentelor pe distanţe lungi şi prezentarea consumatorilor prin stocarea prelungită

constituie condiţii care dacă sunt realizate necorespunzător, devin favorabile dezvoltării

microorganismelor nedorite şi în particular, a mucegaiurilor.

Micotoxinele sunt metaboliţi ai mucegaiurilor cu o structură chimică mai mult sau

mai puţin cunoscută care au capacitatea de a modifica structuri biologice anormale, cu

efecte degradante atât la om,cât şi la animale. Aceste toxine pot fi conţinute în sporii de

mucegai sau de cele mai multe ori eliminate în substratul de creştere (aliment).

2. Ce sunt drojdiile ?

Drojdiile reprezintă un grup taxonomic complex şi heterogen de

microorganime monocelulare de tip eucariot care se înmulţesc prin înmugurire

(mitoză), ca formă generală de reproducere şi în mod particular, prin ascospori formaţi

pe cale asexuată şi sexuat (în urma proceselor de conjugare între celule).

Importanţă şi rol. Având drept caracteristică principală capacitatea de a

produce fermentarea glucidelor simple în anaerobioză, cu formare de alcool etilic şi dioxid

de carbon, drojdiile fermentative sunt utilizate industrial în biotehnologii alimentare la

fabricarea spirtului de fermentaţie, a vinului, a berii şi pâinii. Drojdiile au o compoziţie

chimică valoroasă şi după cultivare în condiţii de aerare şi prelucrare sunt utilizate ca

sursă de proteine în alimentaţia umană (cu denumirea da SCP – single cell protein –

proteine din monocelulare) sau în alimentaţia animalelor, deoarece, pe lângă 45-55%

proteină brută s.u., aduc în raţie aminoacizi şi vitamine ale grupului B.

In microbiologia industrială din biomasa de drojdie se obţin: plasmolizate,

autolizate, folosite ca aditivi alimentari sau pentru îmbogăţirea în substanţe azotate a

mediilor de cultură destinate fermentaţiilor. Cu ajutorul drojdiilor se pot obţine avantajos.

În condiţii industriale, --fructofuranozidaza şi vitaminele hidrosolubile (B1, B2, PP,

ergosterol), enzime ( galactozidaza), iar prin metode de inginerie genetică, din mutanţi ai

speciei Saccharomyces cerevisiae, s-a obţinut interferonul – substanţă cu efect antiviral şi

citostatic.

Răspândire în natură. Drojdiile au o largă răspândire în mediul ambiant, fiind

întâlnite în toate habitatele naturale: sol, ape, aer, plante, animale. În sol, celulele de

drojdie se întâlnesc în straturile superficiale, până la adâncimi de aproximativ 30 cm, în

concentraţii de 102 -2x105 g -1. Cantitatea creşte în solurile viilor şi grădinilor, ca urmare

a îmbogăţirii solului în substanţe nutritive furnizate de fructele care cad la sol şi suferă

lent putrezirea. Din sol, prin acţiunea unor factori fizici, mecanici şi biologici,

microorganismele ajung temporar în aer şi se răspândesc la distanţe mari; din sol şi aer

drojdiile pot ajunge în ape, unele specii fiind întâlnite chiar la adâncimi de 4000 m.

În mod permanent, drojdiile se află în microbiota epifită a plantelor(flori,

fructe, frunze, rădăcini). Răspândirea drojdiilor este favorizată de insecte, care, o dată cu

nectarul/sucul, preiau şi celule de drojdii care pot hiberna în tractul digestiv al insectelor.

În organismul animal, drojdiile sunt prezente în biocenoza intestinală şi se elimină pe căi

naturale prin produsele de dejecţie; în cantitpţi mai reduse se întâlnesc în cavitatea

bucală şi pe piele. Un grup restrâns de drojdii sunt patogene (Candida albicans,

Cryptococcus neoformans) şi dau îmbolnăviri la om şi la animale.

3. Tehnici de identificare a mucegaiurilor

Pentru manipularea eşantioanelor se recomandă să se lucreze în cabine

securizate biologic. Pentru protecţie, personalul trebuie să poarte în permanenţă sorţ,

mănuşi şi mască.

Manipularea produselor mucegăite

Produsele mucegăite nu trebuie să fie manipulate niciodată fără mănuşi şi

analizele se vor face în aşa fel încât să se evite pe cât posibil inhalarea particulelor

toxice.

Analiza eşantioanelor test

Securitatea manipulării este foarte importantă în timpul acestei operaţii. Este

primordială minimizarea contaminării atmosferice cu vapori toxici si particule de praf.

Contactul direct cu toxinele pure sau în soluţie trebuie să fie evitat prin folosirea

echipamentului de pipetare mecanic. Toate suprafeţele de lucru ca şi echipamentele

folosite în timpul extracţiei trebuie să fie obligatoriu decontaminate după utilizare.

Decontaminarea laboratorului

Sticlăria de laborator şi suprafeţele care au intrat în contact cu toxinele sunt

spălate cu NaClO 0,5%. Carcasele în care au fost ţinute animalele de laborator sunt

incinerate.

Eşantionarea

Studii au arătat că peste 90% din erorile de cuantificare a micotoxinelor se

datorează eşantionării necorespunzătoare; trebuie deci să ne asigurăm că eşantioanele

prelevate pentru a fi analizate sunt reprezentative.

Este important deci să se prezinte un plan de eşantionare care să facă parte din

reglementările privind controlul contaminării cu micotoxine. În ultimii ani, o atenţie

deosebită a fost acordată ameliorării şi asigurării calităţii analizelor făcute pentru

identificarea contaminanţilor din produsele din alimentaţia umană şi animală. Pentru

stabilirea normelor comerciale, contaminanţii trebuie să fie corect identificaţi si cantităţile

determinate să fie scăzute. Micotoxinele nu fac excepţie de la aceste reguli şi analiza lor

prezintă dificultăţi particulare în ceea ce priveşte obţinerea eşantioanelor reprezentative

iar analiza trebuie să permită identificarea nivelurilor scăzute de micotoxine (sub 500

ppm).

Eşantionarea constitue o etapă crucială în determinarea conţinutului de micotoxine

dintr-un lot de produse alimentare. Deoarece cantitatea de micotoxină nu este

proporţională cu cantitatea de mucegaiuri prezentă, sunt foarte rar distribuite uniform în

eşantion. Contrar metodelor analitice, sistemele de eşantionare nu pot face obiectul

încercărilor interlaboratoriale şi în general, un plan de eşantionare este propus pe baza

unui studiu statistic al repartiţiei toxinelor măsurate, apoi el este adoptat în mod oficial.

Determinarea numarului de mucegaiuri

Materiale necesare:

1. Cutii necesare pentru operatia de pregatire si omogenizare a probei

2. Cutii Petri, eprubete si pipete

3. Solutii diluate: solutie fiziologica peptonata 0.1 %; apa de robinet sterila; citrat de

sodiu 2%.

4. Solutii: acid tartric solutie 10%, acid lactic solutie 10%

5. Inhibitori

6. Medii de cultura (Czapek Dox, extract de drojdie, agar-malt, etc)

Efectuarea dilutilor decimale: din alimentele lichide, omogenizate prin agitare se ia 1 ml si

se introduce intr-o eprubeta de 9 ml cu ser fiziologic peptonat. Se continua dilutiile

decimale succesive

Insamantarea: din fiecare dilutie se introduce cate 1 ml in doua cutii Petri. Se toarna cate

15 ml mediu topic si racit si se omogenizeaza.

Incubarea: cutiile Petri se tin la o temperatura de 22-24 grade timp de 5 zile pentru

mucegaiuri.

Numararea coloniilor: cu ochiul liber sau cu lupa. Se efectueaza de obicei in cutiile Petri

in care s-au dezvoltat intre 10 si 100 colonii.

4. Identificarea morfologica a coloniilor de mucegaiuri:

Examenul macroscopic: se efectueaza pe colonii de o saptamana in placa initiala. Se

urmareste aspectul general al coloniei, textura, ritmul de crestere si pigmentarea.

1. Examinarea la lupa binocular: prin observarea in detaliu a aparatului vegetativ.

2. Examinarea microscopica: se racleaza cu ansa o mica portiune de colonie, se

pune o picatura de Lugil si se examineaza cu obiectivele de 10x, 20x si 40x pentru

a observa spori sau alte structuri de diagnostic.

Tehnici de identificare a mucegaiurilor

Examenul microscopic direct este dificil, prin caracterul sau interpretabil. El poate

creea confuzii deoarece filamentele fungice pot fi ușor confundate cu fibrele vegetale, iar

sporii pot fi confundați cu diferite artefacte. Fungii levuriformi sau filamentoși primari,

răspunzatori cu declanșarea bolii, pot fi deseori mascați de specii care se dezvoltă

secundar, așa cum ar fi Penicillium, Rhizopus sau Scopulariopsis.

Prin colorarea frotiurilor obținute din materiale patologice se ating doua obiective:

vizualizarea mai bună a elementelor fungice și conservabilitatea preparatelor. De

asemenea, se pot colora și fragmente de miceți recoltate din coloniile ce au crescut pe

mediile de cultură. Frotiurile se realizeaza prin suspendarea miceților în apă distilată, pe

lama degresată, și uscate la temperatura camerei.

1. Metoda de colorare rapida (dupa Schwartz si Lamkins).

2. Metoda Hotckiss – McManus

5. DETERMINAREA NUMĂRULUI TOTAL DE DROJDII SI MUCEGAIURI

PRINCIPIUL METODEI

Prin această metodă, numărul de drojdii si mucegaiuri se apreciază indirect, pe baza

coloniilor generate de celulele acestor microorganisme prezente în proba de analizat,

care se formează când proba sau o dilu_ie a acesteia vine în contact cu un mediu nutritiv gelozat,

după termostatare la 25°C timp de 72 de ore.

ECHIPAMENTE

_ Omogenizator;

_ Balan_ă analitică;

_ Termostat reglat la 25°C;

_ Baie de apă pentru fluidificarea mediului de cultură reglată la 45°C.

MATERIALE SI STICLĂRIE

_ 25g produs alimentar;

_ 225 ml 0.1% apa peptonată;

_ Plăci Petri Φ=10 cm sterile;

_ Pipete de 1 cm3 si 10 cm3 sterile;

_ Eprubete cu ser fiziologic steril, câte 9 cm3 per eprubetă;

_ Baloane cu ser fiziologic steril;

_ Pungi sterile pentru omogenizarea probelor solide sau semisolide;

_ Numărător de colonii.

Reactivi pentru determinare

Mediu de diluare: Solu_ie ser fiziologic;

Mediu de cultură: Anexa 2.

DESCRIEREA MODULUI DE LUCRU

Se cântăresc 25 g proba produs alimentar, peste care se adaugă 225 ml apa

peptonată. Se omogenizează timp de 1 min.

Pentru diluarea probei se aplică schema de dilutie din figura 1.

Figura 1 Schema de lucru pentru realizarea dilu_iilor si inocularea probelor

*Toate probele se realizează in duplicat.

Cu o pipetă sterilă se transferă în fiecare placă Petri sterilă, câte 1 cm2 probă de

analizat, dacă produsul este lichid sau câte 1 cm2 dilu_ie ini_ială, în cazul altor produse.

Se realizează apoi prima dilu_ie decimală a probei de analizat (10-1). Se repetă aceste

opera_ii cu dilu_iile următoare, folosind câte o nouă pipetă sterilă pentru fiecare dilu_ie

decimală (Fig.1).

Se toarnă în fiecare placă Petri câte cca. 15 cm2 mediu MEA (Malt Extract Agar) cu

temperatura de 45±5°C.

Mediile se uniformizează rapid în plăci, prin rotirea plăcilor în plan orizontal, apoi sunt

lăsate în repaus până se produce solidificarea lor.

Se notează pe capacul plăcilor numele probei, mediul utilizat, dilu_ia inoculată,

temperatura la care se va face termostatarea.

După solidificarea mediului plăcile se termostatează cu capacul în jos, pentru 3-5 zile la

temperatura de 25-28°C.

REZULTATE

Se re_in plăcile care con_in 25-250 de colonii. Numărul de ufc de drojdii si mucegaiuri

per ml sau gram de produs se calculează ca medie ponderată, cu formula următoare:

C

ufc/ g(ml)=

(n1+0,1· n2)·dunde

ΣC – suma coloniilor numărate în toate plăcile re_inute;

n1 – numărul de placi re_inute dintr-o dilu_ie

n2 – numărul de placi re_inute din dilu_ia succesivă

d – factorul de dilu_ie corespunzător primei dilu_ii din care s-a realizat re_inerea

plăcilor.

Rezultatele calculate se rotunjesc la două cifre semnificative.

Se exprima gradul de contaminare printr-un număr cuprins între 1,0 si 9,9 multiplicat cu

10x, unde x este puterea atribuită lui 10.

Dacă cele două placi Petri, la nivelul probei de analizat (produse lichide) sau al dilu_iei

ini_iale (alte produse) con_in mai pu_in de 15 colonii, se face media aritmetică, m, a

coloniilor numărate în cele două placi.

Rezultatul se exprima sub forma:

- număr de ufc de drojdii si mucegaiuri estimat per ml:

NE=m (produse lichide)

- număr de ufc de drojdii si mucegaiuri estimat per gram

NE=m·d-1 (alte produse), în care d este factorul de dilu_ie al dilu_iei ini_iale (alte produse).

Dacă cele două plăci Petri , la nivelul probei de analizat (produse lichide) sau al dilu_iei

ini_iale (alte produse) nu con_in nicio colonie, rezultatul se exprima sub forma:

- mai pu_in de o ufc de drojdii sau mucegaiuri per ml (produse lichide);

- mai pu_in de 1·d-1 ufc de drojdii sau mucegaiuri pe gram (alte produse)

ANEXA 1

GRUPELE PRINCIPALE DE PRODUSE PENTRU CARE SE RECOMANDA ANALIZA

Nr.crt. Grupe de produse

1. Pâine si produse de panifica_ie

2. Produse lactate acide si brânzeturi

3. Carne si produse din carne

4. Uleiuri, grăsimi si semin_e oleaginoase

5. Fructe. Legume si produse prelucrate

6. Băuturi alcoolice

7. Băuturi nealcoolice

8. Făinuri proteice, furaje , sroturi

9. Zahăr si produse zaharoase

10. Cereale si produse din cereale

11. Produse de cofetărie si patiserie

12. Condimente, supe, sosuri, salate

ANEXA 2

CONDITII DE CULTIVARE SI COMPOZITIA MEDIILOR DE CULTURĂ PENTRU

NUMĂRAREA MICROORGANISMELOR

Conditiile particulare de lucru conform prevederilor din normativele românesti adaptate

la conditiile ISO (SR ISO) sunt prezentate în tabelul 1.

Tabelul 1. Conditii de cultivare pentru numărarea microorganismelor impuse de

normativele ISO

Grup de microorganisme Medii de cultură Condi_ii de termostatare

Temperatură/timp

_ Drojdii si mucegaiuri - YGC 25ºC/5 zile

- OGA (OGYE)

Compozitia mediilor de cultură recomandate pentru evaluarea diferitelor categorii de

microorganisme este prezentată în tabelul 2.

Tabelul 2. Compozitia mediilor de cultură recomandate pentru determinarea si

confirmarea numărului de unităti formatoare de colonii

Indicator microbiologic Compozi_ie medii de cultură, g·l-1

Drojdii si mucegaiuri YGC

(Extract de drojdie, glucoză, cloramfenicol agar )

Extract de drojdie ......... 5g

Glucoză ...................... 20g

Cloramfenicol ............ 0,1g

Agar-agar ................... 15g

Apă până la .......... 1000 ml

pH=6,6

OGA (OGYE)

(Oxitetraciclina glucoză agar)

Extract de drojdie ......... 5g

Glucoză ...................... 20g

Agar-agar ................... 16g

Apă până la ........... 1000ml

pH=7,2

În momentul utilizării, în mediul fluidificat se adaugă

100 ml solu_ie 1mg/ml oxitetraciclină.

Geloză nutritivă (geloză alba)

Agar-agar ........................... 12-18g

Apă până la ...................... 1000 ml

MEA (Malt Extract Agar)

Extract de malt ........................ 30g

Peptonă .................................... 5g

Agar-agar ................................ 15g

Apa până la ....................... 1000ml

pH=7,6

CUPRINS

1.Ce sunt mucegaiurile ?

2.Ce sunt drojdiile ?

3. Tehnici de identificare a mucegaiurilor

4.Identificarea morfologica a coloniilor de mucegaiuri

5. Determinarea numarului total de drojdii si mucegaiuri

BIBLIOGRAFIE

http://bibliotecafmvb.ro/doc-site/ma1bib.pdf

https://www.scribd.com/doc/112686525/Laborator-

Microbiologie-Speciala-2012-2013