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RECUPERAÇÃO DE COMPOSTOS BIOATIVOS A
PARTIR DE RESÍDUOS DA INDÚSTRIA VITIVINÍCOLA
Ana Paula Gil Cruz
2013
1.
2. UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO DE JANEIRO
UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO DE JANEIRO
ii
Ana Paula Gil Cruz
RECUPERAÇÃO DE COMPOSTOS BIOATIVOS A
PARTIR DE RESÍDUOS DA INDÚSTRIA VITIVINÍCOLA
Tese de Doutorado apresentado ao
Programa de Pós-Graduação em Ciências de
Alimentos, Instituto de Química, da
Universidade Federal do Rio de Janeiro,
como parte dos requisitos necessários à
obtenção do título de Doutor em Ciências.
Orientadores: Drª. Lourdes Maria Corrêa Cabral
Profª. Drª. Suely Pereira Freitas
Prof. Dr. Alexandre Guedes Torres
Rio de Janeiro,
Abril, 2013.
iii
Ana Paula Gil Cruz
RECUPERAÇÃO DE COMPOSTOS BIOATIVOS A PARTIR DE
RESÍDUOS DA INDÚSTRIA VITIVINÍCOLA
Tese de Doutorado apresentado ao Programa de Pós-Graduação em Ciências de Alimentos, Instituto de Química, da Universidade Federal do Rio de Janeiro, como parte dos requisitos necessários à obtenção do título de Doutor em Ciências.
Aprovada por:
________________________________________
Lourdes Maria Corrêa Cabral, D. Sc., Embrapa Agroindústria de Alimentos (Orientadora)
________________________________________
Suely Pereira Freitas, D. Sc., Escola de Química – UFRJ (Co-Orientadora)
________________________________________
Alexandre Guedes Torres, D. Sc., Instituto de Química – UFRJ (Co-Orientador)
________________________________________
Virgínia Martins da Matta, D. Sc., Embrapa Agroindústria de Alimentos.
________________________________________
Neusa Pereira Arruda, D. Sc., Instituto Federal de Educação, Ciência e Tecnologia do Rio de Janeiro – IFRJ
________________________________________
Veronica Calado, D. Sc., Escola de Química - UFRJ
________________________________________
Daniel Weingart Barreto, DSc., Escola de Química - UFRJ
Rio de Janeiro
iv
Abril, 2013
C957r Cruz, Ana Paula Gil.
Recuperação de compostos bioativos a partir de resíduos da indústria
vitivinícola/ Ana Paula Gil Cruz. Rio de Janeiro: UFRJ/ IQ, 2013.
xxvi; 202 f.: il, 31cm.
Orientadores: Lourdes Maria Corrêa Cabral, Suely Pereira Freitas e
Alexandre Guedes Torres
Tese (Doutorado) – UFRJ/ IQ/ Programa de Pós-graduação em Ciências de
Alimentos 2013.
Referências bibliográficas: 177-193.
1. Bagaço de uva. 2. Extração. 3. Atividade antioxidante. 4.Concentração por
membrana. 5. Secagem por spray drying. I. Cabral, Lourdes Maria Corrêa;
Freitas, Suely Pereira; Torres, Alexandre Guedes. II. Unisversidade Federal do
Rio de Janeiro/ Instituto de Química/ Programa de Pós-gradução em Ciências
de Alimentos. III. Recuperação de compostos bioativos a partir de resíduos da
indústria vitivinícola.
v
DEDICATÓRIA
Dedico aos meus pais, José Luiz e Inês, por todos os ensinamentos, renúncias e
amor com que me educaram, pelas palavras de incentivo, pelos conselhos e
presença constante na minha vida mesmo com a distância física atual, pois sem eles
nada seria possível.
Dedico igualmente ao meu esposo, Esteban, por seu imenso amor, dedicação,
incentivo, apoio, companheirismo, conselhos, desprendimento e confiança na minha
capacidade, que me permitiram a realização de mais um sonho.
Dedico às minhas filhas, Pâmela e Manuela, por todo amor e cumplicidade que por
muitas vezes não me deixaram fraquejar, pelas palavras de incentivo, pelos abraços
acolhedores que me fizeram seguir em frente sem esmorecer e sem os quais as
renúncias de alguns momentos de convívio não seriam possíveis.
vi
AGRADECIMENTOS
À Deus, nosso Pai, pela vida e todas as oportunidades concedidas.
À Jesus, Divino Mestre, pelos ensinamentos que me fazem buscar
melhorar a cada dia, em todos os âmbitos.
À Embrapa Agroindústria de Alimentos, pela oportunidade e cessão de
suas instalações que permitiram a realização deste trabalho.
Aos meus orientadores, Lourdes, Suely e Alexandre, pela confiança no
meu potencial, ensinamentos e conselhos que me permitiram um crescimento
ímpar e a conquista de mais uma etapa. Muito obrigada pela paciência e
incentivo que muitas vezes precisei, obrigada pelos exemplos de vida
profissional e pessoal que me deram.
Aos professores e coordenadores do Programa de Pós-Graduação em
Ciências de Alimentos do Instituto de Química, pela dedicação e empenho para
garantir a excelência do curso.
Aos funcionários do Programa de Pós-Graduação em Ciências de
Alimentos em especial ao Rafael e ao Cláudio, que com toda a paciência e
conhecimento me socorreram nos momentos mais angustiantes.
Aos professores e funcionários do Programa de Pós Graduação da Escola
Química, pela dedicação e empenho que me permitiram novos conhecimentos.
Aos pesquisadores Loiva, Gildo, da Embrapa Uva e Vinho, e suas equipes
pela ajuda na obtenção dos bagaços e pela troca de conhecimento neste
período.
Aos meus amigos da Embrapa, Chorão, Flávia, William, Filé, Selma,
Érika, Claudão, David, Henriqueta, Andressa, Manuela, Ana Cristina, Sidney,
Luciana Sampaio, Sidinéa e Marco pela amizade, incentivo, conversas e o
carinho que sempre esteve presente em nossos relacionamentos, além da
imensa ajuda em diferentes etapas da parte experimental deste trabalho.
À Virgínia, por ter sido a primeira a acreditar no meu potencial e me
incentivar a seguir e crescer profissionalmente, pela amizade e valiosos
ensinamentos e conselhos que me fizeram crescer ao longo de todos estes anos
de convívio.
vii
À Renata Tonon, Flávia Gomes, Manuela e Ronoel, por todo o
conhecimento transmitido, amizade e valiosos ensinamentos e conselhos que
me ajudaram a seguir em frente.
À Ilana e Regina Nogueira pelas conversas tão produtivas, amizade e
conselhos nestes anos de convívio.
Ao Edmar, Renata Torrezan, Leda, Janine, Félix e Viktor, por contribuírem
de alguma forma com meu crescimento e pelo convívio sempre tão rico.
Aos colegas de doutorado, em especial à Alexandra, Vanessa Naciuk,
Renata Mariano, Juliane, Luciana Lopes, Ívina, Célia e Nara por compartilhar
tanto os momentos de desespero, como os de alegrias e sucessos ao longo do
curso.
Aos colegas do Laboratório de Bioquímica Nutricional e de Alimentos pela
troca de conhecimento e pelo convívio.
Aos meus pais, que me ensinaram a prosseguir sempre e que os
obstáculos existem para serem superados sem, contudo, trair nossos valores e
ideais. Muito obrigada pelo exemplo que são para mim.
À minha família, Esteban, Pâmela e Manuela, que sempre me
incentivaram e que me motivam a crescer e a ser uma pessoa/profissional
melhor a cada dia. Muito obrigada por serem meu porto seguro, por todo amor,
paciência, apoio, sensibilidade e sabedoria, principalmente durante este período.
Sem vocês não seria possível.
Aos meus amados irmãos, Tico e Tuti, que mesmo longe fisicamente
sempre se fazem presentes em minha vida e dos quais recebo sempre palavras
de carinho, amor, incentivo e conselhos que necessito. Muito obrigada por
fazerem parte da minha história, vocês são meus modelos de desprendimento,
dedicação e amor à vida.
Aos meus tios e tias, Bibiana, Newton, Madalena (in memorian), Clayton,
José Augusto, Tereza, Braúlio, Ireny, Maria Francisca, Jaime, Marilda e Márcio
pelos inúmeros ensinamentos e exemplos de vida.
viii
Aos meus avôs, Bráulio (in memorian), Aparecida, Joanna e Márcio (in
memorian) que me mostraram que a humildade e a dedicação são ferramentas
fundamentais para o conhecimento e crescimento.
Aos meus sogros, Humberto e Marina, meus primos, primas, cunhadas,
sobrinho e sobrinhas pelo incentivo e carinho.
À Natalia Eitel, minha super estagiária e amiga, por toda a dedicação e
trabalho, sem os quais não teria conseguido atingir todos os objetivos, por todo o
carinho, amizade e companheirismo que crescem a cada dia.
Ao Marlon, Neto e a Carla, por todo empenho e ajuda na execução dos
trabalhos, por todo o crescimento que a rica convivência me trouxe.
Às grandes amigas confidentes Alexandra, Luciana e Isabelle, por todo o
incentivo, apoio, força, ombro amigo e conselhos nas horas mais difíceis, pelos
momentos de descontração e pelos laços da amizade sincera que transcende.
À Rosângela, amiga e meu grande apoio na sustentação do meu lar,
pelas suas orações, carinho e amor a mim e à minha família que me permitiram
a tranquilidade necessária para realizar meus sonhos.
Aos amigos Mônica Pagani, Daniel, Aline Bravo, Sandra Márcia e Simone
pelo incentivo.
Aos amigos conquistados ao longo deste tempo, em especial Flávia
Pingo, Priscila (Perê), Cássia, Renata Cabral, Juliana, Juliana Furtado, Crislen,
Rodrigo, Neto, Larissa, Nara, Luciana, Nathalia, Natalia, Carla, Marlon, Diego,
Luísa, Ana Cristina, pela ajuda, por todos os momentos compartilhados e pelos
laços que não se desfazem com o tempo e distância.
A todos com os quais tive o prazer de conviver e que certamente
contribuíram para este momento.
À CAPES pela concessão de bolsa.
ix
Seja em você a mudança que quer para o mundo.
Mahatma Gandhi
Embora ninguém possa voltar atrás para fazer um novo começo,
qualquer um pode começar agora a fazer um novo fim.
Emmanuel por Francisco Cândido Xavier
x
RESUMO
CRUZ, Ana Paula Gil. Recuperação de compostos bioativos a partir de res íduos da indústria vitivinícola. Rio de Janeiro, 2013. Tese (Doutorado em Ciência de Alimentos) – Instituto de Química, Universidade Federal do Rio de Janeiro, 2013.
O Brasil é o terceiro maior produtor mundial de frutas, e o décimo primeiro em
uvas. Em 2011, a safra brasileira de uva foi de 1,46 milhões de toneladas das quais
836 mil toneladas foram destinadas ao processamento. Nesta etapa, efluentes e
resíduos diversos são gerados e estima-se que bagaço corresponda a 16% da uva
processada. Assim, é possível inferir que cerca de 134 mil toneladas deste co-
produto são geradas anualmente. O descarte desses resíduos promove graves
impactos ambientais, causados pelas elevadas demandas química e bioquímica de
oxigênio, que impõem a necessidade de tratamentos de elevado custo operacional.
Por outro lado, o bagaço destaca-se quanto a sua composição nutricional e
funcional, que favorece sua utilização como matéria prima para elaboração de novos
produtos de interesse industrial. Diante deste cenário, o presente trabalho teve por
objetivo recuperar os compostos bioativos presentes nos bagaços de uva,
resultantes das vinificações em branco e em tinto assim como da elaboração do
suco de uva. Para tal, foram avaliados os processos de extração com solvente e
com enzimas, seguidos da concentração por tecnologia de membranas. O
planejamento experimental empregado identificou a extração com etanol 70% em
água, como a mais eficiente para a obtenção de extratos ricos em compostos
bioativos. Porém, a alta concentração de etanol no extrato não favorecia sua
posterior concentração por osmose inversa ou nanofiltração. A redução do teor de
etanol de 70 para 30% na etapa de extração possibilitou que, na etapa de
concentração, um fator de concentração em massa igual a dez fosse alcançado na
nanofiltração, além de um incremento de quase seis vezes no valor do fluxo de
permeado. Os extratos, obtidos a partir dos bagaços de uva Pinot Noir vinificada em
branco (VB), de uva Chardonnay vinificada em tinto (VT) e de uva Isabel utilizada na
elaboração do suco (SU), após a concentração por nanofiltração apresentaram
atividade antioxidante média de 120, 45 e 69 µmol TE.g-1, respectivamente, medida
xi
pelo método ORAC. Os coeficientes de difusão dos compostos fenólicos foram de
8,6x10-15; 1,5x10-16 e 3,3x10-16 m².s-1 para os bagaços VT, SU e VB,
respectivamente, a 50 °C, pH 4,0 e solução hidroeta nólica 70:30 como solvente. Foi
possível a microencapsulação por spray drying destes extratos concentrados
empregando maltodextrina com DE 10 como material de parede. Os pós obtidos
apresentaram atividade antioxidante medida pelo método ORAC de cerca de 440
µmol TE.g-1 para o pó VB e de 218 µmol TE.g-1 para os pós VT e SU. Os valores de
umidade na monocamada foram de 3,7%, 5,9 e 5,4% para os pós VB, VT e SU,
respectivamente, de acordo com as isotermas ajustadas pelo modelo de BET. Foi
possível ainda verificar que a partir da atividade de água (aw) de 0,4 inicia-se a
adsorção de água nas camadas inferiores à monocamada e, acima de 0,7 ocorre a
solubilização dos pós.
Palavras-chave: bagaço de uva, extração, atividade antioxidante,
concentração por membranas, secagem por spray drying.
xii
ABSTRACT
Brazil is the third largest fruit producer of the world, and the eleventh of grapes. In
2011, the Brazilian grape harvest was 1.46 million tons of which 836 tons were
destined for juice and wine processing. In this step, effluents and waste are
generated, estimated to correspond to 16% of grapes marc. Thus, is possible infer
that about 134 thousand tons of this co-product are generated annually. The disposal
of this waste promotes serious environmental impacts caused by the high chemical
and biochemical oxygen demands, which impose high cost treatments. Moreover,
bagasse stands out as its functional and nutritional composition, which indicates its
use as raw material for production of new products of industrial interest. This study
aimed to recover bioactive compounds present in grape marcs resulting from white
and red winemaking as well as grape juice processing. In this sense, solvent and
enzymatic extractions were evaluated, followed by the concentration using
membrane technology. The experimental design identified the extraction condition
with 70% ethanol in water, as the most efficient for obtaining extracts rich in bioactive
compounds. However, the high concentration of ethanol in the extract did not favor
its subsequent concentration by reverse osmosis or nanofiltration. The reduction of
the ethanol content from 70 to 30% in the extraction step has enabled, in the
concentration step by nanofiltration, a volumetric concentration factor equal to ten
and in addition to an increase of almost six times the value of the permeate flux. The
concentrated extracts, from Pinot Noir grape marc winemaking as white wine (VB),
Chardonnay grapes winemaking as red wine (VT) and Isabel grape used in juice
processing (SU), showed antioxidant activity average of 120, 45 and 69 micromol
TE.g-1, respectively, measured by ORAC method. Phenolics mass diffusion
coefficients were 8,6 x10-15; 1,5 x10-16 e 3,3 x10-16 m².s-1 for grape pomace VT, SU
and VB, respectively, at 50°C, pH 4,0 and 30% ethan ol in aqueous solution as
solvent. It was possible to microencapsulate the extracts by spray drying using
maltodextrin DE 10 as wall material. The obtained powders had antioxidant activity of
approximately 440 µmol TE.g-1 to VB powder and 218 µmol TE.g-1 to the powders VT
and SU. Monolayer moisture value were 3,7%, 5,9 and 5,4% for VB, VT and SU
powders, respectively, in isotherms adsorption fitted using BET model. It was
xiii
possible verify that water adsorption in multilayers starting from aw 0,4 and, above aw
0,7 occur powders solubilization.
Key-words: grape pomace, extraction, antioxidant activity, concentraction by
membrane process, spray drying.
xiv
LISTA DE FIGURAS
Figura 4.1 – Infográfico, indicando os polos da viticultura brasileira, nos
principais estados produtores de uvas para processamento: uvas finas (A); uvas de
mesa (B) (CAMARGO et al., 2010). ............................................................................ 6
Figura 4.2 – Cacho de uva tinta (alto), engaço (direita) e baga das uvas
(esquerda) e as classificação botânica de suas principais estruturas (TECCHIO et
al., 2010). .................................................................................................................... 8
Figura 4.3- Diagrama resumido dos processos de elaboração de sucos e
vinhos e os respectivos resíduos gerados. Adaptado de: Marzarotto (2005); Brazinha
e Crespo (2010) e Pérez-Serradilla e Luque de Castro (2008). ................................ 11
Figura 4.4 – Metabolismo dos compostos fenólicos em vegetais (NAZCK e
SHAHIDHI, 2004). .................................................................................................... 28
Figura 4.5 Principais subclasses de compostos não flavonoides em uva. ..... 29
Figura 4.6 – Estrutura química do ácido elágico (pt.encydia.com). ................ 30
Figura 4.7- Classificação dos taninos em: 1-galotanino; 2-elagitanino; 3-tanino
complexo e 4-tanino condensado (KHANBABAEE e VAN REE, 2001). ................... 33
Figura 4.8 – Núcleo Flavílio (BRAVO, 1998). ................................................. 34
Figura 4.9 – Principais classes de flavonoides. .............................................. 35
Figura 4.10- Unidades monoméricas das proantocianidinas:Flavan-3-ol
(esquerda) e Flavan-3,4-diol (direita). ....................................................................... 36
Figura 4.11 – Estruturas que contribuem para a atividade antioxidante dos
flavonoides (WADA et al., 2007). .............................................................................. 37
Figura 4.12 – Rota metabólica dos flavonoides a partir da chalcona
(OHKATSU et al., 2010). .......................................................................................... 38
Figura 4.13 – Principais antocianidinas em alimentos.................................... 40
Figura 4.14- Comportamento das antocianinas em função do pH. ................ 42
xv
Figura 4.15- Exemplos de piranoantocianinas encontradas nos vinhos
(MATEUS, 2009). ..................................................................................................... 44
Figura 4.16-Processos de separação por membranas em função do tamanho
dos poros .................................................................................................................. 51
Figura 4.17 – Esquemas de filtração convencional (A) e com fluxo tangencial
(B) ............................................................................................................................. 53
Figura 4.18- Microesferas produzidas por spray drying (Fang e Bhandari,
2010)......................................................................................................................... 59
Figura 5.1- Prensa hidráulica. ........................................................................ 63
Figura 5.2 – Resíduos industriais. .................................................................. 64
Figura 5.3 – Diagrama de processos para a determinação da eficiência da
extração. ................................................................................................................... 70
Figura 5.4- Tacho encamisado ....................................................................... 71
Figura 5.5- Centrífuga de cestos. ................................................................... 72
Figura 5.6 – Diagrama simplificado dos testes preliminares. ......................... 73
Figura 5.7 - Diagrama representativo do módulo de configuração quadro e
placas (DSS). ............................................................................................................ 73
Figura 5.8 - Módulo piloto de osmose inversa de configuração quadros e
placas (esquerda) e .tanque de alimentação (direita) ............................................... 74
Figura 5.9 - Esquema do sistema de nanofiltração. ....................................... 76
Figura 5.10 - Módulo piloto de nanofiltração configuração tubular e
membranas cerâmicas.............................................................................................. 76
Figura 5.11 – Sistema de nanofiltração com membrana polimérica de
conformação espiral.................................................................................................. 77
Figura 5.12- Fluxograma de processo de limpeza dos sistemas de osmose
inversa e nanofiltração. ............................................................................................. 79
Figura 5.13 - Spray dryer. ............................................................................. 82
Figura 6.1 Gráfico de Pareto para a atividade antioxidante na extração
enzimática. ................................................................................................................ 95
xvi
Figura 6.2 - Efeito da temperatura e pH sobre as antocianinas totais
(esquerda) e monoméricas (direita). ......................................................................... 96
Figura 6.3 – Efeito do pH e da temperatura sobre a atividade antioxidante. .. 97
Figura 6.4- Efeito da temperatura e razão solvente:substrato sobre a atividade
antioxidante (esquerda) e fenólicos totais (direita). .................................................. 97
Figura 6.5 - Gráficos de Pareto para a atividade antioxidante (esquerda) e
antocianinas (direita) na extração hidroetanólica. ................................................... 100
Figura 6.6 – Efeito da temperatura e razão solvente:substrato sobre a
atividade antioxidante. ............................................................................................ 102
Figura 6.7 – Gráficos das médias marginais de etanol e temperatura para os
fenólicos totais (esquerda) e antocianinas totais (direita). ...................................... 103
Figura 6.8 - Gráficos de Pareto para a atividade antioxidante (esquerda) e
fenólicos totais (direita) na extração do bagaço VB. ............................................... 107
Figura 6.9 - Superfície de resposta da extração dos compostos fenólicos
frente às variações no teor de etanol e pH (esquerda) e pH e razão S:S (direita) .. 108
Figura 6.10 – Gráficos de Pareto para as antocianinas totais (esquerda) e
monoméricas (direita) na extração do bagaço VB. ................................................. 109
Figura 6.11 – Gráfico de superfície de resposta para a atividade antioxidante
em função do pH e teor de etanol na solução, mantendo a razão solvente:substrato
em 9:1. .................................................................................................................... 110
Figura 6.12 Gráficos de Pareto para a atividade antioxidante (esquerda) e
fenólicos totais (direita). .......................................................................................... 114
Figura 6.13 – Gráfico de Pareto para a atividade antioxidante .................... 117
Figura 6.14 - Gráfico de pareto para os compostos fenólicos totais. ........... 118
Figura 6.15 - Gráfico de superfície de resposta para o rendimento em
compostos fenólicos totais de bagaço de uva Isabel (S) em função do pH e teor de
etanol na solução. ................................................................................................... 119
Figura 6.16 – Gráficos de superfície de resposta para as antocianinas totais
(esquerda) e monoméricas (direita) em função da concentração de etanol e do pH.
................................................................................................................................ 120
xvii
Figura 6.17 – Gráficos de Pareto para antocianinas totais (A) e monoméricas
(B). .......................................................................................................................... 121
Figura 6.18 – Gráfico de valores experimentais versus valores estimados pelo
planejamento fatorial 2². ......................................................................................... 122
Figura 6.19 – Cinética da extração de fenólicos do bagaço de uva Pinot Noir
(VB) ajustada pela segunda lei de Fick com três termos (esquerda) e com o primeiro
termo (direita). ........................................................................................................ 124
Figura 6.20 – Cinética da extração de fenólicos dos bagaços VT e SU. ...... 125
Figura 6.21 – Cinética de extração das antocianinas nos bagaços de uva
Isabel (SU esquerda) e Pinot Noir (VB direita). ...................................................... 126
Figura 6.22 – Eficiência da extração em fenólicos totais e atividade
antioxidante. ........................................................................................................... 128
Figura 6.23 – Fluxo de permeado dos processos de osmose inversa. ........ 129
Figura 6.24- Frações do processo de osmose inversa de extrato
hidroetanólico de bagaço de uva Pinot Noir (VB). .................................................. 131
Figura 6.25 – Permeabilidade hidráulica das membranas de osmose inversa
antes e após o processamento com extrato hidroetanólico. ................................... 132
Figura 6.26 – Fluxo de permeado e fator de concentração volumétrica dos
processos de nanofiltração em sistema cerâmico. ................................................. 133
Figura 6.27 – Correntes da nanofiltração do extrato hidroetanólico de bagaço
de uva Pinot Noir (VB) em membrana cerâmica. .................................................... 134
Figura 6.28- Fluxo de permeado e fator de concentração volumétrica do
extrato hidroetanólico de bagaço de uva Pinot Noir (VB) contendo 70% de etanol
pelo sistema de nanofiltração com membrana polimérica. ..................................... 135
Figura 6.29 – Frações da nanofiltração do extrato hidroetanólico de bagaço de
uva Pinot Noir em sistema espiral com membrana polimérica. .............................. 136
Figura 6.30- Permeabilidade hidráulica da membrana de nanofiltração de
poliamida antes e após o processamento com extrato hidroetanólico. ................... 137
Figura 6.31 – Comparativo entre os processos de nanofiltração com
membranas cerâmica e polimérica. ........................................................................ 138
xviii
Figura 6.32 – Fluxo de permeado e fator de concentração volumétrica de
extrato de bagaço de uva contendo 30% de etanol submetido à nanofiltração a 40°
C. ............................................................................................................................ 139
Figura 6.33- Comparativo entre os retidos da nanofiltração dos extratos de
bagaço de uva contendo 30 e 70% de etanol. ........................................................ 141
Figura 6.34 - Fluxo limite do extrato de bagaço de uva contendo 30% de
etanol no processo de nanofiltração. ...................................................................... 142
Figura 6.35- Nanofiltração do extrato de bagaço de uva Pinot Noir (VB)
contendo 30% de etanol. ........................................................................................ 143
Figura 6.36- Correlação de Pearson entre a atividade medida em ABTS e
ORAC e os compostos bioativos ............................................................................ 147
Figura 6.37 – Cromatogramas sobrepostos da fração retida de VB (preto) e de
jabuticaba (vermelho). ............................................................................................ 148
Figura 6.38 – Espectros de absorção no visível de delfinidina-3-glicosídeo (1)
e cianidina-3-glicosídeo (2). .................................................................................... 148
Figura 6.39- Estrutura química das antocianidinas encontradas Pinot Noir. 150
Figura 6.40 – Cromatogramas das frações da nanofiltração de extrato
hidroetanólico de bagaço de uva Pinot Noir (VB). .................................................. 151
Figura 6.41 - Fluxo de processo e aproveitamento sugerido para a fração de
permeado. ............................................................................................................... 153
Figura 6.42 - Nanofiltração do extrato de bagaço de uva Chardonnay
contendo 30% de etanol. ........................................................................................ 154
Figura 6.43- Fluxo de permeado em função da concentração volumétrica. . 154
Figura 6.44 – Concentração dos extratos durante o processamento. .......... 155
Figura 6.45- Coeficientes de retenção para o extrato hidroetanólico de bagaço
de uva Chardonnay. ............................................................................................... 156
Figura 6.46 - Nanofiltração do extrato de bagaço de uva Isabel. ................. 159
Figura 6.47 – Coeficientes de retenção para o extrato hidroetanólico do
bagaço de uva Isabel. ............................................................................................. 160
xix
Figura 6.48 – Diagrama de processos sugerido para o máximo
aproveitamento do bagaço e redução real do resíduo sólido. ................................ 164
Figura 6.49- Isotermas de sorção dos microencapsulados obtidos com os
dados experimentais e com os dados ajustados pelo modelo BET ........................ 166
Figura 6.50 Isotermas de sorção dos microencapsulados obtidos com os
dados experimentais e com os dados ajustados pelo modelo de GAB. ................. 167
Figura 6.51- Microencapsulados nas condições de umidade de equilíbrio das
diferentes umidades relativas aos quais foram submetidos para a determinação das
isotermas. ............................................................................................................... 168
Figura 6.52 – Estabilidade das antocianinas totais (esquerda) e monoméricas
(direita) durante o armazenamento. ........................................................................ 169
Figura 6.53- Microencapsulados obtidos com extratos SU, VT e VB, da
esquerda para a direita. .......................................................................................... 170
Figura 6.54- Diagrama de cor do sistema Lab. ............................................ 171
Figura 6.55- Estabilidade dos microencapsulados quanto aos fenólicos totais.
................................................................................................................................ 172
Figura 6.56- Estabilidade dos pós quanto à capacidade antioxidante medida
pelos métodos TEAC e ORAC. ............................................................................... 173
xx
LISTA DE TABELAS
Tabela 4.1- Coloração das antocianidinas (TAIZ e ZEIGER, 2004). .............. 40
Tabela 5.1 Matriz do planejamento experimental da extração enzimática. .... 65
Tabela 5.2 - Matriz do planejamento experimental para a extração
hidroetanólica. .......................................................................................................... 67
Tabela 5.3- Matriz experimental para a extração hidroetanólica dos bagaços
industriais. ................................................................................................................. 68
Tabela 5.4 – Pontos axiais complementares do planejamento Composto
Central. ..................................................................................................................... 69
Tabela 5.5- Valores de umidade relativa para as soluções saturadas a 25 °C
(Spiess e Wolf 1987)................................................................................................. 92
Tabela 6.1- Matriz experimental do tratamento enzimático e resultados obtidos
.................................................................................................................................. 99
Tabela 6.2 – Matriz experimental do tratamento hidroetanólico e resultados
obtidos. ................................................................................................................... 101
Tabela 6.3 – Ensaios preliminares de extração com bagaço industrial de Pinot
noir submetido à vinificação em branco. ................................................................. 105
Tabela 6.4- Matriz experimental e resultados obtidos com o planejamento
composto central para o bagaço VB. ...................................................................... 111
Tabela 6.5 – Matriz experimental 2³ e resultados obtidos para o bagaço VT.
................................................................................................................................ 113
Tabela 6.6 – Comparativo entre extração hidroetanólica e aquosa. ............ 114
Tabela 6.7 - Matriz experimental e resultados obtidos para o bagaço de uva
Isabel proveniente da elaboração do suco (SU). .................................................... 116
Tabela 6.8 – Comparativo entre os rendimentos em atividade antioxidante
dos bagaços VB, VT e SU em duas condições de extração. .................................. 123
xxi
Tabela 6.9 – Compostos bioativos e capacidade antioxidante in vitro nas
correntes dos processos de osmose inversa .......................................................... 131
Tabela 6.10 - Compostos bioativos e capacidade antioxidante in vitro nas
correntes da nanofiltração em membrana polimérica. ............................................ 136
Tabela 6.11 – Compostos bioativos e capacidade antioxidante in vitro nas
frações de nanofiltração a 40° C de extrato de baga ço de uva contendo 30% de
etanol. ..................................................................................................................... 140
Tabela 6.12 - Compostos bioativos e atividade antioxidante in vitro nas
correntes da nanofiltração do extrato de bagaço de uva Pinot Noir (VB) – Ensaio 1.
................................................................................................................................ 144
Tabela 6.13 - Compostos bioativos e atividade antioxidante in vitro nas
correntes da nanofiltração do extrato de bagaço de uva Pinot Noir (VB) – Ensaio 2.
................................................................................................................................ 145
Tabela 6.14- Área média dos picos dos cromatogramas das frações
alimentação e retido dos processos com extratos VB. ........................................... 149
Tabela 6.15 – Características físico-químicas das frações da nanofiltração.152
Tabela 6.16 – Compostos bioativos e atividade antioxidante in vitro das
correntes da nanofiltração do extrato de bagaço de uva Chardonnay (VT). ........... 157
Tabela 6.17 – Características físico-químicas das frações da nanofiltração de
extrato hidroetanólico de uva Chardonnay (VT). .................................................... 158
Tabela 6.18 - Compostos bioativos e atividade antioxidante in vitro das
correntes da nanofiltração do extrato de bagaço de uva Isabel (SU) – Processo 1.
................................................................................................................................ 161
Tabela 6.19 -- Compostos bioativos e atividade antioxidante in vitro das
correntes da nanofiltração do extrato de bagaço de uva Isabel (SU) – Processo 2.
................................................................................................................................ 161
Tabela 6.20- Características físico-químicas das frações da nanofiltração de
extrato hidroetanólico de uva Isabel (SU). .............................................................. 163
Tabela 6.21 – Coeficientes dos ajustes das isotermas segundo os modelos de
BET e GAB. ............................................................................................................ 166
xxii
Tabela 6.22 Medida de cor dos microencapsulados no ponto inicial e final do
estudo de estabilidade. ........................................................................................... 171
Tabela 9.1 – Investimento para a produção de microencapsulados de extrato
de bagaço de uva. .................................................................................................. 199
Tabela 9.2 – Custos operacionais fixos e variáveis para a produção do
micorencapsulado de bagaço de uva VB. ............................................................... 200
Tabela 9.3– Investimento para a produção de microencapsulados de extrato
de bagaço de uva VT .............................................................................................. 201
Tabela 9.4 – Custos operacionais fixos e variáveis para a produção do
micorencapsulado de bagaço de uva V. ................................................................. 202
xxiii
LISTA DE ABREVIATURAS
ABTS Ácido 2,2 azinobis (3-etilbenzotiazolina-6-sulfônico) diamônio
AUC Area Under Curve
BE Bagaço obtido experimental
BHA Butil-hidroxi-anisol
BHT Butil-hidroxi-tolueno
COX Ciclooxigenase
DE Dextrose equivalente
ER Espécies reativas
GE Grau de esterificação
PAL Fenilalanina amônia liase
PG Galato de propila
SU Bagaço de uva Isabel empregada na elaboração de suco de uva
TBHQ Terc-butilhidroquinona
TROLOX Ácido 6-hidroxi-2-5-7-8-tetrametilcromo2-carboxílico
VB Bagaço de uva Pinot Noir vinificada em branco
VT Bagaço de uva Chardonnay submetida à vinificação tinta
xxiv
SUMÁRIO
RESUMO ......................................................................................................... x
ABSTRACT ..................................................................................................... xii
LISTA DE FIGURAS ...................................................................................... xiv
LISTA DE TABELAS ....................................................................................... xx
LISTA DE ABREVIATURAS ......................................................................... xxiii
1. INTRODUÇÃO ........................................................................................ 1
2. JUSTIFICATIVA ...................................................................................... 3
3. OBJETIVOS ............................................................................................ 4
3.1. Objetivo geral ................................................................................... 4
3.2. Objetivos específicos ........................................................................ 4
4. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA .................................................................... 5
4.1. Uva e seus resíduos ......................................................................... 7
4.1.1. Aspectos botânicos da uva ............................................................ 7
4.1.2. Processamento da uva .................................................................. 8
4.1.3. Resíduos gerados pela vitivinicultura e potenciais de valorização
......................................................................................................13
4.2. Compostos bioativos de uvas e seus resíduos ............................... 26
4.2.1. Não flavonoides ........................................................................... 29
4.2.2. Flavonoides ................................................................................. 34
4.2.3. Relevância dos compostos fenólicos ........................................... 45
4.3. Processos de separação por membranas ...................................... 50
4.4. Secagem por spray drying .............................................................. 56
5. MATERIAL E MÉTODOS ...................................................................... 63
xxv
5.1. Matéria prima .................................................................................. 63
5.2. Procedimento Experimental ............................................................ 64
5.2.1. Seleção dos parâmetros operacionais da etapa de extração ...... 64
5.2.2. Determinação da melhor condição de extração – resíduos
industriais ......................................................................................................67
5.2.3. Cinética da extração .................................................................... 69
5.2.4. Eficiência da extração ................................................................. 70
5.2.5. Extração em escala piloto ........................................................... 71
5.2.6. Concentração por membranas .................................................... 72
5.2.7. Remoção do etanol por evaporação a vácuo .............................. 81
5.2.8. Microencapsulação ...................................................................... 81
5.3. Métodos analíticos .......................................................................... 84
5.3.1. Determinação da atividade antioxidante pelo método ABTS
expresso em Trolox Equivalent Antioxidant Capacity (TEAC) ............................ 84
5.3.2. Determinação da atividade antioxidante pelo método ORAC
expresso em Trolox Equivalent Antioxidant Capacity (TEAC). ........................... 85
5.3.3. Antocianinas totais e monoméricas ............................................. 86
5.3.4. Identificação das antocianinas monoméricas por CLAE .............. 88
5.3.5. Compostos fenólicos totais por Folin-Ciocalteu ........................... 88
5.3.6. Cor instrumental .......................................................................... 89
5.3.7. pH ................................................................................................ 90
5.3.8. Sólidos solúveis (ºBrix) ................................................................ 90
5.3.9. Acidez titulável total ..................................................................... 90
5.3.10. Sólidos totais ............................................................................. 90
5.3.11. Densidade aparente .................................................................. 90
5.3.12. Determinação do teor de etanol ................................................ 91
5.3.13. Determinação da espessura dos bagaços ................................ 91
xxvi
5.3.14. Isotermas de sorção .................................................................. 91
5.4. Avaliação estatística ....................................................................... 93
6. RESULTADOS E DISCUSSÃO ............................................................ 95
6.1. Seleção dos parâmetros operacionais da etapa de extração ......... 95
6.1.1. Extração enzimática aquosa........................................................ 95
6.1.2. Extração hidroetanólica ............................................................. 100
6.2. Determinação da melhor condição de extração – Bagaços
industriais .......................................................................................................106
6.2.1. Bagaço de uva tinta Pinot noir resultante da vinificação branca
(VB) ....................................................................................................106
6.2.2. Bagaço de uva branca Chardonnay resultante da vinificação tinta
(VT) ....................................................................................................112
6.2.3. Bagaço de uva tinta Isabel oriundo da fabricação do suco de uva
(SU) ....................................................................................................115
6.3. Cinética da extração ..................................................................... 123
6.4. Eficiência da extração ................................................................... 127
6.5. Concentração dos extratos por processos de separação por
membranas .......................................................................................................129
6.5.1. Testes preliminares ................................................................... 129
6.5.2. Concentração dos extratos industriais ....................................... 142
6.6. Secagem e microencapsulação dos extratos concentrados na
nanofiltração e sem etanol por Spray Drying ....................................................... 164
7. CONCLUSÕES E CONSIDERAÇÕES FINAIS ................................... 175
8. BIBLIOGRAFIA ................................................................................... 177
9. ANEXOS ............................................................................................. 194
1
1. INTRODUÇÃO
O suprimento mundial de alimentos apresenta exigência crescente por um
melhor aproveitamento dos recursos naturais, de forma a acompanhar o crescimento
populacional. De acordo com a FAO, perde-se cerca de um terço dos alimentos
produzidos mundialmente, e neste sentido o melhor aproveitamento dos alimentos
por meio de produção integrada mais eficiente em um mundo com recursos naturais
finitos não deve ser uma prioridade negligenciada (GUSTAVSSON et al., 2011).
Além de apresentar implicações econômicas diretas, o melhor aproveitamento dos
alimentos está estreitamente ligado aos impactos ao meio-ambiente. Desta forma, a
investigação de alternativas tecnológicas com vistas a agregar valor a resíduos
agroindustriais pode contribuir para reduzir seu volume e/ou os custos para seu
descarte apropriado.
Enquanto nas décadas de 70 e 80 havia maior preocupação com a
preservação da água e do ar, respectivamente, na de 90 a atenção voltou-se para os
resíduos (KRAEMER). A partir de então têm surgido diretrizes, pesquisas e
posteriormente leis incisivas quanto à destinação dos resíduos e punição nos casos
de não cumprimento da legislação. Uma das consequências foi a criação das
diretrizes europeias para a destinação final de resíduos que determina para 2020 um
volume máximo correspondente a 35% do volume gerado em 1995. Além de
diretrizes gerais (lei espanhola n° 10/1998; lei br asileira nº 12.305/2010), foram
criados acordos setoriais que dispõem sobre a destinação específica de resíduos da
vinicultura, tais como Regulamentos do Conselho Europeu EC 1493/1999 e EC
479/2008 (BRASIL, 2010; DEVESA-REY et al., 2011; BUSTAMANTE et al., 2008).
Uma vez que a legislação brasileira na área de resíduos agroindustriais está no
geral alinhada à União Européia, é possível que no futuro surjam leis específicas
para a vitivinicultura brasileira. As penalidades e multas associadas à má destinação
e ao não desenvolvimento de soluções ambientalmente sustentáveis vêm
favorecendo as ações de responsabilidade compartilhada dos resíduos e
desestimulando os estabelecimentos a permanecerem como “poluidor-pagadores”
(DEVESA-REY et al., 2011).
A “produção verde” pode ser atingida a partir da aplicação de diversas ações
estratégicas, destacando-se o aproveitamento dos co-produtos gerados e as
modificações na planta de produção como algumas das mais promissoras. Além do
2
aproveitamento da água de distintas etapas do processo, os resíduos vegetais
despertam o interesse pela diversidade de aplicações possíveis, que vão desde a
recuperação de compostos de interesse até a utilização dos resíduos como matéria
prima para elaboração de produtos de maior valor agregado, tais como antibióticos,
enzimas, gomas especiais, biocombustíveis, dentre outros (KOSSEVA, 2009).
A indústria de alimentos gera grande quantidade de subprodutos e resíduos
que podem conter substâncias de elevado valor nutricional e funcional. Além disso, o
descarte desses resíduos apresenta graves limitações ambientais, causadas pelas
elevadas demandas química e bioquímica de oxigênio, que impõem a necessidade
de tratamentos de elevado custo operacional. A uva, por sua vez, é uma das frutas
mais cultivadas no mundo, com cerca de 68 milhões de toneladas, com
aproximadamente 57% da sua produção destinada à fabricação de vinhos, sucos e
derivados (MELLO, 2012a). O Brasil em 2010 foi o 13° maior produtor de vinho e 10°
maior exportador mundial de suco de uva e, de acordo com dados da safra de 2011,
aproximadamente 836 mil toneladas de uvas foram processadas (MELLO, 2012b).
Considerando que o bagaço, principal resíduo gerado, representa de 12 a 15% do
peso da uva processada e que as indústrias gaúchas processam 90% da safra
nacional, estima-se que em 2011 foram gerados cerca de 100 mil toneladas de
bagaço entre os meses de janeiro e março (IBRAVIN, 2011).
O bagaço apresenta características poluentes, mas também uma composição
rica em fibras e compostos bioativos, permitindo seu aproveitamento para um fim
nobre aliando ganhos ambientais, econômicos e sociais. Os bioativos majoritários
são os compostos fenólicos cuja distribuição média na uva é de 84% na semente,
15% na casca e 1% na polpa (PASTRANA-BONILLA et al., 2003). O interesse na
recuperação destes compostos deve-se às propriedades plurifarmacológicas
(SOOBRATTEE et al., 2005) e tecnológicas como ingredientes funcionais, aditivos
naturais, dentre outras, as quais em sua maioria estão associadas à atividade
antioxidante.
3
2. JUSTIFICATIVA
O Brasil é o terceiro maior produtor mundial de frutas, consumidas in natura e
processadas. A uva é uma das frutas mais cultivadas no mundo e o Brasil
atualmente destaca-se como o décimo primeiro produtor mundial (FAOSTAT, 2011).
Durante o processamento, efluentes e resíduos são gerados e estima-se que para
as frutas e vegetais, a quantidade de resíduos corresponda de 10 a 60% da matéria-
prima processada (EIPESON e RAMTEKE, 2003). Em 2011, aproximadamente 836
mil toneladas de uva foram processadas, gerando diversos resíduos dentre os quais
se estima que só de bagaço tenha sido em torno de 134 mil toneladas. O descarte
desses resíduos apresenta graves limitações ambientais, causadas pelas elevadas
demandas química e bioquímica de oxigênio, que impõem a necessidade de
tratamentos de elevado custo operacional. Por outro lado, a composição rica em
nutrientes e compostos funcionais tem direcionado o aproveitamento destes co-
produtos como uma alternativa potencial. A legislação ambiental cada vez mais
rigorosa também favorece a destinação dos co-produtos para diversos fins
diminuindo a quantidade a ser descartada. Na Europa os custos com o não
tratamento dos resíduos das vinícolas podem atingir valores da ordem de 30 a 40 mil
euros/mês (DEVESA-REY et al., 2011). Embora no Brasil as penalidades possam
não atingir estes valores, observa-se a tendência de seguir a legislação europeia
com relação à questão ambiental. Neste âmbito, em 2010 foi promulgada a Lei
12.305 (BRASIL, 2010) que obriga a implantação de um plano de gerenciamento de
resíduos pelas empresas bem como definição de metas e procedimentos
relacionados à minimização dos mesmos. Esta lei também prevê penalidades
diversas para o não cumprimento, que incluem penalidades administrativas e
criminais. Diante do exposto acima, da perspectiva de ampliar a oferta destes co-
produtos, e da necessidade de destinação e tratamento dos mesmos para atender
as legislações vigentes, o presente trabalho objetivou estudar o aproveitamento do
bagaço de uva quanto aos compostos bioativos.
4
3. OBJETIVOS
3.1. OBJETIVO GERAL
Extrair, concentrar e desidratar compostos bioativos obtidos a partir de
bagaços provenientes da fabricação do suco de uva e dos processos de vinificação
tinta e branca.
3.2. OBJETIVOS ESPECÍFICOS
• Determinar a melhor condição de extração de compostos bioativos
presentes nos bagaços, tendo como critérios de escolha a atividade
antioxidante e os teores de compostos fenólicos e antocianinas totais;
• Determinar a cinética da extração dos compostos bioativos nas diferentes
matrizes avaliadas;
• Extrair, em escala piloto, os compostos bioativos presentes nos bagaços
na melhor condição de extração determinada anteriormente;
• Avaliar os processos de nanofiltração e osmose inversa para a
concentração dos extratos quanto aos compostos bioativos;
• Caracterizar os extratos e os concentrados obtidos quanto às suas
propriedades físico-químicas, bem como à sua capacidade antioxidante in
vitro;
• Avaliar a microencapsulação por spray drying para obtenção de pós com
altos teores de bioativos do resíduo da uva;
• Avaliar a estabilidade dos compostos bioativos nos microencapsulados;
• Determinar as isotermas de sorção das microcápsulas.
5
4. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
A uva é uma das frutas mais cultivadas no mundo e as primeiras variedades
introduzidas no Brasil pelos portugueses em 1535 foram de uvas finas da espécie
Vitis vinifera, destinadas à elaboração de vinhos e ao consumo in natura. Dentre as
cultivares brancas tem-se a Chardonnay, Moscato Branco, Moscato Canelli,
Proseco, Riesling Itálico e dentre as tintas a Pinot Noir, Cabernet Sauvignon,
Cabernet Franc, Merlot, entre outras (GUERRA et al., 2009). No entanto, a viticultura
brasileira se firmou comercialmente com o cultivo de uvas americanas em especial a
cultivar Isabel (Vitis labrusca) pelos imigrantes italianos em meados de 1860
(CAMARGO et al., 2010). Somente a partir do século XX, o cultivo de uvas
europeias se consolidou comercialmente para a produção dos primeiros vinhos
varietais ou finos, aqueles produzidos exclusivamente com estas variedades.
Tecnologias de produção de uvas e elaboração de vinhos têm contribuído para a
consolidação e expansão, inclusive geográfica, deste mercado. Foi a partir de 1950
que as regiões emergentes como o Vale do Submédio do São Francisco (Bahia e
Pernambuco), norte do Paraná, noroeste Paulista e norte de Minas Gerais iniciaram
o cultivo da uva. Por ser atualmente cultivada em regiões de climas temperado,
subtropical e tropical, a uva é oferecida o ano todo (GUERRA et al., 2009;
CAMARGO et al., 2011).
Pesquisas para o desenvolvimento de novas cultivares e a difusão dessas
castas mais adaptadas ou com características mais interessantes, progressos no
cultivo, expansão geográfica da viticultura, assim como a implantação de sistema de
produção integrada, certificações de localização geográfica e indicação de
procedência foram algumas das ações do setor vitivinícola que auxiliaram e vem
contribuindo para a consolidação e crescimento desta atividade econômica para o
Brasil (CAMARGO et al., 2011) que ocupou o 14° luga r no ranking mundial de
produtores de uva em 2010 (MELLO, 2012b). A grande diversidade climática e
geográfica da viticultura atual no Brasil (Figura 4.1) permite a produção de uvas e
produtos derivados ao longo de todo o ano e com tipicidade distintas, pois são mais
de 160 cultivares entre as espécies Vitis vinífera, Vitis labrusca, Vitis bourquina e
híbridas. (CAMARGO et al., 2011; GUERRA et al. 2009). As adaptações das
variedades às condições edafoclimáticas e de produção das distintas áreas
cultivadas propiciam a síntese de compostos fenólicos que, por sua vez, têm gerado
6
vinhos com teores de antioxidantes similares e até superiores às concentrações
médias desses compostos para os mesmos vinhos de outros países. Entretanto
poucas pesquisas e patentes foram geradas sobre os antioxidantes dos cultivares
produzidos em solo brasileiro e, dentre elas, duas uvas, Cabernet Sauvignon e
Merlot, concentram 50% das pesquisas (OLIVEIRA et al. 2012).
Embora a Europa ainda seja o maior produtor de uvas e vinhos do mundo,
tem-se observado uma redução em sua área cultivada o que vem impactando na
produção, com redução de 26,41% e 22,16%, respectivamente, no triênio 2008/2010
em relação ao triênio 1990/1992. No mesmo período observou-se um aumento tanto
na área plantada como na produção nos continentes americano e asiático, com
grande destaque para a Ásia, que no triênio 1990/92 produzia 16,65% do total de
uvas e no triênio 2008/2010 passou a produzir 30,01%, aproximadamente 20,37
milhões de toneladas (MELLO, 2012b). Mesmo sendo consumida in natura, grande
parte da produção é destinada ao processamento. Estima-se que 57% da safra
mundial de 2007 tenha sido processada e aproximadamente 26,35 milhões de
toneladas de vinhos tenham sido produzidos (MELLO, 2009).
Figura 4.1 – Infográfico, indicando os polos da viticultura brasileira, nos principais estados produtores
de uvas para processamento: uvas finas (A); uvas de mesa (B) (CAMARGO et al.,
2010).
A B
7
No Brasil a área plantada de videiras é de 81.915 hectares dos quais 50 mil
encontram-se no Rio Grande do Sul e, mesmo tendo ocorrido uma diminuição de
quase 2% na área cultivada de 2008 para 2011, a safra no mesmo período
aumentou aproximadamente 4,6% (MELLO, 2012a). Em 2011, observou-se que
além do aumento da safra, que atingiu 1,46 milhões de toneladas, o perfil de
distribuição também se alterou, com 57,13% da safra destinada à elaboração de
vinhos, sucos e derivados, superando a safra de 2008 (MELLO, 2012a) igualando-se
ao perfil mundial de 2007. E embora o Brasil não figure entre os três maiores
produtores de uvas, sucos e vinhos, a vitivinicultura de vinhos finos é uma atividade
comercial importante para as regiões Sul e Nordeste (GUERRA et al., 2009). O Rio
Grande do Sul é o principal estado produtor de sucos, vinhos e derivados da uva,
sendo responsável por cerca de 90% da produção nacional, que em 2011 foi de
578,81 milhões de litros (IBRAVIN, 2011).
4.1. UVA E SEUS RESÍDUOS
4.1.1. Aspectos botânicos da uva
A videira botanicamente é classificada em arbusto sarmentoso e trepador da
família Vitaceae gênero Vitis, subgêneros: Euvitis e Muscadinia, com
aproximadamente 62 e 3 espécies, respectivamente. A espécie Muscadinia cultivada
no Brasil é a Vitis rotundifolia, enquanto que do subgênero Euvitis destacam-se as
espécies Vitis vinífera conhecida como uva europeia ou fina e as espécies Vitis
labrusca e Vitis bourquina denominadas uvas americanas ou rústicas (CAMARGO et
al., 2010). Diversas variedades destas espécies são cultivadas no mundo, estima-se
que existam em torno de 5.000 variedades Vitis vinífera e 2.000 Vitis labrusca além
dos híbridos.
O fruto da uva apresenta-se em bagas com formas variadas, esférica, ovóide,
alongada, globosa, oval, e outras, confirmando sua definição como “berry”. De
acordo com a variedade a baga pode apresentar-se em tonalidades que vão de
esverdeada, amarelada, rosado, vermelho, roxo e preta-azulada. Quando a polpa
também é tinta, denomina-se uva tintórea ou tintureira. As bagas apresentam-se
dispostas em cachos sustentados por uma estrutura herbácea ligno-celulósica
8
denominada engaço (Figura 4.2) e podem conter até quatro sementes (TECCHIO et
al., 2010).
Figura 4.2 – Cacho de uva tinta (alto), engaço (direita) e baga das uvas (esquerda) e as classificação
botânica de suas principais estruturas (TECCHIO et al., 2010).
A baga constitui-se geralmente de epicarpo e sementes. O epicarpo pode ser
subdividido em epicarpo e endocarpo, o primeiro vulgarmente denominado casca
representa de 5 a 12% do peso da baga, enquanto que o endocarpo ou polpa 64-
90%. As sementes constituem mais de 10% do peso das bagas (GURAK et al.,
2012).
4.1.2. Processamento da uva
Por ser um fruto não climatérico a vindima deve ser rapidamente processada
para evitar perdas e assim tornar possível o abastecimento do mercado ao longo do
ano, sendo as bebidas, vinhos e sucos, os principais produtos derivados de uva
produzidos no Brasil. Embora existam diferenças significativas nos processos
Almofada
Pedúnculo
Pericarpo
Epicarpo
Endocarpo
Almofada
Sementes
Umbigo
Engaço
Baga
9
produtivos do suco e vinhos tinto e branco, diversos resíduos como sarro, borra,
engaço, bagaço e outros são gerados e correspondem a cerca de 16% do peso total
da fruta processada (SILVA, 2003; MARZAROTTO, 2005).
O Brasil vem mantendo um crescimento anual de sua produção de suco de
uva, que atualmente corresponde a 32,4% do volume total de bebidas de uva
produzidas, embora os vinhos de mesa ainda sejam os de maior volume,
correspondendo a 44,5%. Já os vinhos finos, que tiveram a produção prejudicada
em 2010 por fatores climáticos, apresentaram um aumento em torno de 92% em
2011 atingindo um volume total de 47,59 milhões de litros (MELLO, 2012a). Os
sucos são elaborados com uvas americanas e híbridas, enquanto os vinhos finos
são obtidos exclusivamente com uvas Vitis vinífera. No Brasil, os vinhos de mesa
são elaborados principalmente com variedades das espécies Vitis labrusca e Vitis
bourquina (GUERRA et al., 2009).
As cultivares tradicionalmente empregadas na elaboração dos sucos são
Concord, Isabel e Bordô, porém novas cultivares como BRS Rúbea, Isabel Precoce,
BRS Violeta, Concord clone 30 e BRS Carmen lançadas pela Embrapa Uva e Vinho
também estão sendo empregadas e permitindo aumentar o período de safra em 25
dias. As cultivares BRS Rúbea e BRS Violeta assim como a Bordô são tintureiras,
com elevado teor de pigmentos antociânicos. Os sucos são normalmente elaborados
com misturas de cultivares para se atingir a qualidade desejada, principalmente
quanto às características organolépticas de aroma, sabor e cor (CAMARGO et al.,
2010). Os sucos, assim como os vinhos, são classificados em branco, tinto e rosado
em função da cor e em relação à forma são denominados de integral, adoçado,
concentrado, desidratado e reconstituído (BRASIL, 1990), sendo o integral a base
para os demais.
As uvas destinadas à elaboração de vinhos devem apresentar teores de
sólidos solúveis elevados para garantir a graduação etílica necessária pela
transformação dos seus açúcares pela levedura; para um mínimo de 12 ºGL, são
necessários pelos menos 22º Brix. Porém, como em alguns países as condições não
favorecem o acúmulo de açúcares na uva madura, é permitida a chaptalização, que
consiste na adição de açúcar após a obtenção do mosto (GUERRA e BARNABÉ,
2005). Dentre as variedades usadas para a elaboração de vinhos finos no Brasil
destacam-se, entre tintas e brancas: Cabernet Franc e Sauvignon; Merlot, Pinotage,
10
Pinot noir, Syrah, Tannat, Chardonnay, Malvasia Bianca, Moscato Branco, Moscato
Canelli, Proseco e Riesling Itálico (GUERRA et al., 2009)
Os vinhos podem ser classificados em branco, tinto e rose quanto à cor e com
relação à enologia em tranquilos, espumantes, licorosos e compostos. Os vinhos
tranquilos compreendem os de mesa, finos e leves com no máximo 1 atm de
pressão de gás carbônico; os espumantes caracterizam-se pela presença de
anidrido carbônico que pode variar de no mínimo 1,1 atm para os frisantes e acima
de 4 atm nos espumantes natural e moscato (GUERRA e BARNABÉ, 2005).
Um diagrama simplificado dos processos de obtenção das bebidas e resíduos
gerados é apresentado na Figura 4.3. Independentemente da bebida a ser
produzida, as uvas são desengaçadas e depois esmagadas. O engaço é o primeiro
resíduo gerado e representa de 3 a 6% da uva (PING et al., 2011b).O esmagamento
é suave de modo a romper as bagas sem dilacerar as sementes evitando que alguns
compostos sejam transferidos para o mosto. As sementes e o engaço apresentam
de 6 a 7% de taninos (PING et al., 2011a; ROCKENBACH et al. 2011) e estes
compostos, por conferirem adstringência e amargor além de serem capazes de
precipitar proteínas (SHAHIDHI e NAZCK, 1995), são indesejáveis quando em
excesso.
A principal diferença entre os processos de vinificação em tinto e em branco é
a etapa de fermentação alcoólica (Figura 4.3), na qual as leveduras adicionadas ao
mosto transformarão os açúcares em etanol e subprodutos. Na vinificação em tinto,
as bagas esmagadas seguem com o mosto para a fermentação que pode durar de
quatro a seis dias, enquanto que na vinificação em branco, o bagaço é removido
logo após o esmagamento (GUERRA et al., 2009). Em alguns casos, o vinho segue
para a fermentação malolática, transformação do ácido málico em lático. E após as
etapas de fermentação, trasfegas são realizadas, ou seja, o vinho é transferido de
um recipiente para outro, de modo a remover os sólidos insolúveis. Nesta etapa dois
outros resíduos são recuperados, a borra, massa heterogênea composta
basicamente de vinho (70 a 90%) e sólidos insolúveis como sais de tartarato (2,5 a
4%), e o sarro, material sólido mais resistente que permanece incrustrado nos
recipientes contendo quase 80% de substâncias tartáricas (SILVA,2003). O vinho
ainda segue para a maturação, estabilização, filtração e envelhecimento antes de
ser envasado.
11
Figura 4.3- Diagrama resumido dos processos de elaboração de sucos e vinhos e os respectivos
resíduos gerados. Adaptado de: Marzarotto (2005); Brazinha e Crespo (2010) e Pérez-
Serradilla e Luque de Castro (2008).
12
Dentre os processos de obtenção do suco, destacam-se o Flanzy em que a
extração é auxiliada pelo insuflamento de SO2 e o método Welch cuja extração se dá
por aquecimento (MARZAROTTO, 2005; GUERRA e BARNABÉ, 2005), que
favorece a extração dos compostos fenólicos (FULEKI e RICARDO-DA-SILVA,
2003). Devido à baixa qualidade do suco e aos riscos operacionais do uso de SO2, o
método Welch é o mais empregado atualmente.
Previamente à maceração o mosto é submetido a um tratamento térmico ou
sulfitação para inativação das enzimas endógenas, principalmente polifenoloxidases
e pectinametilesterase, e diminuir a carga microbiana que pode comprometer a
qualidade e inocuidade do suco. A maceração, que pode ser auxiliada pela adição
de enzimas pécticas, é a etapa de diferenciação para a elaboração de sucos branco,
rosado e tinto. Nos dois primeiros, a maceração não é auxiliada pelo aquecimento e
quando se empregam uvas tintóreas, a prensagem ocorre logo após o
esmagamento (GUERRA e BARNABÉ, 2005). Já para a obtenção do suco tinto, o
mosto com as cascas segue para o aquecimento e maceração com enzimas
pectinolíticas, que irão facilitar a extração de aromas e pigmentos. A temperatura
pode variar principalmente em decorrência das características da preparação
enzimática utilizada assim como o tempo em função das condições da uva e
variedade (CIOTA, 2007).
A obtenção do suco propriamente dito ocorre por prensagem, separando-se
então o suco do material sólido – bagaço. Não se recomenda o uso de roscas sem
fim de modo a evitar o rompimento das sementes. A filtração é auxiliada com nova
dose de enzimas pécticas, pois além da precipitação destas pelos taninos presentes
no suco, quantidades significativas de pectina também são liberadas da casca para
o suco dificultando a filtração e envase (MARZAROTTO, 2005).
A etapa de clarificação, remoção dos sólidos em suspensão pela
centrifugação do suco com ou sem o auxílio de agentes floculantes, é essencial para
a estabilização tartárica, na qual os sais de tartarato são removidos (MARZAROTTO,
2005). A borra removida na etapa de clarificação do suco é constituída de sais
tartáricos e substâncias diversas como proteínas, tanino, fosfatos, sulfatos e outros
(SILVA, 2003). O suco pode ser ainda pasteurizado, caso siga para consumo como
suco integral ou como ingrediente na elaboração de outros produtos. No Brasil,
13
grande parte do suco de uva produzido é concentrada para diminuir custos com
transporte e armazenagem.
4.1.3. Resíduos gerados pela vitivinicultura e potenciais de valorização
Os resíduos do processamento da uva são diversos e gerados em grandes
volumes. Estima-se que para cada 100 litros de vinho branco são gerados 31,7 kg
de subprodutos enquanto que para o vinho tinto, 25 kg (COSTA e BELCHIOR, 1972
apud SILVA, 2003), sendo aproximadamente 20 e 15 kg de bagaço,
respectivamente (CAMPOS, 2005). O bagaço da uva é constituído de casca,
semente e engaço, podendo ou não conter etanol e apresenta em sua composição
compostos com atividade antioxidante, fibras, proteínas e alguns ácidos graxos.
Além da grande quantidade de resíduos gerados, estes são produzidos
durante um curto espaço de tempo e apresentam características poluentes como o
baixo pH e elevados teores de compostos fenólicos, antibacterianos e fitotóxicos,
que dificultam sua aplicação direta na resistem à degradação biológica
(BUSTAMANTE et al., 2008) tornando-se um problema ambiental a ser resolvido.
Um acordo da União Europeia obriga as vinícolas a destinar o bagaço e as
borras para as destilarias que, por sua vez, irão gerar outros dois resíduos, o bagaço
exaurido e a vinhaça (BUSTAMANTE et al., 2008). Entretanto, no Brasil, para evitar
o acúmulo destes subprodutos, algumas vinícolas doam os resíduos, que são
empregados como ração animal e adubo de vinhedos. Esta não é uma prática
realizada por todos e nem garante o melhor destino para estes resíduos.
Na Europa, ações efetivas de valorização dos co-produtos e a redução no
volume de resíduos aconteceram a partir de 2000, com penalidades e multas mais
severas (DEVERSA-REY et al., 2011). Assim, espera-se que o panorama nacional
mude fortemente com as legislações ambientais cada vez mais fortes, como a lei de
crimes ambientais, a política nacional de resíduos e as normas estaduais e
municipais.
A Lei 12.305/2010, que instituiu a política nacional de resíduos, impõe à
instituição geradora um plano de gerenciamento dos resíduos como parte para a
obtenção do licenciamento ambiental, que deve conter metas e procedimentos
relacionados à minimização da geração, reutilização, reciclagem, compostagem,
14
aproveitamento energético, dentre outros, prevendo a responsabilidade
compartilhada e soluções consorciadas (BRASIL, 2010). Desta forma, espera-se que
as indústrias se adequem e implementem soluções mais ambientalmente viáveis e
juntamente com todas as instâncias da sociedade estabeleçam padrões
sustentáveis de produção e consumo. As mudanças começam a surgir, ainda que de
forma tímida, como o teste piloto da Vinícola Aurora de aproveitamento do engaço e
bagaço para fins energéticos com a safra de 2013 (OLIVEIRA, 2012).
A compostagem vem sendo usualmente sugerida como opção de destinação
dos resíduos vegetais (KOSSEVA, 2009), não sendo diferente para os co-produtos
da vinificação, como sugerido por Bustamante et al. (2008) para um melhor
aproveitamento dos recursos pelos vegetais. A co-compostagem também foi
sugerida por Bertran et al. (2004), empregando o sarro e o engaço para a obtenção
de matéria orgânica e potássio. Outros autores sugerem ainda a obtenção de
substrato para plantas a partir da mistura de resíduos como o bagaço, brotos de
parreiras, borra, vinhaça e bagaço hidrolizado (BUSTAMANTE et al., 2009; DÍAZ et
al., 2002).
Diante do panorama mundial que vem cobrando mais ações dos
estabelecimentos geradores, estimulando a gestão integrada, os resíduos da
indústria de alimentos são vistos atualmente como fonte barata e interessante para
recuperação de compostos valiosos (KOSSEVA, 2009). Embora as pesquisas de
aproveitamento de co-produtos da uva sejam amplas e a destinação tradicional
esteja sendo revista, o foco atual é a recuperação de compostos de maior valor
agregado. Os compostos de interesse desses co-produtos são os sais de tartarato,
leveduras e bioativos, basicamente compostos fenólicos, com variação qualitativa e
quantitativa decorrente de diversos fatores como cultivar, clima, solo, processo a que
foi submetido, dentre outros.
4.1.3.1. Borra e Sarro
A borra e o sarro representam de 5 a 8% do volume de vinho dependendo do
processo e devido à composição rica em substâncias tartáricas e o elevado teor de
etanol, o aproveitamento mais comum é a recuperação de sais de tartarato para a
produção do ácido tartárico e “cremor tártaro”, além da recuperação do álcool vínico
15
que após a destilação pode atingir 96° GL (TEIXEIRA et al., 2008). O sarro, por ser
um material mais duro aderido às paredes dos recipientes, tem sua recuperação
auxiliada por água quente ou vapor.
Ciota (2007) avaliou a composição química da borra obtida durante a
fabricação do suco de uva e sugeriu a correção com calcário antes da utilização
como adubo devido ao baixo pH encontrado. Além do baixo pH, Bustamante et al.
(2008) encontraram baixos teores de micronutrientes e consideráveis teores de
compostos fenólicos (1,2 a 16,3 g.kg-1) na borra e no sarro, que podem comprometer
a aplicação desses resíduos como fertilizantes quando aplicados diretamente no
solo e, por isso, sugerem a co-compostagem como alternativa para superar esses
efeitos negativos (BUSTAMANTE et al., 2008).
A borra é rica em compostos nitrogenados, inorgânicos e orgânicos e, embora
para a ração animal este apresente um valor nutricional muito pobre o mesmo não
ocorre para os microorganismos. Considerando que o meio fermentativo pode
representar até 30% do custo total do processo, Bustos et al. (2004a) testaram a
borra sem tratamento prévio e a combinação desta com licor de milho conseguindo
rendimentos similares aos obtidos com o meio convencional contendo extrato de
levedura e peptona para a produção de ácido lático por diversas cepas de
Lactobacillus.
Outra possibilidade de aproveitamento desses co-produtos é a recuperação
de compostos fenólicos, que por apresentarem, em geral, propriedades
antinutricionais limita sua utilização como ração animal. Pérez-Serradilla e Luque-de-
Castro (2011) avaliaram a extração dos compostos fenólicos da borra e verificaram
que a extração facilitada em microondas permitiu rendimentos similares à extração
convencional com borra seca e triturada e ainda com maior taxa de difusão. Wu et
al. (2009) verificaram o efeito positivo do teor de etanol sobre o rendimento da
extração dos fenólicos da borra, na extração por fluído supercrítico. Estes autores
encontraram uma forte correlação entre os compostos fenólicos extraídos e a
atividade de anti-tirosinase. Este fato sugere uma importante aplicação para o
extrato, uma vez que estudos têm demonstrado a relação da tirosinase com mal de
Parkinson e alguns tipos de câncer (ASANUMA et al., 2003; SLOMINSKI et al.
2004).
16
4.1.3.2. Bagaço exaurido e vinhaça
Devido ao grande volume de resíduos gerados em curto espaço de tempo e
suas características, foi criado o regulamento europeu 1943 em 1999, pelo qual as
vinícolas são obrigadas a enviarem o bagaço e a borra às destilarias de álcool, para
a recuperação do etanol e tartarato de cálcio, e com isso geram-se outros dois
novos co-produtos, o bagaço exaurido e a vinhaça. Alguns estudos vêm sendo
realizados para um melhor aproveitamento destes últimos.
A vinhaça é o efluente da destilação, constituída de altos teores de sólidos,
em especial leveduras mortas, casca, semente e polpa de uva. Dentre as
alternativas de valorização da vinhaça pode-se citar a recuperação de ácido tartárico
(SALGADO et al., 2010), aplicação para o controle de fungos com 100% de
supressão do crescimento do Fusarium oxysporum (SANTOS et al., 2008), utilização
como substrato para a produção de ácido lático e xilitol (SALGADO et al., 2010; LIU
et al., 2010) e obtenção de biomassa rica em proteína para uso como ingrediente na
ração de peixes (NITAYAVARDHANA e KHANAL, 2010).
O bagaço exaurido, por sua vez, pode ser seco e fracionado e, segundo
Teixeira et al. (2008), servir de combustível para os fornos e geração de vapor para
alimentar a unidade industrial ou ainda serem ensacados e vendidos como material
orgânico para plantas. Esse resíduo pode ainda seguir para a compostagem
(BUSTAMANTE, MORAL et al., 2008), pirólise (ENCINAR et al., 1996) ou como
coadjuvante para o tratamento ambiental adsorvendo metais pesados (FARINELLA
et al., 2007).
4.1.3.3. Engaço
O engaço e o broto de parreira são resíduos lignocelulósicos que não
sofreram transformação alguma, apenas foram removidos em alguma etapa do
processo. Os galhos de parreiras usualmente empregados como fertilizantes
mostraram-se boas fontes de trans-resveratrol e trans-ε-viniferina, 2 e 5 mg.g-1 (base
seca) respectivamente, sendo estes fenólicos compostos bioativos de relevante
interesse por suas propriedades nutracêutica, farmacêutica e fitopatogênica já
descritas na literatura (RAYNE et al., 2008). O engaço, como mencionado
anteriormente, representa de 3 a 6% do peso total da uva e é constituído
17
basicamente de fibras, cujo percentual varia muito entre os cultivares, de 60 a 90%
em base seca (GONZÁLEZ-CENTENO et al., 2010).
De acordo com Ping et al. (2011b), o engaço é constituído de
aproximadamente 36% celulose, 34% lignina, 24% hemicelulose e 6% taninos
condensados, especialmente do tipo procianidina. Os taninos condensados são
polímeros de flavan-3-ol incolores que ao serem submetidos ao aquecimento e
hidrólise ácida liberam unidades de antocianidinas (SUN e SPRANGER, 2005), que
são pigmentos responsáveis pela coloração vermelha a roxa. Desta forma, a
recuperação dos compostos fenólicos presente nos engaços, pode ser uma
alternativa de valorização deste co-produto.
As propriedades funcionais de inchaço, adsorção de gordura e retenção de
água do engaço foram avaliadas indicando-o como uma boa fonte de fibra dietética,
e ainda, como fonte de pectina de baixo grau de metilação com menos de 50% das
unidades de ácido galacturônico esterificadas (GONZÁLEZ-CENTENO et al., 2010).
A pectina pode ser empregada na indústria de alimentos para a elaboração de
geleias com reduzido teor de açúcar, pudins, pós para pudins, sucos de frutas e
vegetais, molhos, purês, frutas enlatadas, dentre outras (JASKARI, 1990 apud
COELHO, 2008). O engaço e o bagaço de uva foram classificados por Saura-Calixto
(1998) como fibra dietética antioxidante, por conter mais de 50% de fibra dietética e
capacidade antioxidante, no mínimo, equivalente a 50 mg de vitamina E.
Assim como tantos outros resíduos vegetais o engaço no Brasil está sendo
utilizado diretamente na lavoura, com finalidades distintas como evitar erosão,
nivelar o terreno, facilitar o acesso à parreira e também como adubo para diversas
culturas. Porém, alguns cuidados devem ser tomados para se evitar a contaminação
cruzada na lavoura por este material. Diferente do bagaço que pode ser triturado e
utilizado como ingrediente da ração animal, não sugere-se a mesma aplicação para
engaço devido ao seu elevado teor de taninos (CORREIO RIOGRANDENSE, 2004).
A aplicação do engaço como fertilizante diretamente no solo não é uma boa
alternativa segundo Bustamante et al. (2007), devido a baixa mineralização e a
elevada imobilização do nitrogênio no solo, muito provavelmente pelo elevado teor
de compostos fenólicos. Desta forma, estudos sugerem que a redução destes
compostos através de pré-tratamentos como a compostagem melhoram
significativamente a incorporação da matéria orgânica (BERTRAN et al., 2004).
18
4.1.3.4. Bagaço
O bagaço constitui-se basicamente de casca e semente e torna-se um
problema ambiental a ser resolvido, pois além da grande quantidade de resíduos
gerados (16% do total de frutas processadas) em curto espaço de tempo estes
apresentam características poluentes como o baixo pH e elevados teores de
compostos fenólicos, antibacterianos e fitotóxicos, que resistem à degradação
biológica (BUSTAMANTE et al., 2008). Por outro lado, a composição rica em fibras e
compostos fenólicos torna-o interessante pela potencialidade de gerar produtos
inovadores e funcionais. Este direcionamento além de diminuir os impactos
ambientais, pode agregar valor a este co-produto.
Tradicionalmente, no Brasil, esse resíduo também segue para aplicação
direta como fertilizante nas lavouras e ingrediente da ração animal. Contudo, esta
aplicação tem suas limitações decorrentes da composição química rica em taninos,
principalmente nas sementes, que por complexar proteínas, é reconhecidamente um
fator antinutricional. Desta forma, estudos nesta área vêm sendo realizados
propondo novas aplicações ou ainda que estas destinações sejam mais eficazes.
Santos (2011) verificou que a silagem do bagaço de uva em conjunto com o milho
oferecida ao gado como ração promoveu um incremento na atividade antioxidante
do leite e não reduziu a produção de leite. Entretanto, a digestibilidade da matéria
seca e da proteína bruta foram prejudicadas com o aumento do teor de bagaço de
uva, muito provavelmente pelos taninos da semente. Assim o autor sugere que a
inclusão do bagaço de uva na ração animal deve ocorrer juntamente com uma boa
fonte de proteína e ser melhor estudada, para que se comprove os efeitos dos
antioxidantes presentes na dieta tanto sobre a saúde do animal como sobre a
funcionalidade dos produtos por ele gerados.
A preocupação com o meio–ambiente motivou Ping et al. (2011a) a avaliarem
o extrato de proantocianidinas do bagaço de uva obtido via alcalina e recuperados
via ácida e por liofilização, como adesivo verde de madeiras, substituindo os
solventes tradicionais. Da mesma forma outros autores têm apontado o bagaço de
uva como uma boa fonte para combustíveis renováveis por apresentarem matéria
orgânica com alto poder energético (lignina, celulose, hemicelulose). Xu et al. (2009)
submeteram o bagaço à pirólise (aquecimento sem oxigênio) obtendo combustível
19
das frações gasosa e líquida, enquanto Bracchitta et al. (2010) e Dinuccio et al.
(2010) sugerem o emprego do bagaço para a obtenção de biogás por fermentação.
Ainda na área da biotecnologia, o bagaço tem sido testado como meio
fermentativo para a produção de enzimas. E embora grande parte da produção
mundial de enzimas se dê por meio de fermentação submersa, devido à facilidade
de homogeneidade do meio e manutenção dos parâmetros de processo, a
fermentação em estado sólido vem sendo largamente estudada principalmente como
forma de valorização de resíduos agroindustriais diminuindo o custo de produção e
maior facilidade de recuperação das enzimas produzidas. Seguindo esta linha, o
bagaço de uva foi utilizado como substrato por Botella et al. (2007) para a produção
de xilanase e pectinase, por Paranthaman et al. (2009) na obtenção de tanase, por
Botella et al. (2005) na produção de enzimas hidrolíticas que poderiam ser
reincorporadas na própria indústria da uva com desempenho similar ao de
preparações comerciais como verificado por Díaz et al. (2011). Outra aplicação
sugerida para o bagaço foi a obtenção de pigmentos naturais monascus por meio de
fermentação em estado sólido com Monascus purpureu (SILVEIRA et al., 2008)
Quanto à aplicabilidade em alimentos, o bagaço de uva mostrou-se uma fonte
interessante de fibra dietética, sendo a lignina, hemicelulose, celulose e pectina os
principais compostos. Os bagaços em pó de uvas “Carbernet Sauvignon e “Royale
Rouge” apresentaram uma composição muito similar quanto aos macronutrientes,
em torno de 56% de fibra dietética total, 7% de lipídios, 11% de proteínas e 5,6% de
açúcares, solúveis. No entanto, diferiram quanto aos teores de metabólitos
secundários, cujos maiores valores foram encontrados na cultivar “Royal Rouge” (YI
et al., 2009), sugerindo a influência genética sobre o metabolismo vegetal.
O bagaço de uva, processado e transformado em fibra dietética antioxidante
de acordo com a metodologia de Saura-Calixto (1998), foi adicionado à carne de
peixe por Sánchez-Alonso et al. (2007) retardando a oxidação lipídica em três
meses, muito provavelmente pela ação antioxidante sinérgica dos compostos
fenólicos e fibra. O bagaço de uva mostrou ainda efeitos positivos sobre o
crescimento de Lactobacillus acidophilus, sugerindo sua aplicação na elaboração de
probióticos, podendo apresentar ainda os efeitos benéficos das fibras e fenólicos
presentes naturalmente (HERVERT-HERNÁNDEZ et al., 2009)
20
Os compostos fenólicos são a classe de metabólitos secundários majoritária,
com distribuição heterogênea na uva. A distribuição média dos compostos fenólicos
na uva é de 84% na semente, 15% na casca e 1% na polpa, com predomínio dos
taninos condensados nas sementes e ácidos e outros flavonoides na casca
(PASTRANA-BONILLA et al., 2003). Brazinha e Crespo (2010) afirmaram que o
resíduo proveniente do processamento da uva pode alcançar altos preços quando
usado como aditivo nutricional, com grande interesse nos compostos fenólicos,
principalmente flavonoides das cascas e sementes ou, ainda como matéria prima na
indústria cosmética. Corroborando com os referidos autores, verifica-se que a
maioria dos estudos com o bagaço de uva está sendo direcionada à recuperação
dos compostos fenólicos.
O grande interesse nos compostos fenólicos é devido às suas possíveis
propriedades biológicas e tecnológicas como ingredientes funcionais, aditivos
naturais, dentre outras, as quais em sua maioria estão associadas à atividade
antioxidante. Os antioxidantes são largamente empregados nas indústrias
alimentícia, cosmética e farmacêutica e podem ser definidos como qualquer
substância presente em baixas concentrações quando comparada a outras
substâncias e que têm a capacidade de prevenir ou retardar a oxidação de certos
substratos (NAWAR, 1996). Extratos ricos em compostos antioxidantes naturais
estão sendo comercializados e empregados na indústria de alimentos como
antioxidantes naturais na elaboração de alimentos prontos para o consumo
(BREWER, 2011). Porém, um grande desafio tecnológico é aliar a eficácia dos
extratos à manutenção das características sensoriais do produto final.
A extração sólido-líquido é a principal técnica aplicada para a recuperação
dos compostos fenólicos presentes nos bagaços. Esta baseia-se na transferência do
soluto da matriz sólida para a solução extratora envolvendo mecanismos diversos
como a difusão, sorção e dessorção, dentre outros, até que se atinja o equilíbrio
entre as fases. Assim, manter um gradiente de concentração entre as fases favorece
a taxa de transferência ou coeficiente de difusão. A menor granulometria e, em
alguns casos, também a geometria da partícula, podem diminuir ou facilitar o
caminho a ser percorrido pelo soluto, fazendo com que o equilíbrio termodinâmico
seja atingido mais rapidamente. A temperatura e o solvente empregado, por sua vez,
atuarão diretamente sobre a solubilidade dos compostos influenciando sobre o
21
rendimento e tempo de equilíbrio da extração. O tempo de extração é um parâmetro
importante a ser definido, uma vez que está relacionado com o equilíbrio e
rendimento (BRENNAN, 2006) e, no caso de compostos bioativos longos períodos
de extração podem favorecer a degradação.
Amendola et al. (2010) utilizaram bagaço seco e moído e etanol aquoso 60%
como solvente na proporção 1:4 a 60 °C e verificara m que a extração dos
compostos fenólicos seguiu a cinética de primeira ordem e o equilíbrio da extração
atingido em 120 minutos. Já Sant’Anna et al. (2012) identificaram o modelo de
cinética de pseudo primeira ordem como o mais apropriado para ajustar os
resulatdos da extração dos compostos fenólicos do bagaço de uva. O equilíbrio da
extração dos fenólicos foi atingido a 45 e 30 minutos a 50 e 60 °C, respectivamente.
A cinética da extração é um dado muito importante para o dimensionamento
da produção e varia com os parâmetros operacionais. Enquanto Amendola et al.
(2010) encontraram um coeficiente de difusividade que variou de 1,23 – 1,50 x10-
10m²s-1 nas condições descritas acima, Pinelo et al. (2005) identificaram o coeficiente
de difusividade de 1,05 x10-12m²s-1 na melhor condição. No trabalho de Pinel et al.
(2005) a extração dos fenólicos do bagaço de uva foi em modo contínuo com etanol
a 50 °C, e verificou-se o melhor coeficiente de dif usão nos níveis inferiores de
tamanho de partícula e fluxo de solvente, sugerindo que o tempo de residência
influenciou mais o mecanismo de extração que o gradiente de concentração.
Os solventes mais empregados na extração de compostos fenólicos são o
metanol, acetona, etanol, água, acetato de etila, soluções aquosas com estes
solventes e misturas destes (KAHKONEN et al., 2001). Porém, devido a grande
variabilidade estrutural das subclasses modificações na solução extratora podem
favorecer a recuperação de uma em detrimento da outra. Embora, muitas vezes,
solventes mais agressivos permitam um maior rendimento, este é um ponto a ser
considerado pelos possíveis danos à saúde dos manipuladores e ao meio ambiente,
além do custo e viabilidade operacional para a total remoção dos mesmos.
A escolha do solvente está fortemente relacionada à aplicação desejada para
o extrato. Diante disso, os extratos para fins alimentícios empregam,
preferencialmente, meios aquosos (GÓMEZ-PLAZA et al., 2006), misturas binárias
com solvente mais ambientalmente favorável como o etanol em meio ácido
(VALDUGA et al., 2008), água sulfurada (JU e HOWARD, 2005, CACACE e MAZZA,
22
2002), água acidificada (JU e HOWARD, 2003), meio aquoso com enzimas
hidrolíticas (LANDBO e MEYER, 2001; MUÑOZ et al., 2004), fluído supercrítico
(PALENZUELA et al., 2004), meio aquoso empregando tratamentos elétricos
(BOUSSETTA et al., 2012), alta pressão hidrostática, ultrassom, micro-ondas
(CORRALES et al., 2008; LI et al., 2012) entre outras. Os compostos fenólicos
ligados às estruturas celulares são mais difíceis de serem removidos por solventes e
condições brandas, necessitando nestas situações condições drásticas de hidrólise
ou o emprego de enzimas hidrolíticas.
A aplicação de ciclodextrinas para auxiliar a recuperação dos fenólicos
presentes no bagaço foi avaliada positivamente como alternativa à extração com
solventes. Ratnasooriya et al. (2012) empregaram uma solução aquosa de 2,5% β-
ciclodextrina na razão 20:1 solvente:substrato, a 60°C e 70 rpm atingindo 81% do
rendimento observado com solução 80% de etanol nas mesmas condições.
A extração hidroetanólica dos fenólicos presentes no bagaço também foi
objeto de estudo de Spigno et al. (2007), que verificaram a influência da temperatura
e da composição do solvente sobre o rendimento e a cinética de extração. O
equilíbrio foi atingido com 5 horas de processo a 60°C e os dados sugerem a
cinética de primeira ordem como o modelo de melhor ajuste. A mistura binária água
etanol na faixa de 10 a 30% de água incrementou o rendimento da extração dos
fenólicos, sendo observado ainda, que acima de 50% ocorre efeito contrário.
No processamento da uva tinta para a obtenção de vinho e outros derivados
estima-se que somente de 30 a 40% das antocianinas sejam extraídas (GÓMEZ-
PLAZA et al., 2006). As antocianinas os carotenoides e as betalaínas são corantes
naturais, que também possuem capacidade antioxidante (MERCADANTE et al.,
2010) e, por esta razão, têm sido classificados como aditivos multifuncionais (WADA
et al., 2007). A substituição de corantes sintéticos por naturais é uma das grandes
demandas devido à preocupação crescente dos consumidores por produtos mais
saudáveis. Apostando neste segmento a Christian Hansen que já comercializa
corantes naturais na China desde a década de 1990, investiu, em 2004, US$ 1
milhão para a construção de uma nova planta de corantes naturais (DAGLADET
BORSEN, 2004). Do mesmo modo, os co-produtos gerados principalmente pelas
indústrias processadoras de insumos vegetais são fontes promissoras de pigmentos
e compostos bioativos (BREWER, 2011).
23
As antocianinas, por sua vez, são mais eficientemente extraídas em metanol
acidificado, por romper a membrana celular favorecendo a liberação destes
pigmentos presentes nos vacúolos para o meio líquido e, simultaneamente
favorecendo a estabilização do núcleo flavílio (NAZCK e SHAHIDHI, 2004). Porém,
Teixeira et al. (2008) conseguiram rendimentos similares aos obtidos com metanol
empregando solução de etanol acidificado com ácido clorídrico.
Valduga et al. (2008) empregaram a extração hidroetanólica acidificada com
ácido clorídrico para a extração das antocianinas do bagaço de uva Isabel e
obtiveram como rendimento máximo 300 mg ciandina-3-glucosídeo.100g-1 bagaço.
Estes verificaram ainda o efeito negativo do pH sobre o rendimento da extração, ou
seja, o incremento no rendimentos ocorre com a diminuição do pH. O extrato obtido
foi ainda microencapsulado em spray dryer após a remoção do etanol por
evaporação a vácuo e a concentração em antocianinas do pó foi de 95 mg.100 g-1.
Luque-Rodríguez et al. (2007) empregaram a extração sólido-líquido com
etanol aquoso 50% acidificado com HCl e superaquecido (120º C) obtendo extrato
de casca de bagaço de uva com teores de fenólicos totais, antocianinas e flavonóis
7, 3 e 11 vezes superiores ao extrato obtido por extração sólido líquido
convencional.
A extração aquosa de antocianinas da casca da uva facilitada pela ação de
microondas foi avaliada utilizando a superfície de resposta, sendo a densidade da
energia fornecida o fator de maior impacto para o rendimento da extração, seguido
pela concentração de ácido cítrico e razão solvente:substrato (LI et al., 2012). A
densidade de energia foi definida como a energia de irradiação de microondas por
unidade de volume de solvente (W.mL-1) em certo intervalo de tempo. Observou-se
ainda que rendimento máximo foi atingido com uma temperatura de 60,8 °C e uma
densidade de energia da ordem de 32 ω para uma razão solvente substrato de 1:20,
sendo que acima destes valores foi observado mais degradação do que extração
das antocianinas.
A extração subcrítica aquosa e com água sulfurada das antocianinas
presentes na casca de uva foram avaliadas por Ju e Howard (2005) e mostraram
rendimentos de 50 e 60 mg.g-1 (base seca) respectivamente, valores comparáveis
aos 50 mg.g-1 (base seca) da extração com metanol 60% a 50 °C em banho de
ultrassom. Como a utilização de metabissulfito está sendo desencorajada pelos
24
riscos operacionais que representa a extração subcrítica aquosa e a extração
auxiliada por preparações enzimáticas podem ser alternativas interessantes.
O emprego de preparações enzimáticas, especialmente com atividades de
pectinase, celulase e hemicelulase, auxilia na extração por hidrolisarem estruturas
celulares favorecendo o extravasamento ou a liberação dos compostos fenólicos
ligados. Embora em alguns casos o rendimento seja inferior ao obtido com solventes
como o metanol, esta é uma alternativa a ser considerada pela segurança e
aplicabilidade (LANDBO e MEYER, 2001). Entretanto, devem-se evitar preparações
com atividade glicosídica residual, por afetar diretamente a estabilidade dos
compostos fenólicos glicosilados extraídos, principalmente das antocianinas, as
quais são mais instáveis na forma de agliconas.
Muñoz et al. (2004) avaliaram o emprego de preparações enzimáticas
comerciais normalmente utilizadas pela indústria vinícola para auxiliar na obtenção
de extratos antociânicos de bagaço de uva provenientes da fabricação de vinho tinto
de três cultivares distintas e, constataram que o tempo de processo e dose de
enzima influenciaram positivamente na densidade de cor do extrato. Embora as
cultivares seja um fator de variação, a preparação contendo pectinase de Aspergillus
niger e hemicelulase de Trichoderma longibachiatum foi a mais eficiente para todas.
O aproveitamento do bagaço vai além da casca, pois estima-se que de 38 a
52% do peso seco do bagaço seja de sementes e, estas apresentam, em média,
40% de lignina, 12% de proteína e de 9,5 a 14,5% de extrato etéreo, em base seca
(SPANGHERO et al., 2009), valores que variam muito de um cultivar para outro.
Desta forma, visando o máximo de aproveitamento e valorização deste resíduo e,
devido ao seu consagrado uso nas indústrias farmacêutica e cosmética, o óleo da
semente da uva vem despertando interesse da comunidade cientifica e industrial. O
óleo de semente de uva, apesar de ter uma composição média de 10% de ácidos
graxos saturados e 90% de ácidos graxos poli e monoinsaturados, em especial o
linoléico (58 a 78%) e o oléico (3 a 15%), apresenta um ponto de fumaça elevado
(190-230 ºC) o que permite seu uso também sob altas temperaturas (MORIN, 1996
apud BAIL et al., 2008). O teor de óleo na semente da uva aproxima-se ao da soja,
variando de 10 a 20%, podendo, portanto, o rendimento da extração ser um fator
limitante para a obtenção deste óleo. Atualmente Itália, França, Espanha são os
maiores produtores mundiais deste óleo.
25
O rendimento da extração de óleo de semente de uva não é elevado devido,
principalmente, à composição rica em fibras que pode adsorver o material lipídico
caso seja realizada por via mecânica. Passos et al. (2009) conseguiram aumentar
em 106% o rendimento da extração de óleo de semente de uva em Soxhlet
submetendo as sementes ao tratamento enzimático aquoso com uma mistura de
enzimas protease, celulase, xilanase e pectinase. Já a extração com solvente em
ultrassom permitiu o mesmo rendimento que o obtido com hexano, porém com uma
diminuição significativa no tempo de extração e na quantidade de solvente (DA
PORTO et al., 2013)
Porém, a substituição de solventes como o hexano por outros menos
agressivos ou, ainda, sem o uso de solventes orgânicos vem ganhando força, por
aliar a qualidade do óleo obtido com a questão ambiental. Neste sentido, novas
tecnologias como a extração por fluído supercrítico vêm sendo testadas com
sucesso. Passos et al. (2010) empregaram esta tecnologia em sementes de uva
trituradas obtendo rendimentos de 11,5% em óleo e, ao submeterem as sementes
trituradas ao tratamento enzimático prévio o rendimento foi de 16,5% (PASSOS et
al., 2009). Em ambos os processos o óleo apresentou a mesma composição em
ácidos graxos e capacidade antioxidante, no entanto o custo destas técnicas ainda é
elevado.
Além do óleo, o interesse na semente de uva também reside na sua
composição rica em compostos fenólicos, especialmente oligômeros e polímeros
com grau de polimerização de 2 a 38, com capacidade antioxidante muito superior à
do ácido ascórbico, trolox e quercetina (SPRANGER et al., 2008). As
proantocianidinas das sementes de uva foram extraídas com duas misturas binárias
distintas, acetona-água e acetato de etila-água, verificando-se a importância da água
na solução de modo a estabelecer uma polaridade similar a dos compostos de
interesse. A solução extratora de acetato de etila contendo 10% de água conseguiu
extrair 2,3 vezes mais proantocianidinas que a mistura acetona-água (PEKÍC et al.,
1998), contudo estes solventes devem ser eliminados dos extratos se a
aplicabilidade destes for alimentícia.
O etanol é um dos solventes permitidos para a área alimentícia, e devido a
sua baixa toxicidade tem sido cada vez mais avaliado como substituinte de solventes
orgânicos mais agressivos. A semente de uva teve suas proantocianidinas extraídas
26
com uma mistura de etanol e água, atingindo valores de 11,4% do peso das
sementes (NAWAZ et al., 2006). No trabalho conduzido por Bousseta et al. (2012)
as proantocianidinas das sementes foram extraídas com etanol aquoso 50% na
razão 5:1 (solvente:substrato) a 50°C após a descar ga elétrica de alta tensão ou
pulso de campo elétrico, atingindo teores de 9 g de ácido gálico equivalente.100g-1
semente (base seca). Contudo, os autores sugerem a aplicação de pulso de campo
elétrico pela facilidade de separação das fases uma vez que as sementes se
mantêm em suspensão.
4.2. COMPOSTOS BIOATIVOS DE UVAS E SEUS RESÍDUOS
Os metabólitos secundários das plantas são compostos produzidos, mas não
essenciais para os vegetais como os compostos do metabolismo primário, e
encontram-se divididos basicamente em três grandes grupos: os terpenos, os
compostos fenólicos e os alcaloides. A distribuição dos metabólitos secundários não
é universal como as dos metabólitos primários. O estudo destas substâncias iniciou-
se no final do século XIX com grande interesse nas propriedades farmacológicas.
Em alguns casos estes metabólitos servem de indicadores taxonômicos como, por
exemplo, as betalaínas e antocianinas, que não coexistem, sendo as primeiras
restritas a dez famílias da ordem Caryophyllales, onde se encontra a beterraba (Beta
vulgaris) (PERES, 2012). Os compostos fenólicos estão onipresentes nos vegetais e
caracterizam-se por apresentarem ao menos uma hidroxila fenólica (SHAHIDHI e
NAZCK,1995).
Os compostos fenólicos correspondem a um grupo formado por moléculas
muito distintas entre si que estão divididas, em função da estrutura química, em
duas classes, flavonoides e não flavonoides, e estas duas classes dividem-se em
várias subclasses em função do padrão de substituição e das estruturas químicas
(NAZCK e SHAHIDHI, 2004). A grande diversidade dos fenólicos, aproximadamente
10.000 compostos, se deve por também ocorrerem nas formas livre, glicosilada e
conjugada. As funções nos vegetais, por sua vez, são diversas em função desta
diversidade química (TAIZ e ZEIGER, 2004).
Os compostos fenólicos são metabólitos secundários das plantas sintetizados
normalmente e em resposta a condições de estresse. Podem agir como fitoalexinas,
27
como atrativo para polinização, por contribuírem para a pigmentação do vegetal,
como alelopáticos, inibindo o crescimento de vegetais competidores, como
antioxidantes e, similarmente ao sistema imunológico humano, protegendo a planta
de raios ultravioleta e de patógenos, dentre outros (PERES, 2012.). Nos alimentos
são os principais compostos responsáveis pelas características sensoriais tais como
cor, adstringência, amargor e aroma, além da estabilidade oxidativa dos produtos
derivados de vegetais. São usados como flavorizantes, vanilia e aldeído cinâmico,
mas por muito tempo, esses compostos foram associados negativamente à
qualidade de alimentos vegetais pela ação antinutricional como, por exemplo, dos
taninos, que complexam proteínas, diminuindo o valor nutricional e em alguns casos
inibem a atividade de enzimas como tripsina e lipases (SHAHIDHI e NAZCK, 1995).
O interesse mais recente se dá pelas evidências da diminuição da incidência de
algumas doenças crônico-degenerativas com a ingestão de frutas, verduras e
legumes, estando estes efeitos benéficos correlacionados aos metabólitos
secundários e vitaminas, principalmente devido ao poder antioxidante destes
compostos (ALVES et al., 2007; MANACH et al., 2004).
Duas vias metabólicas estão envolvidas na biossíntese dos compostos
fenólicos, a do ácido mevalônico e a do ácido chiquímico, sendo a última a principal
para os vegetais e a do ácido mevalônico para as bactérias e fungos. Os derivados
do ciclo da pentose e glicólise, ertitrose-4-fosfato e ácido fosfoenolpiruvato, se
condensam formando o ácido chiquímico o qual ao incorporar mais uma molécula de
fosfoenolpiruvato forma o ácido corísmico que por sua vez irá originar os
aminoácidos aromáticos – triptofano, tirosina e fenilalanina (TAIZ e ZEIGER, 2004).
A grande maioria dos compostos fenólicos é originada da fenilalanina (Figura
4.4), tendo como enzima chave da biossíntese destes a fenilalanina amônia-liase
(PAL) que ao remover uma molécula de amônia da L-fenilalanina forma o ácido
trans-cinâmico iniciando a biossíntese de fenólicos por reações sequenciais diversas
como hidroxilação, o-metilação e condensação (PERES, 2012). Contudo foi
verificada a ação da PAL sobre tirosina originando o ácido p-cumárico seguindo a
rota metabólica dos fenólicos (DAVIES e SCHWINN, 2005).
28
C3C6
C3C6
C3C6
C3C6
C3C6
C3C6 C6
C2C6 C6
C3C6 C6C3C6 C6
C3C6
Figura 4.4 – Metabolismo dos compostos fenólicos em vegetais (NAZCK e SHAHIDHI, 2004).
Fatores genéticos irão determinar quais classes e subclasses desses compostos
serão sintetizadas (NAZCK e SHAHIDHI, 2004), os teores e o perfil dos compostos
fenólicos podem ainda variar em função dos estágios de crescimento e maturação,
fatores bióticos e abióticos aos quais o vegetal foi submetido, além das metodologias
analíticas de extração e determinação utilizadas.
A informação genética é uma grande fonte de variabilidade para os teores de
compostos bioativos como pode ser comprovado no estudo de Kataliníc et al.
(2010), que avaliou 14 cultivares de uvas viníferas tintas e brancas encontrando
concentrações médias de fenólicos totais de 1.851 e 875 mg.kg-1 de uvas frescas,
respectivamente e, antocianinas apenas nas uvas tintas com teores que variaram de
158 a 1.848 mg malvidina-3-glucosídeo.kg-1.
As principais subclasses dos não flavonoides presentes nas uvas são: ácidos
fenólicos, estilbenos, taninos, cumarinas, lignanas e neolignanas e dos flavonoides:
flavanol, flavonol, flavona, chalcona e antocianina (GARRIDO e BORGES, 2011;
ABE et al., 2007). Os estudos vêm sendo conduzidos de modo a identificar perfis e
29
padrões de ocorrência de fenólicos como identidade da uva empregada,
principalmente na elaboração dos vinhos finos (FIGUEIREDO-GONZALEZ et al.,
2012).
4.2.1. Não flavonoides
A classe dos não flavonoides não apresenta uma estrutura básica em comum
e, portanto, é uma classe muito heterogênea, conforme ilustra a
Figura 4.5, composta por ácidos fenólicos (ácido benzóico, ácido
hidróxicinâmico e seus derivados), ligninas, lignanas, suberinas, estilbenos e taninos
hidrolisáveis (CHEYNIER, 2005; SHAHIDHI e NAZCK, 1995).
OH
OH
O
O
OO
O
O
CO
CO
OH
OH
OH
OH
OH
OH
CO
OH
CO
CO OH
OH
OH
HOOC
R1
OH
R2HOOC
R1
OH
R2
HO OH
H
H
RO
Figura 4.5 Principais subclasses de compostos não flavonoides em uva.
Os ácidos benzoicos são constituídos de sete carbonos (C6-C1) sendo exemplos
desta classe os ácidos gálico, vanílico e siríngico. Podem estar na forma livre ou
como etil ésteres. O ácido gálico é o mais importante dos ácidos benzoicos por ser
precursor dos taninos hidrolisáveis, que são polímeros de ésteres de ácido gálico ou
elágico. Acredita-se ainda que o ácido elágico (Figura 4.6) seja produto da reação
oxidativa entre dois ácidos gálicos.
30
Evidências apontam atividade anti-inflamatória do ácido elágico, por inibir a
expressão gênica da enzima COX-2 (ciclooxigenase), modular a via de sinalização
celular envolvida nas doenças crônicas não transmissíveis, dentre outros
mecanismos (BASTOS et al., 2009). Este ácido apresenta ainda capacidade
antioxidante (BIANCHI e ANTUNES, 1999) e atividade antifúngica (SILVA JUNIOR
et al., 2010), indicando certa relevância sobre a prevenção de algumas doenças
cujas causas primárias sejam decorrentes da inflamação e/ou estresse oxidativo
como a asma (ROGÉRIO et al., 2008), obesidade (BASTOS et al., 2009),
cardiovasculares, neurológicas dentre outras (VATTEM e SHETTY 2005, PAN et al.,
2010).
Figura 4.6 – Estrutura química do ácido elágico (pt.encydia.com).
Na uva e seus derivados os ácidos cinâmicos são os mais representativos,
sendo encontrados na forma livre ou conjugados formando ésteres ou diésteres
tartáricos (ABE et al., 2007). Apresentam estrutura básica de nove átomos de
carbono (C6-C3), com destaque na uva para os ácidos cafeico, ferúlico, sinápico e
p-cumárico. Alguns estudos têm buscado identificar estes compostos e o perfil dos
mesmos como marcadores taxonômicos (GARRIDO e BORGES, 2011). Os ácidos
fenólicos são potentes antioxidantes e assim como os demais fenólicos a
potencialidade depende da posição e do grau de hidroxilação (YANISHLIEVA-
MASLAROVA, 2001).
Uma das classes de fenólicos mais associada às uvas é a dos estilbenos cujo
composto de referência é o resveratrol, que também pode ser encontrado em mais
de 70 espécies dentre elas uvas, pinheiros, amendoins e berries. A enzima chave
para a síntese é a estilbeno sintase, uma mutação da chalcona sintase, a qual forma
o resveratrol a partir de uma molécula de coumaroil-CoA e três de malonil-CoA. O
31
resveratrol é sintetizado em resposta às condições de estresse bióticos e abióticos
como infecção fúngica, excesso de radiação UV, sendo reconhecidamente uma
fitoalexina de ação fungicida (LANGCAKE e Mc CARTHY, 1979 apud WANG et al.,
2010). Wang et al. (2010) constataram que a maior concentração de resveratrol
encontra-se no floema da haste enquanto que a maior expressão da estilbeno
sintase está na folha. O resveratrol também pode sofrer oxidação e originar
oligômeros denominados viniferina, com propriedade antifúngica (LANGCAKE e Mc
CARTHY,1979 apud MATTIVI et al., 2011).
A uva e seus derivados - vinho e suco- são reconhecidamente as principais
fontes de resveratrol da dieta (WANG et al., 2010). Embora na uva este fenólico seja
menos abundante que os ácidos fenólicos e flavonóis, destaca-se como um dos
fitoquímicos mais promissores em função de seu amplo espectro de efeitos
benéficos à saúde, dentre os quais as atividades antioxidante, cardioprotetora e anti-
carcinogênica (KUNDU e SURH, 2008). A casca é a porção comestível da uva na
qual se concentra o resveratrol, sendo, portanto, uma possível fonte desse
composto.
Os dados da literatura quanto aos teores de resveratrol indicam grande
variabilidade, sendo as condições de cultivo e os tipo de cultivares responsáveis por
esta variabilidade. Pastrana-Bonilla et al.(2003) ao avaliarem 10 cultivares de uva
encontraram resveratrol apenas em oito cultivares com teores que variaram de 0,1 a
0,2 mg.100g-1 de fruta fresca. Anastasiadi et al. (2010) avaliaram o teor de
resveratrol na casca de quatro cultivares obtendo valores muito diferentes (0,00 a
1,18 mg.100g-1 em base seca). Já Iacopini et al. (2008) encontraram resveratrol nas
10 cultivares de uva tinta da espécie Vitis vinifera estudadas, mas os teores também
oscilaram (0,44 a 26,66 mg.100g-1de casca em base seca). Burin et al. (2011)
observaram que mesmo empregando uvas Cabernet Sauvignon de vinhedos
próximos, condições de solo e cultivo similares, os vinhos apresentavam diferentes
conteúdos de resveratrol. Souto et al. (2001) também observaram que teores de
resveratrol nos sete vinhos Merlot da safra de 1997 produzidos na região Sul do
Brasil variaram de 0,91 a 5,43 mg.L-1.
Para os produtos processados, a variação nos teores dos fenólicos e em
especial no resveratrol, que encontra-se na casca, também será fruto das etapas de
processamento necessárias para a elaboração dos mesmos. Nos sucos, por
32
exemplo, a maceração com enzimas hidrolases, pode facilitar a liberação dos
fenólicos presentes nos vacuólos. A vinificação tinta (Figura 4.3), na qual as bagas
esmagadas seguem juntamente com a polpa da uva para a fermentação alcoólica,
também favorece a extração não somente dos pigmentos antociânicos mas também
de outros fenólicos. Neste sentido, Kostadinovic et al. (2012) verificaram que o
tempo de maceração e o tipo de levedura utilizada na fabricação dos vinhos Merlot e
Vranec afetaram a composição dos vinhos quanto ao teor de resveratrol e a
atividade antioxidante.
Outra subclasse de não flavonoides encontrada nas uvas é a lignina, a
segunda classe de substância mais abundante nos vegetais após a celulose.
Embora pertençam à classe dos fenólicos, as ligninas são polímeros de álcoois de
fenilpropanóides (coniferil, cumaril e sinapil) que desempenham funções primárias e
secundárias. Estes polímeros apresentam-se altamente ramificados nas três
dimensões e por esta razão são insolúveis e extremamente complexos e rígidos. A
resistência mecânica é uma função primária muito necessária para o crescimento e
desenvolvimento do vegetal, contudo a síntese das ligninas é estimulada também
pelo ataque de patógenos, estresse ou herbivoria. Nestas duas últimas situações a
função secundária de proteção se dá pela baixa digestibilidade da lignina pelos
patógenos e pela restrição do acesso dos mesmos a fontes energéticas através das
ligações com proteínas e celulose. Estes compostos, por serem insolúveis,
encontram-se na parede celular, enquanto que os fenólicos solúveis apresentam-se
compartimentalizados em vacúolos ou ainda ligados a estruturas de parede celular
como pectinas e polissacarídeos (NAZCK e SHAHIDHI, 2004).
Os taninos são compostos fenólicos mais complexos, solúveis em água e
massa molecular variando de 500 a 3.000 Daltons e, de acordo com Khanbabaee e
van Ree (2001), os taninos podem ser divididos basicamente em dois grupos, os
taninos condensados e taninos hidrolisáveis, estando os últimos subdivididos em
galotaninos, elagitaninos e taninos complexos (Figura 4.7). Embora inicialmente
tenham sido identificados como componentes antinutricionais, por complexarem
proteínas e enzimas salivares, diminuindo a digestão dos nutrientes (SHAHIDHI e
NAZCK, 1995), o interesse atual nos taninos está associado à possibilidade de
prevenção de doenças. Isto porque são, frequentemente, os compostos bioativos de
plantas medicinais como cáscara sagrada (Rhamnuspurshiana), melissa (Melissa
33
officinalis) e outros. Creditam-se estes efeitos à capacidade de complexar proteínas
e polissacarídeos assim como de quelar íons metálicos (COWAN, 1999), que seriam
os mecanismos da ação fungicida e bactericida, por impedir a ação de algumas
enzimas importantes ou ainda inativa-las pela ausência do cofator. Outra
característica importante é a atividade antioxidante por sequestro de radicais livres e
complexação de íons metálicos que podem gerar espécies reativas (Reação de
Fenton) ou decompor peróxidos (YANISHLIEVA-MASLAROVA, 2001). Acredita-se
ainda que os taninos possam atuar de duas maneiras distintas, quando formando
complexos não seriam absorvidos e atuariam sobre o trato gastrointestinal, ou ainda
ao serem absorvidos seus efeitos seriam sistêmicos (SERRANO et al., 2009).
Figura 4.7- Classificação dos taninos em: 1-galotanino; 2-elagitanino; 3-tanino complexo e 4-tanino
condensado (KHANBABAEE e VAN REE, 2001).
Os taninos hidrolisáveis são formados por ésteres de ácidos fenólicos, nos
quais as hidroxilas da molécula de açúcar são esterificadas pelos ácidos gálico ou
elágico e estes são facilmente hidrolisados via enzimática (tanase) e não enzimática
(RODRÍGUEZ-DURÁN et al., 2010). Recentemente a classificação dos taninos
hidrolisáveis compreende os galotaninos, quando o açúcar está esterificado por
unidades de ácido gálico, os elagitaninos, que quando hidrolisados formam o ácido
hexahidróxidifênico que se estabiliza formando o ácido elágico (dilactona), e os
taninos complexos, os quais são ésteres formados por catequina e pelos ácidos
elágico e gálico (KHANBABAEE e VAN REE, 2001). Os taninos não hidrolisáveis
também denominados de taninos condensados ou proantocianidinas pertencem a
classe dos flavonoides.
34
4.2.2. Flavonoides
Os flavonoides apresentam uma estrutura comum composta por dois anéis
aromáticos ligados por três carbonos e um átomo de oxigênio formando um
heterociclo oxigenado denominado núcleo flavano (Figura 4.8). O grau de oxidação
e o padrão de substituição do anel C, heterociclo, definem as classes de flavonoides
e dentro destas as substituições nos anéis A e B são responsáveis pelas
diversidades de compostos de cada classe. Os compostos podem ainda apresentar
um ou mais moléculas de açúcar principalmente nas posições 3,5 e 7, e ainda ser o
açúcar acilado por um ácido orgânico (RHODES, 1996).
Figura 4.8 – Núcleo Flavílio (BRAVO, 1998).
As principais classes de flavonoides encontradas nos vegetais utilizados em
alimentos (
Figura 4.9) são: flavona ou flavonol, flavanona, flavanol, isoflavona, chalcona,
antocianidina e proantocianidina (NAZCK e SHAHIDHI, 2004; RHODES, 1996).
Nas uvas as principais classes são os flavanóis, proantocianidinas, flavonol e nas
uvas tintas as antocianidinas (GARRIDO e BORGES, 2011; PERESTRELO et al.,
2012).
35
OHO
OH
R1
R2
R3
O
OH
Flavonóis
OHO
OH
R1
R2
R3
O
Flavonas
OHO
OH
R1
R2
R3
O
Flavanonas
OHO
R OOH
Isoflavonas
OHO
OH
R1
R2
R3
OH
Flavanóis
O
OH
OH
OHHO
OH
O
OH
OH
OHHO
OH
O
OH
OH
OHHO
OH
Proantocianidinas
R2=OH; R1=R3=H Kaempoferol
R1=R2=OH; R3=H Quercetina
R1=R2=R3=OH Miricetina
R2=OH; R1=H Apegenina
R1=R2=OH Luteolina
R=H Daidzeína
R=OH Genisteína
R2=OH; R1=H Naringenina
R1=R2=OH Eriodictiol
R1=OH; R2=OCH3 Hosperetina
R2=R1=H Perlagonidina
R1=OH; R2=H Cianidina
R1=R2=OH Delfinidina
R1=OCH3; R2=OH Petunidina
R1=R2=OCH3 Malvidina
OHO
OH
R1
OH
R2
OH
Antocianidinas
R1=R2=OH; R3=H Catequinas
R1=R2=R3=OH Galocatequinas
Procianidina trimérica
Figura 4.9 – Principais classes de flavonoides.
Os taninos condensados ou proantocianidinas são polímeros ou oligômeros
formados por condensação de unidades de flavan-3ol ou flavan-3,4diol (Figura 4.10),
cujos produtos da hidrólise são antocianidinas (SHAHIDHI e NAZCK, 1995). Quando
as unidades monoméricas se ligam através de ligações éter (C2-C7) tem-se as
proantocianidinas do tipo A. Já quando os monômeros se ligam por reações entre
carbonos, geralmente C4-C6 e C4-C8, denomina-se proantocianidina tipo B. As
unidades podem ser distintas em função do padrão de hidroxilação dos anéis A e B
e desta forma as proantocianidinas podem ser: procianidinas ((+)-catequina/(-)-
epicatequina), prodelfinidinas ((-)-galocatequina/-epigalocatequina) e
properlagonidina ((+)-afzelequina/(-)-epiafzelequina), dentre outras (SERRANO et
al., 2009).
36
Figura 4.10- Unidades monoméricas das proantocianidinas:Flavan-3-ol (esquerda) e Flavan-3,4-diol
(direita).
Nas uvas as principais ocorrências são de taninos condensados do tipo B,
procianidinas e prodelfinidinas são os de maior prevalência (HE et al., 2008;
HELLSTRÖM et al., 2009, ZHAO et al., 2010). As proantocianidinas não estão
uniformemente distribuídas nas uvas. Montealegre et al. (2006) ao avaliarem o perfil
de fenólicos de dez variedades de Vitis vinífera encontraram grande variedade nos
teores de proantocianidinas tanto com relação às variedades quanto localização no
fruto, com as mais elevadas concentrações nas sementes (210 a 790 mg.Kg-1) e
casca (traços – 69 mg.Kg-1) e todas as procianidinas identificadas foram do tipo B.
Como pode ser verificado na Figura 4.9, os flavonóis diferem das flavonas apenas
pela função álcool no heterociclo não saturado com função cetona no carbono 4. Já
foram identificados em uvas e vinhos quercetina, miricetina, kaempferol, rutina,
laricitrina, siringetina e isorhamnentina e estes flavonóis foram encontrados nas
formas glicosilada e não glicosilada (MAKRIS et al., 2006, GARRIDO e BORGES,
2011). A conjugação se dá por uma ligação hemiacetal entre o açúcar e a hidroxila
do heterociclo. Estes compostos apresentam sabor amargo e são reconhecidamente
compostos com atividade antioxidante, podendo alguns ainda como a quercetina
também apresentar atividade foto-antioxidante (OHKATSU et al., 2010).
A atividade antioxidante dos flavonoides não decorre somente da remoção de
radicais livres, mas também da quelação de metais e da inibição de algumas
enzimas, como a lipoxigenase (YANISHLIEVA-MASLAROVA, 2001). Os metais se
estabilizam quando existem as hidroxilas adjacentes, como nas posições 3’ e 4’ no
anel B ou ainda quando as hidroxilas estão nas posições C3 e C5 com grupo oxo em
C4 (PIETTA, 2000).
A atividade antioxidante está diretamente relacionada com a estrutura química
(Figura 4.11), presença de hidroxilas livres, bem como a posição das mesmas para
que estejam disponíveis e não estabilizadas com outros constituintes da molécula,
37
assim como a presença de duplas conjugadas, por exemplo, entre os carbonos 2 e 3
do heterociclo com a função cetona no carbono 4 (WADA et al., 2007).
OHO
OH
R1
OH
R2
OH
O
OHO
OH
R1
R2
OH
O
OH
OHO
O
R1
R2
O
O
OH
HH
Figura 4.11 – Estruturas que contribuem para a atividade antioxidante dos flavonoides (WADA et al.,
2007).
Ao avaliarem alguns flavonoides, Ohkatsu et al. (2010) verificaram que em
termos de atividade antioxidante tinha-se, em ordem decrescente, quercetina,
luteolina (flavona) e kaempoferol. Pode-se supor que seja pelo número e posição de
hidroxilas, que na quercetina são cinco, enquanto na luteolina e kaempoferol são
quatro hidroxilas. Contudo mesmo ambos apresentado quatro hidroxilas, no
kaempoferol duas hidroxilas estão nas posições 3 e 5 entre a função cetona no
carbono 4, dificultando a doação do elétron enquanto que na luteolina as três
hidroxilas estão mais disponíveis (Figura 4.9).
As flavanonas possuem um grupo cetona no heterociclo saturado e são
intermediários biossintéticos de diversas classes de flavonoides (Figura 4.12).
Podem apresentar sabor amargo ou doce dependendo da configuração, e ainda
ação protetora (VERMERRIS e NICHOLSON, 2006).
38
Figura 4.12 – Rota metabólica dos flavonoides a partir da chalcona (OHKATSU et al., 2010).
Embora as flavanonas não sejam potentes removedores de radicais livres,
são compostos que apresentaram atividade fotoantioxidante, podendo assim atuar
de forma distinta na preservação dos alimentos como, por exemplo, sendo
adicionados às embalagens, ou ainda na área cosmética ou farmacêutica. A
hidroxila na posição 7 do anel A, assim como o grupo oxo em C4 e a dupla ligação
entre C2 e C3 no heterociclo são características que favorecem a atividade
fotoantioxidante (OHKATSU et al., 2010)
Os flavanóis, além do heterociclo saturado com função cetona, apresentam
hidroxilas na posição C3 sendo denominados de flavan-3ol ou nos carbonos C3 e
C4 denominando-se flavan-3,4-diol (SHAHIDHI e NAZCK, 1995). Estes compostos
assim como as flavonas absorvem luz na região do UV (280-320nm), sendo
importantes para a proteção da planta contra o excesso desta radiação (TAIZ e
ZEIGER, 2004). Nas uvas os flavanóis identificados foram a catequina, o mais
abundante na natureza, epicatequina e os derivados de ambas. Nos vinhos brancos
produzidos sem o contato prologado das cascas com o mosto fermentativo a
39
catequina é o flavonoide mais abundante e responsável pelo sabor deste (GARRIDO
e BORGES, 2011). Contudo além dos monômeros glicosilados ou agliconas, estes
flavonóis também estão nas uvas como dímeros, trímeros e polímeros denominados
proantocianidinas, conferindo sabor adstringente.
A catequina e epicatequina mostraram um comportamento antagonista
quando em associação entre si e entre os flavonóis (quercetina e rutina) e
resveratrol quando a atividade antioxidante foi medida pelo método do DPPH;
contudo este efeito não foi verificado quando o método de análise empregado foi o
de inibição da nitração da tirosina por peroxinitrito (IACOPINI et al., 2008). De um
modo geral tem se preferido a aplicação dos extratos como antioxidantes em
detrimento aos compostos isolados, tanto pelas possíveis interações sinérgicas
como pelo custo elevado de purificação.
As antocianidinas são flavonoides que apresentam o grupo estrutural comum
o núcleo flavílio no qual existem duas insaturações que, por ressonância, se
estabilizam (WROLSTAD et al., 2005) e conferem a propriedade de absorção de luz
na região do visível (500 nm), sendo esta classe de pigmentos fenólicos
hidrossolúveis responsável pelas colorações de vermelho, azul e violeta na maioria
dos vegetais.
A luz é o fator externo mais importante na biossíntese desses compostos por
ativar indiretamente as enzimas envolvidas através do sistema fitocromo, porém sua
biossíntese e acúmulo também são influenciados por outros fatores como
temperatura, condição nutricional, hormônios, danos mecânicos e ataque de
patógenos. Fatores genéticos definem as substituições nos carbonos 3 e 5 do anel B
as quais definem as agliconas ou antocianidinas (MAZZA e BROUILLARD, 1990),
sendo seis as de principal interesse em alimentos (Figura 4.13).
40
OHO
OH
R1
OH
R2
OH
B
A C
Figura 4.13 – Principais antocianidinas em alimentos.
As substituições no anel B contribuem para a variação de cor (Tabela 4.1),
porém o pH, a concentração na solução e a presença de co-pigmentos são também
fatores importantes (MAZZA e BROUILLARD, 1990; WROLSTAD et al., 2005) que
permitem a grande variabilidade nas tonalidades encontradas no reino vegetal. O
aumento de hidroxilas modifica a coloração de rosa para azul sendo a metilação
responsável pelo efeito contrário (STRINGHETA e BOBBIO, 2000).
Tabela 4.1- Coloração das antocianidinas (TAIZ e ZEIGER, 2004).
Antocianidina Substituintes Coloração
Perlagonidina 4’OH Vermelho alaranjado
Cianidina 3’ e 4’- OH Vermelho violáceo
Delfinidina 3’, 4’ e 5’- OH Azul violáceo
Peonidina 3’- OCH3, 4’- OH Vermelho rosado
Petunidina 3’ - OCH3, 4’ e 5’- OH Violeta
Malvinidina 3’ e 5’ - OCH3, 4’- OH Violeta
As antocianinas localizam-se em vacúolos e se apresentam no vegetal
predominantemente na forma de mono ou di-glicosídeos, e muito pouco na forma de
agliconas. As glicosilações ocorrem mais frequentemente nos carbonos 3 e 5,
podendo também ocorrer, ainda que raramente, como triglicosídeos nas posições 7,
3, 4 e/ou 5. Os açúcares mais encontrados são mono e dissacarídeos como glicose,
Antocianidinas R 1 R2
Perlagonidina H H
Cianidina OH H
Delfinidina OH OH
Peonidina OMe H
Petunidina OMe OH
Malvidina OMe OMe
41
ramnose, galactose, xilose e arabinose. As antocianinas podem ainda sofrer
acilações nas moléculas do açúcar, em muitos casos por ácidos tais como p-
cumárico, cafeico, ferrúlico ou sinápico, e com menor frequência pelos ácidos p-
hidroxibenzóico, malônico ou acético. Geralmente, os ácidos se ligam ao carbono 3
da molécula do açúcar, sendo que, em alguns pigmentos, essa ligação ocorre no
grupamento 6-hidroxil e muito raramente no 4-hidroxil (SHAHIDHI e NAZCK, 1995;
FRANCIS, 1982; FRANCIS, 1993). Nas uvas foram identificadas cinco das seis
antocianidinas encontradas nos alimentos: cianidina, delfinidina, peonidina,
petunidina e malvidina; principalmente na forma glicosilada. Estudos indicam ainda
que nos cultivares Vitis vinífera não ocorrem antocianinas diglicosiladas (GUERRA e
BARNABÉ, 2005) e tem-se ainda tentado estabelecer um padrão de ocorrência das
antocianinas para auxiliar a identificação da uva originária do vinho, auxiliando no
combate à fraude (GARRIDO e BORGES, 2011).
De acordo com Francis (1982) e Wrolstad et al. (2005), as antocianinas são
muito instáveis e susceptíveis à degradação. A estabilidade das antocianinas é
afetada fortemente pelo pH e temperatura, contudo sua estrutura química,
concentração na solução, luz, enzimas endógenas ou adicionadas, co-pigmentos,
relação molar entre co-pigmentos e antocianinas, oxigênio, ácido ascórbico, íons
metálicos, açúcares e seus produtos de degradação, proteínas e dióxido de enxofre
também atuam sobre a estabilidade das antocianinas.
O pH atua sobre a estrutura química das antocianinas favorecendo a
degradação irreversível e perda da coloração devido à formação de chalcona (Figura
4.14). Em pH ácido (<2,0) as antocianinas se encontram na forma do cátion flavílio,
cuja coloração é intensa. À medida que o pH aumenta ocorre a formação da base
quinoidal (azul ou violeta) conjuntamente com a hidratação do cátion formando a
pseudobasecarbinol ou hemiacetal que lentamente atinge o equilíbrio formando a
chalcona (incolor), uma estrutura de degradação cujo heterociclo foi rompido
(MARKAKIS, 1982).
42
R
Gl
HO
O
R1
OH
R2
O
CH OOHO
O
R1
OH
R2
O
R
Gl
OHO
O
R1
OH
R2
O
OH
R
Gl
O
O
R1
OH
R2
O
O
R
Gl
R
OHO
O
R1
R2
O
O
Gl
R
Gl
HO
O
R1
OH
R2
O
CH O
-H +
rápido
Figura 4.14- Comportamento das antocianinas em função do pH.
O aumento da temperatura leva a degradação das antocianinas e à formação
de compostos de coloração marrom. A luz aumenta a síntese das antocianinas no
vegetal, contudo a coloração é mantida em ambiente escuro (MARKAKIS, 1982).
Alguns estudos indicaram diferenças na cinética de degradação pela luz, sugerindo
que fatores como a fonte e, portanto, a estrutura das antocianinas também atue
favorecendo ou não esta degradação (CAVALCANTI et al., 2011).
A ação das enzimas endógenas (polifenoloxidase e peroxidase) é um dos
principais fatores de degradação dos compostos fenólicos, e nas antocianinas
destaca-se também a atuação das glicosidases que ao removerem o açúcar da
molécula formam a aglicona, muito mais instável (HUANG, 1955 apud CAVALCANTI
et al., 2011). Por serem termorresistentes, a inativação térmica destas enzimas em
produtos derivados de vegetais fica dificultada, sendo alternativamente inibidas por
adição de compostos que se ligam à parte protéica da enzima, que complexam o
grupo heme ou que neutralizam o cofator. O dióxido de enxofre (SO2) e os sulfitos,
assim como o ácido ascórbico, são largamente utilizados na indústria com esta
finalidade. No entanto, esses compostos favorecem a degradação das antocianinas
por mecanismos não enzimáticos (RODRIGUEZ-SANOA et al., 1999; MALIEN-
AUBERT et al., 2001).
43
Os sulfatos e sulfitos se ligam nas posições 2 ou 4 formando compostos
incolores, sendo esta reação reversível em doses menores que 10g.kg-1 (FRANCIS,
1993). Já o ácido ascórbico degrada as antocianinas tanto pela condesação no
carbono 4 como pela oxidação do anel pirílium (PACHECO-PALENCIA et al., 2007).
Fatores estruturais da molécula são também responsáveis pela estabilidade
das antocianinas, da cor e, por consequência, da atividade biológica, tais como o
grau de substituição do anel B, ou seja, R1 e R3; a natureza e número de açúcares
ligados à molécula; e, ainda, a estrutura e número de grupamentos acil; bem como a
posição da ligação destes na molécula de açúcar. Moléculas diaciladas apresentam
maior estabilidade, uma vez que os radicais acil podem proteger o núcleo flavano
através do rearranjo espacial das moléculas. As acilações favorecem as co-
pigmentações intramoleculares, as quais são mais eficientes já que propiciam a
ligação covalente entre pigmento e copigmento. A presença de resíduo aromático no
grupamento acil permite o alinhamento do resíduo com o núcleo flavílio e
empilhamento, possivelmente por interações hidrofóbicas, protegendo a molécula do
ataque nucleofílico da água, diminuindo a hidratação e prevenindo a formação de
chalcona (WROLSTAD et al., 2005; MALIEN-AUBERT et al., 2001).
As copigmentações intermoleculares são interações entre as antocianinas e
outros compostos que podem ser flavonoides, alcaloides, aminoácidos, ácidos
orgânicos, nucleotídeos ou polissacarídeos ou metais, por ligações covalentes mais
fracas π-π. Os metais são facilmente complexados pelas antocianinas formando
complexos estáveis, sendo este um dos mecanismos de atividade antioxidante desta
classe de fenólicos. Acredita-se ainda que a complexação de metais como ferro,
cobre, alumínio e magnésio sejam responsáveis pela coloração azulada
(CASTAÑEDA-OVANDO et al., 2009).
Quando o copigmento é outra molécula de antocianina, denomina-se auto-
associação e ocorre em soluções concentradas de antocianinas. A copigmentação é
um fenômeno de ocorrência natural ao qual se atribui o principal mecanismo de
estabilidade das antocianinas nos vegetais, ocorrendo preferencialmente em
condições ácidas (MAZZA e BROUILARD, 1990). Estas associações químicas
fracas podem aumentar a estabilidade das antocianinas e ampliar as suas
propriedades antioxidantes (RODRIGUEZ-SANOA et al., 1999, REYES e
CÍSNEROS-ZEVALLOS, 2007).
44
A copigmentação é provavelmente o principal fenômeno de estabilização das
antocianinas nos vegetais e promovem o deslocamento batocrômico e efeito
hipercrômico (STRINGHETA e BOBBIO, 2000; CAVALCANTI et al., 2011). Acredita-
se que estes efeitos sejam os responsáveis pela grande diversidade de matizes e
ainda pela variação na cor e adstringência de vinhos (MAZZA, 1995). Contudo, a
intensidade dos efeitos depende fortemente do pH da solução que irá deslocar o
equilíbrio para a formação do cátion flavílio (CASTAÑEDA-OVANDO et al., 2009). E
segundo Asen et al. (1972) apud Stringheta e Bobbio (2000), o efeito batocrômico
está diretamente relacionado com a razão copigmento:pigmento.
Os estudos mais recentes apontam para a identificação de possíveis
interações que seriam responsáveis pela estabilidade das antocianinas (PACHECO-
PALENCIA et al., 2007) e, por consequência, favoreceriam o poder antioxidante
responsável pela grande maioria das atividades biológicas (antimutagênica,
anticarcinogênica, efeito protetor gástrico) desta classe de compostos (GALVANO et
al., 2004; PAN et al., 2010).
Outro mecanismo de estabilização das antocianinas é por meio da ciclização
entre o carbono 4 e a hidroxila em C5 formando as piranoantocianinas (Figura 4.15),
que foram identificadas inicialmente em vinhos tintos.
Figura 4.15- Exemplos de piranoantocianinas encontradas nos vinhos (MATEUS, 2009).
45
A presença do quarto anel na molécula confere um efeito hipsocrômico em
relação à antocianina precursora (MATEUS, 2009) e maior estabilidade em relação
às antocianinas. A estabilidade em relação ao pH vem despertando o interesse
nestas moléculas e este mecanismo pode ser uma alternativa para a viabilização do
uso de pigmentos antociânicos em substituição aos corantes artificiais
(CASTAÑEDA-OVANDO, et al. 2009).
As uvas representam importantes fontes de compostos fenólicos, porém estes
não estão distribuídos uniformemente no fruto e dependem fortemente da cultivar,
entre outros fatores associados às condições de cultivo. Pastrana-Bonilla et al.
(2003), ao avaliarem frutas íntegras, casca e semente de 10 cultivares muscadines
verificaram que os teores de fenólicos totais (mg ácido gálico equivalente.100g-1) e
atividade antioxidante encontram-se distribuídos em ordem decrescente nas
sementes (3.258 a 1.649), casca (545 a 262) e polpa (33 a 11). As antocianinas
encontram-se quase que exclusivamente nas cascas de cultivares púrpuras (132,1 +
47,0 mg.100g-1), com ocorrência nas sementes de todas as cultivares avaliadas (1,2
a 8,7 mg.100g-1) e nas polpas de cultivares púrpuras (0,7 a 4,7 mg.100g-1). Nas
sementes a predominância é de flavonóis, (-)-epicatequina e (+) catequina, enquanto
que na casca os maiores teores foram de miricetina e ácido elágico.
4.2.3. Relevância dos compostos fenólicos
As uvas e seus derivados, vinhos e sucos, são importantes fontes dietéticas
de compostos fenólicos e como vários estudos têm demonstrado os efeitos
plurifarmacológicos (bactericida, antiviral, antialérgico, antitrombótico,
antiinflamatório, anticarcinogênico, hepatoprotetor, vasodilatador) dos fenólicos
(CHEYNIER, 2005, SOOBRATTEE et al. 2005), o interesse sobre estes alimentos e
aproveitamento máximo do potencial dos mesmos é crescente. Grande parte destes
efeitos decorre da capacidade dos compostos fenólicos em remover espécies
reativas, inibir as vias de sinalização e ativação de fatores de transcrição, inibindo
enzimas oxidativas e mediadores inflamatórios, dentre outros. Muitos danos no
organismo iniciam-se com os ataques de espécies reativas (ER) produzidas pelo
metabolismo normal e também durante os processos inflamatórios. A inflamação
crônica está associada como um dos maiores fatores de risco de doenças crônicas,
como arterosclerose, Parkinson, Alzheimer, câncer, obesidade, doenças
46
inflamatórias crônicas, transtornos metabólicos, musculares e esqueléticos (PAN et
al., 2010).
As espécies reativas, por sua vez, irão promover danos oxidativos em
biomoléculas importantes como proteínas, DNA, lipídios e açúcares, através de
mecanismos diversos. A oxidação dos lipídios constituintes das membranas
celulares promove a perda de sua principal função, a permeabilidade seletiva. Nas
proteínas a oxidação pode ocorrer em sítios específicos inativando as enzimas, ou
alterar a carga elétrica, aumentando a propensão da molécula à proteólise, ou ainda
promover mutações, translocações e degradações no DNA dentre outras
(SCANDALIOS, 2005). Caso estas espécies reativas não sejam eliminadas pelo
sistema de defesa, enzimático e não-enzimático, e se acumulem no organismo,
ocorrerá um desequilíbrio conhecido como estresse oxidativo, causa primária de
muitas doenças crônico-degenerativas.
Estudos indicam ação protetora dos flavonoides na prevenção de doenças
como o câncer (KAMPA et al. 2007, YANG et al., 2009), cardiovasculares,
desordens neurológicas e metabólicas, dentre outras associadas à inflamação
crônica (PAN et al., 2010), e também na proteção da pele à oxidação e perda de
elasticidade (CORNELLI, 2009).
Com relação aos efeitos benéficos dos fenólicos presentes nas uvas e
derivados sobre a prevenção de doenças cardiovasculares, acredita-se que a
redução das lesões causadas pela aterosclerose e oxidação do LDL, remoção dos
radicais livres minimizando o estresse oxidativo e a modulação da sinalização celular
para a inflamação e agregação plaquetária sejam os principais mecanismos
(LEIFERT e ABEYWARDENA, 2008). O resveratrol, mais precisamente, tem
ganhado notoriedade devido aos estudos atribuírem a ele ações contra certos tipos
de câncer, efeitos neuroprotetor e cardiovascular além da atividade anti-inflamatória
e antienvelhecimento (DAS e MAULIK, 2006).
Embora, inicialmente, a teoria do paradoxo francês sugerisse que parte dos
efeitos benéficos da dieta com alta ingestão de vinho tinto fosse do etanol outros
estudos indicaram que os efeitos benéficos independiam da presença do etanol
(GAZIANO et al., 1993) e estariam relacionados aos compostos fenólicos presentes
nas bebidas (VINSON et al., 2001). Com isso, não somente as bebidas, mas
também extratos de partes como casca e sementes vêm ganhando espaço nas
47
pesquisas para um aproveitamento mais nobre com funcionalidades diversas, desde
aditivos naturais com ação antioxidante, conservante microbiano, corante,
suplementos com funcionalidade biológica dentre outras.
Os extratos aquoso e metanólico de uvas viníferas gregas, Mandilaria (tinta) e
Assyrtiko (branca), tiveram o solvente removido por evaporação a vácuo e foram
adicionados juntamente aos indutores de mutagenicidade, bleomicina e peróxido de
hidrogênio (H2O2), às cepas de Salmonella typhimurium TA102, usualmente
empregadas em testes de antimutagencicidade. Os extratos exibiram atividade
antimutagênica, muito provavelmente por remover os radicais livres e/ou complexar
íon ferroso (Fe+2), contudo, não foi observada a mesma resposta quando os ensaios
foram realizados com frações metanólica e de acetato de etila ricas em alguns
fenólicos, sugerindo que a atividade antimutagênica está relacionada ao sinergismo
dos compostos nos extratos não purificados ou ainda decorrentes de outros
compostos além dos fenólicos isolados nas frações mencionadas.
O extrato de semente de uva foi administrado por 12 semanas em hamsters,
verificando-se uma redução de 25% do colesterol plasmático e 68% da
aterosclerose (AUGER et al., 2004). Os extratos de casca e sementes de uva
inibiram a agregação plaquetária em sangue humano através de teste in vitro em
12,7% quando testados isolados e 96,5% quando os extratos foram administrados
juntos. Contudo, em testes ex vivo com sete cachorros a agregação plaquetária foi
inibida em 31,9% somente quando a dose continha os dois extratos e, este efeito foi
potencializado atingindo uma inibição de 56,2% quando além dos extratos de uva os
cachorros receberam uma dose de um blend enzimático de proteases. O efeito dos
extratos foi mantido após 24 horas da administração da última dose, garantindo,
desta forma, o efeito antiplaquetário até a dose seguinte (SHANMUGANAYAGAM et
al. 2002).
Bagchi et al. (2000) avaliaram um extrato comercial concentrado de
proantocianidinas de semente de uva em ensaios in vitro e in vivo, que indicaram
elevada atividade antioxidante e proteção ao estresse oxidativo. O extrato também
apresentou excelente proteção contra lesão de isquemia e reperfusão do miocárdio,
assim como na proteção do infarto do miocárdio. Em humanos a aplicação tópica do
mesmo extrato aumentou a proteção solar e a suplementação melhorou a
pancreatite crônica.
48
No estudo de Kataliníc et al. (2010), com 14 cultivares de uvas viníferas tintas
e brancas, verificou-se que os extratos de uvas brancas apresentaram, em média,
menores valores de concentração mínima inibitória para as cepas de
Staphylococcus aureus, Bacillus cereus, Campylobacter coli, Escherichia coli
O157:H7 e Salmonella infantis, sendo, portanto, mais eficientes como
antibacterianos. Os extratos de uvas tintas, por sua vez, apresentaram maiores
teores de compostos fenólicos totais, flavonóis e antocianinas e, apresentaram maior
poder redutor que os extratos de uvas brancas. Assim, a aplicabilidade dos extratos
de uvas tintas e brancas pode ser direcionada de modo a maximizar a
potencialidade de cada um frente às características físicoquímicas e ao perfil em
fenólicos inerentes aos mesmos.
O extrato de uva Isabel aplicado em salsichas por imersão mostrou ser
eficiente na redução de bactérias ácido-lácticas causadoras de limosidade um dos
grandes problemas deste produto (MARDIGAN et al., 2009). Em outro estudo, a
atividade antibacteriana do extrato de semente de uva foi testado contra doze cepas
diferentes de Campylobacter (jejuni e coli) e a inibição do crescimento bacteriano
variou de 5,08 a 6,97 (log UFC.mL-1 extrato). O gênero Campylobacter é o principal
causador de diarreia alimentar e, compreende 17 espécies das quais 14 já foram
associadas a doenças humanas (PARK, 2002). Um dos principais veículos é a carne
de aves domésticas em especial a de frango fresco e, neste sentido, o extrato
poderia ser introduzido na cadeia produtiva de modo a diminuir a contaminação de
alimentos por estas bactérias.
Os extratos comerciais de bagaço e semente de uva foram testados como
suplementos em sistema alimentício para obtenção de produtos desidratados por
soluções osmóticas e incrementaram a concentração de compostos fenólicos que
atingiu 7.176 mg GAE.kg-1, superior ao encontrado em cranberries (5.272 mg
GAE.kg-1) e tida pelos autores como uma das frutas mais ricas em compostos
fenólicos (RÓZEK et al., 2010).
Por outro lado, as indústrias de alimentos vêm buscando substituir os aditivos
sintéticos por naturais devido à demanda dos consumidores e à legislação mais
rígida, sustentada por estudos que indicam efeitos nocivos daqueles à saúde como
carcinogenicidade, reações alérgicas, alterações no metabolismo dentre outras.
49
Assim os extratos vegetais são alternativas interessantes, principalmente quando
obtidos de fontes mais econômicas como de co-produtos ou por biotecnologia.
No Brasil, os antioxidantes butil-hidroxi-anisol (BHA), butil-hidroxi-tolueno
(BHT), galato de propila (PG) e terc-butilhidroquinona (TBHQ) ainda são permitidos
com limite de uso máximo de 100 a 200 mg.kg-1, porém ainda que estudos tenham
indicado um limite de uso seguro, o Canadá e a comunidade europeia não permitem
o uso de TBHQ e o BHA e BHT são considerados potencialmente tóxicos (FOOD
INGREDIENTS, 2009). Assim os extratos naturais ricos em compostos antioxidantes
podem ser alternativas interessantes e vem sendo avaliados como substitutos.
Negro et al. (2003) avaliaram a atividade antioxidante dos extratos de bagaço de uva
pelo método in vitro de branqueamento do β-caroteno encontrando 90% da atividade
antioxidante de BHT com 160 ppm dos extratos. Vale ressaltar, porém, que os
compostos fenólicos são compsotos solúveis em meio aquoso estando portanto
mais aptos a atuar em sistemas aquosos. A solubilidade e compatibilidade com o
sistema ao qual será aplicado são características importantes a serem avaliadas
para a escolha do antioxidante. É possível que a microencapsulação em sistemas
lipídicos permitisse a aplicabilidade em meios lipofílicos com maior eficiência.
A substituição dos corantes sintéticos por corantes naturais é de grande
interesse das indústrias, principalmente pela demanda dos consumidores por
produtos naturais e pela maior rigidez das legislações, suportadas em estudos como
o de McCann et al. (2007) que indicaram que os corantes sintéticos contendo
compostos azo podem ser prejudiciais à saúde das crianças. Desta forma,
pesquisas com fontes baratas e estáveis de corantes naturais como as betalaínas,
os carotenoides e as antocianinas vêm sendo conduzidas, mas, em muitos casos, a
estabilidade é um ponto crítico, principalmente para as antocianinas por serem
compostos altamente instáveis e susceptíveis à degradação por pH, oxigênio,
temperatura, enzimas e outros.
Sabe-se que o maior grau de metoxilação assim como o número, estrutura e
localização dos grupos acilas no resíduo glicosil incrementam a estabilidade das
antocianinas, porém estes são fatores inerentes à origem genética da fonte das
antocianinas. Assim, estudos de estabilidade têm sido conduzidos para minimizar
estes problemas. Extratos mais concentrados tendem a ter maior estabilidade, pois
as reações entre as moléculas de antocianinas são favorecidas estas se estabilizam
50
através de reações hidrofóbicas (STRINGHETA e BOBBIO 2000). A
microencapsulação por meio de técnicas como spray drying (NAZARRO et al.,
2012), e também pela copigmentação, que pode ser intermolecular com ácidos
fenólicos (GRIS et al., 2007) e outros flavonoides não coloridos (TALCOTT et al.,
2005), ou, ainda, a complexação com íons metálicos permitem uma maior
estabilidade das antocianinas.
BUCHWEITZ et al. (2013) produziram corantes azuis naturais através da
quelação das antocianinas de três diferentes extratos com íons férrico que foram
aplicados com sucesso em sistemas alimentícios sugerindo um potencial uso como
corante natural.
Tendo em vista este cenário, um destino alternativo e mais nobre para o
bagaço de uva poderia ser a obtenção de extratos ricos em compostos bioativos que
além de trazer benefícios econômico e ambiental à agroindústria, agregaria valor ao
co-produto, diminuindo o custo com o tratamento do mesmo. Entretanto, de um
modo geral, a não especificidade e quantidade dos solventes empregados, a
extração de outros constituintes da matriz vegetal podem demandar processos
subsequentes para remover alguns compostos, purificar ou concentrar o extrato
obtido visando aumentar a estabilidade dos mesmos. Assim, a estabilização não
somente das antocianinas, que são mais instáveis, mas também dos demais
fenólicos é de grande interesse para a obtenção de extratos concentrados para as
mais diversas aplicações, podendo inclusive potencializar algumas atividades como
a antioxidante e antimicrobiana por mecanismos sinérgicos.
4.3. PROCESSOS DE SEPARAÇÃO POR MEMBRANAS
Os processos de separação por membranas aplicados industrialmente são
recentes, apesar de o primeiro estudo relatando fenômenos envolvendo membranas
ser de 1748 com Abade Nollet, que emergiu em água pura um copo contendo
destilado de vinho e vedado com uma bexiga de origem animal, que após certo
tempo estufou e, em alguns casos, rompeu-se, evidenciando, com esta experiência,
a permeabilidade e a seletividade da membrana. Porém os fundamentos teóricos
destes processos só foram elucidados recentemente (CHERYAN, 1998; HABERT et
al., 2006).
51
Os processos de separação por membrana baseiam-se na permeabilidade
seletiva de alguns compostos do material através do meio filtrante, por meio de uma
força motriz. A composição da membrana e o tipo de força motriz utilizado definem
os diferentes processos: microfiltração, ultrafiltração, nanofiltração, diálise, osmose
inversa, evaporação osmótica, pervaporação, permeação de gases (PORTER,
1990).
Os processos de micro, ultra e nanofiltração utilizam membranas porosas cuja
seletividade é caracterizada pela diferença de tamanho entre as moléculas da
solução e os poros da membrana; promovendo, então, um fluxo convectivo com
escoamento do permeado nos poros. No processo de osmose inversa utiliza-se uma
membrana densa, sendo a força motriz a diferença de pressão aplicada ao sistema.
Estes processos diferem entre si pelo tamanho dos poros das membranas, que
diminuem da microfiltração para a nanofiltração (0,6 µm a 100 Da) e quase inexistem
nas membranas densas, aumentando a resistência à permeação e,
consequentemente, a diferença de pressão aplicada (Figura 4.16).
Figura 4.16-Processos de separação por membranas em função do tamanho dos poros
Nos processos de osmose inversa, o fluxo de solvente ocorre no sentido
inverso ao do fenômeno denominado osmose, no qual o potencial químico entre as
fases separadas por uma membrana semipermeável promove a permeação do
solvente da solução mais diluída para a mais concentrada até que se atinja o
equilíbrio. Desta forma, para que ocorra a permeação do solvente no processo de
osmose inversa, a pressão aplicada à solução concentrada tem de ser superior à
pressão osmótica da mesma. O solvente neste caso consiste basicamente de água,
Cab
ral,
L. M
. C
52
pois as membranas densas utilizadas possuem tamanho de corte de 10-4 a 10-2µm
retendo solutos de muito baixo peso molecular como sais, açúcares simples ou
demais moléculas com massa molecular acima de 50 Daltons (HABERT et al.,
2006).
Independente do tipo de força motriz aplicada ao sistema, o fluxo será difusivo
nos processos envolvendo as membranas densas (osmose inversa, pervaporação e
permeação de gases), ou seja, haverá interação entre os componentes da
membrana e o solvente e, no caso da diálise, em que as membranas podem ser
porosas ou densas, o fluxo também será difusivo já que a força motriz aplicada é a
diferença de concentração. Nos processos que empregam membranas porosas e a
pressão como força motriz o fluxo de permeado será convectivo, e nestes casos, os
efeitos de entupimento podem ocorrer (CHERYAN 1998, HABERT et al., 2006).
Os processos de separação por membranas geralmente ocorrem à
temperatura ambiente, trazendo como vantagens o baixo custo energético, a
preservação de compostos termo sensíveis, a seletividade do meio filtrante e o fácil
escalonamento, por se tratar de sistemas modulares. Porém, o custo de reposição
da membrana, a diminuição do fluxo ao longo do processo e a limpeza dos sistemas
são algumas das desvantagens. Mesmo utilizando o fluxo tangencial (Figura 4.17),
verifica-se a diminuição do fluxo de permeado ao longo do processo, consequência
do fenômeno conhecido como fouling, que se caracteriza pelo aumento da
resistência à passagem do solvente pela membrana, que pode ser resultante tanto
da diminuição da porosidade (entupimento, adsorção) quanto da polarização de
concentração e formação de camada gel na superfície da membrana.
53
Figura 4.17 – Esquemas de filtração convencional (A) e com fluxo tangencial (B)
A permeabilidade hidráulica é um fator característico de cada membrana e
pode ser definido como o inverso da resistência intrínseca da mesma. Ela pode ser
determinada pela medida da quantidade de água que permeia a membrana em um
determinado tempo, por unidade de área e por unidade de pressão. Porém, o fluxo
de permeado pode ser reduzido drasticamente quando a alimentação deixa de ser a
água, devido aos fatores mencionados anteriormente, entupimento e polarização de
concentração. Como o fluxo de permeado é influenciado pela pressão e
temperatura, estas variáveis podem ser ajustadas de modo a favorecer o
escoamento e modificar as propriedades reológicas do fluido, minimizando os efeitos
de tais fatores e, com isso, garantir maiores rendimentos operacionais.
O uso de tecnologias de processamento mais amenas, como os processos de
separação por membranas, pode ser uma alternativa com grande potencial para se
concentrar e, de certa forma, atingir uma maior estabilidade dos compostos fenólicos
que são facilmente degradados por oxigênio, pH, temperatura e outros (NAZCK e
SHAHIDHI 2004). O crescente interesse por compostos bioativos e produtos
funcionais também tem sido observado nas pesquisas com membranas. Patil e
Raghavarao (2007) avaliaram os processos de ultrafiltração, osmose inversa e
destilação osmótica e suas combinações, para a obtenção de um concentrado de
Men
ezes
, L. F
. S.
B
A
54
antocianinas da casca de rabanete, sendo a combinação dos três processos o mais
atrativo quando comparado com os processos isolados. O extrato inicial foi
concentrado 25 vezes em sólidos solúveis (1 a 26ºBrix) e, atingido um fator similar
na concentração das antocianinas cuja concentração passou de 40 mg.100 mL-1
para 980 mg.100 mL-1.
Os processos de separação por membranas, em especial, ultrafiltração,
nanofiltração e osmose inversa, vêm sendo testadas com sucesso na concentração
de compostos bioativos. Díaz-Reinoso et al. (2009) testaram cinco membranas,
sendo duas de ultrafiltração e três de nanofiltração, para a concentração de extrato
aquoso de bagaço de uva destilado. Os coeficientes de rejeição de fenólicos
variaram de 61,4 a 100,0% em função das membranas, sendo o menor fator obtido
com a membrana cerâmica de ultrafiltração. As membranas poliméricas
apresentaram-se similares, e os coeficientes de retenção de fenólicos ficou entre 98
e 100%.
Couto et al. (2011) avaliaram seis membranas de nanofiltração de poliamida e
os coeficientes de retenção das antocianinas de suco de açaí clarificado foram de,
no mínimo, 98%. A concentração do suco de uva por osmose inversa, a diferentes
temperaturas, propiciou um coeficiente de retenção das antocianinas de no mínimo
99%, em estudo realizado por Santana (2009).
A nanofiltração foi avaliada para a recuperação de compostos fenólicos do
licor da prensagem do bagaço da laranja vermelha (blood orange), permitindo a
separação parcial destes compostos e dos açúcares. Quatro membranas
poliméricas foram testadas e, para as antocianinas o índice de rejeição foi de no
mínimo 89%, superior, em alguns casos, aos coeficientes de rejeição dos
flavonoides. O pH da alimentação (~3,4) contribuiu para a maior retenção das
antocianinas, pois neste pH tanto as antocianinas quanto as membranas
apresentam carga positiva. Assim, é provável que a repulsão eletrostática entre as
moléculas de antocianinas e as membranas tenha dificultado a permeação das
antocianinas, ainda que estas se apresentem estruturalmente mais favoráveis à
permeação do que outros flavonoides. Assim, dentre as membranas avaliadas, a
membrana de polietersulfona (NFPES10) foi a que permitiu retenção de 89,2% de
antocianinas, 70% de flavonoides e menos de 25% dos açúcares, sendo a mais
indicada para a separação de fenólicos e açúcares (CONIDI et al., 2012)
55
A concentração de extratos bioativos de repolho roxo por nanofiltração e
osmose inversa também vem sendo avaliada. Porém, a extração dos compostos
bioativos com solventes é mais eficiente que a extração aquosa como comprovado
por CHANDRASEKHAR et al. (2012) que conseguiram extrair quase duas vezes a
quantidade de antocianinas ao substituir a água por solução de etanol 50% em água
acidificada contendo 1% de HCl 1%. A presença do solvente, por sua vez, pode
dificultar a concentração por membranas poliméricas, pois os solventes podem
interagir com o material constituinte da membrana modificando-o de forma a perder
as características de permeabilidade, seletividade e até a integridade das mesmas
(TSUI e CHERYAN, 2004). E, ainda, a presença de solventes também pode limitar a
aplicação dos extratos sendo interessante a remoção do mesmo.
Os extratos aquoso e etanólico de pequi foram submetidos à nanofiltração,
empregando membrana de poliamida a 25°C e 8.000 kPa de pressão, para a
concentração dos compostos fenólicos e carotenóides. A presença de etanol no
extrato modificou drasticamente as características de seletividade da membrana de
modo que, os coeficientes de retenção que, em meio aquoso, eram de 100% e 97%
para os fenólicos e carotenóides, respectivamente, passaram para 15 e 10% com o
extrato etanólico (MACHADO et al., 2013).
Leidens (2011) precisou reduzir o teor de etanol do extrato de bagaço de uva
de 60% para 18% para que o processo de osmose inversa fosse possível. A
membrana empregada apresentou seletividade ao etanol, e o processo conduzido a
50°C, 5 bar de pressão e 40 L.h -1 de vazão de recirculação permitiu, ao final de duas
horas de processo, obter um retido com apenas 2% de etanol e com 98,5% de
retenção das antocianinas monoméricas.
A desalcolização de vinhos vem sendo uma demanda recente e processos
como evaporação, destilação, destilação a vácuo, adsorção, processos de sepração
por membranas (diálise ou osmose inversa), dentre outros, vêm sendo avaliados. Os
processos com membranas, por serem conduzidos sob condições amenas, têm
permitido poucas alterações nas características sensoriais (BOGIANCHINI et al.,
2011; LABANDA et al., 2009). O condicionamento das membranas é fator
determinante para que condições operacionais sejam atingidas, mas as
características dos solventes irão impactar sobre as propriedades das membranas. A
massa molar de corte deve ser determinada para cada solvente, pois este parâmetro
56
determinado em sistema aquoso é insuficiente para caracterizar as membranas
(TSUI e CHERYAN, 2004). Assim, além destas considerações o conhecimento dos
solutos quanto à estrutura, conformação, carga e outros, como já mencionado
anteriormente afetam o fluxo.
Nawaz et al.(2006) utilizaram a mistura etanol:água (50:50 v/v) para extrair os
polifenóis presentes na semente de uva e concentraram o extrato empregando uma
célula de ultrafiltração de escala laboratorial. A membrana empregada apresentou
elevada seletividade e, por ter sido conduzida a 23 + 1ºC, os compostos
termosensíveis foram preservados e concentrados.
Patil et al. (2009) empregaram dois processos de destilação osmótica, um
para a remoção do etanol e outro para posterior concentração das antocianinas
presentes em um extrato hidroetanólico de casca de rabanete. Na etapa de
desalcoolização, a solução de salmoura empregada nos processos de destilação
osmótica foi substituída por água pura, que circulou continuamente, permitindo além
da remoção completa do etanol a concentração das antocianinas em mais de 67%.
O extrato desaclolizado foi concentrado quase oito vezes por destilação osmótica.
Desta forma, os processos integrados de destilação osmótica permitiram concentrar
extrato inicial contendo 37 mg.100mL-1 atingiu 485 mg.100mL-1 processos integrados
permitiram em quase oito vezes por destilação osmótica.
Embora um dos fatores que podem atuar na estabilidade das antocianinas
seja o aumento da concentração das mesmas em solução, estas ainda permancem
muito instáveis em meio aquoso ou hidroetanólicos quando comparadas aos pós ou
microencapsulados. Clemente e Galli (2011) conseguiram uma maior estabilidade
das antocianinas presentes no extrato de bagaço de uva contendo 70% de etanol e
pH 2,0 com a adição de ácido caféico na proporção de 1:2 (ácido:extrato) com uma
meia vida de 15 dias e retenção de 87,5% da cor. Gris et al. (2007) também
adicionaram ácido cafeico na razão de 1:1 (massa:volume) aos extratos de Cabernet
Sauvignon isolado e adicionado ao sistema modelo de iogurte mantidos na ausência
da luz, pH 3,0 e armazenados a 4 + 1°C, contudo a c opigmentação intermolecular
neste caso foi bem mais efetiva e a meia vida nestas condições foi de 6.930 h e
6.673 h para o extrato e iogurte, respectivamente.
4.4. SECAGEM POR SPRAY DRYING
57
A secagem por atomização ou spray drying data do século XVIII, mas
somente na década de 1920 passou a ser aplicado em nível industrial. Por esta
técnica o líquido que alimenta o sistema é aspergido finamente, entrando em contato
com uma corrente de gás aquecido a temperaturas superiores a 100°C e desta
forma, o líquido é instantaneamente evaporado, formando o produto em pó
(GHARSALLAOUI et al., 2007). Os líquidos a serem processados podem ser
emulsões, soluções ou suspensões, sendo que em algumas situações, dependendo
da composição da alimentação, o processo de secagem pode vir a ser um processo
de microencapsulação, no qual alguns compostos são protegidos por matrizes
poliméricas.
A microencapsulação é um processo pelo qual partículas ou gotículas são
revestidas por um material de parede, formando as microcápsulas. A matriz que
constitui o material de parede pode ser homogênea ou heterogênea e as
propriedades requeridas das cápsulas como proteção química e mecânica, liberação
controlada, ou outros, podem ser atingidas manipulando-se a composição da matriz.
Por outro lado, o material a ser revestido pode ser composto por sólidos, líquidos ou
gases (GHARSALLAOUI et al., 2007). Os primeiros produtos encapsulados foram
obtidos em meados de 1950, embora os estudos tenham sido iniciados na década
de 1930. Por muito tempo, a microencapsulação ficou restrita às indústrias
farmacêuticas, principalmente por permitir a liberação controlada do princípio ativo,
mascarar sabores indesejáveis e aumentar a estabilidade de formulações (GIBBS et
al., 1999). Em alimentos os estudos sobre microencapsulação se iniciaram na
década de 1960, com óleos essenciais, visando evitar a perda de voláteis, promover
liberação controlada de aromas e reduzir a oxidação (RÉ, 1998).
Os processos de encapsulação visam aumentar a estabilidade do material a
ser encapsulado frente a diversos fatores, permitir a liberação controlada, evitar
perda de compostos voláteis. Para os compostos bioativos, como os compostos
fenólicos, a microencapsulação vem sendo largamente avaliada e testada devido
aos ganhos efetivos com a estabilidade, aumento da meia-vida e, redução dos
sabores desagradáveis, quando comparado ao uso dos mesmos compostos na
forma livre. Os agentes de parede mais utilizados são amidos, amidos modificados,
maltodextrinas, goma arábica, misturas destes agentes (FANG e BHANDARI, 2010),
mas também quitosana (KOSARAJU et al., 2006), fibra de frutas (CHIOU e
58
LANGRISH, 2007) e emulsão lipoproteica de lecitina de soja e caseinato de sódio
(KOSARAJU et al., 2008).
As microcápsulas podem ser formadas por diversas técnicas como a
secagem por atomização, coacervação, aprisionamento em lipossomas,
revestimento em leito fluidizado, revestimento por extrusão, dentre outros. A
microencapsulação por spray drying, por sua vez, vem sendo mais largamente
empregada pela indústria alimentícia pelo baixo custo relativo aos demais processos
como liofilização que chega a ser 30 a 50 vezes superior (GHARSALLAOUI et al.,
2007). Outra característica importante da microencapsulação por spray drying, que
tem favorecido sua disseminação em alimentos, é que a rápida formação das
cápsulas protege o material do núcleo mesmo sob as condições de temperatura
elevada, permitindo assim poucas perdas e preservação, inclusive, de compostos
termo sensíveis, como os compostos fenólicos (FANG E BHANDARI, 2010)
A alimentação do processo de spray drying deve ser uma solução, emulsão
ou uma suspensão, assim o material de parede deve ter certa solubilidade, mas
também a capacidade de formar filmes e emulsões sem aumentar muito a
viscosidade, além de serem inodoros não higroscópicos e insípidos
(GHARSALLAOUI et al., 2007; SANGUANSRI e AUGUSTIN, 2010). Embora as
possibilidades naturais e sintéticas sejam inúmeras, as opções aprovadas para
alimentos são reduzidas o que, muitas vezes, acaba sendo um fator limitante. Diante
disso, os materiais de parede mais empregados são biopolímeros naturais de
diversas fontes como gomas, proteínas, amidos, gorduras, alginatos, ceras, entre
outros, usados sozinhos ou em combinações. As pesquisas atuais em alimentos têm
focado em agentes encapsulantes alimentícios de mais baixo custo, assim como em
processos viáveis. A liberação controlada ainda é um foco de grande interesse
investigativo, como também a introdução de inibidores de amargor ou realçadores
de sabor nos sistemas de microencapsulação (SANGUANSRI e AUGUSTIN, 2010).
As etapas de obtenção do microencapsulado envolvem basicamente a
obtenção da alimentação (emulsão ou solução), homogeneização, a atomização e a
desidratação das partículas atomizadas. O material de parede, as condições
operacionais como temperatura no atomizador e no tubo coletor e a vazão de
alimentação irão influenciar as características e a granulometria do pó. Quanto à
morfologia, basicamente tem-se microcápsulas e microesferas, sendo que nas
59
primeiras o material do núcleo fica no centro totalmente envolto pela matriz,
enquanto que nas microesferas o núcleo está uniformemente disperso na matriz. Os
pós obtidos por secagem por atomização são do tipo microesferas (Figura 4.18)
Figura 4.18- Microesferas produzidas por spray drying (Fang e Bhandari, 2010).
As características de maior estabilidade, a possibilidade de mascarar sabores
indesejáveis, facilitar e permitir maior aplicabilidade, homogeneidade, maior proteção
da bioatividade e biodisponibilidade dos fenólicos microencapsulados têm feito com
que estes se destaquem em relação aos extratos líquidos contendo fenólicos livres
(SANGUANSRI e AUGUSTIN, 2010).
Os processos de microencapsulação de compostos bioativos, de um modo
geral, são avaliados quanto à perda durante o processo determinando-se o
coeficiente de retenção, que é o percentual, em base seca, da massa da substância
de interesse no produto final frente ao total presente na alimentação. Os agentes
encapsulantes afetam o rendimento e o coeficiente de retenção, como verificado por
Sansone et al. (2011), que conseguiram maior eficiência na microencapsulação de
fenólicos nos extratos comerciais dos nutracêuticos, Melissa, Fadogia e Tussilago,
com a mistura de maltodextrina 16 DE (dextrose equivalente) e pectina (70-75% GE
– grau de esterificação) na proporção de 10:1.
Idham et al. (2012) avaliaram maltodextrina com DE de 11 – 15, goma arábica
e misturas dessas na microencapsulação de antocianinas de extrato de Hibiscus
sabdariffa. Em todos os ensaios a matriz foi adicionada até que se atingisse 20°Brix.
O pH foi mantido entre 2,5 a 3,0 e as temperaturas ajustadas para 160/100°C
(entrada/saída). Os autores verificaram que a mistura de maltodextrina e goma
arábica na razão 60:40 foi a mais eficiente, pois permitiu dobrar o tempo de meia
vida das antocianinas a 60°C quando comparada ao co ntrole.
Fenólicos
(solúveis em água)
Matriz
Fenólicos
(insolúveis em água)
Matriz
60
As temperaturas de entrada e de saída do ar também afetam a estabilidade e
coeficiente de retenção. Ersus e Yurdagel (2007) avaliaram a influência da
temperatura de processo (160/107ºC; 180/118 ºC; 200/130 ºC, entrada/saída) e do
material de parede (maltodextrinas 10, 20 e 30 DE) sobre a concentração e
estabilidade das antocianinas de extrato de cenoura preta (Daucuscarota, L), e
constataram maiores perdas com o aumento da temperatura do processo, sendo
que a maltodextrina DE10 foi a mais indicada por reter melhor os pigmentos.
Cai e Corke (2000) verificaram a influência da temperatura de processo e do
material de parede sobre a retenção e estabilidade de betacianinas de Amaranthus e
obtiveram perdas pequenas, de 2,8 a 7,7%. As maiores perdas ocorreram a 195 e
210°C, corroborando com os resultados previamente a presentados na literatura.
Assim, os autores sugerem que os processos sejam conduzidos com temperaturas
inferiores a 180°C. Dentre os materiais de parede t estados, a mistura de
maltodextrinas DE 10 e 25 na razão 1:3 foi a que promoveu maior estabilidade. Além
da temperatura a umidade relativa (UR) de armazenagem influencia a estabilidade
dos pós microencapsualdos como verificado pelos referidos autores, que
conseguiram após 16 semanas a 25°C, uma retenção de 96,6% dos pigmentos a 5%
de UR enquanto que a 32% de UR a retenação caiu para 88,1%.
A umidade relativa do ar interfere na estabilidade dos pós, pois são capazes
de adsorver água do ambiente em que se encontram, e a água, por sua vez, é
necessária para diversas reações químicas e microbiológicas responsáveis pela
dissolução do pó e degradação do alimento. A atividade de água (aw) é um
parâmetro mais relevante que a umidade por indicar o quanto a água presente no
alimento está na forma livre ou fracamente ligada (FENNEMA, 1996).
As isotermas de sorção de umidade descrevem a relação entre a atividade de
água (aw) e o teor de umidade de equilíbrio de um alimento em uma dada
temperatura. Desta forma, são ferramentas importantes para a determinação da
umidade de equilíbrio, característica importante para as etapas de estocagem,
manuseio, processamento. As isotermas estão divididas em três fases, porém nem
sempre a distinção entre as fases ocorre facilmente. Na primeira fase a aw varia de
0-0,35 que representa a adsorção da água na monocamada (LABUZA, 1968 apud
TONON, 2009). A região correspondente à segunda fase (aw 0,35-0,60) representa a
água adsorvida pelas camadas adicionais à monocamada. E a terceira fase,
61
geralmente acima de 60%, corresponde à região em que ocorre a solubilização do
material (FENNEMA, 1996). Em microencapsulados alimentícios o valor da umidade
da monocamada varia de 0,05 a 0,11 (BRENNAN, 2006).
As isotermas de sorção podem ser do tipo adsorção, obtidas com a
hidratação do material, ou de dessorção, obtidas com a secagem do material. As
isotermas de adsorção são obtidas através da determinação da umidade de
equilíbrio do microencapsulado sob diferentes condições de atividade água (aw)
obtidas com soluções supersaturadas de sais conhecidos, mantidos a uma
temperatura controlada pré-definida. A umidade de equilíbrio é atingida quando o
produto é exposto à dada condição de umidade por longo período, neste ponto as
pressões de vapor de água do alimento (P) e do ar (P0) circundante são as mesmas.
Na condição de equilíbrio a umidade relativa correlaciona-se com a aw do meio de
acordo com a Equação 4.1.
[4.1]
As isotermas são construídas empregando modelos matemáticos e os mais
utilizados em alimentos são os de BET (BRUNAUER, EMMETT e TELLER, 1938) e
GAB (GUGGENHEIM-ANDERSON-DE BOER) os quais baseiam-se na adsorção de
água na monocamada molecular e permitem a determinação da quantidade de água
fortemente ligada (Xm), sendo este um valor ótimo para garantir a estabilidade do
produto (FENNEMA, 1996).
Tonon et al. (2010) encontraram teores de umidade na monocamada
molceluar de 3,2% a 6,3% para os sucos de açaí em pó obtidos com diferentes
agentes encapsulantes calculados pelo modelo de GAB, verificando ainda que o
aumento no teor de dextrose equivalente aumenta a higroscopicidade do pó.
A avaliação de distintos materiais de parede, condições operacionais e de
armazenagem que permitam uma maior estabilidade e menor perda dos compostos
bioativos, bem como a caracterização dos pós obtidos, foram e continuam sendo
objetos de estudo com diferentes matérias-primas. Porém, uma maior compreensão
das propriedades e mecanismos da atuação dos fenólicos na prevenção e
62
tratamento de doenças pode direcionar as pesquisas nesta área de modo a
aproveitar os sinergismos possíveis, novas tecnologias para liberação controlada em
sítios alvos, dentre outras (FANG e BHANDARI, 2011).
63
5. MATERIAL E MÉTODOS
5.1. MATÉRIA PRIMA
Experimentos preliminares foram realizados com o bagaço obtido nas Plantas
Piloto I e II da Embrapa Agroindústria de Alimentos, Rio de Janeiro/RJ, denominado
“ BE” – bagaço experimental. A uva rosada foi adquirida no comercio local e, após
higienização, foi desengassada e acondicionada em sacos confeccionados com tela
nylon de 150 µm. .Os frutos embalados foram então esmagados em prensa
hidráulica (Figura 5.1) para a obtenção do suco e bagaço.
Figura 5.1- Prensa hidráulica.
Os bagaços provenientes da indústria foram coletados na safra 2010/2011 e
gentilmente cedidos pela Vinícola Aurora. Os três diferentes bagaços (Figura 5.2)
utilizados neste trabalho resultaram da uva Isabel usada na elaboração do suco; da
uva tinta Pinot noir submetida ao processo de vinificação em branco e do. processo
Silv
a, L
. F. M
.
64
de vinificação tinta a partir da uva branca Chardonnay. Os bagaços foram
denominados “SU”, “VT”. e “VB”, respectivamente.
Figura 5.2 – Resíduos industriais.
5.2. PROCEDIMENTO EXPERIMENTAL
5.2.1. Seleção dos parâmetros operacionais da etapa de ext ração
Para selecionar a melhor condição de extração dos compostos bioativos
presentes no bagaço da uva foi realizado um planejamento experimental 24 com
triplicata no ponto central para dois processos distintos: aplicando-se tecnologia
enzimática em meio puramente aquoso e utilizando-se uma mistura binária de etanol
e água como solvente.
As variáveis de resposta avaliadas em todos os planejamentos experimentais
foram os teores de compostos fenólicos totais (SINGLETON e ROSSI, 1968
modificado por GEORGÉ et al., 2005), antocianinas totais e monoméricas (GIUSTI e
WROLSTAD, 2001) e atividade antioxidante (RE et al., 1999).
5.2.1.1. Extração enzimática aquosa
Para a avaliação da melhor condição de extração enzimática, foi realizado um
planejamento fatorial completo 24 com triplicata no ponto central (Tabela 5.1). Os
65
fatores avaliados foram a proporção solvente: substrato (massa:volume), dose do
preparado enzimático, pH e temperatura do meio extrator.
Tabela 5.1 Matriz do planejamento experimental da extração enzimática.
Ensaio T ºC pH Enzima¹ Razão S:S²
1 30 (-1) 2,0 (-1) 210 (-1) 1,0 (-1)
2 30 (-1) 2,0 (-1) 210 (-1) 3,0 (+1)
3 30 (-1) 2,0 (-1) 630 (+1) 1,0 (-1)
4 30 (-1) 2,0 (-1) 630 (+1) 3,0 (+1)
5 30 (-1) 4,0 (+1) 210 (-1) 1,0 (-1)
6 30 (-1) 4,0 (+1) 210 (-1) 3,0 (+1)
7 30 (-1) 4,0 (+1) 630 (+1) 1,0 (-1)
8 30 (-1) 4,0 (+1) 630 (+1) 3,0 (+1)
9 50 (+1) 2,0 (-1) 210 (-1) 1,0 (-1)
10 50 (+1) 2,0 (-1) 210 (-1) 3,0 (+1)
11 50 (+1) 2,0 (-1) 630 (+1) 1,0 (-1)
12 50 (+1) 2,0 (-1) 630 (+1) 3,0 (+1)
13 50 (+1) 4,0 (+1) 210 (-1) 1,0 (-1)
14 50 (+1) 4,0 (+1) 210 (-1) 3,0 (+1)
15 50 (+1) 4,0 (+1) 630 (+1) 1,0 (-1)
16 50 (+1) 4,0 (+1) 630 (+1) 3,0 (+1)
17 (PC) 40 (0) 3,0 (0) 420 (0) 2,0 (0)
18 (PC) 40 (0) 3,0 (0) 420 (0) 2,0 (0)
19 (PC) 40 (0) 3,0 (0) 420 (0) 2,0 (0)
¹ Enzima – valores em UI. 100g-1 bagaço; ² Razão S:S – razão solvente:substrato
A preparação enzimática comercial empregada nos experimentos foi a
Rapidase® TF (Aspergillus sp e Trichoderma longibrachiatum). Segundo dados do
fabricante (2010), ela apresenta atividade de hemicelulase e pectinase, podendo
então atuar na hidrólise da parede celular do bagaço da uva, aumentando assim a
66
liberação dos compostos bioativos para o meio. Os níveis de pH (2 - 4) e
temperatura (30 a 50ºC) foram estabelecidos com base nas características do
preparado enzimático (ANEXO A) e também visando a preservação dos compostos
bioativos de interesse, sendo as antocianinas os mais sensíveis à temperatura e pH.
Foi empregado ácido cítrico para o ajuste de pH da solução extratora uma vez que o
extrato tinha por finalidade aplicação em alimentos.
A quantidade de enzima adicionada foi baseada em dados da literatura
(SANTIAGO, 2010) e variou de 210 a 630 UI.100.g-1 bagaço (atividade de
poligalacturonase), enquanto que a razão solvente:substrato variou de 1:1 a 3:1.
A preparação enzimática foi diluída no volume correspondente da solução
extratora de cada ensaio antes de ser adicionada ao bagaço previamente pesado e
acondicionado em erlenmeyers. Os erlenmeyers foram tampados e transferidos para
um banho-maria com agitação orbital (60 rpm) e temperatura controlada onde foram
mantidos por 120 minutos. Os sólidos em suspensão foram reduzidos por filtração
em funil de Büchner, sem papel de filtro e, os extratos obtidos foram congelados a -
20°C até análise.
5.2.1.2. Extração hidroetanólica
Para a avaliação da melhor condição de extração hidroetanólica foi realizado
um planejamento fatorial completo 24 com triplicata no ponto central (Tabela 5.2). Os
fatores operacionais: proporção solvente:substrato (massa:volume), porcentagem de
álcool etílico na solução, pH e temperatura do meio extrator foram avaliados.
Os níveis de pH (2 a 4), temperatura (30 a 50ºC) e razão sólido:líquido (1:1 a
1:3), assim como o tempo de extração (120 minutos) foram iguais aos do
planejamento enzimático. O teor de etanol variou de 30 a 70 % com 50 % no ponto
central e teve por base dados reportados na literatura (POMPEU, SILVA e ROGEZ,
2009). Da mesma forma, o ácido cítrico também foi empregado para o ajuste do pH.
O bagaço foi pesado em erlenmeyers, a solução de extração correspondente
a cada ensaio foi adicionada e, após vedação, a mistura foi mantida em banho-maria
com agitação orbital (60 rpm) e temperatura controlada, nas condições do desenho
experimental. Após 120 minutos, os sólidos em suspensão foram reduzidos por
67
filtração em funil de Büchner, sem papel de filtro e, os extratos obtidos foram
congelados a-20°C até análise.
Tabela 5.2 - Matriz do planejamento experimental para a extração hidroetanólica.
Ensaio T ºC pH Etanol¹ Razão S:S²
1 30 (-1) 2,0 (-1) 30 (-1) 1,0 (-1)
2 30 (-1) 2,0 (-1) 30 (-1) 3,0 (+1)
3 30 (-1) 2,0 (-1) 70 (+1) 1,0 (-1)
4 30 (-1) 2,0 (-1) 70 (+1) 3,0 (+1)
5 30 (-1) 4,0 (+1) 30 (-1) 1,0 (-1)
6 30 (-1) 4,0 (+1) 30 (-1) 3,0 (+1)
7 30 (-1) 4,0 (+1) 70 (+1) 1,0 (-1)
8 30 (-1) 4,0 (+1) 70 (+1) 3,0 (+1)
9 50 (+1) 2,0 (-1) 30 (-1) 1,0 (-1)
10 50 (+1) 2,0 (-1) 30 (-1) 3,0 (+1)
11 50 (+1) 2,0 (-1) 70 (+1) 1,0 (-1)
12 50 (+1) 2,0 (-1) 70 (+1) 3,0 (+1)
13 50 (+1) 4,0 (+1) 30 (-1) 1,0 (-1)
14 50 (+1) 4,0 (+1) 30 (-1) 3,0 (+1)
15 50 (+1) 4,0 (+1) 70 (+1) 1,0 (-1)
16 50 (+1) 4,0 (+1) 70 (+1) 3,0 (+1)
17 (PC) 40 (0) 3,0 (0) 50 (0) 2,0 (0)
18 (PC) 40 (0) 3,0 (0) 50 (0) 2,0 (0)
19 (PC) 40 (0) 3,0 (0) 50 (0) 2,0 (0)
¹ Etanol – valores em % de etanol na solução extratora; ² Razão S:S – razão solvente:substrato.
5.2.2. Determinação da melhor condição de extração – resíd uos
industriais
A partir dos resultados preliminares obtidos nos itens 5.2.1.1 e 5.2.1.2, duas
condições experimentais foram selecionadas e testadas com o bagaço VB, por ser o
mais similar ao BE. Os resultados iniciais indicaram um rendimento cinco vezes
maior com a extração hidroetanólica sendo, portanto, descartada a extração
enzimática para os bagaços provenientes da indústria.
68
A validação da melhor condição de extração dos compostos bioativos
presentes nos bagaços industriais foi realizada utilizando um planejamento fatorial 23
com triplicata no ponto central (Tabela 5.3), tendo a razão solvente:substrato, o pH e
o teor de etanol como variáveis independentes avaliadas. A temperatura de extração
deixou de ser um fator a ser avaliado e foi fixada em 50 °C, uma vez que nesta
temperatura o processo foi eficiente e não ocorreu a degradação dos compostos de
interesse.
Devido às diferenças físico-químicas entre o bagaço BE e os resíduos
industriais (VB, VT e SU), foi inserida uma etapa de reidratação com água destilada
na razão de 1:2 (água:bagaço) em banho-maria a 30°C por 60 minutos previamente
à extração dos biocompostos. Após esta etapa, a solução extratora correspondente
a cada ensaio foi adicionada aos frascos e estes tampados e mantidos por 120
minutos em banho-maria com agitação orbital (60rpm) e temperatura de 50 °C. Os
sólidos em suspensão foram reduzidos por filtração em funil de Büchner sem papel
de filtro e os extratos pesados e congelados (-20 °C) até as análises.
Tabela 5.3- Matriz experimental para a extração hidroetanólica dos bagaços industriais.
Ensaio pH Etanol¹ RazãoS:S²
1 2,0 (-1) 30 (-1) 3,0 (-1)
2 2,0 (-1) 30 (-1) 9,0 (+1)
3 2,0 (-1) 70 (+1) 3,0 (-1)
4 2,0 (-1) 70 (+1) 9,0 (+1)
5 4,0 (+1) 30 (-1) 3,0 (-1)
6 4,0 (+1) 30 (-1) 9,0 (+1)
7 4,0 (+1) 70 (+1) 3,0 (-1)
8 4,0 (+1) 70 (+1) 9,0 (+1)
9 (PC) 3,0 (0) 50(0) 6,0 (0)
10 (PC) 3,0 (0) 50(0) 6,0 (0)
11 (PC) 3,0 (0) 50(0) 6,0 (0)
¹ Etanol – valores em % de etanol na solução extratora; ² Razão S:S – razão solvente:substrato.
69
Para o bagaço proveniente da vinificação branca (VB), alguns fatores
apresentaram dependência significativa com os termos de segunda ordem. Neste
caso, seis novos ensaios (Tabela 5.4) foram realizados e o planejamento fatorial 23
transformado em composto central.
Tabela 5.4 – Pontos axiais complementares do planejamento Composto Central.
Ensaio pH Etanol Razão S:S
1 1,32 (-1,68) 50(0) 6,0 (0)
2 4,68 (+1,68) 50(0) 6,0 (0)
3 3,0 (0) 16,36 (-1,68) 6,0 (0)
4 3,0 (0) 83,63 (+1,68) 6,0 (0)
5 3,0 (0) 50(0) 0,95 (-1,68)
6 3,0 (0) 50(0) 11,05 (+1,68)
¹ Etanol – valores em % de etanol na solução extratora; ² Razão S:S – razão solvente:substrato.
5.2.3. Cinética da extração
Para a determinação da cinética da extração, oito ensaios foram conduzidos a
50 ºC em banho-maria com agitação orbital (60 rpm) por 30, 60, 90, 120, 180, 240,
300 e 1440 minutos, empregando uma solução extratora contendo 30% de etanol e
pH ajustado para 4,0 com ácido cítrico na proporção de 9:1 de solvente:substrato.
Previamente à extração, os bagaços foram reidratados com água destilada na
proporção 1:2 (água:bagaço), por 30 minutos em banho-maria a 30 ºC.
Após o período estabelecido de cada ensaio, as misturas foram filtradas em
funil de Bücnher, sem papel de filtro e, os extratos obtidos pesados e avaliados
quanto aos teores de compostos bioativos (itens 5.3.5 e 5.3.3) e atividade
antioxidante (5.3.1). Para fins de modelagem matemática, foi determinada a
espessura média do bagaço usando-se um micrômetro digital (5.3.13) assim como o
teor de sólidos totais (5.3.10) nos resíduo após a extração. Os dados cinéticos foram
ajustados à equação de Fick para se obter o coeficiente de difusão dos compostos.
70
5.2.4. Eficiência da extração
Três extrações sequenciais foram realizadas para cada matéria-prima. Os
rendimentos observados na extração por 24 horas foram considerados como os
máximos possíveis e, por esta razão, empregados na determinação da eficiência da
extração.
A primeira extração foi conduzida com o bagaço reidratado nas mesmas
condições descritas no item 5.2.3 por 120 minutos em banho-maria a 50 °C e então
filtrada em funil de Büchner sem papel de filtro. Os bagaços retidos no funil foram
submetidos a duas outras extrações sequenciais, por 120 minutos em banho-maria a
50°C com a mesma solução de extração (Figura 5.3). Os filtrados foram recolhidos,
pesados, identificados e, congelados para posterior análise. Os extratos foram
avaliados quanto aos teores de compostos fenólicos totais (item 5.3.5), antocianinas
totais e monoméricas (item 5.3.3) e atividade antioxidante (item 5.3.1).
BAGAÇO FILTRADOS
BAGAÇO
IDENTIFICAÇÃOANÁLISES
REHIDRATAÇÃO(2:1 ÁGUA:BAGAÇO)
30°C 60'
EXTRAÇÃO(Etanol 30%, pH 4.0 razão
solv.:subst. 9:1)
FILTRAÇÃO(Funil de Büchner)
50°C 120'
DUAS VEZES
Figura 5.3 – Diagrama de processos para a determinação da eficiência da extração.
71
5.2.5. Extração em escala piloto
As extrações em escala piloto foram realizadas sob duas condições: a
primeira, com o maior rendimento, definida no item 5.2.2 para o bagaço VB: 70%
etanol, pH 4,0 e razão solvente:subtrato 9:1 e uma segunda condição, com menor
teor de etanol: 30% etanol, pH 4,0 e razão solvente:substrato 9:1. Para melhor
compreensão, o primeiro extrato foi denominado extrato 70% e somente foi
empregado nos testes preliminares.
Para a obtenção dos extratos hidroetanólicos, de 3 a 6 quilos de bagaço
foram previamente reidratados com água filtrada a uma razão 2:1 (bagaço:água) por
60 minutos a 30 °C em banho-maria. A extração sólid o:líquido foi conduzida por 120
minutos a 50 °C em tacho encamisado (Figura 5.4) so b agitação mecânica de 48
rpm empregando-se o volume de solução extratora correspondente a razão 9:1
(solução:bagaço). As soluções extratoras empregadas tiveram o pH ajustado para
4,0 com ácido cítrico e o teor de etanol foi de 70% para o extrato empregado nos
ensaios preliminares e de 30% de etanol para os extratos utilizados para a obtenção
dos concentrados.
Figura 5.4- Tacho encamisado
A separação das frações foi realizada em centrífuga de cestos (Figura 5.5) a
37,5 g, tendo como meio filtrante uma malha de nylon de 150 µm. O extrato obtido
foi homogeneizado, pesado e envasado em bombonas plásticas previamente
Silv
a, L
. F. M
.
72
sanitizadas e armazenadas em câmara fria para posterior concentração por
membrana.
Figura 5.5- Centrífuga de cestos.
Antes e após o processo de extração, os equipamentos e a malha eram
lavados com detergente e água e sanitizados com solução de hipoclorito de sódio a
0,01%. A centrífuga era desmontada para sua melhor sanitização.
5.2.6. Concentração por membranas
5.2.6.1. Testes Preliminares
A partir da determinação da melhor condição de extração definida no item
5.2.2 foram obtidos 45 litros de extrato 70 %, que foram empregados nos testes
preliminares para se determinar o melhor processo de separação por membranas
para a concentração do mesmo (Figura 5.6).
Silv
a, L
. F. M
.
73
Figura 5.6 – Diagrama simplificado dos testes preliminares.
5.2.6.1.1. Concentração por Osmose Inversa
Foi utilizado um sistema de osmose inversa de configuração do tipo quadros e
placas (Figura 5.7) LAB UNIT M20 - DSS com membranas planas e área de
permeação de 0,288 m² com um módulo de alimentação acoplado. O tanque de
alimentação com capacidade para 16 litros é de aço inox, e possui um sistema de
refrigeração e uma bomba de deslocamento positivo de pistão, com pressão máxima
de trabalho de 60,0 bar.
Figura 5.7 - Diagrama representativo do módulo de configuração quadro e placas (DSS).
74
A membrana utilizada foi a HR98PP (DSS, Dinamarca), do tipo composta,
constituída por um suporte poroso de polissulfona com a camada seletiva de
poliamida e, segundo o fabricante, apresenta 98 % de rejeição a uma solução de
NaCl a 0,25 %, determinada a 25 ºC e 42 bar (Figura 5.8).
Figura 5.8 - Módulo piloto de osmose inversa de configuração quadros e placas (esquerda) e .tanque
de alimentação (direita)
Dois processos de concentração foram conduzidos em sistema de batelada
utilizando 6 litros do extrato 70% obtido no item 4.3, com recirculação do retido, a
uma vazão de recirculação de 700 L.h-1 e diferença de pressão aplicada à
membrana de 60,0 bar. Os processos foram conduzidos até se atingir o fator de
concentração em massa máximo possível. O fator de concentração em massa (Fc) é
definido pela equação 5.1.
[5.1]
sendo;
Fc o fator de concentração em massa,
Ma a massa de alimentação, em quilos e,
Mp a massa de permeado recolhida, em quilos.
75
O acompanhamento dos processos foi realizado pela determinação do fluxo
de permeado a cada dez minutos. Nestes mesmos tempos, os valores de volume de
permeado acumulado, as pressões de entrada e saída e a temperatura foram
registrados.
O fluxo de permeado foi determinado pela medida da massa de permeado
recolhida entre os intervalos de tempo e calculado pela equação 5.2.
[5.2]
sendo;
J - fluxo de permeado, expresso em kg.h-1m-²,
Mp - massa de permeado recolhido, em kg,
t - tempo medido no cronômetro, em segundos,
a - área filtrante da membrana, em m².
Em todos os processos foram retiradas amostras das frações alimentação,
permeado e retido, para serem analisadas posteriormente, a fim de avaliar o efeito
dos processos sobre os compostos de interesse.
5.2.6.1.2. Concentração por nanofiltração em membranas
cerâmicas
O sistema de nanofiltração está ilustrado na Figura 5.9 e o módulo composto
por membranas cerâmicas utilizado no trabalho está apresentado na Figura 5.10.
Este é composto por quatro membranas tubulares de α-alumina com poros de 0,1
µm e área filtrante total de 0,022 m² e está acoplado ao mesmo módulo de
alimentação descrito no item 5.2.6.1.1. As membranas estão dispostas em série,
sendo o permeado coletado de cada membrana por tubos flexíveis independentes.
76
Figura 5.9 - Esquema do sistema de nanofiltração.
Figura 5.10 - Módulo piloto de nanofiltração configuração tubular e membranas cerâmicas
Os processos foram realizados em batelada simples a 25 °C, com
recirculação do retido, a uma vazão de recirculação de 700 L.h-1 e diferença de
pressão aplicada à membrana de 14,0 bar. Os processos foram conduzidos até se
atingir o fator de concentração em massa (Fc) máximo possível, e este foi definido
pela equação 5.1.
O fluxo de permeado foi medido a cada dez minutos, sendo a temperatura e
as pressões de entrada e saída registradas, para o acompanhamento do processo.
O fluxo de permeado foi determinado como descrito no item 5.2.6.1.1 e calculado
pela equação 5.2.
77
Em todos os processos, foram retiradas amostras das correntes de
alimentação, permeado e retido, a fim de avaliar o efeito dos processos na
degradação dos compostos de interesse.
5.2.6.1.3. Concentração por nanofiltração em membrana polimérica
O sistema polimérico (Figura 5.11) utilizado é composto por uma membrana
plana de conformação espiral de poliamida com área filtrante total de 2,5 m²
acoplado ao tanque de alimentação descrito no item 5.2.6.1.1. A membrana utilizada
foi a NF90-2540 (Dow) que apresenta uma retenção de 97% de sais estabilizados
com temperatura de trabalho máxima de 45 °C e 41,0 bar.
Figura 5.11 – Sistema de nanofiltração com membrana polimérica de conformação espiral.
O teste preliminar com este sistema foi conduzido com uma alimentação de
14 kg em sistema de batelada simples e recirculação do retido, a uma vazão de
recirculação de 700 L.h-1, diferença de pressão aplicada à membrana de 15,0 bar e
Silv
a, L
. F. M
.
78
25 °C. O tempo de processo foi 145 minutos, o qual permitiu atingir o fator de
concentração em massa (Fc) de 5,6.
O fluxo de permeado foi medido a cada dez minutos sendo a temperatura e
as pressões de entrada e saída registradas, para o acompanhamento do processo.
O fluxo de permeado foi determinado como descrito no item 5.2.6.1.1 (
[5.2]
).
As correntes de alimentação, permeado e retido, foram coletadas e
analisadas posteriormente, a fim de avaliar o efeito dos processos sobre os
compostos de interesse.
5.2.6.2. Permeabilidade hidráulica
Para a determinação da permeabilidade hidráulica, o sistema era alimentado
com água destilada, o fluxo de permeado medido a 25 °C sob diferentes pressões e,
calculado pela equação .
[5.3]
sendo;
J - fluxo de permeado, expresso em L.h-1m-2,
V - volume de permeado recolhido, em litros,
t - tempo medido no cronômetro, em segundos,
a - área filtrante da membrana, em m² e,
∆P é a pressão transmembrana aplicada ao sistema, em bar.
79
A determinação da permeabilidade hidráulica foi realizada sempre antes do
processamento e após a etapa de limpeza descrita a seguir. Os coeficientes de
inclinação da reta, que dão a medida da permeabilidade, eram comparados para
avaliar a remoção de sólidos retidos na membrana.
5.2.6.3. Limpeza dos sistemas de nanofiltração e osmose inversa
Os sistemas de osmose inversa e nanofiltração eram lavados de acordo com o
procedimento descrito no fluxograma abaixo, sempre após o uso e repetido, quando
necessário.
Figura 5.12- Fluxograma de processo de limpeza dos sistemas de osmose inversa e nanofiltração.
A permeabilidade hidráulica era determinada após o processo de limpeza, a fim
de verificar as características hidrodinâmicas da membrana. O sistema era
considerado limpo quando se restaurava, no mínimo, 60% da permeabilidade
hidráulica inicial das membranas, pois o etanol promove alterações nas
configurações das membranas que não são revertidas totalmente com a limpeza.
Caso este valor não fosse atingido, todo o procedimento era repetido.
80
5.2.6.4. Determinação do fluxo limite
A determinação do fluxo limite foi realizada em membrana polimérica
empregando-se o extrato de vinho branco contendo 30% de etanol, para se
aumentar a eficiência do processo global de obtenção de um extrato concentrado de
bagaço de uva.
Foram realizados três ensaios, com temperaturas de 20, 30 e 40 °C, no
sistema de nanofiltração com membrana polimérica (Figura 5.11) com recirculação
das correntes de permeado e retido, sendo o fluxo de permeado medido sob
diferentes pressões aplicadas ao sistema.
Para cada temperatura de processo foram construídas as curvas de fluxo de
permeado em função da pressão aplicada, determinando-se, então, a condição de
fluxo limite.
5.2.6.5. Concentração dos extratos por nanofiltração
Os resultados obtidos com os ensaios preliminares indicaram a nanofiltração
em membrana polimérica (5.2.6.1.3) de conformação espiral a 40 ºC e 12 bar de
pressão com extrato contendo 30% de etanol como a condição mais favorável para
a concentração dos extratos.
Os processos foram conduzidos no sistema de nanofiltração com membrana
polimérica, em regime de batelada alimentada com recolhimento da corrente
permeada, a 40 °C e 12 bar de pressão aplicada ao s istema até se atingir um fator
de concentração mássica de, no mínimo, 10. A alimentação variou de 35 a 42 kg, e
foram realizadas duplicata dos processos para os extratos dos bagaços VB, VT e
SU.
O fluxo de permeado foi medido a cada dez minutos, sendo a temperatura e
as pressões de entrada e saída anotadas, para o acompanhamento dos processos.
Em todos os processos foram retiradas amostras das correntes de alimentação,
permeado e retido, para serem analisadas posteriormente.
A avaliação da eficiência da membrana dada pelo coeficiente de retenção dos
compostos de interesse foi determinada pela equação 5.4.
81
[5.4]
sendo,
Cp é a concentração do soluto na fração permeado;
Ca é a concentração do soluto na fração alimentação.
5.2.7. Remoção do etanol por evaporação a vácuo
As correntes retidas foram submetidas à evaporação a vácuo para remover o
etanol remanescente e viabilizar a secagem por spray drying. As correntes de retido
da duplicata dos processos de concentração dos extratos VB, VT e S foram
homogeneizadas na razão 1:1, obtendo-se assim a alimentação deste processo. A
remoção do etanol foi conduzida em rotaevaporador, marca Fisatom modelo 802,
com banho-maria ajustado para 50 °C, com rotação do balão de 50 rpm e pressão
de – 700 mmHg obtida pela bomba de vácuo de bancada (Prismatec modelo 131)
acoplada ao sistema. A fim de evitar perdas, o sistema era alimentado com, no
máximo, 200 mL, e o processo conduzido até a redução de 30% da massa inicial.
5.2.8. Secagem por spray drying
Os processos de secagem por spray drying foram conduzidos em escala
laboratorial utilizando-se o spray dryer da marca Buchii, modelo B190 (Figura 5.13)
com temperatura de entrada controlada em 180 °C. Ne stas condicões a temperatura
de saída foi cerca de 90 °C.
82
Figura 5.13 - Spray dryer.
Aos extratos sem etanol, obtidos no item 5.2.7, foi adicionada matodextrina
DE10 (Maltodextrina MOR-REX® 1910) em quantidade suficiente para se atingir um
teor de sólidos solúveis de 18 °Brix e, estas mistu ras seguiram para a
microencapsulação no spray-dryer. A massa necessária de maltodextrina a ser
adicionada foi calculada pela equação 5.5.
[5.5]
em que;
mAE - é a massa de agente encapsulante;
mi - é a massa inicial do extrato;
Brixf - é o teor de sólidos solúveis desejado para a mistura;
Brixi - é o teor de sólidos solúveis inicial do extrato;
Os microencapsulados coletados foram pesados e avaliados quanto à
estabilidade, a 25 °C e UR de 52,9%, por três meses .
Cru
z, A
. P. G
.
83
A retenção dos compostos fenólicos e antocianinas totais e monoméricas foi
estimada a partir dos dados em base seca, de acordo com as equações 5.6 e 5.7,
considerando completa uniformidade do material encapsulado.
[5.6]
em que,
RCFT é a porcentagem de retenção dos compostos fenólicos totais;
CFTmc é a concentração de compostos fenólicos totais em base seca (mg
ácido gálico.100 g-1) no pó
CFTal é a concentração de compostos fenólicos totais em base seca (mg
ácido gálico.100 g-1) na alimentação.
[5.7]
em que,
RA é a porcentagem de retenção das antocianinas (totais e monoméricas);
CAmc é a concentração das antocianinas (totais e monoméricas) em base
seca (mg malvidina 3,5-diglicosídeo.100g-1) no pó;
CAal é a concentração das antocianinas (totais e monoméricas) em base seca
(mg malvidina 3,5-diglicosídeo.100g-1) na alimentação.
5.2.8.1. Estabilidade dos extratos em pó
Os extratos em pó foram distribuídos em placas de petri acondicionadas em
frascos de vidro hermeticamente fechados contendo uma solução supersaturada de
nitrato de magnésio (Mg(NO3)2), mantendo-se uma umidade relativa de 52,9%. A
temperatura da estufa incubadora foi mantida constante, a 25 °C, por três meses.
84
Os extratos em pó foram avaliados ao longo dos três meses em intervalos
regulares de tempo, quanto à cor (5.3.6), teores de fenólicos totais (5.3.5),
antocianinas totais e monoméricas (5.3.3) e capacidade antioxidante (5.3.1e 5.3.2).
5.3. MÉTODOS ANALÍTICOS
5.3.1. Determinação da atividade antioxidante pelo método ABTS
expresso em Trolox Equivalent Antioxidant Capacity (TEAC)
Para a determinação da atividade antioxidante das diferentes amostras foram
obtidos extratos de acordo com a metodologia descrita por Rufino et al.(2007) e a
quantificação de acordo com Re et al (1999).
As amostras líquidas foram submetidas ao procedimento descrito no ANEXO
B e os extratos congelados por no máximo 15 dias, enquanto que as amostras em
pó foram diluídas diretamente em solução de acetona 7% em água e também
denominados extratos analíticos.
O radical ABTS+ foi formado quimicamente com K2SO5, persulfato de
potássio, adicionando em um frasco âmbar 5 mL da solução 7mM de ABTS em água
destilada e 88 µL da solução deK2SO5 140mM, que permaneceu fechado à
temperatura ambiente por no mínimo 14 horas, para formação e estabilização do
radical ABTS+•. Esta solução concentrada de ABTS+ foi diluída, aproximadamente
80 vezes, em etanol 95% até atingir uma absorvância de 0,700 + 0,020 a 734nm.
Para a construção da curva de calibração de Trolox, eram elaboradas
soluções com concentrações de 100; 500; 1000; 1500 e 2000 μM em etanol 95%, as
quais ao reagirem com a solução de ABTS+ (na proporção de 1:100) durante 6
minutos, ao abrigo da luz e à temperatura ambiente, promoviam um decréscimo na
absorvância da solução, lida a 734 nm, por restaurar parte do ABTS+• em ABTS não
radicalar. O branco era lido com etanol 95% na mesma proporção.
A quantificação da atividade antioxidante dos extratos analíticos era realizada
da mesma forma: alíquotas do extrato de 30 µL e 3,0 mL da solução etanólica de
ABTS+•, eram homogeneizadas, mantidas ao abrigo da luz à temperatura ambiente
e as absorvâncias lidas em espectrofotômetro Bioespectro modelo SP-220 após 6
minutos da adição da última solução. Deste modo, a diferença entre a absorvância
85
do branco e da amostra, pôde ser expressa como equivalente de Trolox necessário
para uma mesma resposta, utilizando a equação da reta que descreve a variação da
absorvância.em função da concentração do padrão.
5.3.2. Determinação da atividade antioxidante pelo método ORAC
expresso em Trolox Equivalent Antioxidant Capacity (TEAC).
A determinação da atividade antioxidante pelo método do ORAC (Oxygen
Radical AntioxidantCapacity) baseou-se na metodologia descrita por Zuleta , Esteve
e Frígola (2009). A quantificação baseia-se na transferência de hidrogênio do
material antioxidante (Trolox ou amostras) para o radical (AAPH) em excesso,
evitando o ataque deste último à fluoresceína por determinado tempo. Desta forma,
à medida que os compostos com capacidade antioxidante são consumidos a
fluoresceína é oxidada perdendo sua capacidade de emitir fluorescência (ANEXO
C). A oxidação a fluoresceína foi acompanhada pela leitura da fluorescência do meio
reacional em uma microplaca preta (Greiner 96 Flat Bottom Black Polystyrol) tendo a
solução de fluoresceína 78 nM como referência.
Os extratos analíticos obtidos no item 5.3.1foram diluídos em solução tampão
fosfato 75 mM pH 7,4 o suficiente para que a concentração final estivesse entre 20 e
100 µM equivalente a Trolox.
No dia da análise preparou-se 50 mL de solução de fluoresceína sódica 78
nM e 10 mL de solução 221 mM de radical AAPH (Dicloridrato de 2,2,Azobis(2-
metilpropionamida)) em solução tampão fosfato 75 mM pH 7,4. Os pontos da curva
de calibração de Trolox - 10; 20; 40; 60, 80, 100 e 120 μM- foram obtidos a partir de
uma solução estoque de 500 µM e diluídos em solução tampão fosfato 75 mM pH
7,4.
A determinação foi realizada a 37 °C em leitor de m icroplaca Tecan modelo
Infinite 200 com comprimento de onda de excitação de 485 nm e comprimento de
onda de emissão de 535 nm, com leitura de cima para baixo
Em uma microplaca preta foram pipetados 80 µL das soluções de Trolox ou
dos extratos diluídos, e através do sistema de injeção do equipamento foram
dispensados 80 µL da solução de fluoresceína 78 nM nas posições contendo as
amostras e 200 µL nas posições de referência da fluorescência (H10, H11 e H12). A
86
placa foi agitada e permaneceu no interior do equipamento a 37 °C e leitura da
fluorescência das posições H10-H12 foi medida durante dez minutos. O branco da
reação foi obtido com a solução tampão (80 µL). Após a leitura da fluorescência
inicial, o segundo sistema de injeção do equipamento dispensou 40 µL da solução
de AAPH em todas as posições com exceção das posições de referência, e a
fluorescência foi medida imediatamente e a cada minuto, em modo cinético, até que
se atingisse uma leitura inferior a 5% da fluorescência inicial.
A área abaixo da curva (AUC – area under curve) das soluções padrão de
Trolox, assim como das amostras e do branco foi calculada através de programa
computacional Prisma, plotando-se as leituras de fluorescência ao longo do tempo
de reação. Os valores de AUC das diferentes concentrações de Trolox foram
subtraídos da AUC do branco e as diferenças utilizadas para a construção da curva
de calibração do Trolox. Os coeficientes, linear e angular, obtidos na curva de
calibração foram empregados na quantificação das amostras (Eq. 5.8)
[5.8]
sendo,
AUC amostra- a área abaixo da curva calculada para a amostra;
AUC branco- a área abaixo da curva calculada para branco;
b – o coeficiente linear;
a – o coeficiente angular, e
CA - a concentração da amostra em solução dada em mg.L-1
5.3.3. Antocianinas totais e monoméricas
A determinação do teor de antocianinas totais e monoméricas das amostras
foi realizada utilizando a metodologia de pH diferencial descrita por Giusti e Wrolstad
(2001) adaptada (ANEXO D). As amostras que apresentaram sólidos em suspensão
foram filtradas em papel de filtro de rápida filtração para a leitura da absorvância.
87
O comprimento de onda de 520 nm foi escolhido devido ao valor do εmalvidina-3,5-
diglucosídeo em tampão pH 1.0 existente na literatura, por ser esta a antocianina
majoritária em uva e, por isso, a mais comumente utilizada para expressar os
valores destes metabólitos secundários em uva.
Para a quantificação das antocianinas totais foram consideradas as absorvâncias
a 520 e 700 nm apenas da solução de pH 1,0 e os cálculos realizados de acordo
com a equação 5.9.
[5.9]
sendo;
AT as antocianinas totais expressas em mg de malvidina-3,5-diglucosídeo,
antocianina majoritária, em 100 g de amostra;
(Abs520 e Abs700)pH1,0 os valores de absorvância da amostra diluída na solução
tampão pH 1,0 lidos a 520 e 700nm, respectivamente;
PM o peso molecular da malvidina-3-glucosídeo (655,5)
fd é o fator de diluição dado pela razão volume da diluição, em litros, por
massa de amostra, em gramas;
ε é o coeficiente de extinção molar da malvidina 3,5-diglucosídeo em solução
tampão pH 1,0 a 520nm, cujo valor é de 37.700 Lcm-1mol -1;
100 é utilizado para expressar o valor por 100 gramas de amostra.
Para a quantificação das antocianinas monoméricas foram consideradas as
absorbâncias a 520 e 700nm das amostras diluídas nas soluções tampão pH 1,0 e
4,5 e os cálculos de acordo com a equação 5.10.
88
[5.10]
em que,
AM são as antocianinas monoméricas expressas em mg de malvidina-3,5-
diglucosídeo, antocianina majoritária, presentes em 100g de amostra.
AT são as antocianinas totais expressas em mg da antocianina predominante
em 100g de amostra
(Abs520 e Abs700)pH 4.5 são as absorvâncias lidas da solução em pH 4.5 nos
comprimentos de onda 520 e 700 nm, respectivamente.
5.3.4. Identificação das antocianinas monoméricas por CLAE
As antocianinas monoméricas foram identificadas por cromatografia líquida de
alta eficiência empregando a metodologia proposta por de Brito et al. (2007), com
diluição das frações da nanofiltração em metanol em ácido fórmico aquoso (1:9)
antes de ser injetado no cromotógrafo.
Para análise das antocianinas foi utilizado Cromatógrafo Líquido de Alta
Eficiência Waters® modelo Alliance 2695, detector de arranjo de fotodiodos Waters®
2996, coluna Thermo® C18 (100mm x 4,6mm; 2,4µm) a 40ºC, fluxo de 1,0mL/min, e
modo de eluição gradiente com acetonitrila e ácido fórmico 5% em água. O volume
de injeção foi de 20µL.
A identificação de duas das antocianinas detectadas foi realizada pela
comparação com cromatogramas de frutos caracterizados pelo Laboratório de
Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (Embrapa Agroindústria de Alimentos)
através das mesmas condições cormatográficas descritas acima.
5.3.5. Compostos fenólicos totais por Folin-Ciocalteu
Para a quantificação dos compostos fenólicos totais foi realizada uma
extração prévia em acetona 70% por trinta minutos sob agitação magnética e a
mistura filtrada em papel de filtro de rápida filtração. O filtrado foi diluído dez vezes
89
em água destilada e este seguiu para a quantificação seguindo o procedimento do
ANEXO E, de acordo com o método espectrofotométrico proposto por Singleton e
Rossi (1965) modificado por Georgé et al. (2005). A quantificação dos compostos
fenólicos totais foi realizada através de uma curva de calibração de ácido gálico,
sendo os valores expressos em mg equivalentes de ácido gálico.100 g-1 de amostra.
As leituras de absorvância foram realizadas em espectrofotômetro marca
Bioespectro modelo SP-220 em cubetas de vidro com 1 cm de caminho óptico a
760nm.
5.3.6. Cor instrumental
A análise instrumental de cor foi realizada por transmitância com o auxílio de
colorímetro da marca Minolta modelo CR 400, com medidas nos espaços de cor dos
sistemas CIE L*a*b e LCh. O iluminante escolhido foi o D65, recomendado pela CIE
(Comissão Internacional de Iluminação), por representar a luz média do dia. O
equipamento foi calibrado antes das leituras empregando-se uma placa branca
padrão, com valores definidos de X, Y, Z para o iluminante escolhido.
O sistema de cor CIE L*a*b* é dado por uma esfera, em que a coordenada L*
representa a luminosidade da amostra, e lida de cima para baixo com valores
variando de 100 (reflexão da luz - cor branca) a 0 (cor preta). A coordenada a* pode
assumir valores positivo e negativo correspondendo ao vermelho e verde,
respectivamente. As tonalidades de azul e amarelo são dadas pela coordenada b*,
assumindo valores negativo e positivo, respectivamente.
Para o sistema LCh, a luminosidade L é dada da mesma forma que no
CIEL*a*b*. Este sistema emprega coordenadas polares, em que o C (Chroma) indica
a saturação da cor, variando de 0 a 100, sendo medido do centro à extremidade. O
valor h (hue) indica a tonalidade e inicia-se no eixo sendo medido em graus, em que
90° representa o tom amarelo, 180° o verde, 270° o azul e 0/360° o vermelho.
As determinações da cor instrumental foram realizadas nos pós durante o
período de estabilidade em que estes foram armazenados a 25 °C em estufa
incubadora com umidade relativa de 52,9% obtida com solução salina supersaturada
de cloreto de magnésio. O procedimento consistiu em medida direta da cor do pó
distribuído na placa de petri imediatamente após a homogeneização do mesmo.
90
5.3.7. pH
As medidas de pH foram realizadas através de leitura direta em
potenciômetro marca Metrohm, modelo 785, de acordo com a metodologia descrita
pela A.O.A.C. (1984 – 13.010), utilizando as soluções tampão pH 4,0 e pH 7,0, para
calibração do equipamento.
5.3.8. Sólidos solúveis (ºBrix)
O teor de sólidos solúveis foi determinado pela leitura direta em refratômetro
de acordo com a metodologia descrita pelo A.O.A.C., 1997 – 932,12, utilizando um
refratômetro de campo, marca Atago modelo N1 com escala de 0 a 32 ºBrix.
5.3.9. Acidez titulável total
A acidez titulável total foi realizada através do método titulométrico proposto
pela A.O.A.C. (1997), em titulador automático, marca Metrohm, modelo 785 DMP –
Titrino, utilizando como titulante uma solução de hidróxido de sódio fatorada com
biftalato de sódio. Os valores obtidos foram expressos em mg de ácido málico por
100 g de amostra.
5.3.10. Sólidos totais
O teor de sólidos totais foi realizado através da metodologia descrita no livro
de normas analíticas Instituto Adolfo Lutz (1985), a qual se baseia na determinação
do peso seco obtido pela secagem, em estufa a vácuo a 60 °C, do material de
interesse até obtenção de peso constante. Os valores foram expressos em
porcentagem mássica.
5.3.11. Densidade aparente
A determinação da densidade aparente foi realizada diretamente em
densímetro da marca PAAR modelo DMA 48, após a calibração do mesmo com ar e
água destilada. Os resultados foram expressos em g.cm-3.
91
5.3.12. Determinação do teor de etanol
O teor de etanol nas correntes de alimentação, permeado e retido, foi
realizada por meio da determinação da densidade aparente das amostras e
elaboração de uma curva de densidade aparente em função do teor de etanol.
Em erlenmeyers pequenos e tarados, foram transferidas massas conhecidas
das correntes, em triplicata, as quais seguiram para a secagem em estufa a vácuo a
60 °C. Após a secagem as amostras foram ressuspensa s em água destilada e
soluções aquosas contendo 15 e 45% de etanol, sendo a densidade aparente destas
misturas determinadas em triplicata no densímetro. Estes dados foram empregados
para a elaboração da curva de calibração do teor de etanol na mistura binária versus
densidade.
Esta análise foi realizada somente para as correntes de um processo de
nanofiltração do extrato de vinho branco para verificar a seletividade da membrana
para o etanol.
5.3.13. Determinação da espessura dos bagaços
Dez medições de espessura dos bagaços VB, VT e SU foram realizadas em
micrômetro digital da marca Fowler, modelo IP 54, com limite de detecção de 0 a 1
polegada e precisão de 5 x 10-5 polegadas.
5.3.14. Isotermas de sorção
A isoterma de sorção de umidade foi determinada pelo método gravimétrico,
em que a temperatura e a umidade relativa do ar são mantidas constantes até que a
umidade de equilíbrio do material seja atingida. Para tanto, preparou-se sete potes
de vidro hermeticamente fechados, contendo somente as soluções salinas saturadas
da Tabela 5.5, os quais foram armazenados em estufa incubadora mantida a 25 °C
por 24 horas para se atingir o equilíbrio no interior dos mesmos.
92
Tabela 5.5- Valores de umidade relativa para as soluções saturadas a 25 °C (Spiess e Wolf 1987).
Sais aw Massa sal.100g-1 água
LiCl 0,112 136,34
CH3COOK 0,226 307,70
MgCl2 0,327 200,05
K2CO3 0,438 200,06
KI 0,699 192,97
NaCl 0,753 198,72
KCl 0,843 200,01
As amostras foram pesadas em cadinhos plásticos devidamente identificados
e tarados, transferidas e mantidas no interior dos potes de vidro em estufa
incubadora a 25 °C. As pesagens foram realizadas a cada semana em balança
analítica até que a umidade de equilíbrio fosse atingida. Os ensaios foram realizados
em duplicata.
As umidades de equilíbrio foram determinadas pela equação 5.11 e para
tanto, a umidade inicial de cada extrato em pó foi quantificada em triplicata até peso
constante em estufa a vácuo mantida a 65 °C.
[5.11]
sendo;
Ue a umidade de equilíbrio;
me a massa da amostra no ponto de equilíbrio;
mi a massa inicial da amostra em base seca.
93
Os dados experimentais foram ajustados empregando-se os modelos de GAB
(Eq. 5.12) e BET (Eq. 5.13)
[5.12]
em que,
UE é a umidade de equilíbrio em cada atividade água avaliada (gágua. g-1
sólidos
secos);
Xm é a umidade na monocamada molecular (gágua. g-1
sólidos secos)
CGAB e KGAB são constantes;
aw é a atividade de água correspondente à cada solução salina saturada.
[5.13]
em que,
UE é a umidade de equilíbrio em cada atividade água avaliada (gágua. g-1
sólidos
secos);
Xm é a umidade na monocamada molecular (gágua. g-1
sólidos secos);
CBET é uma constante;
aw é a atividade de água correspondente à cada solução salina saturada.
N é o número de camadas moleculares.
5.4. AVALIAÇÃO ESTATÍSTICA
Os resultados foram avaliados estatisticamente pela metodologia de
superfície de resposta, análise de variância, testes de normalidade e comparação de
médias empregando os softwares comerciais, Statistica 7.0 e XLSTAT 7.5.
94
A determinação da área abaixo da curva (AUC) foi calculada pelo programa
GraphPad Prisma versão 5.0 e a modelagem das curvas de sorção de umidade
pelos produtos em pó empregando as equações de GAB e BET por meio do
programa Solver dentro da plataforma do Excell.
95
6. RESULTADOS E DISCUSSÃO
6.1. SELEÇÃO DOS PARÂMETROS OPERACIONAIS DA ETAPA DE
EXTRAÇÃO
6.1.1. Extração enzimática aquosa
Na faixa analisada, os resultados obtidos para a extração enzimática
indicaram a influência positiva dos fatores razão solvente/substrato e temperatura
para todas as variáveis de resposta. Como esperado, o aumento da razão
solvente/carga favoreceu a transferência de massa da matriz sólida para a solução
extratora por aumentar a diferença de potencial químico. Neste caso o solvente,
água pura (índice de polaridade de 10,2), foi capaz de extrair os compostos mais
polares e fracamente ligados na estrutura da matriz.
Pareto Chart of Standardized Effects; Variable: AA
2**(4-0) design; MS Pure Error=5820,495
DV: AA
-,091191
-,930066
1,734517
1,851838
2,061373
-2,0647
3,23501
3,596609
3,750267
11,13954
11,14695
p=,05
Standardized Effect Estimate (Absolute Value)
1by2
Curvatr.
2by3
(2)Enzima
3by4
2by4
1by3
(3)pH
1by4
(4)Razão solvente:substrato
(1)Temperatura
Figura 6.1 Gráfico de Pareto para a atividade antioxidante na extração enzimática.
O aumento da temperatura também contribuiu de forma positiva para a
recuperação dos compostos bioativos, muito provavelmente pelas características da
preparação enzimática empregada cuja condição ótima foi alcançada nos níveis
superiores de pH e temperatura (ANEXO A).
96
A redução do pH da solução de extração favoreceu a extração das
antocianinas totais e monoméricas (Figura 6.2 ), muito provavelmente por estabilizar
o núcleo flavílio (MARKAKIS, 1982).
Fitted Surface; Variable: AT2**(4-0) design; MS Pure Error=2,789694
DV: AT
> 24 < 23 < 17 < 11
3035
4045
50
Temperatura
2,02,4
2,83,2
3,64,0
pH
12
18
24
30
AT
Fitted Surface; Variable: AM2**(4-0) design; MS Pure Error=2,463695
DV: AM
> 24 < 23 < 19 < 15 < 11 < 7
2530
3540
4550
55
Temperatura
1,62,0
2,42,8
3,23,6
4,04,4
pH
8
12
16
20
24
28
AM
Figura 6.2 - Efeito da temperatura e pH sobre as antocianinas totais (esquerda) e monoméricas
(direita).
O pH isolado foi marginalmente significativo (p=0,069) para a atividade
antioxidante e, embora o fator de interação entre pH e temperatura não tenha sido
significativo é possível verificar na Figura 6.3 que o aumento simultâneo destes
fatores aumenta a capacidade antioxidante dos extratos. Isto ocorre, provavelmente,
devido a maior estabilidade da preparação enzimática e consequentemente maior
extração de compostos bioativos.
97
Fitted Surface; Variable: AA2**(4-0) design; MS Pure Error=5820,495
DV: AA
> 1100 < 1200 < 1100 < 1000 < 900 < 800 < 700
3035
4045
50
Temperatura
2,02,4
2,83,2
3,64,0
pH
600800
10001200140016001800
AA
Figura 6.3 – Efeito do pH e da temperatura sobre a atividade antioxidante.
A capacidade antioxidante e o teor de fenólicos totais apresentaram
comportamento similar quanto às variáveis independentes, sendo, portanto,
favorecidas pelo aumento da temperatura e da razão solvente:substrato (Figura 6.4).
O fator de interação entre estas duas variáveis independentes foi significativo para
os fenólicos e marginalmente significativo para a atividade antioxidante (p=0,064).
Fitted Surface; Variable: AA2**(4-0) design; MS Pure Error=5820,495
DV: AA
> 1250 < 1250 < 1000 < 750 < 500
3035
4045
50
Temperatura
1,01,5
2,02,5
3,0
Razão S:S
500750
1000125015001750
AA
Fitted Surface; Variable: FT2**(4-0) design; MS Pure Error=268,9269
DV: FT
> 250 < 235 < 210 < 185 < 160 < 135
3035
4045
50
Temperatura
0,81,2
1,62,0
2,42,8
3,2
Razão S:S
100125150175200225250275300
FT
Figura 6.4- Efeito da temperatura e razão solvente:substrato sobre a atividade antioxidante
(esquerda) e fenólicos totais (direita).
98
Embora os maiores rendimentos de extração dos compostos fenólicos totais e
antocianinas tenham ocorrido em pH 2,0, 50°C, razão solvente/substrato 3:1 e 630
UI .100g bagaço-1, a capacidade antioxidante do extrato foi maior em pH 4,0 (Tabela
6.1). Como a curvatura não foi estatisticamente significativa pode-se inferir que
dentre as condições avaliadas, as dos ensaios 12 e 16 foram as mais eficientes
quando se trata da capacidade antioxidante e não apresentaram diferença
significativa entre si (p=0,458).
As duas melhores condições para a obtenção de extratos bioativos foram: pH
4,0 (+1), razão solvente:substrato de 3:1 (+1), temperatura de 50°C (+1) em ambos
os níveis de concentração de enzima (210 e 630 UI.100g-1 de bagaço),
respectivamente, sugerindo um excesso da preparação enzimática no meio extrator.
Desta forma, extrações variando a dose da enzima na faixa de 200 a 1800 UI.100g
bagaço-1 foram conduzidas, confirmando a condição de 600 UI.100g bagaço-1 como
a dose mínima para se alcançar a máxima eficiência.
99
Tabela 6.1- Matriz experimental do tratamento enzimático e resultados obtidos
Ensaios T E pH S:S AA FT AT AM
1 -1 -1 -1 -1 496,7+ 31,2 114,5 +0,9 15,0+ 0,1 12,7+ 0,1
2 -1 -1 -1 +1 786,3+ 9,0 193,9 + 5,8 26,5+ 0,4 22,6+ 0,5
3 -1 -1 +1 -1 455,7+18,8 177,4 + 10,8 8,2+ 0,2 7,0+ 0,2
4 -1 -1 +1 +1 744,7+ 13,0 120,9+12,2 14,0+ 0,4 11,8+ 0,6
5 -1 +1 -1 -1 536,1+ 31,2 144,8 + 0,9 18,3+ 0,2 15,6+ 0,3
6 -1 +1 -1 +1 784,9+ 44,8 171,0 + 3,7 24,1+ 0,2 20,5+ 0,8
7 -1 +1 +1 -1 579,4+ 18,0 102,2 +8,4 9,6+ 0,2 8,3+ 0,1
8 -1 +1 +1 +1 879,5+ 17,6 143,1 +15,1 14,7 + 0,1 12,2+ 0,7
9 +1 -1 -1 -1 658,7+ 30,5 148,0+9,2 17,8 + 0,1 15,2+ 0,1
10 +1 -1 -1 +1 1257,0+ 25,8 286,1 +1,8 32,8+ 0,6 28,1+ 0,7
11 +1 -1 +1 -1 722,3+ 35,4 111,5 + 1,6 11,3+ 0,2 9,7+ 0,2
12 +1 -1 +1 +1 1560,2+ 63,7 235,6+24,7 22,3 + 0,4 18,95+ 0,8
13 +1 +1 -1 -1 823,5+ 27,1 204,1+1,2 20,0+ 0,3 17,31+ 0,4
14 +1 +1 -1 +1 1072,1+ 23,3 232,3 +17,2 31,0+ 0,6 26,31+ 0,6
15 +1 +1 +1 -1 992,0+ 28,8 156,2+10,2 14,2 + 0,1 12,2 + 0,1
16 +1 +1 +1 +1 1579,2+ 50,0 245,1 +1,6 21,1 + 0,5 17,9+ 0,6
17 0 0 0 0 7501+ 34,5 166,4 +13,6 21,7+ 0,8 18,9+ 0,8
18 0 0 0 0 902,7+ 51,3 175,2 +9,5 20,1 + 0,3 17,4 + 0,2
19 0 0 0 0 824,8+ 23,0 198,2 +19,21 23,4+ 0,2 20,5 + 0,2
T°C – temperatura em °C; S:S – razão solvente subst rato; E – enzima em atividade de poligalacturonase; AA – atividade
antioxidante expressa em µmol Trolox.100g bagaço-1
; FT – fenólicos totais expressos em mg de ácido gálico equivalente.100g
bagaço-1
; AT- antocianinas totais – expressas em mg de cianidina-3-glucosídeo.100g bagaço-1
e AM – antocianinas
monoméricas expressas em mg de cianidina-3-glucosídeo.100g bagaço-1
.
100
6.1.2. Extração hidroetanólica
Os valores de rendimento em capacidade antioxidante variaram de 600 a
2.000 µmol Trolox equivalente.100 g de bagaço-1 na extração hidroetanólica (Tbela
6.2), um pouco acima da faixa de 440 a 1.600 µmol Trolox equivalente.100g de
bagaço-1 observada para a extração enzimática (Tabela 6.1).
Assim como no processo enzimático, a razão solvente/carga e a temperatura
foram os parâmetros estatisticamente significativos para todas as variáveis de
resposta avaliadas. Para a extração das antocianinas a razão solvente/carga foi o
parâmetro de maior impacto, enquanto que a extração dos fenólicos totais e
atividade antioxidante, foram mais sensíveis à variação da temperatura (Figura 6.5).
Pareto Chart of Standardized Effects; Variable: AA2**(4-0) design; MS Pure Error=17753,02
DV: AA
,0714839
,2353584
,576849
-,649428
,7750575
1,509599
2,688955
3,298383
3,430857
4,752745
8,302186
p=,05
Standardized Effect Estimate (Absolute Value)
2by3
1by3
1by2
2by4
3by4
Curvatr.
(2)Etanol
1by4
(3)pH
(4)Razão
(1)Temperatura
,576849
-,649428
,7750575
1,509599
2,688955
3,298383
3,430857
4,752745
Pareto Chart of Standardized Ef fects; Variable: AM
2**(4-0) design; MS Pure Error=,4733805
DV: AM
-1,74449
2,20819
2,404964
-2,57194
2,872069
-3,02431
4,158998
4,652698
-5,01727
10,97468
20,17392
p=,05
Standardized Effect Estimate (Absolute Value)
1by3
Curvatr.
3by4
2by4
1by4
2by3
(3)pH
1by2
(2)Etanol
(1)Temperatura
(4)Razão
Figura 6.5 - Gráficos de Pareto para a atividade antioxidante (esquerda) e antocianinas (direita) na
extração hidroetanólica.
101
Tabela 6.2 – Matriz experimental do tratamento hidroetanólico e resultados obtidos.
Ensaios T Etanol pH S:S AA FT AT AM
1 -1 -1 -1 -1 890,6 + 24,1 125,3+ 1,8 16,7 + 1,4 14,2 + 0,5
2 -1 -1 -1 +1 751,30+ 27,3 176,1+ 5,4 20,7 + 0,3 19,2 + 0,2
3 -1 -1 +1 -1 719,35+ 51,9 114,4+ 1,7 15,1 + 0,3 12,7 + 0,2
4 -1 -1 +1 +1 999,31+ 72,0 139,3+ 4,5 27,0 + 1,7 25,6 + 1,9
5 -1 +1 -1 -1 639,56 + 42,0 144,8 + 1,0 14,0 + 0,6 11,7 + 0,6
6 -1 +1 -1 +1 934,8 + 52,4 196,2+ 6,1 19,6 + 0,4 15,9 + 0,7
7 -1 +1 +1 -1 1198,70+ 0,8 154,8+ 11,5 16,7 + 0,3 14,6 + 0,4
8 -1 +1 +1 +1 1150,4 + 52,7 209,0+11,03 17,6 + 0,5 16,2 + 0,6
9 +1 -1 -1 -1 906,8 + 36,1 188,6+ 8,3 18,2 + 0,1 15,4 + 0,4
10 +1 -1 -1 +1 1393,6 + 60,3 301,0+ 15,4 26,6 + 0,7 22,3 + 0,6
11 +1 -1 +1 -1 1153,4 + 14,5 183,3+ 14,8 21,3 + 0,2 18,1 + 0,2
12 +1 -1 +1 +1 1965,4 + 68,6 279,6 +7,5 28,9+ 0,3 24,6 + 0,4
13 +1 +1 -1 -1 1324,1 + 80,7 263,0+ 4,1 19,6 + 0,3 16,2 + 0,3
14 +1 +1 -1 +1 1741,3+ 124,6 393,0+ 3,1 30,1 + 0,6 24,6 + 0,6
15 +1 +1 +1 -1 1397,3 + 91,7 207,5+6,9 17,3 + 0,3 14,6 + 0,4
16 +1 +1 +1 +1 1826,7+ 114,2 347,1+ 9,0 28,3 + 0,3 24,6 + 0,6
17 0 0 0 0 1181,5 + 74,8 233,4+ 12,5 22,7 + 0,2 19,9 + 0,2
18 0 0 0 0 1448,0 + 78,7 256,9+ 6,8 21,9+ 0,6 18,6 + 0,5
19 0 0 0 0 1311,3 + 10,0 217,2+ 15,2 22,1 + 0,3 18,8 + 0,4
T – temperatura em °C; S:S – razão solvente substra to em massa; E – % de etanol na solução extratora; AA – atividade
antioxidante expressa em µmol Trolox.100gbagaço-1
; FT – fenólicos totais expressos em mg de ácido gálico equivalente.100g
bagaço-1
; AT- antocianinas totais – expressas em mg de cianidina-3-glucosídeo.100g bagaço-1
e AM – antocianinas
monoméricas expressas em mg de cianidina-3-glucosídeo.100g bagaço-1
.
102
O aumento da temperatura favoreceu o coeficiente de difusão e a solubilidade
das moléculas no solvente, incrementando o rendimento da extração hidroetanólica
dos compostos avaliados. Embora a maioria dos compostos bioativos recuperados
sejam termolábeis, não se verificou a degradação destes com a temperatura de
50°C, uma vez que a atividade antioxidante dos extr atos também apresentou o
mesmo comportamento.
Fitted Surface; Variable: AA2**(4-0) design; MS Pure Error=17753,02
DV: AA
> 1750 < 1625 < 1375 < 1125 < 875
3035
4045
50
Temperatura
0,81,2
1,62,0
2,42,8
3,2
Razão
75010001250150017502000
AA
Figura 6.6 – Efeito da temperatura e razão solvente:substrato sobre a atividade antioxidante.
O teor de etanol influenciou positivamente a extração dos compostos
fenólicos totais enquanto para as antocianinas o efeito deste fator foi negativo
(Figura 6.7). Acredita-se que embora as antocianinas pertençam à classe dos
compostos fenólicos, outras subclasses também são mensuradas pela metodologia
de Folin empregada e neste caso a modificação da polaridade pelo aumento do teor
de etanol seja mais favorável para a maioria destas subclasses. Para as
antocianinas, observa-se que o etanol somente influi negativamente quando em
temperatura mais baixa (30 °C) em que a solubilidad e destes compostos depende
mais fortemente da polaridade por serem pigmentos hidrossolúveis. Entretanto, a
50°C o efeito da concentração do etanol na solução é sobreposto pelo aumento do
coeficiente de difusão ocasionado pelo aumento da temperatura. Outro fato
importante que deve ser considerado é o baixo teor de antocianinas nesta matriz se
103
comparado ao de outras fontes como o açaí e outras uvas tintas, que pode ser um
fator a contribuir para a maior intensidade das interações mencionadas acima.
138,82
176,17
238,12
302,15
30,00 50,00
Temperatura
30,00
70,00
Eta
nol
19,90
16,98
23,74
23,82
30,00 50,00
Temperatura
30,00
70,00
Eta
nol
Figura 6.7 – Gráficos das médias marginais de etanol e temperatura para os fenólicos totais
(esquerda) e antocianinas totais (direita).
O pH somente foi significativo para as antocianinas totais, assim como na
extração enzimática. O rendimento da extração foi maior no nível mais elevado de
pH, diferente do observado por Valduga et al. (2009) para as antocianinas do
bagaço de uva seco e triturado. Acredita-se que a solubilização dos compostos
hidrossolúveis seja favorecida em pH 4,0, uma vez que para elaboração da solução
extratora uma menor quantidade de ácido cítrico é adicionada e, consequentemente
menor quantidade de água seja requerida para sua solubilização. Sendo as
antocianinas pigmentos hidrossolúveis, a condição de pH 4,0 favorece sua
solubilização e estabilidade do cátion flavílio. Valduga et al (2009) observaram a
redução do pH aumentava a extração das antocianinas, assim é possível que o
ácido clorídrico adicionado para se atingir o pH 1,0 pode ter auxiliado a ruptura de
estruturas celulares, favorecendo a recuperação das antocianinas. Por outro lado, na
extração enzimática o pH atuou na estabilização do preparado enzimático. E neste
caso, a extração foi favorecida pelo aumento desta variável.
O emprego de ácido clorídrico para acidificar e favorecer a extração das
antocianinas pode diminuir a estabilidade do extrato final quando este for submetido
à concentração a vácuo ou em excesso (>1%), por promover a hidrólise destas ou
desacilação das antocianinas aciladas (RODRIGUEZ-SANOA e WROLSTAD, 2001).
104
Amendola et al. (2010) obtiveram um extrato hidroetanólico de bagaço de uva
com teor de fenólicos totais de 7,2 g.L-1, um valor muito superior ao 1,2 g.L-1 atingido
neste trabalho no experimento 16, muito provavelmente em decorrência não
somente da cultivar, mas das condições de processo que envolveram a secagem e
moagem do bagaço integral constituído de casca e semente. Embora seja de
conhecimento que a área de contato do material está diretamente relacionada ao
rendimento da extração, no presente trabalho optou-se por utilizar o bagaço com as
dimensões iniciais para facilitar o processamento e diminuir o teor de taninos
condensados nos extratos, os quais se encontram majoritariamente nas sementes.
Embora os taninos condensados contribuam fortemente para a atividade
antioxidante, também são responsáveis pela adstringência nos alimentos (NACZK e
SHAHIDI, 2004) e, desta forma poderiam afetar sensorialmente os produtos nos
quais o extrato poderia ser empregado ou até limitar o uso em preparações
alimentícias.
Ainda que, na maioria dos casos, o aumento da temperatura, da razão
solvente/carga e do teor de solvente melhore a extração de solutos, as
características da matriz e dos compostos de interesse são primordiais para se
estabelecer a condição operacional mais favorável do ponto de vista termodinâmico
e econômico.
Considerando que a capacidade antioxidante do extrato é a variável de
resposta que avalia, de forma global, os compostos extraídos e que os termos de
segunda ordem não foram significativos para nenhum dos planejamentos, pode-se
inferir que as melhores condições de extração foram: hidroetanólico (pH 4,0, razão
S:S 3:1, 30% etanol e 50°C) e enzimático (pH 4,0; r azão S:S 3:1, 630 UI.100g
bagaço e 50°C).
Embora a análise de variância e comparação de médias pelo teste de Fisher
(p<0,05) aplicada aos resultados selecionados nas melhores condições tenha
indicado a extração hidroetanólica como a mais eficiente para a obtenção de extrato
bioativo de bagaço de uva rosada, a diferença entre os rendimentos foi muito baixa e
dependendo da aplicação do extrato a condição enzimática pode ser mais favorável.
Diante dos resultados observados a partir dos dois planejamentos –
enzimático e hidroetanólico – as melhores condições operacionais foram avaliadas
de forma preliminar com o bagaço de uva Pinot noir resultante da vinificação em
105
branco (VB). Este resíduo industrial era i que se apresentava mais similar ao bagaço
experimental (BE) obtido nas plantas piloto I e II da Embrapa e, por isso foi o
escolhido para os ensaios preliminares. Os resultados obtidos indicaram a extração
hidroetanólica como a mais eficiente para a extração dos compostos bioativos do
bagaço industrial, pois o extrato hidroetanólico apresentou uma atividade
antioxidante cinco vezes superior a do extrato obtido com a extração enzimática
(Tabela 6.3)
Tabela 6.3 – Ensaios preliminares de extração com bagaço industrial de Pinot noir submetido à
vinificação em branco.
Ensaios Enzima Etanol Razão S:S AA FT
Enzimático 630 0 3 607 + 87b 121 + 14b
Etanólico 0 30% 3 3.004 + 173a 465 + 10a
Enzima – dose da preparação enzimática em atividade de poligalacturonase UI.100g bagaço-1
; Razão S:S – razão solvente
substrato em massa; AA – atividade antioxidante expressa em µmol Trolox.100g bagaço-1
; FT – fenólicos totais expressos em
mg de ácido gálico equivalente.100g bagaço-1
.
O bagaço industrial de uva Pinot noir resultante da vinificação em branco
apresentou um teor de umidade de 65% enquanto para o obtido na unidade piloto
este valor foi de 80%. Acredita-se que esta diferença seja a principal causa da
variação observada nos rendimentos dos dois processos avaliados: extração com
etanol e extração enzimática. Por ser um material mais recalcitrante e por não ter
sido triturado ou moído de modo a aumentar a superfície de contato e diminuir o
tamanho das partículas o acesso das enzimas aos substratos foi dificultado
impactando fortemente sobre sua eficácia na extração dos compostos de interesse.
Outro fator importante a ser considerado são os compostos recuperados em cada
tipo de extração, pois os compostos fenólicos fracamente ligados às estruturas da
parede celular ou ainda os compartimentalizados nos vacúolos são mais facilmente
recuperados pela ação de solventes que os arrastam, porém a extração enzimática
permite a recuperação de fenólicos mais fortemente ligados à parede celular e desta
forma o tempo de extração pode ser diferente, uma vez que a transferência de
massa se dá de forma distinta. Para que a extração enzimática seja de interesse
106
comercial deve-se fazer uma seleção de preparações enzimáticas que promovam
maior hidrólise do substrato. Adicionalmente, pode-se avaliar o emprego da
preparação enzimática como tratamento prévio à extração hidroetanólica.
6.2. DETERMINAÇÃO DA MELHOR CONDIÇÃO DE EXTRAÇÃO – BAGAÇOS
INDUSTRIAIS
Diante dos resultados apresentados acima para o bagaço de uva tinta Pinot
noir (VB), um novo planejamento fatorial com algumas modificações foi realizado
para todos os bagaços industriais. A temperatura foi excluída do planejamento e
mantida a 50 °C. Nesta temperatura, a eficiência de extração foi favorecida sem
perda de estabilidade e atividade antioxidante dos extratos. Este dado corrobora
com os resultados observados por Spigno et al. (2007) para extração dos fenólicos
da casca da uva, que indicaram a degradação dos compostos em temperatura de
extração acima de 60 °C.
Ao final da etapa de extração com o bagaço VB este ainda apresentava uma
coloração muito intensa e um ensaio alterando a razão solvente:substrato para 10:1
foi conduzido obtendo-se um incremento de 40% da atividade antioxidante (AA) do
extrato (4.175 + 166 µm Trolox.100g bagaço-1). Observou-se ainda que a
rehidratação prévia do bagaço favorecia a atuação do solvente na matriz sólida,
aumentando o rendimento de extração.
Deste modo, adotou-se o planejamento fatorial 2³ completo com triplicata no
ponto central, cujas variáveis independentes foram o pH, porcentagem de etanol na
solução de extração e a razão sólido:líquido, para todos os bagaços industriais.
Todos os ensaios foram conduzidos em banho-maria com agitação de 60rpm, a
50°C por duas horas após a etapa de rehidratação pr évia com água destilada.
6.2.1. Bagaço de uva tinta Pinot noir resultante da vinificação branca
(VB)
O bagaço resultante da vinificação branca (VB) foi obtido de uva tinta Pinot
noir logo após a etapa de esmagamento, ou seja, não seguiu para a fermentação
etanólica, sendo este o bagaço menos exaurido da indústria vinícola, e mais similar
107
ao obtido experimentalmente. Porém, na indústria, a prensagem das uvas foi mais
eficiente que a prensagem hidráulica realizada com as uvas rosadas, tendo em vista
a menor umidade dos bagaços industriais. Neste caso, foi incorporada uma etapa de
rehidratação com água destilada (2:1 bagaço: água) por 60 minutos a 30°C em
banho-maria previamente aos ensaios de extração com solvente.
Como esperado, a razão solvente:substrato atuou positivamente sobre a
extração dos compostos fenólicos (Figura 6.8) e antocianinas (Figura 6.10). O
aumento de solvente promove um acréscimo no potencial químico entre a
concentração do soluto na solução e a concentração de saturação do meio,
favorecendo a transferência do soluto. E, embora para a atividade antioxidante este
fator tenha sido apenas marginalmente significativo (p= 0,056) sabe-se que este é
um fator importante na transferência de massa. Acredita-se que este resultado deva-
se à heterogeneidade da matriz, já que a distribuição dos compostos fenólicos varia
entre as estruturas do vegetal e a atividade antioxidante destes está fortemente
ligada à suas estruturas químicas.
Pareto Chart of Standardized Effects; Variable: aa
2**(3-0) design; MS Pure Error=73130,07
DV: aa
,3832036
,5463851
1,593704
1,615236
2,561185
4,045435
7,482806
p=,05
Standardized Effect Estimate (Absolute Value)
1by2
2by3
Curvatr.
1by3
(1)pH
(3)Razão
(2)Etanol
Pareto Chart of Standardized Ef fects; Variable: ft
2**(3-0) design; MS Pure Error=1242,411
DV: ft
-,22125
-4,08104
-4,81715
5,527135
9,204203
9,408425
12,58302
p=,05
Standardized Effect Estimate (Absolute Value)
(1)pH
1by2
1by3
Curvatr.
(2)Etanol
(3)Razão
2by3
Figura 6.8 - Gráficos de Pareto para a atividade antioxidante (esquerda) e fenólicos totais (direita) na
extração do bagaço VB.
Como reportado por Pinelo et al. (2005), a extração dos compostos fenólicos
da casca da uva que estão fracamente ligados à estrutura celular ou presentes nos
vacúolos foi fortemente afetada pelo tipo de solvente e razão solvente:substrato.
Também foram verificadas as interações entre pH e razão S:S e entre teor etanol e
razão SS, atuando de forma negativa e positiva, respectivamente. Desta forma, a
108
redução do pH e o aumento, tanto da razão S:S quanto do teor de etanol na solução,
contribuem para uma maior extração dos fenólicos (Figura 6.9).
Fitted Surface; Variable: ft2**(3-0) design; MS Pure Error=1242,411
DV: FT
> 600 < 560 < 460 < 360 < 260
2,0
2,4
2,8
3,2
3,6
4,0
pH30
45
60
75
Etanol
200300400500600700800900
1000
FT
Fitted Surface; Variable: ft2**(3-0) design; MS Pure Error=1242,411
DV: FT
> 700 < 640 < 540 < 440 < 340 < 240
2,02,4
2,83,2
3,6
4,0
pH2
4
6
8
10
Razão
100200300400500600700800900
1000
FT
Figura 6.9 - Superfície de resposta da extração dos compostos fenólicos frente às variações no teor
de etanol e pH (esquerda) e pH e razão S:S (direita)
A extração das antocianinas totais foi mais fortemente afetada pela razão S:S
do que pelo fator de interação razão S:S e etanol enquanto que para as
monoméricas a ordem de grandeza destes fatores foi muito parecida (Figura 6.10).
Observa-se que os maiores rendimentos foram atingidos na máxima razão
solvente:substrato com menores proporções de etanol, muito provavelmente pela
maior solubilização destes compostos em água.
Embora o pH seja um fator importante para a estabilidade das antocianinas e
as monoméricas sejam as mais sensíveis, a influência somente foi observada para
as antocianinas totais. Muito provavelmente porque as antocianinas se mantêm
estáveis na faixa de pH utilizada no estudo, pH ácido abaixo de 4,5. Valduga et al.
(2008) também verificaram a influência do pH sobre a extração das antocianinas
totais no bagaço de uva Isabel, sendo seu efeito negativo, ou seja, os maiores
rendimentos foram atingidos no nível mais baixo de pH.
109
Pareto Chart of Standardized Effects; Variable: at
2**(3-0) design; MS Pure Error=53,41759
DV: at
1,360015
1,548602
2,181319
-4,10295
-5,30945
-5,5552
9,665589
p=,05
Standardized Effect Estimate (Absolute Value)
1by3
1by2
(2)Etanol
Curvatr.
(1)pH
2by3
(3)Razão
Pareto Chart of Standardized Effects; Variable: am
2**(3-0) design; MS Pure Error=99,26688
DV: am
,3630495
1,270259
1,450584
-2,80107
5,173392
-5,45521
-6,90744
p=,05
Standardized Effect Estimate (Absolute Value)
(2)Etanol
1by3
1by2
(1)pH
(3)Razão
2by3
Curvatr.
Figura 6.10 – Gráficos de Pareto para as antocianinas totais (esquerda) e monoméricas (direita) na
extração do bagaço VB.
A curvatura foi estatisticamente significativa para a extração dos compostos
fenólicos e antocianinas monoméricas, e indicou uma tendência para as
antocianinas totais, sugerindo a existência de interações de segunda ordem. Ou
seja, pontos de sela de máximo (fenólicos) ou de mínimo (antocianinas) rendimento.
Desta forma, para se investigar melhor a interação de segunda ordem o
planejamento experimental fatorial 2³ foi acrescido de seis pontos axiais (PA). Para a
capacidade antioxidante os termos quadráticos dos fatores avaliados foram
significativos, assim como os termos lineares da razão solvente:substrato e etanol.
Entretanto nenhum dos fatores de interação foi significativo, mas pode-se verificar
uma região de máxima atividade antioxidante na Figura 6.11. Neste caso observa-se
valores máximos na faixa de pH de 2,25 a 5,0 o pH e etanol variando de 45 a 80%,
para uma razão solvente:substrato 9:1. O teor de 30% de etanol na solução de
extração e pH de 3 a 4 permite a obtenção de extratos com uma atividade
antioxidante entre 4.000 e 5.000 µmol TE.100g-1 bagaço. Em soluções com menos
de 30% de etanol a atividade antioxidante dos extratos será inferior a 3.000 µmol
TE.100g-1 bagaço na faixa de pH entre 2,0 e 4,0 e, inferior a 1.000 µmol TE.100g-1
bagaço nos valores extremos de pH avaliados.
110
4500 3000 1500
Figura 6.11 – Gráfico de superfície de resposta para a atividade antioxidante em função do pH e teor
de etanol na solução, mantendo a razão solvente:substrato em 9:1.
Como pode ser verificado na Tabela 6.4, os valores de atividade antioxidante
variaram de 600 a 6.600 µmol TEAC.100g de bagaço-1, com o maior rendimento
atingido no nivel mais alto de todos os fatores. Rockenbach et al. (2007) avaliaram a
composição dos bagaços de uva das variedades Pinot noir e Regente quanto aos
teores de fenólicos totais e atividade antioxidante e, para tanto, empregaram a
extração sólido:líquido com três soluções de 0,1M de ácido clorídrico em solventes
distintos (50% de acetona, metanol e etanol) na proporção de 1,5:50
(bagaço:solvente) por duas horas sob agitação mecânica. Os bagaços foram
previamente secos, triturados e desengordurados em extrator de Soxhlet e os
extratos obtidos apresentaram atividade antioxidante de 41.900 e 47.700 µmol
TEAC.100 g de bagaço-1Regente e Pinot noir, respectivamente. Se considerarmos a
umidade encontrada nos resíduos (77 e 80%), estes rendimentos passam a ser de
10.990 e 9.640 µmol TEAC.100 g de bagaço-1, ainda um pouco superiores aos
resultados deste trabalho. Contudo, vale ressaltar que a razão solvente:substrato no
presente trabalho foi quase três vezes menor e as sementes foram preservadas,
sendo possível sua utilização posterior. Outro ponto importante a ressaltar no
trabalho de Rockenbach et al. (2007) é o uso do ácido clorídrico como auxiliar da
extração, que deve ser removido para a aplicação dos extratos em alimentos, por
exemplo.
111
Tabela 6.4- Matriz experimental e resultados obtidos com o planejamento composto central para o bagaço VB.
Ensaios Etanol pH Razão S:s AA¹ FT² AT³ AM³
1 30 (-1) 2 (-1) 3 (-1) 3.936,86 + 65,09 265,42 + 5,35 98,93 + 4,30 74,16 + 3,98
2 30 (-1) 2 (-1) 9 (+1) 4.254,56 + 92,27 359,59 + 10,13 174,67 + 0,54 140,71 + 0,82
3 70 (+) 2 (-1) 3 (-1) 5.147,45 + 462,86 336,15 + 2,12 135,02 + 4,57 105,55 + 5,16
4 70 (+) 2 (-1) 9 (+1) 5.759,15 + 506,71 951,10 + 37,30 145,12 + 1,39 94,00 + 4,20
5 30 (-1) 4 (+1) 3 (-1) 4.001,95 + 300,46 534,91 + 6,71 60,57 + 0,55 35,88 + 2,90
6 30 (-1) 4 (+1) 9 (+1) 5.022,42 + 339,85 282,50 + 5,83 142,15 + 1,32 119,09 + 1,28
7 70 (+) 4 (+1) 3 (-1) 5.444,12 + 41,17 295,75 + 3,17 104,44 + 1,62 86,47 + 1,48
8 70 (+) 4 (+1) 9 (+1) 6.588,52 + 547,37 777,04 + 9,94 136,82 + 7,26 94,05 + 5,97
9 (PA) 50 (0) 1,3 (-1,68) 6 (0) 1.974,33 + 120,37 325,67+ 11,72 73,44 + 0,12 59,23 + 0,62
10 (PA) 50 (0) 4,7 (+1,68) 6 (0) 1.920 + 62,91 242,06+ 7,87 71,70 + 0,51 60,73 + 0,41
11 (PA) 16 (-1,68) 3 (0) 6 (0) 728,67+ 28,97 100,95 + 3,87 26,07 + 0,37 21,85 + 0,31
12 (PA) 84 (+1,68) 3 (0) 6 (0) 2.245,75 + 199,89 295,88 + 6,88 90,48 + 1,46 74,62 + 0,77
13 (PA) 50 (0) 3 (0) 0,95 (-1,68) 600,75 + 12,93 78,62 + 1,60 23,70 + 0,34 20,44 + 0,70
14 (PA) 50 (0) 3 (0) 11,05 (+1,68) 1.907,75 + 38,08 312,15 + 8,17 87,66 + 1,52 73,57 + 1,70
15 (PC) 50 (0) 3 (0) 6 (0) 5.006,30 + 769,73 647,89 + 32,20 98,47 + 1,06 57,60 + 1,84
16 (PC) 50 (0) 3 (0) 6 (0) 5.522,15 + 202,75 587,71 + 22,56 102,20 + 1,63 37,76 + 2,69
17(PC) 50 (0) 3 (0) 6 (0) 5.405,01 + 353,37 586,01 + 34,06 112,58 + 2,35 46,09 + 3,74
¹Atividade Antioxidante (ABTS em TEAC) – valores expressos em µmol Trolox equivalente.(100g bagaço)-¹; ² Fenólicos totais – valores expressos em mg ácido gálico equivalente.(100g bagaço)-¹ e
³ Antocianinas totais e monoméricas com valores expressos em malvidina-3,5-diglucosídeo.(100g bagaço) -¹; PA – ponto axial; PC – ponto central.
112
Embora a atividade antioxidante não seja uma classe de compostos, mas sim
uma condição associada aos compostos extraídos, e o objetivo da extração é a
obtenção de extrato bioativo, por isso esta foi a variável dependente de maior
relevância para o trabalho. Desta forma, a partir dos resultados obtidos estabeleceu-
se a condição de extração: razão solvente:substrato 1:9, solução extratora contendo
70% de etanol com pH ajustado para 4,0 com ácido cítrico, como a mais eficiente
dentre as avaliadas para a extração dos compostos bioativos.
6.2.2. Bagaço de uva branca Chardonnay resultante da vinificação tinta
(VT)
No processo de vinificação tinta o bagaço segue para a fermentação etanólica
sendo este bagaço o mais exaurido de todos. O bagaço de uva branca Chardonnay
utilizado neste trabalho foi submetido à vinificação tinta, uma prática que vem sendo
empregada para se aumentar a concentração dos compostos fenólicos no vinho
branco.
Técnicas enológicas como o aumento na pressão sobre as uvas na primeira
etapa de processo e um maior tempo de maceração proporcionaram vinhos branco
e tinto com maior atividade antioxidante (VILLAÑO et al., 2006); assim como o
aquecimento do mosto e a fermentação com a casca aumentaram a extração de
diversas classes de compostos fenólicos que contribuem para a atividade
antioxidante dos vinhos (NETZEL et al. 2003)
Os rendimentos em atividade antioxidante variaram de 920 a 1.860 µmol
TEAC.100g bagaço-¹ (Tabela 6.5), uma variação menor que a observada com o
bagaço VB e próxima às faixas observadas nas extrações enzimática e
hidroetanólica com o bagaço de uva rosada . No entanto, mesmo sendo o bagaço
VB mais rico que o VT, o rendimento em algumas condições (Tabela 6.4) foi mais
baixo, corroborando para a necessidade de se avaliar as matrizes.
113
Tabela 6.5 – Matriz experimental 2³ e resultados obtidos para o bagaço VT.
Ensaios pH Etanol % Razão S:S¹ AA² FT³
1 2 (-1) 30 (-1) 3 (-1) 918,29 ± 86,85 183,55 + 5,90
2 2 (-1) 30 (-1) 9 (+1) 1162,21 ± 21,32 301,07 + 2,33
3 2 (-1) 70 (+1) 3 (-1) 1490,35 ± 61,62 313,18 + 14,45
4 2 (-1) 70 (+1) 9 (+1) 1659,89 ± 148,74 382,18 + 2,61
5 4 (+1) 30 (-1) 3 (-1) 970,92 ± 53,87 297,25 + 13,09
6 4 (+1) 30 (-1) 9 (+1) 1561,96 ± 118,96 312,65 + 6,61
7 4 (+1) 70 (+1) 3 (-1) 1186,51 ± 43,58 281,15 + 11,97
8 4 (+1) 70 (+1) 9 (+1) 1820,23 ± 58,92 294,04 + 10,04
9 (PC) 3 (0) 50 (0) 6 (0) 1435,99 ± 43,55 259,69 + 2,61
10 (PC) 3 (0) 50 (0) 6 (0) 1858,56 ± 58,70 272,79 + 5,77
11 (PC) 3 (0) 50 (0) 6 (0) 1725,93 ± 113,78 313,95 + 8,53
¹Atividade Antioxidante (ABTS em TEAC) – valores expressos em µmol Trolox equivalente.100g bagaço-¹; ² Fenólicos totais –
valores expressos em mg ácido gálico equivalente.100g bagaço-¹; PC – ponto central.
Nas condições experimentais propostas, nenhum dos fatores avaliados foi
estatisticamente significativo para a extração dos compostos bioativos do bagaço
oriundo da vinificação tinta (VT), como pode ser verificado nos gráficos de Pareto
(Figura 6.12). Muito provavelmente, a grande heterogeneidade da matéria prima,
que pode ser comprovada pelas diferenças nos valores dos pontos centrais,
ocasionou elevada variação entre os ensaios, impossibilitando a identificação da
causa da variação. Outra hipótese que deve ser considerada neste caso são as
características da matéria prima, uma vez que o bagaço VT é um resíduo já
parcialmente esgotado, devido à fermentação etanólica sofrida durante o
processamento, o teor residual de fenólicos pode ter sido um fator limitante no
transporte de massa.
114
Pareto Chart of Standardized Effects; Variable: AA2**(3-0) design; MS Pure Error=103742,
DV: AA
-,112866
-,262734
,4922483
,8511072
1,194853
1,30829
3,226783
p=,05
Standardized Effect Estimate (Absolute Value)
1by2
2by3
(1)pH
(3)Razão Sól liq
(2)Etanol
1by3
Curvatr.
-,262734
,4922483
,8511072
1,194853
Pareto Chart of Standardized Effects; Variable: FT2**(3-0) design; MS Pure Error=3990,836
DV: FT
-,06062
-,103663
,2814671
,3217227
,4112581
-,810389
1,482716
p=,05
Standardized Effect Estimate (Absolute Value)
1by3
2by3
(3)Razão Sól liq
(1)pH
(2)Etanol
1by2
Curvatr.
,2814671
,3217227
,4112581
Figura 6.12 Gráficos de Pareto para a atividade antioxidante (esquerda) e fenólicos totais
(direita).
Embora os fatores não tenham sido estatisticamente significativos, observou-
se uma grande variação nos rendimentos, sendo desta forma confirmada a
influência do etanol na extração através dos ensaios, realizados em triplicata (Tabela
6.6). O rendimento da extração com 30% de etanol foi quase três vezes o obtido
com a extração aquosa e mais de 80% do atingido com 70% de etanol (ensaios 6 e
8 – Tabela 6.5). Como o custo com os insumos e processo não deve ser
negligenciado, a melhor condição para a obtenção de extrato concentrado de
bagaço de uva Chadonnay (VT) foi a do ensaio 8: solução extratora contendo 30%
de etanol, pH ajustado para 4 e razão 9:1 solvente:substrato.
Tabela 6.6 – Comparativo entre extração hidroetanólica e aquosa.
Ensaios pH Etanol % Razão S:S¹ AA² FT³
1 4 30 9 1.351,35 + 70,30 251,57 + 5,24
2 4 0 9 447,93 + 40,14 55,54 + 3,09
¹Razão S:S – razão solvente:substrtato; ² Atividade Antioxidante (ABTS em TEAC) – valores expressos em µmol Trolox
equivalente.100g bagaço-¹; ³ Fenólicos totais – valores expressos em mg ácido gálico equivalente.100g bagaço-¹.
Não foi possível a determinação de um modelo matemático para explicar a
extração dos compostos bioativos do bagaço VT usando a metodologia de superfície
de resposta. Entretanto, empregando a avaliação de correlação linear de Pearson
115
verificou-se uma forte correlação positiva entre a atividade antioxidante e o teor de
compostos fenólicos cujo r foi de 0,81. Assim, alterações que levem a uma maior
extração dos compostos fenólicos fornecerão extratos mais ativos.
O extrato obtido com as condições do ensaio 6, solução 30% de etanol com
pH 4,0 e razão solvente substrato de 9:a, apresentou um teor médio de fenólicos de
389 ± 5,9 mg.L-1, expresso em ácido gálico, superior ao teor médio reportado por
Bravo (1998) para vinhos brancos (200 a 300 mg.L-1) e inferior aos 2.860 mg. L-1
encontrado por Negro et al. (2003) para o extrato de bagaço de uva tinta seco e
triturado extraído com etanol 80%, acidificado com 0,5% de ácido clorídrico 0,1 N e
razão solvente:susbtrato de 30:1, na mesma temperatura de 50°C. Embora a
concentração do extrato tenha sido sete vezes menor que a obtida por Negro et al
(2003), o bagaço de uva branca Chardonnay resultante da vinificação em tinto
apresenta potencial para uso como fonte de compostos fenólicos com aplicação
mais abrangente, uma vez que não apresenta os pigmentos antociânicos.
6.2.3. Bagaço de uva tinta Isabel oriundo da fabricação do suco de uva
(SU)
Assim como os outros bagaços VB e VT da indústria, este também se
apresentava muito seco sendo necessária a reidratação previamente à extração com
solvente. Os resultados experimentais estão apresentados na Tabela 6.7.
116
Tabela 6.7 - Matriz experimental e resultados obtidos para o bagaço de uva Isabel proveniente da elaboração do suco (SU).
Ensaios Etanol (%) pH Razão S:s AA¹ FT² AT³ AM³
1 30,0 2,0 3:1 856,93 ± 76,23 117,78 ± 8,40 41,89 ± 0,41 34,70 ± 0,35
2 30,0 2,0 9:1 841,14 ± 54,50 130,20 ± 2,60 67,72 ± 0,59 56,86 ± 0,61
3 70,0 2,0 3:1 2158,13 ± 141,29 497,91 ± 11,78 107,03 ± 1,18 83,06 ± 0,73
4 70,0 2,0 9:1 3368,06 ± 293,78 586,52 ± 13,91 155,84 ± 1,62 120,63 ± 2,63
5 30,0 4,0 3:1 1445,47 ± 48,44 241,09 ± 11,12 58,76 ± 2,38 44,81 ± 2,38
6 30,0 4,0 9:1 2502,50 ± 155,41 368,74 ± 16,13 100,70 ± 1,52 78,42 ± 1,56
7 70,0 4,0 3:1 2974,77 ± 55,00 443,93 ± 6,31 81,41 ± 1,85 37,62 ± 2,18
8 70,0 4,0 9:1 4126,68 ± 135,15 601,71 ± 31,79 100,79 ± 3,90 83,05 ± 4,37
9 (PC) 50,0 (0) 3,0 (0) 6:1 (0) 2.986,82 ± 163,04 504,32 ± 24,37 76,20 ± 1,23 62,50 ± 0,92
10 (PC) 50,0 (0) 3,0 (0) 6:1 (0) 3.556,06 ± 184,16 542,08 ± 2,61 88,76 ± 3,17 71,38 ± 3,08
11 (PC) 50,0 (0) 3,0 (0) 6:1 (0) 3.107,59 ± 159,87 551,63 ± 18,73 85,91 ± 1,35 68,85 ± 1,28
¹Atividade Antioxidante (ABTS em TEAC) – valores expressos em µmol Trolox equivalente.100g bagaço-¹; ² Fenólicos totais – valores expressos em mg ácido gálico equivalente.100g bagaço-¹ e ³
Antocianinas totais e monoméricas com valores expressos em mgde malvidina-3,5-diglucosídeo.100g bagaço-¹; PC – ponto central.
117
Os fatores pH e concentração de etanol atuaram positivamente sobre o
rendimento da extração em atividade antioxidante, sendo verificada uma maior
influência do teor de etanol que do pH, provavelmente por que os níveis de pH
empregados estão dentro da faixa ácida. A razão solvente:substrato mostrou-se
marginalmente significativa (p=0,057), cujo aumento favorece a atividade
antioxidante, porém os fatores de interação não foram estatisticamente significativos
(Figura 6.13).
Pareto Chart of Standardized Effects; Variable: AA2**(3-0) design; MS Pure Error=89958,97
DV: AA
-,795238
1,196233
1,55671
4,011503
4,509011
4,59292
8,229772
p=,05
Standardized Effect Estimate (Absolute Value)
1by2
1by3
2by3
(3)Razão Sól liq
(1)pH
Curvatr.
(2)Etanol
-,795238
1,196233
1,55671
4,011503
4,509011
4,59292
Figura 6.13 – Gráfico de Pareto para a atividade antioxidante
É comum o uso de solventes alcoólicos na extração de compostos fenólicos
de matriz vegetal, especialmente o etanol, quando o extrato é para fins alimentícios.
Tem-se observado, ainda, uma maior eficiência de extração com misturas aquosas
de solventes frente aos solventes puros (PINELO et al., 2005). Acredita-se que seja
a polaridade obtida nas misturas permitem a solubilização de mais classes de
compostos fenólicos.
O comportamento observado para a atividade antioxidante foi muito similar ao
observado para os compostos fenólicos (Figura 6.14), provavelmente por serem os
compostos fenólicos os principais metabólitos secundários presentes na uva e
responsáveis pela capacidade antioxidante. Além disso, as metodologias de
118
quantificação de compostos fenólicos e de atividade antioxidante por ABTS,
expressa em TEAC, baseiam-se, ambas, em reações de oxi-redução.
Pareto Chart of Standardized Effects; Variable: FT2**(3-0) design; MS Pure Error=625,9002
DV: FT
1,502432
2,605933
4,565513
5,46128
-5,66193
9,398719
17,97935
p=,05Standardized Effect Estimate (Absolute Value)
2by3
1by3
(1)pH
(3)Razão Sól liq
1by2
Curvatr.
(2)Etanol
1,502432
2,605933
4,565513
5,46128
-5,66193
Figura 6.14 - Gráfico de pareto para os compostos fenólicos totais.
Assim como verificado por Pompeu, Silva e Rogez (2009) para extração dos
compostos bioativos do açaí, o teor de etanol influenciou positivamente, facilitando a
extração dos compostos fenólicos provavelmente por afetar a difusão dos
compostos da matriz sólida para o solvente, aumentando a taxa de transferência de
massa. Cacace e Mazza (2003) verificaram o efeito positivo da concentração do
solvente sobre a extração dos compostos fenólicos de berries trituradas.
Soares et al. (2007) também avaliaram o efeito da concentração do solvente
na solução extratora que variou de 0 a 100% de acetona. Os maiores teores de
fenólicos, 197 e 183 mg.100g-1de casca de uvas Isabel e Niágara, respectivamente,
foram obtidos com as soluções de acetona 75% mantendo-se a proporção de 1:10
(m:v). No entanto, estes valores foram quase um quarto dos observados no presente
trabalho, 586 e 602 mg.100g-1 de bagaço de uva Isabel, obtidos a partir da extração
com etanol 70% em pHs 2 e 4, evidenciando a maior eficiência do sistema de
extração escolhido e utilizado no presente trabalho.
A concentração do solvente na solução promove as alterações físicas como
densidade e viscosidade que podem alterar o coeficiente de difusão dos compostos
119
de interesse. Na extração de antocianinas de groselha preta (black currant) com
água sulfurada o coeficiente de difusão aumentou com o aumento da concentração
de SO2 já para a extração hidroetanólica este aumento ocorreu na faixa de 39 a 67%
e diminui entre 67 e 95% de etanol (CACACE e MAZZA 2003).
O pH influenciou positivamente a extração dos compostos fenólicos como
esperado, uma vez que o nível mais alto (pH 4,0) empregado no trabalho requer
uma quantidade pequena de ácido cítrico para ser atingido disponibilizando desta
forma mais água livre para a solubilização dos compostos de interesse que são
hidrossolúveis. Outro ponto a ser considerado é que o nível mais alto ainda está na
faixa ácida abaixo de 4,5 que permite a estabilização das antocianinas.
Fitted Surface; Variable: FT
2**(3-0) design; MS Pure Error=625,9002
DV: FT
> 500 < 500 < 400 < 300 < 200 < 100
Figura 6.15 - Gráfico de superfície de resposta para o rendimento em compostos fenólicos totais de
bagaço de uva Isabel (SU) em função do pH e teor de etanol na solução.
A razão solvente:substrato como esperado também atuou de forma positiva
para a extração dos compostos fenólicos (Figura 6.14) já que a difusão dos solutos é
facilitada pelo potencial químico estabelecido entre as concentrações do soluto na
matriz sólida e a solução extratora. Este comportamento também foi verificado por
Cacace e Mazza (2003) para ambos os sistemas solventes avaliados (etanol e água
sulfurada) na extração sólido:líquido de berries trituradas.
120
As antocianinas são uma classe de compostos fenólicos mais sensíveis às
alterações de pH, pois o aumento do pH favorece a desprotonação do cátion flavílio
facilitando reações de associação e o deslocamento do equilíbrio entre as formas
para a formação de chalcona que por sua vez compromete a coloração da solução.
Já a diminuição do pH estabiliza as antocianinas e intensifica sua coloração
avermelhada (FALCÃO et al. 2007). Por sua vez, as antocianinas monoméricas são
mais sensíveis ao pH, que por não estarem estabilizadas pelos mecanismos de co-
pigmentação intramolecular, intermolecular e auto associação (GIUSTI &
WROLSTAD, 2001) sofrem mais facilmente o ataque nucleofílico da água e
consequente formação de chalcona (MALIEN-AUBERT et al., 2001)
O fator pH isolado não influenciou a extração das antocianinas totais e
monoméricas, porém o fator de interação pH e etanol foi significativo, observando-se
um aumento na extração com o aumento do solvente e diminuição do pH (Figura
6.16) diferente do observado para os compostos fenólicos totais e atividade
antioxidante, para os quais a solução menos ácida favoreceu o rendimento.
> 140 < 140 < 105 < 70 < 35
> 105 < 105 < 70 < 35
Figura 6.16 – Gráficos de superfície de resposta para as antocianinas totais (esquerda) e
monoméricas (direita) em função da concentração de etanol e do pH.
Assim como para os compostos fenólicos, o teor de etanol na solução
extratora influenciou positivamente a extração das antocianinas totais e
monoméricas (Figura 6.17). O maior rendimento foi observado com a solução de
70% de etanol, bem próxima à solução de 74% de etanol identificada por Pompeu,
Silva e Rogez (2009) como a melhor para a extração das antocianinas de açaí.
121
Pareto Chart of Standardized Effects; Variable: AT
2**(3-0) design; MS Pure Error=43,38501
DV: AT
,0223399
-,71587
-1,26571
-1,65499
-7,00603
7,29799
9,447459
p=,05
Standardized Effect Estimate (Absolute Value)
2by3
1by3
Curvatr.
(1)pH
1by2
(3)Razão Solvente:Substrato
(2)Etanol
Pareto Chart of Standardized Effects; Variable: AM2**(3-0) design; MS Pure Error=20,89738
DV: AM
,0587839
1,49362
2,10621
-3,97132
8,47516
-8,87041
10,73391
p=,05
Standardized Effect Estimate (Absolute Value)
Curvatr.
1by3
2by3
(1)pH
(2)Etanol
1by2
(3)Razão Solvente:Substrato
1,49362
2,10621
-3,97132
Figura 6.17 – Gráficos de Pareto para antocianinas totais (A) e monoméricas (B).
Com relação à razão solvente:substrato, sobre o rendimento da extração
ocorreu como esperado, ou seja, atuou de forma positiva, uma vez que o aumento
da razão de solvente promove um aumento do potencial químico e favorece a
transferência dos compostos da matriz sólida para a solução.
Na condição do ensaio 4 (Tabela 6.7),o extrato obtido apresentou um teor de
antocianinas monoméricas de aproximadamente 157 mg.L-1, muito superior aos
teores encontrados por Malacrida e Motta (2005) para os sucos de uva simples e
reconstituídos cujos valores máximos encontrados foram 67 e 36 mg.L-1,
respectivamente. Porém Valduga, et al (2008) obtiveram um extrato com 300
mg.100g de bagaço-1 seco e triturado de uva Isabel, empregando etanol pH 1,0
acidificado com HCl e três horas de extração. Enquanto que Soares et al. (2007)
empregaram uma solução de metanol acidificada com 0,1% de HCl encontrando um
teor de antocianinas totais de 82 mg.100g de bagaço-1, inferior ao obtido com a
condição do ensaio 6 (Tabela 6.7), salientando a influência de fatores abióticos
sobre o teor de metabólitos secundários.
Os dados experimentais foram bem ajustados (R²>0,87) ao modelo polinomial
associado ao planejamento fatorial 2³ conforme Figura 6.18.
122
Observed vs. Predicted Values2**(3-0) design; MS Pure Error=89958,97
DV: AA
500 1000 1500 2000 2500 3000 3500 4000 4500
Observed Values
0
500
1000
1500
2000
2500
3000
3500
4000
4500
5000
Pre
dict
ed V
alue
s
Figura 6.18 – Gráfico de valores experimentais versus valores estimados pelo planejamento fatorial
2³.
Como o bagaço residual da extração ainda apresentou uma coloração
intensa, acredita-se que a razão solvente:substrato não foi suficiente para a
solubilização total dos compostos de interesse. No entanto, uma maior proporção na
razão solvente:suubstrato deve ser criteriosamente avaliada por impactar nos custos
de extração e principalmente de concentração dos solutos. Alternativas mais viáveis
a se considerar são a extração em múltiplos estágios e a extração em fluxo contra-
corrente que permitem maximizar o rendimento da extração por manter um potencial
químico relativamente alto que favorece a difusão.
Da mesma forma que o observado para os demais bagaços, a escolha da
melhor condição de extração considerou a atividade antioxidante dos extratos
obtidos como a variável mais importante e o planejamento fatorial 2³. Desta forma, a
condição do ensaio 8 foi a de maior eficiência. Na Tabela 6.8 estão apresentados os
rendimentos das extrações em atividade antioxidante para os três bagaços
estudados nas duas condições de extração mais favoráveis e utilizadas nas etapas
subsequentes do presente trabalho.
123
Tabela 6.8 – Comparativo entre os rendimentos em atividade antioxidante dos bagaços VB, VT e SU
em duas condições de extração.
Condições Etanol pH Razão S:S VB¹ VT¹ SU¹
1 30 4 9 5.022 ± 340 1.562 ± 119 3.368 ± 294
2 70 4 9 6.588 ± 547 1.820 ± 59 4.127 ± 135
¹- expresso em µmol Trolox equivalente.(100g bagaço)-¹
.
6.3. CINÉTICA DA EXTRAÇÃO
O tempo para se atingir o equilíbrio na extração sólido-líquido depende de
fatores como solvente, temperatura, agitação mecânica, tamanho de partícula,
geometria da partícula, matriz sólida e características da mesma, dentre outros. A
modelagem cinética adequada da extração é uma ferramenta importante na
ampliação de escala e definição dos processos, de modo a se obter melhores
rendimentos com o mínimo de recursos energético, de insumos e tempo, os quais
irão impactar incisivamente sobre os custos operacionais (SILVEIRA et al., 2013,
AMENDOLA et al., 2010).
A cinética do processo de extração dos fenólicos e antocianinas foi obtida
pelo ajuste dos dados à segunda lei de Fick (Eq. 6.3).
[6.3]
onde,
∂c/∂t é a variação temporal da concentração
D é o coeficiente de difusão.
A extração pode ser conduzida em único estágio ou múltiplos estágios. Neste
caso, um novo potencial químico se estabelece a cada estágio, facilitando a
transferência do soluto da matriz para o solvente. Assim, além do número de
estágios, a razão solvente:substrato, características do solvente, temperatura e
124
agitação são fatores que afetam o rendimento da extração, favorecendo o transporte
de massa pelo potencial químico no sistema extrator aumentando o coeficiente de
difusão dos solutos.
Embora a máxima extração dos compostos bioativos tenha sido com a
solução 70% de etanol aquoso, esta não permitiu a concentração dos extratos pelos
processos de separação por membranas. Portanto, a melhor condição de extração
para a obtenção de um extrato concentrado de bioativos por nanofiltração foi a 50°C,
razão solvente:substrato de 9:1 (massa:volume), solução extratora contendo 30% de
etanol e pH ajustado para 4 com ácido cítrico; sendo esta a condição empregada na
determinação da cinética da extração dos compostos fenólicos e antocianinas.
O dados experimentais foram melhor ajustados ao modelo de Fick (R² = 0,97),
conforme mostrado na Figura 6.19. Nas condições experimentais, o coeficiente de
difusão dos fenólicos no bagaço VB foi de 1,2x10-12 m².h-1. Enquanto que usando-se
apenas o primeiro termo da equação de Fick (Eq. 6.3) o valor obtido para o mesmo
parâmetro foi muito inferior (8x10-14 m².h-1). Neste caso, o coeficiente de difusão foi
subestimado.
VB
2
3 4
5 6
7 8
0 1 2 3 4 5 6
Tempo (horas)
0,00
0,25
0,50
0,75
1,00
Con
cent
raçã
o fe
nólic
os to
tais
1
2
3 4
5 6
7 8
Figura 6.19 – Cinética da extração de fenólicos do bagaço de uva Pinot Noir (VB) ajustada pela
segunda lei de Fick com três termos (esquerda) e com o primeiro termo (direita).
Para os bagaços de uva branca Chardonnay (VT) e Isabel (SU) os dados
também foram bem explicados pela equação de Fick (Figura 6.20). Os coeficientes
de difusão dos fenólicos presentes nos bagaços foram de 8,58x10-15, 1,53 x10-16 e
3,33 x10-16m².s-1 para os bagaços VT, SU e VB, respectivamente e ficaram muito
125
abaixo dos 1,23 x10-10 e 1,50 x10-10 m².s-1 obtidos por Amendola et al. (2010), com o
bagaço de uva tinta com solução de etanol 60% a 60°C e razão solvente:substrato
4:1. É possível que esta diferença seja devido, principalmente, à geometria e ao
tamanho das partículas, pois no presente trabalho os bagaços foram utilizados
íntegros enquanto que no trabalho mencionado da literatura o resíduo foi seco e
triturado. Desta forma, o processo difusivo do soluto para o meio foi favorecido.
Adicionalmente, o menor tamanho de partícula reduz a distância a ser percorrida
pela solução durante o transporte.
VT
2
3 4
5 6
78
0 1 2 3 4 5 6
Tempo (horas)
0,00
0,25
0,50
0,75
1,00
Con
cent
raçã
o fe
nólic
os to
tais
1
2
3 4
5 6
78
SU
2
3
4
5
6
7
8
0 1 2 3 4 5 6
Tempo (horas)
0,00
0,25
0,50
0,75
1,00
Con
cent
raçã
o fe
nólic
os to
tais
1
2
3
4
5
6
7
8
Figura 6.20 – Cinética da extração de fenólicos dos bagaços VT e SU.
Spigno et al. (2007) verificaram que a temperatura influenciou positivamente a
extração dos fenólicos e também agiu sinergicamente com o etanol, sendo
verificados maiores rendimentos a 60°C que a 28°C e ainda diminuindo o tempo de
extração em cinco vezes. Assim, como o teor de etanol e a temperatura também
foram superiores no trabalho relatado da literatura é possível que estas diferenças
também tenham contribuído para um maior coeficiente de difusão.
Pinelo et al. (2006) extraíram os fenólicos presentes no bagaço de uva seco e
triturado (0,5 mm) em sistema contínuo com vazão de 2 mL.min-1 a 50°C e obtiveram
coeficientes de difusão (10,55x10-13 m².s-1) intermediário aos atingidos com os
extratos VB, VT e SU e com o obtido por Spigno et al. (2007).
O equilíbrio da extração dos fenólicos nos bagaços estudados foi atingido em
aproximadamente três horas, diferente dos 120 minutos observados por Amendola,
et al. (2010) e um quinto do tempo aplicado por Sant’Anna et al. (2012) para a
126
extração de fenólicos de bagaço de uva Isabel seco e triturado em etanol 50%
acidificado com 0,0012 mol.L-1 de HCl na proporção de 1:50 de subtrato:solvente a
60°C. Contudo vale salientar que a razão solvente:s ubstrato de 50:1 é
excessivamente elevada, considerando a necessidade posterior de concentração
dos extratos obtidos. Além da influência da temperatura e do solvente empregado, a
matriz também influencia na difusão, pois a extração dos fenólicos de groselha preta
atingiu equilíbrio após dez minutos, empregando 1100 ppm de SO2 a 60°C e razão
20:1 de solvente:substrato (CACACE e MAZZA, 2002).
Verifica-se na Figura 6.21 que, para as antocianinas presentes no bagaço SU,
o tempo de extração foi de aproximadamente 90 minutos, menor que o observado
para o bagaço VB. Entretanto, para estas amostras verificou-se a diminuição das
antocianinas nos extratos obtidos com 24 horas de extração, sugerindo a
desestabilização térmica destes compostos. Como esperado, a taxa de transferência
de massa diminui com o tempo. Isto ocorre, pois a diferença entre a concentração
do soluto na matriz e no solvente também diminuindo com o tempo até que se atinja
a condição de equilíbrio.
SU
23
45
6
7
0 1 2 3 4 5 6
Tempo (horas)
0,00
0,25
0,50
0,75
1,00
Con
cent
raçã
o an
toci
anin
as to
tais
1
23
45
6
7
VB
2
3
4
56
7
8
0 1 2 3 4 5 6
Tempo (horas)
0,00
0,25
0,50
0,75
1,00
Con
cent
raçã
o an
toci
anin
as to
tais
1
2
3
4
56
7
8
Figura 6.21 – Cinética de extração das antocianinas nos bagaços de uva Isabel (SU esquerda) e
Pinot Noir (VB direita).
Os coeficientes de difusão foram 1,25 x10-15 e 6,86 x10-16 m²s-1 para as
antocianinas do bagaço de uva Isabel (SU) e de uva Pinot Noir (VB),
respectivamente. As características físico-químicas da matriz podem facilitar o
transporte de massa seja de forma direta ou ainda por suportar temperaturas
127
maiores. O Hibiscus sabdariffa é um exemplo destas matrizes, pois a extração
aquosa de suas antocianinas conduzida a uma razão solvente:substrato de 25:1
apresentou um coeficiente de difusão de 3,9 x10-11 m².s-1 a 23°C. Adicionalmente, foi
possível aumentar o coeficiente de difusão para 1,35x10-10m².s-1 a 90 °C (CISSÉ et
al., 2012).
Diante dos resultados obtidos, optou-se pelo tempo de 120 minutos para a
extração dos compostos bioativos dos bagaços de uva Pinot Noir submetido à
vinificação branca (VB), uva branca Chardonnay (VT) submetido à vinificação tinta e
uva Isabel (SU) proveniente da obtenção do suco. Este tempo foi escolhido porque
mesmo tendo atingido 75% da extração dos fenólicos totais para o VB e 50% da
extração para VT e SU, a extração das antocianinas já havia atingindo o equilíbrio e
o aumento de 50% no tempo pouco acrescentaria para o rendimento final. Deste
modo, uma avaliação posterior de extração em múltiplos estágios de modo a facilitar
a difusão dos solutos pelo potencial químico poderia ser mais interessante.
6.4. EFICIÊNCIA DA EXTRAÇÃO
Os ensaios para se determinar a eficiência da extração foram conduzidos por
120 minutos nas mesmas condições selecionadas para o estudo cinético em 3
estágios consecutivos conforme a Figura 5.3.
No primeiro estágio foi possível extrair em torno de 50% dos fenólicos
correspondendo a quase 80% da capacidade antioxidante do bagaço de uva Pinot
noir tendo como referência a extração realizada em 24 horas. Com a segunda
extração estes percentuais caem para 38 e 28%, respectivamente e para 22 e 15%
na terceira extração (Figura 6.22). Comportamento similar foi observado com os
outros dois bagaços diminuindo quase 50% o rendimento entre a primeira e a
segunda extração tanto para os fenólicos quanto para a atividade antioxidante. Estes
resultados diferem bastante do observado por Sant’Anna et al. (2012) que obtiveram
somente 9,5% dos fenólicos com a segunda extração. Porém, este autores
empregaram o bagaço de uva Isabel seco e triturado sendo a extração conduzida a
60°C, razão solvente:substrato de 50:1 com solução de etanol aquoso 50%e
concentração de HCl final de 1,2 mM. Estas diferenças nas condições de extração
podem explicar as discrepâncias entre os resultados, uma vez que além dos valores
128
de temperatura e razão solvente:substrato serem superiores e o menor tamanho das
partículas favorecerem a transferência de massa, a quantidade de ácido clorídrico
adicionado também facilitou a extração por promover a hidrólise de algumas
estruturas. É possível que a extração em contra corrente supere as limitações da
extração em um único estágio aumentando a eficiência quer seja pela redução no
consumo de solvente ou por se atingir maiores rendimentos.
Figura 6.22 – Eficiência da extração em fenólicos totais e atividade antioxidante.
Os bagaços VB e SU residuais das três extrações ainda apresentaram
coloração intensa, indicando a presença de antocianinas e possivelmente também
outros fenólicos mais fortemente ligados na matriz, corroborando com os resultados
de Sant’Anna et al. (2012). Assim, o resíduo da extração poderia ainda ser
aproveitado para a elaboração da fibra dietética antioxidante definida e obtida por
Saura-Calixto (1998) que reduziu a oxidação lipídica de polpa de peixe (SÁNCHEZ-
ALONSO et al., 2007). Ou ainda para tantas outras aplicações como ser submetido
a uma extração mais drástica envolvendo uma etapa de hidrólise para a liberação
destes solutos e separação das sementes para obtenção do óleo. A casca pode ser
direcionada para a obtenção de farinha cuja aplicação na elaboração de barras de
cereais foi avaliada por Balestro et al. (2011) ou ainda como substrato para a
obtenção de produtos obtidos por biotecnologia (enzimas, pigmentos de fungos, etc).
129
6.5. CONCENTRAÇÃO DOS EXTRATOS POR PROCESSOS DE SEPARAÇÃO
POR MEMBRANAS
6.5.1. Testes preliminares
6.5.1.1. Osmose Inversa
O processo de osmose inversa foi avaliado com o intuito de concentrar os
compostos bioativos e remover parcialmente o etanol, em uma única etapa.
A Figura 6.23 apresenta o comportamento do fluxo de permeado ao longo dos
processos de concentração do extrato de bagaço de uva VB por osmose inversa,
conduzido em sistema de batelada a uma temperatura média de aproximadamente
30°C. O processo foi realizado em duplicata.
Figura 6.23 – Fluxo de permeado dos processos de osmose inversa.
Mesmo o extrato de bagaço de vinho branco contendo um teor de etanol em
torno de 70%, muito acima do teor encontrado em vinhos, o fluxo de permeado
médio (4,9 L.h-1m-2) do primeiro processo foi muito similar ao verificado por Labanda
et al. (2009) e superior aos valores de 1,2 e 1,4 L.h-1m-2 dos fluxos de permeado
iniciais observados no processo de concentração de antocianinas e desalcolização
de extrato de rabanete por Patil et al. (2009).
Entretanto, na repetição do processo de osmose inversa, verificou-se um fluxo
de permeado inicial mais baixo (4,4 frente aos 6,9 L.h-1m-2) e um decaimento neste
130
parâmetro também mais intenso (Figura 6.23), sendo o fluxo de permeado médio
deste processo igual a 1,57 L.h-1m-2. O segundo processo foi conduzido por 350
minutos e o fator de concentração volumétrica atingido foi inferior a 2, menor do que
o verificado no primeiro processo.
O fluxo de permeado inicial foi mais baixo que a faixa de 16 – 28 L.h-1.m-2
observada para sucos de uva processado a 20° C (SAN TANA, 2009) e que 35 - 45
L.h-1.m-2 atingidos a 50 °C (GURAK et al, 2010), contudo est e fato era esperado, já
que as características do solvente implicam fortemente neste parâmetro sendo
verificadas reduções de até 90% na permeabilidade comparada à permeabilidade
hidráulica. E nos sistemas contendo etanol este efeito é substancial como
constatado por Labanda et al. (2009) que observaram redução da permeabilidade
das membranas entre 15 e 22 vezes.
O primeiro processo foi conduzido por 200 minutos atingindo um fator de
concentração volumétrica de 4,6 enquanto que no segundo processo a
concentração volumétrica alcançada foi de 1,9 com 350 minutos de processo. As
frações foram avaliadas quanto aos compostos fenólicos, antocianinas totais e
monoméricas e capacidade antioxidante e observou-se um comportamento similar
destes compostos nos dois processos (Tabela 6.9).
A relação entre as massas dos compostos fenólicos, antocianinas totais e
monoméricas foi de 3,0, 3,6 e 3,8, respectivamente para o primeiro processo. No
segundo processo a concentração em massa foi de 1,7 para as antocianinas totais e
de 1,6 para os fenólicos totais e antocianinas monoméricas. Os coeficientes de
retenção em ambos os processos foram de 98 e 97%, para os fenólicos totais e
antocianinas totais, respectivamente. Estes valores encontram-se de acordo com o
observado por Santana (2009) que avaliou a concentração de antocianinas de suco
de uva por este processo e por Sagne et al. (2008) que recuperaram os ácidos
acético, propiônico e butírico de efluentes vinícolas.
131
Tabela 6.9 – Compostos bioativos e capacidade antioxidante in vitro nas correntes dos processos de
osmose inversa
Correntes/ Análises
Processo 1 Processo 2
Alimentação Permeado Retido Alimentação Permeado Retido
Fenólicos Totais¹
147,21 ± 1,17
3,15 ± 0,01
444,64 ± 10,82
150,08 ± 9,72
4,27 ± 0,03 254,92 ± 3,51
Antocianinas Totais²
23,34 ± 0,69 0,79 ± 0,01
88,04 ± 0,71 21,87 ± 0,54 0,82 ± 0,01
36,40 ± 0,11
Antocianinas Monoméricas²
19,01 ± 0,89 nd 72,63 ± 1,66 18,39 ± 0,63 nd 30,23 ± 0,16
Capacidade Antioxidante (ABTS)³
9,57 ± 0,47 0,14 ± 0,03 35,97 ± 0,57 11,81 ± 0,30
0,32 ± 0,01 18,64 ± 2,87
Capacidade Antioxidante (ORAC)³
9,64 ± 0,60 0,24 ± 0,01
30,68 ± 2,11 - - -
¹- expresso em mg de ácido gálico.100g-1; ² expresso em mg de malvidina-3,5-diglicosídio.100g-1; ³ expresso em µmol Trolox
equivalente.g-1; nd- não detectado.
Pode-se observar na Figura 6.24 que mesmo com a pequena permeação das
antocianinas a fração de permeado apresentou uma leve coloração rosa.
Figura 6.24- Frações do processo de osmose inversa de extrato hidroetanólico de bagaço de uva
Pinot Noir (VB).
A capacidade antioxidante das correntes do primeiro processo foram medidas
pelas metodologias que envolvem a transferência de elétrons (ABTS) e de
hidrogênio (ORAC) e refletiram a concentração dos compostos bioativos analisados,
132
com fatores de concentração de 3,18 e 3,76, respectivamente, evidenciando a
necessidade de avaliação da capacidade antioxidante por metodologias com
mecanismos distintos. Os extratos apresentam uma diversidade de substâncias e
estruturas químicas que poderão contribuir por mecanismos distintos para a
capacidade antioxidante, inclusive com atividade sinérgica ou antagônica (IACOPINI
et al., 2008). Por motivos operacionais, a metodologia ORAC não pode ser realizada
no segundo processamento.
Embora as antocianinas sejam mais sensíveis que outros compostos
fenólicos, as perdas destas substâncias (5 a 7%) foram inferiores às verificadas para
os compostos fenólicos totais avaliados pelo método espectrofotométrico (21%).
Após o processamento as membranas foram limpas e a permeabilidade
hidráulica verificada antes da condução de novo processo. Contudo observou-se
uma perda irreversível de quase 50% na permeabilidade das membranas (Figura
6.25), mesmo realizando novas etapas de limpeza.
Figura 6.25 – Permeabilidade hidráulica das membranas de osmose inversa antes e após o
processamento com extrato hidroetanólico.
Após o segundo processo, não foi possível recuperar as membranas, pois
estas aderiram fortemente ao suporte inviabilizando a recuperação das mesmas.
Diante destes resultados, a osmose inversa empregando a membrana composta de
133
poliamida HR98PP (DSS, Dinamarca) foi descartada como processo para a
concentração do extrato.
6.5.1.2. Nanofiltração em sistema cerâmico
Para avaliação do processo de nanofiltração foram realizados dois testes com
uma membrana cerâmica conduzidos em regime de batelada a 25 °C.
O decaimento do fluxo de permeado foi bem acentuado como consequência
dos fenômenos de polarização de concentração e entupimento ou fouling (Figura
6.26) causados pela retenção de compostos pela membrana (HABERT et al., 2006).
Figura 6.26 – Fluxo de permeado e fator de concentração volumétrica dos processos de nanofiltração
em sistema cerâmico.
Embora o fluxo médio de permeado (5,1 kg.h-1m-2) e o volume de alimentação
(6 L) tenham sido similares aos do processo de osmose inversa, o fator de
concentração volumétrica foi inferior ao obtido nos processos de concentração por
osmose inversa, devido à área total de permeação do sistema de nanofiltração ser
muito menor que a do sistema de osmose inversa, o que resulta num total de
permeado recolhido menor. O fato do tempo de processamento ser maior pode
afetar a qualidade do extrato concentrado obtido, devido à maior possibilidade de
oxidação.
134
Os coeficientes de retenção das antocianinas foram de 78 e 83% nos
processos 1 e 2, respectivamente, resultando em uma maior permeação destes
pigmentos (Figura 6.27) quando em comparação ao processo de osmose inversa
(Figura 6.24). Diante deste comportamento, a nanofiltração com membranas
poliméricas foi testada já que, em estudos anteriores, esta membrana apresentou m
elevado coeficiente de retenção para as antocianinas presentes no suco de açaí
(COUTO et al., 2011).
Figura 6.27 – Correntes da nanofiltração do extrato hidroetanólico de bagaço de uva Pinot Noir (VB)
em membrana cerâmica.
6.5.1.3. Nanofiltração em sistema polimérico
A nanofiltração com membrana polimérica foi testada com o extrato contendo
70% de etanol a 20°C e pressão aplicada de 15 bar ( Figura 6.28). Ainda com um
fluxo médio de permeado de 1,8 kg.h-1m-2, a grande área de filtração do sistema
permitiu que em 150 minutos se atingisse 5,6 de fator de concentração volumétrica.
135
Figura 6.28- Fluxo de permeado e fator de concentração volumétrica do extrato hidroetanólico de
bagaço de uva Pinot Noir (VB) contendo 70% de etanol pelo sistema de nanofiltração
com membrana polimérica.
Novamente, o fluxo de permeado também diminuiu ao longo do processo,
atingindo um equilíbrio devido à compactação das membranas a partir de uma hora
de processo. O fluxo médio de permeado, embora seja baixo (1,85 L.h-1.m-2),
mostrou-se promissor ao ser comparado aos fluxos médios de permeado, 1,2 L.h-
1.m-2 e 4,5 L.h-1.m-2, observados por Leidens (2011) na ultrafiltração de extrato de
bagaço de uva contendo apenas um residual de 2% de etanol com membrana de 10
e 30 KDa, respectivamente. Diferente do observado nos testes com a membrana
cerâmica, a fração de permeado apresentou-se límpida e sem coloração (Figura
6.29) com um coeficiente de retenção de 100% das antocianinas.
O coeficiente de retenção dos compostos fenólicos totais também foi elevado
(99,5%) e acima do observado por Díaz-Reinoso et al. (2009) em cinco membranas
de ultra e nanofiltração testadas para a concentração de bioativos de extrato aquoso
de bagaço de uva fermentado e destilado. Os valores de fenólicos e antocianinas
totais do retido estão acima dos teores de fenólicos e antocianinas encontrados em
12 marcas de sucos de uvas, os quais variam de 23 a 343 mg.100mL-1 e 4 a 46
mg.100mL-1, respectivamente (BURIN et al., 2010).
136
Figura 6.29 – Frações da nanofiltração do extrato hidroetanólico de bagaço de uva Pinot Noir em
sistema espiral com membrana polimérica.
Embora não tenha sido visualmente observada permeação de antocianinas, o
fator de concentração mássica destes compostos foi mais baixo que o fator de
concentração volumétrica e que a concentração dos compostos fenólicos (Tabela
6.10), diferente do observado no processo de osmose inversa.
Tabela 6.10 - Compostos bioativos e capacidade antioxidante in vitro nas correntes da nanofiltração
em membrana polimérica.
Análises Correntes
AA¹ FT² AT³ AM³
Alimentação 7,66 + 0,12 123,05 + 2,27 17,80 + 0,24 15,36 + 0,25
Permeado 0,12 + 0,01 2,82 + 0,13 nd nd
Retido 33,68 + 2,71 575,78 + 11,26 68,18 + 1,46 55,11 + 1,22
FCV 5,58 5,58 5,58 5,58
FC - analítico 4,40 4,68 3,83 3,59
¹ AA- atividade antioxidante expressa em µmol Trolox equivalente.g-¹ pelo método do ABTS; FT² - fenólicos totais expressos
em ácido gálico equivalente.100g-¹; ³ AT e AM – antocianinas totais e monoméricas – expressas em mg.malvidina-3,5-
diglic..100g-¹.
A membrana polimérica mostrou-se muito eficiente na concentração dos
compostos bioativos do extrato hidroetanólico de bagaço de uva, mesmo com uma
concentração de etanol muito elevada (70%), mas não mostrou seletividade ao
137
etanol, pois as frações apresentaram teores de etanol similares, na faixa de 47%.
Embora o teor de etanol esteja abaixo do teor de etanol da solução extratora é
possível que durante as duas horas de extração a 50°C tenha ocorrido evaporação
de parte do etanol e ainda que o volume morto do sistema tenha diluído o extrato.
Outro fator importante para a escolha do sistema de membranas empregadas
na concentração do extrato é a restauração da permeabilidade hidráulica da
membrana que está diretamente relacionada com a vida útil das mesmas e
viabilidades operacional e econômica do processo.
A permeabilidade hidráulica da membrana não foi totalmente restaurada com
a etapa de limpeza (Figura 6.30) após o processamento, permanecendo com menos
de 40% do valor inicial; contudo este comportamento foi reversível. E, pelos dados
observados a restauração da permeabilidade não depende da quantidade de
processos de limpeza, mas sim parece estar relacionado à evaporação do etanol
presente no interior da membrana. Isto porque após dois meses sem uso, o sistema
foi lavado e a permeabilidade hidráulica restaurada em 100%, com um valor médio
de 13,2 L.h-1m-2bar-1.
Figura 6.30- Permeabilidade hidráulica da membrana de nanofiltração de poliamida antes e após o
processamento com extrato hidroetanólico.
138
Diante dos resultados obtidos com as três membranas avaliadas, a osmose
inversa foi inviável para o extrato hidroetanólico e dentre as membranas de
nanofiltração a mais promissora foi a membrana polimérica (Figura 6.31).
Figura 6.31 – Comparativo entre os processos de nanofiltração com membranas cerâmica e
polimérica.
As características da membrana permitiram os maiores coeficientes de
retenção dos compostos bioativos avaliados e a restauração da sua permeabilidade
hidráulica viabilizou operacionalmente o processo.
Leidens (2011) verificou a influência negativa do teor de etanol sobre o fluxo
de permeado no processo de osmose inversa, sendo necessária a redução do teor
de etanol do extrato para que houvesse permeação. O estudo reológico do extrato
hidroetanólico VB utilizado nestes testes preliminares indicou ser este um fluído
pseudoplástico e mostrou também a diminuição da viscosidade aparente com o
aumento da temperatura (Higino, 2012). Então, diante destes estudos, um novo
teste de nanofiltração na membrana polimérica com o objetivo de aumentar o fluxo
de permeado foi conduzido, empregando o extrato obtido na melhor condição de
extração com o menor teor de etanol (30%) e temperatura do processo de
nanofiltração alterada de 20 para 40°C. A temperatu ra de 40° C foi escolhida por ser
inferior à temperatura máxima de trabalho da membrana (45° C) e também menor
139
que a da extração 50° C, que aparentemente não prom overia perdas dos
compostos.
Figura 6.32 – Fluxo de permeado e fator de concentração volumétrica de extrato de bagaço de uva
contendo 30% de etanol submetido à nanofiltração a 40° C.
O aumento no fluxo médio de permeado foi significativo, passando de 1,85
para 14,5 L.h-1m-2 e acredita-se que a redução do teor de etanol no extrato tenha
sido mais preponderante que o aumento na temperatura sobre o fluxo de permeado.
Pois o fluxo médio a 20°C foi a metade do atingido a 40°C no ensaio de fluxo limite
(Figura 6.34Erro! Fonte de referência não encontrada. ). A redução no teor de
etanol foi eficiente e, o fluxo médio de permeado atingido com o extrato contendo
30% de etanol foi ainda superior aos fluxos médios de 5,9 e 9,5 L.h-1m-2, atingidos
por Xu e Wang (2005) nos processos de concentração por nanofiltração do extrato
aquoso de Ginkgo biloba a 35 e 40°C e mesma pressão de 12 bar aplicada ao
sistema.
O aumento no fator de concentração volumétrica foi possível pela alteração
do volume de alimentação de 6 para 19 litros, permitindo um volume final de retido
circulante superior ao volume morto do sistema. Como pode ser verificado na Figura
6.32, o fluxo de permeado ainda não havia atingido o equilíbrio e o processo poderia
ter continuidade desde que o volume de alimentação fosse maior. Com o fluxo de
permeado sete vezes maior, foi possível atingir 6,9 de fator de concentração
140
volumétrica num período de tempo de processo mais curto, refletindo em maior
rendimento.
Ao considerar a concentração em massa dos compostos bioativos esta foi de
81 a 87% do valor esperado comparado à concentração volumétrica. O aumento na
temperatura de processo não alterou a seletividade da membrana para os
compostos avaliados, pois os coeficientes de retenção se mantiveram. O percentual
de antocianinas monoméricas no extrato concentrado foi de 80% para ambos os
extratos (Tabela 6.11).
Tabela 6.11 – Compostos bioativos e capacidade antioxidante in vitro nas frações de nanofiltração a
40° C de extrato de bagaço de uva contendo 30% de e tanol.
Análises Correntes
AA¹ FT² AT³ AM³
Alimentação 6,27 + 0,22 84,59 + 4,39 16,94 + 0,10 13,86 + 0,10
Permeado 0,17 + 0,01 2,95 + 0,06 nd nd
Retido 35,20 + 3,44 512,06 + 2,88 98,79 + 0,50 79,62 + 0,99
FCV 6,94
FC - analítico 5,62 6,05 5,83 5,75
¹ AA- atividade antioxidante expressa em µmol Trolox equivalente.g-¹ pelo método do ABTS; FT² - fenólicos totais expressos
em ácido gálico equivalente.100g-¹; ³ AT e AM – antocianinas totais e monoméricas – expressas em mg.malvidina-3,5-
diglic..100g-¹.
Ao avaliar as frações alimentação, verifica-se que a concentração dos
compostos fenólicos totais foi a mais afetada pela redução no teor de etanol de 70
para 30% na etapa de extração. Porém, é possível que este resultado também seja
decorrente da grande variabilidade da matriz utilizada. Vale lembrar que o bagaço
constituído de casca e semente basicamente, também apresenta resíduos de
engaço e como no presente trabalho optou-se por não secar e triturar o resíduo é
possível que em cada lote de extrato produzido o bagaço empregado apresentava
uma composição diferente em percentual destas frações e, como já mencionado
anteriormente a distribuição dos fenólicos também não é homogênea em todo o
vegetal.
141
Mesmo partindo de um extrato menos concentrado, a fração retida contendo
30% de etanol apresentou-se similar à fração retida obtida com o extrato contendo
70% de etanol (Figura 6.33). Desta forma, foi possível manter a qualidade do
produto final com uma grande redução do etanol na etapa de extração e do tempo
de processo, que com certeza irão impactar diretamente no custo global de
obtenção do extrato concentrado.
Figura 6.33- Comparativo entre os retidos da nanofiltração dos extratos de bagaço de uva contendo
30 e 70% de etanol.
A redução do etanol no extrato foi extremamente positiva para o rendimento
do processo. No entanto, a determinação do fluxo limite é essencial para garantir
rendimento com economia energética. Os ensaios para a determinação do fluxo
limite foram conduzidos em três temperaturas empregando o extrato de bagaço de
uva Pinot Noir (VB) obtido com etanol aquoso 30%. Como esperado, o aumento da
temperatura influenciou positivamente o fluxo de permeado, contudo este efeito não
foi linear, como pode ser verificado na Figura 6.34.
142
0 5 10 15 20 250
5
10
15
20
30°C40°C
20°C
Pressão aplicada ao sistema (bar)
Flu
xo d
e P
erm
eado
(L.
h-¹.
m²)
Figura 6.34 - Fluxo limite do extrato de bagaço de uva contendo 30% de etanol no processo de
nanofiltração.
Diante dos resultados deste ensaio, estabeleceu-se 40° C e pressão aplicada
ao sistema de 12 bar como as condições de processamento para a concentração
dos extratos hidroetanólicos obtidos de bagaço de uva
6.5.2. Concentração dos extratos industriais
Embora os parâmetros: solução de etanol contendo 70% de etanol, pH 4,0 e
razão solvente:substrato de 9:1, tenham sido responsáveis pelo máximo rendimento
na extração dos compostos bioativos, optou-se pela redução no teor de etanol de 70
para 30% para que a concentração destes extratos por nanofiltração fosse viável.
Assim, os processos de concentração por nanofiltração com membrana polimérica
de conformação espiral foram conduzidos com extratos contendo 30% de etanol, a
40° C, pressão aplicada ao sistema de 12 bar e vazã o de recirculação de 700L.h-1.
Os processos foram conduzidos em regime de batelada alimentada com
recolhimento da fração permeado.
143
6.5.2.1. Extrato de bagaço de bagaço de uva Pinot Noir oriundo da
vinificação branca (VB)
Os extratos utilizados nos processos de concentração foram obtidos em
escala piloto em dias distintos, e para o primeiro processo a alimentação foi de 40,42
kg enquanto que na replicata o volume foi maior, 49,67 kg. Como os processos
foram conduzidos até se atingir um fator de concentração de aproximadamente 10, o
tempo de processamento em cada um dos ensaios variou (Figura 6.35).
Figura 6.35- Nanofiltração do extrato de bagaço de uva Pinot Noir (VB) contendo 30% de etanol.
O fator de concentração volumétrico foi de 10,2 e 10,7, respectivamente.
Ainda que o fluxo inicial de permeado tenha sido o mesmo (25 e 24 kg.h-1m-2), o
fluxo médio de permeado variou de 14,2 kg.h-1m-2 no primeiro ensaio para 9,6 kg.h-
1m-2 no segundo, sendo este dado reflexo da variação do tempo de processo e
volume de alimentação. Contudo estes valores são mais que o dobro do relatado
para extrato aquoso de erva mate, de 4,5 L.h-1m-2 (MURAKAMI et al., 2011) também
submetido a 12 bar de pressão, e que os 4,0 L.h-1m-2 obtido na concentração de
polifenóis de extrato hidroetanólico de própolis por nanofiltração a 50 bar
(TYLKOWSKI et al., 2010). Foi também um pouco acima dos 8,4 e 7,1 L.h-1m-2
obtidos com os extratos aquoso e etanólico de pequi para a concentração dos
144
carotenoides por nanofiltração com membranas de poliamida a 25° C e 8 bar de
pressão (MACHADO et al., 2013).
Ainda que o fator de concentração volumétrica em ambos os ensaios tenha
sido similar, os compostos foram mais preservados no primeiro ensaio (Tabelas 6.12
e 6.13), muito provavelmente pelo menor tempo de processo e consequentemente
menor oxigenação e oxidação dos compostos. Entretanto, não foram verificadas
variações entre os ensaios nos coeficientes de retenção dos compostos bioativos e
atividade antioxidante, que ficaram acima de 99%. Assim pode-se inferir que houve
repetitividade nos processos, porém o tempo de processo é um fator a ser bem
considerado para se evitar perdas na bioatividade dos extratos concentrados.
Tabela 6.12 - Compostos bioativos e atividade antioxidante in vitro nas correntes da nanofiltração do
extrato de bagaço de uva Pinot Noir (VB) – Ensaio 1.
Correntes Análises
AA¹ (ABTS) AA¹ (ORAC) FT² AT² AM²
Alimentação 8,40 + 0,54 10,64 + 0,38 105,36 + 2,43 18,35 + 0,25 14,78 + 0,26
Permeado 0,26 + 0,01 0,46 + 0,05 2,96 + 0,04 nd nd
Retido 99,28 + 5,01 127,18 + 12,31 1.232,15 + 15,01 227,75 + 2,11 168,55 + 14,78
FCV 10,25
FC - analítico 10,49 11,95 11,69 12,41 11,16
¹ AA- atividade antioxidante expressa em µmol Trolox equivalente.g-¹ pelo método do ABTS e ORAC; FT² - fenólicos totais
expressos em ácido gálico equivalente.100g-¹; ³ AT e AM – antocianinas totais e monoméricas – expressas em mg.malvidina-
3,5-diglicosídeo.100g-¹.
145
Tabela 6.13 - Compostos bioativos e atividade antioxidante in vitro nas correntes da nanofiltração do
extrato de bagaço de uva Pinot Noir (VB) – Ensaio 2.
Análises Correntes
AA¹ (ABTS) AA¹ (ORAC) FT² AT³ AM³
Alimentação 7,21 + 0,47 14,44 + 1,39 103,17 + 7,06 16,15 + 0,49 12,46 + 0,10
Permeado 0,28 + 0,02 1,26 + 0,10 3,42 + 0,02 nd Nd
Retido 63,27 + 3,16 111,43 + 6,94 996,84 + 14,30 154,15 + 5,29 117,50 + 5,56
FCV 10,74
FC - analítico 8,75 7,72 9,66 9,54 9,39
¹ AA- atividade antioxidante expressa em µmol Trolox equivalente.g-¹ pelo método do ABTS e ORAC; FT² - fenólicos totais
expressos em ácido gálico equivalente.100g-¹; ³ AT e AM – antocianinas totais e monoméricas – expressas em mg.malvidina-
3,5-diglic..100g-¹.
Os teores de antocianinas da fração retida estão muito acima do encontrado
em sucos de uva que variaram de 4,24 a 46,04 mg.100mL-1 (BURIN et al., 2010) e
mais de 10 vezes superior à concentração de antocianinas encontrada em 173
amostras de vinhos tinto (Merlot, Cabernet Sauvignon, Pinot Noir e Cabernet Franc)
avaliados entre as safras de 1995 a 2000; cujos teores variaram de 6,10 a 12,50
mg.100mL-1 (CLIFF et al., 2007). O teor de antocianinas totais do extrato
concentrado, em base seca, foi de 5,83 e 6,26 g.100g-1, acima dos teores
encontrados em oito diferentes extratos naturais comerciais cujos valores variaram
de 1,00 a 3,47 g.(100g)-1e, destes oito somente um não era de uva e foi o mais
concentrado (PRODANOV et al., 2005). Estes extratos comerciais líquidos eram
quase três vezes mais diluídos que a fração retida.
Embora outras fontes possam gerar extratos ainda mais concentrados, como
o extrato aquoso de casca de rabanete vermelho que, após a concentração por
processo integrado de osmose inversa e destilação osmótica, atingiu uma
concentração de 810 mg.100mL-1 (PATIL e RAGHAVARAO, 2007), ou ainda o
extrato de repolho roxo desalcolizado e concentrado por processos com membrana
de destilação osmótica, cuja concentração final foi de 485 mg.100mL-1 (PATIL et al.,
2009).
Lapornik et al. (2005) testaram alguns solventes para a extração de bagaço
de uva Pinot noir e os teores em fenólicos totais foram de 1.448,6 e 5.790,1 mg.L-1
146
com etanol 70% após 12 e 24 horas de extração e com metanol 70% os valores
foram 2.025,5 e 6.782,8 mg.L-1. O emprego da extração etanólica seguida da
nanofiltração permitiu obter um extrato mais concentrado em fenólicos totais que o
extrato metanólico obtido por Lapornik et al. (2005) após 24 horas de extração,
tendo ainda mais amplo espectro de aplicação devido a baixa toxicidade do etanol.
O teor de compostos fenólicos totais da alimentação foi de 25,50 e 23,38
g.100g-1 (base seca) e 31,55 e 40,48 g.100g-1 na fração retida (base seca), valores
muito acima do observado por Negro et al. (2003) para os extratos hidroetanólicos
de bagaço (1,40 g.100g-1), semente (2,68 g.100g-1) e casca (1,11 a g.100g-1) de uva
Negro amaro, os quais, diluídos a 160 ppm apresentaram atividade antioxidante
similar ao BHT. Embora o método empregado por Katalínic et al. (2010) seja o
FRAP, este também baseia-se na transferência de elétrons, e ao avaliarem 14
extratos de bagaço de uvas viníferas tintas e brancas quanto à atividade
antioxidante, os valores variaram de 1,46 a 16,5 mM de trolox equivalente, no
mínimo quatro vezes inferior às frações de retido, aproximadamente 66,3 e 99,3 mM
trolox equivalente. Então, é possível inferir que os extratos obtidos podem ser
potentes antioxidantes naturais. Porém os estudos de estabilidade, aplicabilidade e
toxicidade são indispensáveis antes de se assumir que os extratos sejam
alternativas seguras e eficazes aos antioxidantes ou corantes artificiais, ainda que
provenientes de fontes naturais. Buchweitz et al. (2013) conseguiram uma boa
estabilidade com os extratos de repolho vermelho, cenoura roxa e sabugueiro cujas
antocianinas estão na forma de íon férrico quelato, usados como corantes em géis
de gelatina e a base de polissacarídeos, contudo as proteínas parecem estabilizar
mais os corantes que os polissacarídeos. Outra possibilidade de aumentar a
estabilidade é a remoção da água e microencapsulação dos bioativos por spray,
uma vez que a microcápsula formada pode protegê-los da ação danosa do oxigênio
e luz.
Assim como verificado para os extratos de uva Pinot Noir em diferentes
solventes (LAPORNIK et al., 2005), nos extratos de casca, bagaço e semente de
uva (KATALINÍC et al., 2010), a capacidade antioxidante das frações medida pelas
duas metodologias apresentou forte correlação de Pearson com os teores de
antocianinas totais, antocianinas monoméricas e fenólicos totais, com rPearson de no
mínimo 0,98 (Figura 6.36). Portanto, embora possam existir outras classes de
147
compostos que contribuam para a capacidade antioxidante dos extratos, esta
depende quase que exclusivamente da concentração dos compostos bioativos
avaliados.
0 20 40 60 80 1000
500
1000
1500ATAMFT
ABTS0 50 100 150
0
500
1000
1500ATAMFT
ORAC
Figura 6.36- Correlação de Pearson entre a atividade medida em ABTS e ORAC e os compostos
bioativos
Na uva (gênero Vitis) os principais tipos de antocianinas presentes são cinco
das seis mais comumente encontradas em alimentos, sendo elas: delfinidina,
cianidina, peonidina, petunidina e malvidina. Contudo o perfil irá variar com as
espécies e variedade. Mazza et al. (1999) avaliou o perfil das antocianinas presentes
nos vinhos das variedades Merlot, Pinot Noir e Cabernet Franc, todas da espécie
Vitis vinífera, identificando cinco antocianinas majoritárias que corresponderam a no
mínimo 71% das antocianinas presentes sendo elas em ordem de eluição :
delfinidina-3-glicosídica, cianidina-3-glicosídica, petunidina-3-glicosídica, peonidina-
3-glicosídica e malvidina-3-glicosídica. Da mesma forma, Núñez et al. (2004)
avaliaram outras variedades de Vitis vinífera (Cabernet Sauvignon, Tempranilo e
Graciano), identificando as mesmas antocianinas monoglicosiladas observadas por
Mazza et al. (1999) e na mesma sequência de eluição, corroborando com os dados
da literatura que indicam somente antocianinas monoglicosiladas para as uvas Vitis
vinífera.
Os extratos hidroetanólicos de bagaço de uva Pinot Noir foram avaliados por
cromatografia líquida de alta eficiência e os cromatogramas obtidos foram avaliados
e comparados com o cromatograma de jabuticaba cujas duas antocianinas já
haviam sido identificadas nas mesmas condições pelo laboratório de cromatografia
148
líquida de alta eficiência da Embrapa Agroindústria de Alimentos e confirmadas por
comparação (BRITO et al., 2007, LEITE-LEGATTI et al., 2012). Pela igualdade entre
o tempo de retenção (Figura 6.37) e o perfil espectral dos picos (Figura 6.38), estes
correspondem à delfinidina-3-glicosídica e cianidina-3-glicosídica, estando de acordo
com os dados da literatura para a uva Pinot Noir (MAZZA et al., 1999).
AU
0,00
0,10
0,20
0,30
0,40
0,50
0,60
0,70
0,80
0,90
1,00
Minutes2,00 4,00 6,00 8,00 10,00 12,00 14,00 16,00 18,00 20,00
Figura 6.37 – Cromatogramas sobrepostos da fração retida de VB (preto) e de jabuticaba (vermelho).
AU
-0,002
0,000
0,002
0,004
0,006
0,008
0,010
0,012
0,014
nm250,00 300,00 350,00 400,00 450,00 500,00 550,00
274,8
371,2
520,1
594,6
AU
0,00
0,02
0,04
0,06
0,08
0,10
0,12
nm250,00 300,00 350,00 400,00 450,00 500,00 550,00
279,5
515,3
Figura 6.38 – Espectros de absorção no visível de delfinidina-3-glicosídeo (1) e cianidina-3-glicosídeo
(2).
Sugere-se ainda, que os picos 3, 4 e 5 possam corresponder à petunidina-3-
glicosídica, peonidina-3-glicosídica e malvidina-3-glicosídica, respectivamente, pois
este seria a ordem de eluição das antocianinas de uva Pinot Noir, como verificado
por Mazza et al. (1999) em condições similares ao do presente trabalho. Outros
trabalhos da literatura com uva Pinot Noir também encontraram esta mesma
sequência de eluição das antocianinas sendo a malvidina-3-glicosídeo a majoritária
2 1
149
com mais de 50% do total de antocianinas (LEE e MARTIN, 2009; LEE e
RENNAKER, 2011; LEE e SKINKIS, 2013). Nas frações alimentação e retido, o pico
5 apresentou um percentual de cerca de 50% das antocianinas majoritárias,
corroborando para a suspeita deste pico ser correspondente à malvidina-3-
glicosídeo (Tabela 6.14).
Tabela 6.14- Área média dos picos dos cromatogramas das frações alimentação e retido dos
processos com extratos VB.
Picos correntes
Alimentação Área dos picos
(µV.seg-1) %
Retido Área dos picos
(µV.seg-1) % FC
1 (delfinidina-3-glicosídeo)
496.813 18,13 5.843.274 17,92 11,76
2 (cianidina-3-glicosídeo
81.122 2,96 838.652 2,57 10,34
3 630.317 23,00 7.505.665 23,02 11,91
4 165.940 6,06 1.938.043 5,94 11,68
5 1.366.209 49,85 16.479.685 50,54 12,06
Como as duas primeiras antocianinas foram identificadas como sendo a
delfinidina-3-glicosídeo e a cianidina 3-glicosídeo, respectivamente, e a coluna
utilizada foi a de fase reversa, não seria possível que as subsequentes fossem de
antocianinas diglicosiladas, pois teriam mais hidroxilas livres e, portanto, com mais
afinidade pela fase móvel. Como na literatura as antocianinas de Pinot Noir
apresentam o mesmo açúcar, a afinidade delas pelas fase móvel e estacionária está
relacionada ao número de hidroxilas livres da aglicona, ou seja, o maior número de
hidroxilas livres confere maior polaridade e afinidade com a fase móvel (CANUTO,
2011), eluindo mais rapidamente e por outro lado a presença de metilas confere
maior afinidade pela fase estacionária (coluna) que por ser de fase reversa
apresenta grupos apolares (Figura 6.39). Assim, sugere-se que a sequência de
eluição seja: delfinidina, cianidina, petunidina, peonidina e malvidina,
respectivamente. Entretanto, a identificação precisa dos demais picos pode ser
realizada com a injeção dos padrões das antocianinas suspeitas quer seja
150
adicionados na amostra ou injetados isoladamente; ou ainda a análise por
cromatografia líquida acoplada à espectroscopia de massa.
Figura 6.39- Estrutura química das antocianidinas encontradas Pinot Noir.
Os cromatogramas apresentados na Figura 6.40 indicam que não houve
alteração no perfil cromatográfico entre as correntes alimentação e retido. Porém, a
intensidade do sinal aumentou em torno de 10 vezes, correspondendo à
concentração das antocianinas. Como esperado, não foram identificadas
antocianinas na fração de permeado. A contribuição percentual das antocianinas
majoritárias está apresentada na Tabela 6.14, porém para a determinação da
concentração de cada uma das antocianinas seria necessária a confirmação da
identificação de todos os picos previamente. A quantificação é realizada
empregando as curvas de calibração de cada uma das antocianinas, já que a
intensidade do sinal percebido está relacionada com as características de
absortividade molar de cada analito.
151
Alimentação AU
0,000
0,010
0,020
0,030
0,040
0,050
0,060
0,070
0,080
0,090
Minutes2,00 4,00 6,00 8,00 10,00 12,00 14,00 16,00 18,00 20,00
Retido
AU
0,00
0,10
0,20
0,30
0,40
0,50
0,60
0,70
0,80
0,90
1,00
Minutes2,00 4,00 6,00 8,00 10,00 12,00 14,00 16,00 18,00 20,00
Permeado
AU
0,00
0,10
0,20
0,30
0,40
0,50
0,60
0,70
0,80
0,90
Minutes2,00 4,00 6,00 8,00 10,00 12,00 14,00 16,00 18,00 20,00
Figura 6.40 – Cromatogramas das frações da nanofiltração de extrato hidroetanólico de bagaço de
uva Pinot Noir (VB).
Além da capacidade antioxidante e compostos fenólicos, as características
fisico-químicas das frações também foram avaliadas e como pode ser conferido na
Tabela 6.15, a concentração em sólidos totais foi bem diferente entre os processos
152
(9,2 e 5,6 vezes) e, provavelmente, não é consequência das variações inerentes ao
bagaço, já que as frações alimentação apresentaram teores similares (0,42 e 0,44).
Observou-se uma concentração em ácidos livres na fração retida,
provavelmente referente aos ácidos fenólicos extraídos do bagaço. Porém a
concentração em massa foi de aproximadamente 6 enquanto que volumétrica foi de
10.
Tabela 6.15 – Características físico-químicas das frações da nanofiltração.
Análises Correntes Acidez¹ pH Sólidos totais²
Pro
cess
o 1
Alimentação 0,11 + 0,00b 3,96 + 0,01b 0,42 + 0,01b
Permeado 0,06 + 0,00c 4,11 + 0,00a 0,14 + 0,01c
Retido 0,68 + 0,01a 3,67 + 0,01c 3,91 + 0,11a
Pro
cess
o 2
Alimentação 0,10 + 0,00b 3,75 + 0,04 0,44 + 0,02b
Permeado 0,06 + 0,00c 3,82 + 0,02 0,15 + 0,01c
Retido 0,58 + 0,00a 3,35 + 0,01 2,46 + 0,11a
¹ valores expressos em ácido tartárico equivalente g.100g-¹; ² sólidos totais expressos em g.100g-¹. Letras diferentes nas
colunas indica diferença significativa com intervalo de confiança de 95% (LSD).
O teor de etanol também foi quantificado, porém em apenas um ensaio e
revelou a não seletividade da membrana por etanol, pois os teores nas frações
alimentação, permeado e retido foram de 25, 26 e 22%, respectivamente. Diante
deste dado, das características físico-químicas e da aparência límpida da fração
permeada, sugere-se a reintrodução desta fração na etapa de extração, pois a
concentração de 40 litros de extrato a um fator de concentração volumétrica de 10,
gera 36 litros de permeado. Assim, considerando um fluxo contínuo de extração e
concentração para cada nova extração de 100 kg de bagaço, os 810 litros de
permeado recuperados iriam compor os 900 litros necessários para a extração
seguinte, necessitando apenas da adição de 67,5 litros de etanol e não mais os 270
litros necessários para a elaboração da solução extratora, além da economia de
água. Consegue-se desta forma a integração dos processos de extração e
153
concentração, tornando o aproveitamento desse resíduo ainda mais sustentável
econômica e ambientalmente (Figura 6.41).
-
Figura 6.41 - Fluxo de processo e aproveitamento sugerido para a fração de permeado.
6.5.2.2. Extrato hidroetanólico de bagaço de uva branca Chardonnay
submetido à vinificação tinta
Os processos de concentração por nanofiltração conduzidos em duplicata
apresentaram o mesmo comportamento (Figura 6.42) com fluxo médio de permeado
de 16,7 e 18,2 kg.h-1m-2, valores superiores aos observados com o extrato de Pinot
Noir, muito provavelmente pela diluição adicional da alimentação pelo volume morto
do sistema, pois nos processos com extratos contendo antocianinas era possível
descartar o volume morto. O rendimento do processo, traduzido em fluxo de
permeado, foi excelente se comparado à concentração de extrato desalcolizado de
bagaço de uva por ultrafiltração em membranas de 10 kDa (1,2 L.h-1.m-2), 30 kDa
(4,5 L.h-1.m-2) e 50 kDa (11,8 L.h-1.m-2) observado por Leidens (2011). O fluxo foi
ainda melhor que o observado na nanofiltração de suco de açaí clarificado, 12 L.h-
1.m-2, empregando a membrana MPF 36 (Koch Membrane Systems) com massa
molar de corte de 1 kDa e pressão de 15 bar e, quase cinco vezes inferior aos 93
L.h-1.m-2, atingido como o mesmo suco clarificado em membrana composta NF270
(Down/ Filmtec) também com a pressão de 15 bar (COUTO et al., 2011).
154
Figura 6.42 - Nanofiltração do extrato de bagaço de uva Chardonnay contendo 30% de etanol.
A redução do fluxo de permeado ao longo do tempo é esperada e está
associada à concentração dos sólidos na fração alimentação (Figura 6.43). Este
mesmo comportamento foi verificado por Díaz-Reinoso et al.(2009) nas membranas
de ultra e nanofiltração utilizadas para a concentração de extrato aquoso de bagaço
de uva. Esta relação fica evidente nos processos com polpas de frutas, nas quais os
teores de sólidos (solúveis e totais) é maior, como verificado por Cassano et al.
(2008) com a ultrafiltração do suco de kiwi para a recuperação dos compostos
bioativos.
Figura 6.43- Fluxo de permeado em função da concentração volumétrica.
155
O volume de alimentação dos dois processos foi diferente, 43,9 kg e 42,1 kg
de extrato e, embora o final do processo tivesse sido, à priori, estabelecido fixando-
se o fator de concentração volumétrica, estes foram 12,9 e 15,5, respectivamente,
isso porque nos sete minutos finais a concentração foi muito rápida passando de 7,8
para os 15,5 (Figura 6.44). Esta concentração elevada associada à manutenção de
um bom fluxo de permeado é atingida com soluções cujos teores de sólidos totais é
baixo, em extratos aquosos ou hidroetanólicos, o que não ocorre com polpas e
sucos de frutas os efeitos de fouling e polarização da concentração dificultam a
permeação e até a impedem.
Figura 6.44 – Concentração dos extratos durante o processamento.
Os coeficientes de retenção para os compostos fenólicos e capacidade
antioxidante mensurada pelos métodos ABTS e ORAC foram, em média, de 99%
(Figura 6.45), similares aos observados com o extrato de bagaço de uva Pinot Noir.
Foram também compatíveis com os observados para carotenoides e fenólicos de
extrato aquoso de pequi e maiores que os 10 e 15% de retenção quando o extrato
de pequi continha 95% de etanol (MACHADO et al., 2013). Isto videncia que a
redução no teor de etanol também pode atuar sobre a qualidade do produto final e
não somente no rendimento. Os solventes podem reagir com as membranas
poliméricas ocasionando inchaço, plastificação ou ainda a dissolução do polímero e
essas interações podem comprometer a integridade ou ainda alterar as propriedades
de permeação/rejeição, resistência das membranas. A solubilidade, constante
156
dielétrica, viscosidade, tensão superficial e massa molar do solvente são
características relacionadas aos efeitos mencionados acima (TSUI e CHERYAN,
2004).
Figura 6.45- Coeficientes de retenção para o extrato hidroetanólico de bagaço de uva Chardonnay.
A concentração dos fenólicos totais da fração alimentação em base seca
(111,20 e 124,87 mg.g-1) foi elevada ao comparar com as concentrações dos
extratos de uva obtidos com extração subcrítica aquosa (52,3 mg.g-1) e com água
sulfurada (62,3 mg.g-1), não obstante, a capacidade antioxidante medida em ORAC
foi menor (JU e HOWARD, 2005), provavelmente pelas antocianinas presentes
nestes extratos. Os teores de fenólicos totais da alimentação estão acima do obtido
com o extrato aquoso obtido com a uva Chardonnay inteira que foi de 218 mg.L-1 e
das demais variedades brancas avaliadas (máximo de 272 mg.L-1), contudo nas
variedades tintas os fenólicos variaram de 497 a 1215 mg.L-1 (MEYER et al., 1997) e
neste caso a fração retida apresentou-se mais concentrada (Tabela 6.16).
157
Tabela 6.16 – Compostos bioativos e atividade antioxidante in vitro das correntes da nanofiltração do
extrato de bagaço de uva Chardonnay (VT).
Análises Correntes
Processo 1 Processo 2
AA¹ AA¹* FT² AA¹ AA¹* FT²
Alimentação 3,50 + 0,07 4,46 + 0,22 43,93 +
1,10 3,67 + 0,10 4,88 + 0,01
43,93 + 0,99
Permeado 0,34 + 0,03 0,38 + 0,38 4,19 + 0,31 0,19 + 0,06 0,53 + 0,03 2,30 + 0,18
Retido 37,64 + 0,46 47,87 +
2,31 415,34 +
20,26 40,43 +
1,69 43,20 +
3,61 421,17 +
3,54
FCV 12,90 15,54
FC - analítico
10,56 10,72 9,46 11,03 8,85 9,59
¹ AA- atividade antioxidante expressa em µmol Trolox equivalente.g-¹ pelo método do ABTS e ¹* atividade antioxidante medida
pelo método ORAC; FT² - fenólicos totais expressos em ácido gálico equivalente.100g-¹
A concentração dos compostos em massa não variou na mesma proporção
que a concentração volumétrica e diferente do que ocorreu com os processos de
extrato de Pinot Noir (VB) o tempo de processo foi muito próximo entre as replicatas,
assim é possível que exista um ponto de concentração a partir do qual não seja mais
possível a concentração em massa, apenas volumétrica. Os dados em base seca
indicam que a concentração média variou de 40 a 60% para os parâmetros
avaliados.
De um modo geral a capacidade antioxidante medida pela metodologia que
envolve transferência de hidrogênio (ORAC) foi um pouco superior que a lida em
ABTS, corroborando para a importância da quantificação por mais de uma
metodologia, pois principalmente os extratos naturais apresentam grande
variabilidade de classes e consequentemente diversos mecanismos e ainda a
possibilidade de sinergismos ou antagonismos. A correlação de Pearson entre as
concentrações de fenólicos totais e capacidade antioxidante, foi significativa com
rPearson > 0,99.
Assim como na concentração de fenólicos em massa, a concentração dos
sólidos totais e da acidez titulável total (Tabela 6.17) foram quase a metade da
volumétrica.
158
Tabela 6.17 – Características físico-químicas das frações da nanofiltração de extrato hidroetanólico
de uva Chardonnay (VT).
Análises Correntes Acidez¹ pH Sólidos totais²
Pro
cess
o 1
Alimentação 0,10 + 0,01b 3,80 + 0,01b 0,40 + 0,02b
Permeado 0,06 + 0,01c 4,07 + 0,01a 0,16 + 0,00c
Retido 0,49 + 0,00a 3,56 + 0,01c 2,89 + 0,04a
Pro
cess
o 2
Alimentação 0,12 + 0,00b 4,03 + 0,01b 0,35 + 0,00b
Permeado 0,05 + 0,00c 4,36 + 0,02a 0,16 + 0,01c
Retido 0,57 + 0,03a 3,79 + 0,00c 2,15 + 0,04a
¹ valores expressos em ácido tartárico equivalente g.100g-¹; ² sólidos totais expressos em g.100g-¹. Letras diferentes na
mesma coluna indicam diferença significativa com intervalo de confiança de 95%, por Fisher (LSD).
As características físico-químicas da fração permeado, límpida, transparente
e o baixo teor de sólidos e pH próximo ao da solução de extração, permitem que o
seu aproveitamento como o da mesma fração obtida com o extrato de uva Pinot
Noir.
6.5.2.3. Extrato hidroetanólico de bagaço de uva tinta Isabel oriundo da
fabricação de suco de uva.
Os processos de concentração por nanofiltração foram realizados em regime
de batelada alimentada, a 40° C, pressão aplicada a o sistema de 12 bar até se
atingir o fator de concentração volumétrica de aproximadamente 10, com volume
total de alimentação de 41,5 e 49,3 kg. O fluxo médio de permeado foi de 14,7 e 8,9
kg.h-1m-2 nos processos 1 e 2, respectivamente (Figura 6.46). Este comportamento
também foi verificado com o extrato de uva Pinot Noir (VB). Em ambos o segundo
ensaio foi conduzido com maior volume de alimentação, o que requereu maior
tempo de processo para se atingir o mesmo fator de concentração volumétrica e
como o fluxo de permeado continuou decaindo a média final foi menor. No entanto,
diferente do ocorrido com o extrato de Pinot Noir (VB), a permeabilidade hidráulica
inicial foi 15% inferior no segundo ensaio, e não foi restaurada até o valor de 9,3 L.h-
159
1.m-2.bar-1, mesmo realizando mais de uma etapa de limpeza. Assim é provável que
estes dois fatores tenham contribuído para a diferença no fluxo médio entre eles.
Figura 6.46 - Nanofiltração do extrato de bagaço de uva Isabel.
As características do material a ser processado, das membranas e condições
do processamento como temperatura, pressão e vazão de recirculação afetam o
fluxo de permeado, pois embora a presença de solventes na alimentação implique
na redução do fluxo de permeado e até altere o coeficiente de retenção. O fluxo
médio obtido neste trabalho com o extrato contendo 30% de etanol foi muito maior
que o atingido com extrato aquoso de erva mate nas mesmas condições
(MURAKAMI et al., 2011), ou na concentração de polifenóis de extrato hidroetanólico
de própolis por nanofiltração a 50 bar (TYLKOWSKI et al., 2010) e ainda similar aos
11,8 L.h-1.m-2 atingido na ultrafiltração de extrato de uva com apenas 2% de etanol
50 kDa (LEIDENS, 2011) e ao fluxo da nanofiltração de suco de açaí clarificado com
a membrana MPF 36 (Koch membrane systems) porém com pressão aplicada de 15
bar (COUTO et al., 2011).
Os coeficientes de retenção foram acima de 99% (Figura 6.47) e similares aos
observados com os outros dois extratos, confirmando que o teor de etanol presente
no extrato não comprometeu a integridade da membrana e nem afetou suas
propriedades. Entretanto, a composição da membrana e a sua massa molar de corte
160
e as características das moléculas de interesse variam e o coeficiente de retenção é
uma consequência destes fatores. A retenção de flavonoides totais, antocianinas e
açúcares de resíduo líquido da indústria de laranja variou entre as membranas
testadas e entre as classes de compostos (CONIDI et al., 2012). As menores
retenções foram observadas para os açúcares, como esperado, pelo peso
molecular. As antocianinas pertencem ao grupo dos flavonoides, os quais
apresentam o núcleo flavano em comum, cuja conformação estrutural da molécula
facilita a retenção. Os autores quantificaram tanto os flavonoides totais quanto as
antocianinas e, verificaram que os maiores coeficientes de retenção em todas as
membranas foram observados para as antocianinas. Tal fato foi relacionado à
deficiência de elétrons das antocianinas gerar uma repulsão eletrostática, já que em
pH 3,0 as membranas utilizadas apresentaram potencial de 1mV.
Figura 6.47 – Coeficientes de retenção para o extrato hidroetanólico do bagaço de uva Isabel.
Os teores de antocianinas e fenólicos totais das correntes de alimentação
(Tabela 6.18 e Tabela 6.19) foram menores que 82,15 mg.100g-1 e 196, 83 mg.
100g-1 de antocianinas e fenólicos totais, respectivamente, encontrados nos extratos
de casca de uva Isabel obtidos com acetona 75% (SOARES et al., 2007). Entretanto
em base seca, observa-se o oposto e, as frações de alimentação dos processos 1 e
2 apresentam teores 20 vezes maiores que os teores de antocianinas e fenólicos
dos mesmos extratos obtidos com acetona 75%.
161
Tabela 6.18 - Compostos bioativos e atividade antioxidante in vitro das correntes da nanofiltração do
extrato de bagaço de uva Isabel (SU) – Processo 1.
Análises Correntes
AA¹ (ABTS) AA¹ (ORAC) FT² AT³ AM³
Alimentação 4,32 + 0,13 5,50 + 0,25 66,94 + 3,28 13,75 + 0,13 11,01 + 0,07
Permeado 0,92 + 0,36 0,42 + 0,01 2,10 + 0,31 nd nd
Retido 49,01 + 6,72 62,07 + 4,71 702,12 + 30,35 154,18+ 4,19 120,83 + 4,11
FCV 10,14
FC - analítico 11,34 11,28 10,49 11,32 10,98
¹ AA- atividade antioxidante expressa em µmol Trolox equivalente.g-¹ pelo método do ABTS e ORAC; FT² - fenólicos totais
expressos em ácido gálico equivalente.100g-¹; ³ AT e AM – antocianinas totais e monoméricas – expressas em mg.malvidina-
3,5-diglicosídeo.100g-¹.
Tabela 6.19 -- Compostos bioativos e atividade antioxidante in vitro das correntes da nanofiltração do
extrato de bagaço de uva Isabel (SU) – Processo 2.
Análises Correntes
AA¹ (ABTS) AA¹ (ORAC) FT² AT³ AM³
Alimentação 6,13 + 0,41 7,25 + 0,43 79,90 + 1,15 14,60 + 0,14 11,55 + 0,10
Permeado 0,11 + 0,00 0,40 + 0,06 2,72 + 0,02 nd nd
Retido 64,42 + 1,33 77,40 + 4,64 886,73 + 43,90 166,29 + 1,06 117,50 + 5,56
FCV 10,47
FC - analítico 10,51 10,62 11,10 11,39 11,04
¹ AA- atividade antioxidante expressa em µmol Trolox equivalente.g-¹ pelo método do ABTS e ORAC; FT² - fenólicos totais
expressos em ácido gálico equivalente.100g-¹; ³ AT e AM – antocianinas totais e monoméricas – expressas em mg.malvidina-
3,5-diglicosídeo.100g-¹.
Dentre os extratos da casca das cultivares Pinot Noir, Isabel, Sangiovese,
Negro Amaro, Cabernet Sauvignon e Primitivo, os maiores teores, em base seca, de
fenólicos totais (1,84 g.100g-1) e atividade antioxidante medida em DPPH (3,64 mmol
Trolox.100g-1) foram encontrados no extrato de Isabel (ROCKENBACH et al., 2011),
porém ainda inferiores ao das frações alimentação. No presente trabalho, os
extratos de bagaço de uva Pinot Noir (VB) apresentaram os maiores teores de
162
fenólicos e antocianinas e, também foram antioxidantes mais potentes dentre os três
extratos avaliados, contrariando o observado por Rockenbach et al. (2011),
evidenciando a forte influência da variedade e dos processos aos quais as uvas
foram submetidas até a obtenção do bagaço. No processamento do suco, o bagaço
segue para os tratamentos enzimático e térmico enquanto que na vinificação branca
o mesmo é removido logo após o esmagamento mantendo-se muito mais íntegro.
A concentração em massa das antocianinas foi próxima a da concentração
volumétrica, porém os valores foram abaixo dos 485 mg.100g-1 atingido por Patil et
al. (2009) com os processos de desalcolização e concentração do extrato de casca
de rabanete empregando membrana de destilação osmótica. As frações de retido
apresentaram, em base seca, teores de antocianinas totais de 6,68 e 5,32 g.100g-1
superior aos teores 3,47 e 2,11 g.100g-1, em base seca, encontrados nos corantes
comerciais de sabugueiro (Sambus nigra L.) e de uva vinífera, respectivamente.
(PRODANOV et al., 2005).
Os teores em compostos fenólicos totais da fração retida foram quase metade
dos 14,80 mg.mL-1 conseguido por Mardigan et al. (2009) com a extração do bagaço
seco e triturado de uva Isabel com etanol 96% por 48 horas e concentrado quase 10
vezes em estufa com circulação de ar, o qual mostrou ação antibacteriana sobre as
bactérias ácido-láticas em salsichas. Por outro lado, a fração retida mostrou-se de 3
vezes mais concentrada em fenólicos que os extratos metanólicos de casca de uva
Isabel obtidos por Soares et al. (2007) e por dos Santos (2009). Esta mesma fração
retida apresentou de cinco a oito vezes mais fenólicos, em base seca, que os
extratos de 17 variedades de uvas testadas por Iacopini et al. (2008), cujos teores,
em base seca, variaram de 37,70 a 53,04 mg.g-1.
A capacidade antioxidante das frações alimentação e retido foram maiores
quando lidas pelo método ORAC, da mesma forma que nos demais extratos
avaliados neste trabalho, sugerindo mecanismos distintos de atividade antioxidante
pelos compostos presentes no extrato. Os extratos analíticos de bagaço e casca de
uva Isabel apresentaram, respectivamente, atividade antioxidante em DPPH média
de 17,06 e 14,63 mM de Trolox equivalente, superiores aos extratos utilizados como
alimentação, cujos valores médios foram de 5,23 e 6,37 mM de Trolox equivalente
medidos em ORAC e ABTS. A nanofiltração, por sua vez, foi eficiente na
concentração dos compostos bioativos atingindo valores de 3,3 a 4,7 vezes
163
superiores. Por outro lado, os extratos metanólicos acidificados de casca de seis
cultivares brasileiras apresentaram uma média de 2.076 µmol Trolox.100g-1 (base
seca) e 3,640 µmol Trolox.100g-1 (base seca) para o extrato de uva Isabel, valores
bem inferiores aos atingidos neste trabalho com o bagaço de uva Isabel, antes e
após a nanofiltração.
Os dados de atividade antioxidante quantificados pelas duas metodologias
apresentaram ótima correlação com os fenólicos e antocianinas,com valores de
rPearson > 0,99 para um intervalo de confiança de 95%. Estes resultados foram
similares aos observados com os outros extratos, comprovando a importância dos
fenólicos da uva para a capacidade antioxidante.
As frações foram ainda avaliadas quanto ao pH, acidez titulável e sólidos
totais (Tabela 6.20) e como verificado nos processos dos outros extratos, a fração
permeada mostrou-se límpida e passível de ser reaproveitada.
Tabela 6.20- Características físico-químicas das frações da nanofiltração de extrato hidroetanólico de
uva Isabel (SU).
Análises Correntes Acidez¹ pH Sólidos totais²
Pro
cess
o 1
Alimentação 0,10 + 0,01b 3,89 + 0,01b 0,32 + 0,04b
Permeado 0,06 + 0,01c 4,07 + 0,01a 0,08 + 0,01c
Retido 0,49 + 0,00a 3,58 + 0,01c 2,32 + 0,10a
Pro
cess
o 2
Alimentação 0,09 + 0,00b 3,72 + 0,01b 0,35 + 0,03b
Permeado 0,05 + 0,00c 3,79 + 0,02a 0,10 + 0,00c
Retido 0,71 + 0,03a 3,10 + 0,00c 3,13 + 0,15a
¹ valores expressos em ácido tartárico equivalente g.100g-¹; ² sólidos totais expressos em g.100g-¹. Letras diferentes na
mesma coluna indicam diferença significativa com intervalo de confiança de 95%, por Fisher (LSD).
Assim da mesma forma que nos demais extratos, sugere-se o aproveitamento
da fração permeado na etapa de extração, sendo proposto o diagrama de processos
ilustrado na Figura 6.48 para o aproveitamento máximo do resíduo.
164
Figura 6.48 – Diagrama de processos sugerido para o máximo aproveitamento do bagaço e redução
real do resíduo sólido.
6.6. SECAGEM E MICROENCAPSULAÇÃO DOS EXTRATOS
CONCENTRADOS NA NANOFILTRAÇÃO E SEM ETANOL POR SPRAY
DRYING
A microencapsulação vem sendo largamente avaliada e testada para os
compostos bioativos, como os compostos fenólicos, devido aos ganhos efetivos com
a estabilidade, aumento da meia-vida, redução dos sabores desagradáveis quando
comparado ao uso dos mesmos compostos na forma livre. Contudo, devido aos
riscos de inflamabilidade, evita-se usar extratos contendo solventes. Assim, o etanol
presente nos extratos concentrados pela nanofiltração, cerca de 25% já que a
165
membrana utilizada não era seletiva, teve de ser removido antes da
microencapsulação. Um ensaio piloto com um sistema de pervaporação foi
conduzido com o intuito de além de remover, recuperar o etanol presente. Porém, o
fluxo médio de permeado foi extremamente baixo (5,3 x10-3 kg.h-1m-2), o que poderia
acarretar grandes perdas para a capacidade antioxidante pelo longo tempo de
processo e oxidação ao qual o extrato seria submetido. Assim, optou-se por remover
o etanol em rotaevaporador de bancada, até que a massa do extrato fosse reduzida
em aproximadamente 30%.
No presente trabalho, o único material de parede testado foi a maltodextrina
MOR-REX 1910® com dextrose equivalente de 10, que foi adicionada aos extratos
desalcoolizados até se atingir um teor de sólidos solúveis de aproximadamente 20°
Brix, lidos em refratômetro de campo. A maltodextrina empregada no estudo foi a
mesma utilizada por Fang e Bhandari (2011) para a encapsulação de suco de
bayberry, que permitiu a retenção de 96% dos fenólicos e 94% das antocianinas
totais. O teor de material de parede adicionado baseou-se na microencapsulação de
antocianinas presentes no extrato de hibisco (Hibiscus sabdariffa L) realizada por
Idham et al. (2012).
No equipamento utilizado neste trabalho, a temperatura de saída é
monitorada e dependente da vazão de alimentação e do equilíbrio termodinâmico, e
para que não ultrapassasse 90°C as vazões foram aju stadas ao longo do processo e
os valores médios foram de 1086,5; 973,4 e 1040,3 g.h-1 para os ensaios com os
extratos de uva Pinot Noir (VB), Chardonnay (VT) e Isabel (SU), respectivamente.
Embora alguns estudos tenham apontado maiores perdas de antocianinas com
temperaturas acima de 160-180°C (ERSUS e YURDAGEL, 2007; SILVA et al.,
2013), é provável que a temperatura de saída acima de 100°C, em conjunto com a
temperatura de entrada acima de 160°C, seja mais preponderante para a
instabilidade das antocianinas que somente a temperatura de entrada.
As massas de extrato alimentadas no sistema foram de 416, 391 e 422 g para
os processos com os extratos VB, VT e SU, respectivamente, e o pó recuperado
correspondeu a 94, 84 e 91% da massa inicial em base seca.
Todos os pós obtidos apresentaram ótimos ajustes aos modelos BET e GAB,
com R² acima de 0,99 (tabela 6.21). Os valores da umidade na monocamada (Xm)
variaram de 3,7 a 7,4%, estando estes teores de acordo com os dados da literatura
166
para a matlodextrina DE 10 pura (PÉREZ-ALONSO et al., 2006). Os pós de extrato
de própolis obtidos por spray-dryer apresentaram teores de umidade na monocamda
(Xm) que variaram de 4,5 a 5,2% (DA SILVA et al., 2013), valores similares aos
observados neste trabalho. A determinação da umidade da monocamada é de
grande interesse por indicar a quantidade de água fortemente adsorvida em sítios
específicos, sendo esta a condição de maior estabilidade do produto.
Tabela 6.21 – Coeficientes dos ajustes das isotermas segundo os modelos de BET e GAB.
GAB BET
VB VT SU VB VT SU
Xm 0,056 0,074 0,238 0,037 0,059 0,054
K 0,873 0,857 0,658 2,757 1,646 1,389
C 1,683 1,249 0,457 -
N
14,615 27,45 9,86
R² 0,999 0,998 0,995 1,000 0,999 0,996
O modelo de BET permitiu uma maior homogeneidade nos valores da
umidade da monocamada. Os ajustes dos dados experimentais por ambos os
modelos empregados foram similares até se atingir uma aw de 0,43, mas o melhor
ajuste de todos pontos experimentais foi conseguido no modelo de GAB (Figuras
6.49 e 6.50).
.
Figura 6.49- Isotermas de sorção dos microencapsulados obtidos com os dados experimentais e com
os dados ajustados pelo modelo BET
167
Mesmo com um ótimo ajuste, o valor de Xm por GAB para o pó SU foi bem
diferente dos demais, em torno de 24g água.100g sólidos-1. Jiménez-Aguilar et al.
(2011) encontraram um teor similar, cerca de 20 g água.100g sólidos-1 para o pó
obtido de extrato de mirtilo tendo como material de parede goma “mesquite”
(Prosopis laevigata).
Figura 6.50 Isotermas de sorção dos microencapsulados obtidos com os dados experimentais e com
os dados ajustados pelo modelo de GAB.
Embora as isotermas pareçam ser as dos tipo II, segundo a classificação de
Brunauer (FENNEMA, 1996), as regiões não estão claramente definidas. Contudo
pode-se observar um leve ponto de inflexão a partir de 0,4 de aw (
Figura 6.49 e Figura 6.50), iniciando-se então a fase II com adsorção da água
nas camadas inferiores à monocamada e. a partir de 0,7 a solubilização do material
(Figura 6.51). Portanto, acima de 0,43 de atividade de água, embora não tenha
ocorrido a solubilização dos pós, a água estará fracamente ligada, ou seja,
facilmente disponível para participar das diversas reações (oxidação, crescimento de
microorganismos) comprometendo a integridade e segurança do produto.
168
CH3COOK
MgCl2
K2CO3
KCl
NaCl
KI
Figura 6.51- Microencapsulados nas condições de umidade de equilíbrio das diferentes umidades
relativas aos quais foram submetidos para a determinação das isotermas.
Os microencapsulados foram mantidos a 25°C e umidad e relativa do ar de
52,9% atingida com a solução salina supersaturada de nitrato de magnésio.
Os microencapsulados VB e SU apresentaram teores de antocianinas totais
em torno de 721 e 404 mg.(100g)-1, respectivamente, valores muito superiores aos
95 mg.(100g)-1 obtido por Valduga et al. (2008) na melhor condição de
microencapsulação do extrato de bagaço de uva Isabel empregando uma mistura de
goma arábica e maltodextrina. Embora o bagaço tenha sido da mesma cultivar,
169
Isabel, o teor de antocianinas do microencapsulado do presente trabalho foi mais de
quatro vezes superior ao observado por Valduga et al. (2008). Estas diferenças
podem ser resultantes tanto pela etapa de extração como pela concentração
empregada do material de parede.
Após os 51 dias de estocagem, as perdas foram de 8,90 e 10,9% em VB e SU
(Figura 6.52), respectivamente, inferior aos quase 20% observado com suco de
bayberry também microencapsulado com matlodextrina 10DE e mantido a 25 °C em
umidade relativa de 44% (FANG e BHANDARI, 2011). No entanto, quando mantidos
em umidade relativa de 11 e 22% no mesmo período, não foram observadas perdas,
enquanto após 6 meses as perdas nestas condições foram de 7%. Estes dados
evidenciam a importância da umidade sobre a estabilidade dos pós
microencapsulados
Ersus e Yurdagel (2007) testaram maltodextrinas diferentes quanto ao teor de
dextrose equivalente na microencapsulação das antocianinas de extrato de cenoura
preta, as quais foram adicionadas até 20°Brix e obs ervaram que a a maltodextrina
com DE 20-23 foi o melhor agente encapsulante. Com relação à variação na
temperatura do ar de secagem, os mesmos autores identificaram perdas elevadas
quando esta era superior a 160 - 180°C. Na melhor c ondição operacional para o
extrato de cenoura preta, os teores de antocianinas no pó foi de 630,9 mg.(100g)-1,
valor intermediáro aos obtidos com os extratos de bagaço de Pinot Noir e Isabel.
Figura 6.52 – Estabilidade das antocianinas totais (esquerda) e monoméricas (direita) durante o
armazenamento.
170
Como esperado, as antocianinas monoméricas mostraram-se um pouco
menos estáveis, com perdas de 13,0% no pó VB e 15,2% no pó SU ao longo dos 51
dias de armazenamento. Estes resultados, por sua vez, mostraram-se promissores
se comparados aos observados por Olaya et al. (2009) para os microencapsulados
de amora dos Andes (Rubus glucus) e tamarillo ou tomate de árbol (Solanum
betaceum) os quais tiveram perdas de 60% e 76% ao longo de 35 dias de
armazenamento a 25°C e a w de 0,35. As antocianinas monoméricas são
responsáveis pela coloração mais intensa de vermelho e violeta, devendo ter uma
atenção especial para sua manutenção e integridade, principalmente quando o pó
for aplicado como corante natural.
A cor inicial e final para os pós foi medida pelos sistemas LCh e La*b* e está
apresentada na Tabela 6.22.
Como esperado os vlores de L que indicam a luminosidade foram menores no
pó VB que apresentou-se mais escuro que os demais (Figura 6.53). Valores
positivos de a* indicam a cor vermelha enquanto que os valores negativos de b*
referem-se à coloração azul e os positivos ao amarelo. Assim, os pós VB e SU são
bem similares entre si com tonalidade violeta correspondente às antocianinas e
diferentes de VT, cuja matiz está mais próxima ao amarelo. Da mesma forma, no
sistema LCh, o C é a saturação da cor e o h o ângulo que indica a tonalidade. O pó
VT cujo ângulo é de 77 estaria bem próximo ao amarelo (90), enquanto nos pós VB
e SU o valor de 350 estaria entre o azul e o vermelho (360), correspondendo ao
violeta (Figura 6.54)
Figura 6.53- Microencapsulados obtidos com extratos SU, VT e VB, da esquerda para a direita.
171
Tabela 6.22 Medida de cor dos microencapsulados no ponto inicial e final do estudo de estabilidade.
Inicial 51 Dias
L a* b* C h L a* b* C h
VB 41,61 33,51 - 3,89 33,73 353,38 54,32 34,65 -4,86 34,98 352,01
VT 87,02 3,30 14,11 14,50 76,87 91,81 2,54 11,69 11,97 77,73
SU 56,83 33,92 - 4,57 34,22 352,33 61,05 31,81 -4,85 32,18 351,33
Embora pela análise estatística (ANOVA e Fisher) ao longo do tempo de
estabilidade, os parâmetros tenham sido diferentes, o olho humano só percebe
variações cujo delta seja superior a 5.
A microencapsulação dos extratos de amora de Castilla (Rubus glucus) e
tamarillo (Solanum betaceum) não foi tão eficiente quanto a realizada no presente
trabalho para os extratos VB e SU, pois ao longo dos 35 dias de armazenamento a
25°C e a w de 0,35 a saturação da cor (C) diminuiu de 50 para 10 e de 34 para 15,
respectivamente (OLAYA et al., 2009), indicando a degradação dos pigmentos.
Figura 6.54- Diagrama de cor do sistema Lab.
172
Os índices de cor do pó de cenoura preta foram L (50 – 56), a* (24 -31) e b*
(5,1 -5,9), posicionando o produto na região do vermelho-alaranjado, diferente dos
pós VB e SU que apresentaram coloração violeta (
Figura 6.54), pois embora os valores de a* estejam próximos ao extrato de
cenoura preta os valores de b foram negativos (ERSUS E YURDAGEL , 2007).
Com relação à estabilidade dos compostos fenólicos após 51 dias de
armazenamento nas condições já mencionadas, foram verificadas perdas de 11,3%
para o VB, 9,8% no VT e 6,3% no extrato SU (Figura 6.55). E embora tenham sido
avaliados apenas durante cerca de 2 meses, estes resultados não estão muito
diferentes da literatura. Os microencapsulados de bayberry perderam de 6 a 9% dos
fenólicos ao longo de 6 meses quando armazenados a 25°C e umidade relativa de
11 a 44%, enquanto que a 40°C estas perdas foram de 9 a 37% e de 6 a 8% sob
5°C (FANG e BHANDARI, 2011).
Figura 6.55- Estabilidade dos microencapsulados quanto aos fenólicos totais.
As oscilações observadas ao longo do tempo e que não se mantiveram
devem ser avaliadas com cuidado, uma vez que a homogeneidade da distribuição
dos extratos e do material de parede nos microencapsulados não foi verificada,
podendo ter diferenças significativas nas proporções destes componentes nas
alíquotas coletadas para as análises.
173
A capacidade antioxidante dos pós medida pelo método ORAC após 51 dias
de armazenamento foi, no máximo, 6,5% menor que a inicial. Porém pelo método
ABTS a redução foi de 20% para SU, 9,2% para VB e 1,4% para VT (Figura 6.56).
Figura 6.56- Estabilidade dos pós quanto à capacidade antioxidante medida pelos métodos TEAC e
ORAC.
A capacidade antioxidante inicial dos microencapsulados em base seca (µmol
TE.g-1) foi de 456,92 + 50,47 para o VB; 227,47 + 20,29 para o VT e 286,08 + 4,27,
valores bem inferiores aos do suco de açaí microencapsulado com maltodextrina
DE10 que foi de 2.376,29 + 98,90 µmol TE.g-1 de massa seca do suco
(aproximadamente 792 µmol TE.g-1 pó em base seca) obtido por Tonon (2009). Vale
salientar que os produtos obtidos neste trabalho são oriundos de extratos de
resíduos e que o açaí é um dos frutos com maior atividade antioxidante. O pó obtido
por Jiménez-Aguilar et al. (2011), a partir do extrato de mirtilo, apresentou uma
capacidade antioxidante de 115,41 + 1,69 µmol TE.g-1 (base seca), praticamente a
metade da atividade do microencapsulado obtido com o resíduo mais exaurido. Este
dado corrobora para a possibilidade de aproveitamento dos resíduos e necessidade
da avaliação potencial individual.
Embora o extrato de VT inicialmente fosse bem menos ativo que o de SU,
após a microencapsulação os pós não foram estatisticamente diferentes quanto à
atividade antioxidante medida pelo método ABTS com intervalo de confiança de
174
95%, porém diferiram quanto à capacidade medida em ORAC com o mesmo
intervalo de confiança. Na metodologia ORAC, o mecanismo de reação é a
transferência de hidrogênio, assim a diferença percebida estatisticamente entre os
extratos SU e VT pode ser devido ao maior número de hidroxilas livres das
antocianinas presentes apenas no extrato SU capazes de transferir o hidrogênio ao
radical AAPH protegendo a fluoresceína por mais tempo.
A capacidade antioxidante medida em ORAC foi a variável que menos oscilou
ao longo dos 51 dias. Contudo assim como verificado por Ersus e Yurdagel (2007)
para o pó de bayberry existe uma correlação entre a capacidade antioxidante e a
concentração dos compostos fenólicos e antocianinas. No presente trabalho, esta
correlação foi significativa, com valores de rPearson > 0,93 para ORAC e maiores que
0,95 para TEAC foram observados.
Os estudos de pré-viabilidade econômica para a obtenção dos pós
microencapsulados dos extratos VB (ANEXO E) e VT (ANEXO F) basearam-se no
trabalho de Eitel (2013), e indicaram que valores de venda acima de R$ 102 e R$ 51
do quilo tornam o processo economicamente viável (TIR>30%). A diferença entre os
valores de venda mínimo de VB e VT deve-se principalmente a quantidade total de
matéria prima considerada para a produção anual. De acordo com os preços
praticados no mercado internacional, acima de €400 o quilo, existe uma indicação da
alta viabilidade econômico-financeira para a produção em escala comercial destes
ingredientes. Contudo, estudos de viabilidade econômica mais detalhados e de
aplicabilidade em sistemas alimentícios devem ser realizados.
175
7. CONCLUSÕES E CONSIDERAÇÕES FINAIS
As extrações enzimática e hidroetanólica com o bagaço obtido
experimentalmente proporcionaram valores similares em atividade antioxidante.
Para o bagaço obtido no processo industrial a extração hidroetanólica foi mais
eficiente que a extração enzimática.
Dentre as condições avaliadas para a extração dos compostos bioativos
presentes nos bagaços de uva Pinot noir (VB), Chardonnay (VT) e Isabel (SU), a
que permitiu os maiores rendimentos em atividade antioxidante foi conduzida a
50°C, por duas horas com agitação orbital de 60 rpm , razão solvente:substrato de
9:1, empregando a solução aquosa de etanol 70% com pH ajustado para 4,0 com
ácido cítrico como solvente.
Os coeficientes de difusão dos fenólicos na condição de extração mais
favorável à elaboração dos extratos concentrados foram de 8,58 x10-15; 1,53 x10-16 e
3,33 x10-16 m².s-1 para os bagaços VT, SU e VB, respectivamente.
O tempo necessário para a extração das antocianinas foi inferior ao
observado para os fenólicos totais.
O tempo de extração afeta negativamente a estabilidade das antocianinas.
O elevado teor de etanol no extrato (70%) inviabilizou a concentração por
osmose inversa.
As membranas cerâmicas de nanofiltração não foram eficientes para a
concentração do extrato hidroetanólico, ocorrendo permeação de compostos de
interesse.
A membrana de nanofiltração composta de poliamida foi a mais eficiente
dentre as avaliadas para a concentração dos compostos bioativos, em especial,
quando o teor de etanol do extrato foi reduzido de 70 para 30%.
No caso do processo combinado de extração hidroetanólica e concentração
por nanofiltração, as condições operacionais mais favoráveis foram: extração com
solução de etanol 30% com pH ajustado para 4,0 com ácido cítrico, empregada na
razão 9:1 (solvente:substrato) por duas horas a 50°C, seguida da centrifugação a
37,5g com malha de 150 µm como meio filtrante e concentração em membrana
176
polimérica a 40°C, pressão aplicada ao sistema de 1 2 bar e vazão de recirculação
de 700 L.h-1.
Foi possível microencapsular os extratos concentrados por membranas e
isentos de etanol empregando maltodextrina DE10 como agente encapsulante. Os
microencapsulados apresentaram uma boa estabilidade. E mesmo em atmosfera
pouco favorável, umidade relativa de 52% a 25°C, as perdas foram inferiores a 20%
nos 51 dias de armazenamento.
Para uma maior estabilidade dos microencapsulados, recomenda-se o
armazenamento em atmosfera com atividade de água inferior a 43%.
Diante dos resultados obtidos neste estudo sugere-se:
• Avaliar a extração hidroetanólica variando o teor de etanol na solução
de 0 a 30%.
• Realizar um estudo de extração em contra corrente para tentar
maximizar a extração dos compostos ou reduzir a quantidade de
solvente.
• Reciclo do permeado da nanofiltração para a etapa de extração.
• Testar outras membranas e sistemas para a remoção ou até mesmo a
recuperação do etanol presente na fração retido.
• Testar a toxicidade dos extratos e microencapsulados.
• Testar os microencapsulados em sistemas alimentícios como
ingredientes funcionais ou somente antioxidantes ou corantes.
• Realizar um estudo de estabilidade dos microencapsulados por um
período mais longo em outras condições de umidade relativa e
temperatura.
• Aproveitamento da torta da centrifugação para redução efetiva do
resíduo.
• Estudo da viabilidade econômica do processo em escala industrial.
177
8. BIBLIOGRAFIA
ABE, LUCILE TIEMI, RENATA VIEIRA DA MOTA, FRANCO MARIA LAJOLO, e MARIA INÉS GENOVESE. “Compostos fenólicos e capacidade antioxidante de cultivares de uvas Vitis labrusca L. e Vitis vinifera L.” Ciência e Tecnologia de Alimentos, abril-junho de 2007: 394-400.
“ALVES, R. E., E. S. BRITO, F. D. SAURA-CALIXTO, M. S. M. RUFINO, e J. PÉREZ-JIMENEZ. “Compostos com propriedades funcionais em frutas.” II Simpósio Brasileiro de Pós-Colheita. 2007. 179-187.
AMENDOLA, D., M. D. De FAVERI, e G. SPIGNO. “Grape marc phenolics: Extraction kinetics, quality and stability of extracts.” Journal of Food Engineering, 2010: 384–392.
ANASTASIADI, MARIA, HARRIS PRATSINIS, DIMITRIS KLETSAS, ALEXIOS-LEANDROS SKALTSOUNIS, e SERKOS A. HAROUTOUNIAN. “Bioactive non-coloured polyphenols content of grapes, wines and vinification by-products: Evaluation of the antioxidant activities of their extracts.” Food Research International, 2010: 805-813.
ASANUMA, M., I. MIYAZAKI, e N. OGAWA. “Dopamine- or L-DOPA-induced neurotoxicity:the role of dopamine quinone formation and tyrosinase in a model of Parkinson’s disease.” Neurotoxicity Research, 2003: 165–176.
ASEN, S., R. N. STEWART, e K. H. NORRIS. “Copigmentation of anthocyanins in plant tissues and its effect on collor.” Phytochemistry, 1972: 1139-1144.
AUGER, C, et al. “Phenolics from commercialized grape extracts prevent early atherosclerotic lesions hamsters by mechanisms other than antioxidant effect.” Journal Agricultural and Food Chemistry, 2004: 5297-5302.
BAGCHI, DEBASIS, et al. “Free radicals and grape seed proanthocyanidin extract: importance in human health and disease prevention.” Toxicology, 2000: 187 – 197.
BAIL, S., G. STUEBIGER, S. KRIST, H. UNTERWEGER, e G. BUCHBAUER. “Characterization of various grape seed oils by volatile compounds, triacylglycerol composition, total phenols and antioxidant capacity.” Food Chemistry, 2008: 1122- 1132.
BALESTRO, EVELINE ANGÉLICA, IVANA GREICE SANDRI, e ROSELEI CLAUDETE FONTANA. “Utilização de bagaço de uva com atividade antioxidante na formulação de barras de cereais.” Revista Brasileira de Produtos Agroindustriais, 2011: 203-209.
BASTOS, DEBORAH H. M., MARCELO M. ROGERO, e JOSÉ ALFREDO G. ARÊAS. “Mecanismos de ação de compostos bioativos dos alimentos no contexto de processos inflamatórios relacionados à obesidade.” Arquivos Brasileiros de Endocrinologia e Matabologia, julho de 2009: 646-656.
BERTRAN, E., X. SORT, M. SOLIVA, e I. TRILL. “Composting winery waste: sludges and grape stalks.” Bioresource Technology, 2004: 203–208.
BIANCHI, MARIA DE LOURDES PIRES, e LUSÂNIA MARIA GREGGI. ANTUNES. “Radicais livres e os principais antioxidantes da dieta - artigo de revisão.” Rev. Nutrição, maio/agosto de 1999: 123-130.
BOGIANCHINI, M., ANA B. CEREZO, A. GOMIS, F. LÓPEZ, e M. C. GARCÍA-PARRILLA. “Stability, antioxidnat cativity and phenolic composition of commercial and reverse osmosis obtained dealcoholised wines.” LWT - Food Science and Technology, 2011: 1369-1375.
BOTELLA, C., A. DIAZ, I. de ORY, C. WEBB, e A. BLANDINO. “Xylanase and pectinase production by Aspergillus awamori on grape pomace in solid state fermentation.” Process Biochemistry, 2007: 98–101.
178
BOTELLA, C., I. ORY, D. CANTERO, e A. BLANDINO. “Hydrolytic enzyme production by Aspergillus awamori on grape pomace.” Biochemical Engineering Journal, 2005: 100–106.
BOUSSETTA, N., E. VOROBIEV, L. H. LE, A. CORDIN-FALCIMAIGNE, e J-L. LANOISELLÉ. “Application of electrical treatments in alcoholic solvent for polyphenols extraction from grape seeds.” LWT - Food Science and Technology, 2012: 127-134.
BRACCHITTA, M., D. ZANICHELLI, e L. SETTI. “Pre-treatment to enhance the energetic yield of winemaking.” Special Abstracts / Journal of Biotechnology, 2010: S576 -S577.
BRASIL. 04 de janeiro de 2008. http://extranet.agricultura.gov.br/legislconsulta/conusltarLegislacao.do?operacao=visualiza&id=18362 (acesso em 18 de janeiro de 2013).
—. 08 de março de 1990. <http://extranet.agricultura.gov.br/sislegis-consulta/consultarLegislacao.do?operacao=visualizar&id=2794 (acesso em 18 de janeiro de 2013).
—. “Lei 12.305 - Política Nacional de Resíduos Sólidos.” JusBrasil. 02 de Agosto de 2010. http://www.jusbrasil.com.br/legislacao/1026318/decreto-7404-10 (acesso em 06 de novembro de 2011).
BRAVO, L. “Polyphenols: Chemistry, Dietary Sources, metabolism and nutritiona significance.” Nutritional Reviews, 1998: 317-333.
BRAZINHA, C., e J. CRESPO. “Membrane processing: Natural antioxidants from winemaking by-products.” 2010.
BRENNAN, JAMES G. “Evaporation and Dehydration.” In: Food Processing Handbook, 71-121. Weinheim: WILEY-VCH Verlag GmbH & Co. KGaA, 2006.
BRENNAN, JAMES G. “Solid-Liquid Extraction.” In: Food Processing Handbook, edição: JAMES G. BRENNAN, 452-460. Weinheim, Germany: WILEY-VCH Verlag GmbH & Co. KGaA, 2006.
BREWER, M. S. “Natural Antioxidants: Sources, compounds, mechanisms of action, and potencial applications.” Comprehensive Reviews in Food Science and Food safety, 2011: 221-245.
BRITO, E. S., M. C. P. ARAÚJO, R. E. ALVES, C. CARKEET, B. A. CLEVIDENCE, e J. A. NOVOTNY. “Anthocyanins present in selected tropical fruits: acerola, jambolão, jussara and guajiru.” Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2007: 9389–9394.
BUCHWEITZ, M., J. BRAUCH, R. CARLE, e D. R. KAMMERER. “Application of ferric anthocyanin chelates as natural blue food colorants in polysaccharide and gelatin based gels.” Food Research International, 2013: 274–282.
BURIN, VÍVIAN MARIA, LEILA DENISE FALCÃO, LUCIANO VALDEMIRO GONZAGA, ROSEANE FETT, JEAN PIERRE ROSIER, e MARILDE TEREZINHA BORDIGNON-LUIZ. “Colour, phenolic content and antioxidant activity of grape juice.” Ciênc. Tecnol. Aliment., out-dez de 2010: 1027-1032.
BURIN, VÍVIAN MARIA; COSTA, LÉA LUZIA FREITAS; ROSIER, JEA-PIERRE e BORDIGNON-LUIZ, TEREZINHA MARILDE. “Cabernet Sauvignon wines from two different clones, characterization and evolution during bottle ageing.” LWT – Food Science and Technology; 44, 1931-1938.
BUSTAMANTE, M. A., C. PAREDES, J. MORALES, A. M. MAYORAL, e R. MORAL. “Study of the composting process of winery and destillery wastes using multivariate techniques.” Bioresource Technology, 2009: 4766-4772.
BUSTAMANTE, M. A., M. D. PÉREZ-MURCIA, C. PAREDES, R. MORAL, A. PÉREZ-ESPINOSA, e J MORENO-CASELLES. “Short-term carbon and nitrogen mineralisation in soil amended with winery and distillery organic wastes.” Bioresource Technology, 2007: 3269-3277.
179
BUSTAMANTE, M. A., R. MORAL, C. PAREDES, A. PÉREZ-ESPINOSA, J. MORENO-CASELLES, e M. D. PÉREZ-MURCIA. “Agrochemical characterisation of the solid by-products and residues from the winery and distillery industry.” Waste Management, 2008: 372-380.
BUSTOS, G., A. B. MOLDES, J. M. CRUZ, e J. M. DOMÍNGUEZ. “Formulation of low-cost fermentative media for latic acid production with Lactobacillus rhamnosus using vinification lees as nutrients.” Journal Agriculture and Food Chemistry, 2004: 801-808.
—. “Evaluation of vinification lees as a general medium for Lactobacillus strains.” Journal Agriculture Food Chemistry, 2004: 5233-5239.
CACACE, J. E, e G. MAZZA. “Mass transfer process during extraction of phenolic compounds from milled berries.” Journal of Food Engineering, 2003: 379-389.
CACACE, J. E., e G. MAZZA. “Extraction of Anthocyanins and Other Phenolics from Black Currants with Sulfured Water.” Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2002: 5939-5946.
CAI, Y. Z., e H. CORKE. “Production and Properties of Spray-dried Amaranthus Betacyanin Pigments.” JFS: Sensory and Nutritive Qualities of Food, 2000: 1248-1252.
CAMARGO, UMBERTO ALMEIDA, JOÃO DIMAS GARCIA MAIA, e PATRÍCIA RITSCHEL. Embrapa Uva e Vinho: novas cultivares brasileiras de uva. Edição: Patrícia Ritschel e Sandra de Souza Sebben. Bento Gonçalves, Rio Grande do Sul: Embrapa Uva e Vinho, 2010.
CAMARGO, UMBERTO ALMEIDA, JORGE TONIETTO, e ALEXANDREre HOFFMANN. “Progressos na viticultura brasileira.” Revista Brasileira de Fruticultura Volume especial E (Outubro 2011): 144-149.
CAMPOS, L. Obtenção e extratos de bagaço de uva Cambernet Sauvingnon (Vitis Vinifera): parâmetros de processo e moldagem matemática. Florianópolis: Universidade Federal de Santa Catarina, 2005.
CANUTO, GISELE ANDRÉ BAPTISTA. Caracterização, quantificação e estudo da relação retençã-propriedade antioxidante (QRPR) de antocianinas em extratos de morango (Fragaria vesca) por Cromatografia Líquida de Alta Eficiência. São Paulo: USP - Universidade de São Paulo, 2011.
CÁRCEL, JUAN A., JOSÉ V. GARCÍA-PÉREZ, ANTONIO MULET, LIGIA RODRÍGUEZ, e ENRIQUE RIERA. “Ultrasonically assisted antioxidant extraction from grape stalks and olive leaves.” Physics Procedia, 2010: 147–152.
CASSANO, A., C. CONIDI, R. TMPONE, M. D'ÁVELLA, e E. DRIOLI. “A membrane-based process for the clarification and the concentration of the cactus pear juice.” Journal of Food Engineering, 2007: 914-921.
CASSANO, A., L. DONATO, C. CONIDI, e E. DRIOLI. “Recovery of bioactive compounds in kiwifruit juice by ultrafiltration.” Innovative Food Science and Emerging Technologies, 2008: 556–562.
CASTAÑEDA-OVANDO, ARACELI, MARIA DE LOURDES PACHECO-HERNÁNDEZ, MARIA ELENA PÁEZ-HERNÁNDEZ, JOSÉ A. RODRÍGUEZ, e CARLOS ANDRÉS GALÁN-VIDAL. “Chemical studies of anthocyanins: A review.” Food Chemistry, 2009: 859–871.
CAVALCANTI, RODRIGO N., DIEGO T. SANTOS, e MARIA ANGELA A. MEIRELES. “Non-thermal stabilization mechanims of anthocyanins in model and food systems - An overview.” Food Research International, 2011: 499-509.
CHANDRASEKHAR, J., M. C. MUDHUSUDHAN, e K. S. M. S. RAGHAVARAO. “Extraction of anthocyanins from red cabbage and purification using adsorption.” Food and Bioproducts Processing, 2012: 615-623.
180
CHERYAN, M. Ultrafiltration and Microfiltration Handbook. Lancaster: Technomic Publishing Company, 1998.
CHEYNIER, V. “Polyphenols in foods are more complex than often thought.” American Journal Clinical Nutrition, 2005: 223S-229S.
CHIOU, D., e T. A. G. LANGRISH. “Development and characterisation of novel nutraceuticals with spray drying technology.” Journal of Food Engineering, 2007: 84-91.
CIOTA, ALINE SIMIONATO. Composição química do resíduo do suco de uva, visando a utilização como adubo orgânico em videiras. Bento Gonçalvez: Trabalho de conclusão do curso de Tecnologia em Viticultura e Enologia. CEFETEC de Bento Gonçalves, 2007.
CISSÉ, MADY, PHILIPPE BOHUON, FALILLOU SAMBE, CHEIKHOU KANE, MAMA SAKHO, e MANUEL DORNIER. “Aqueous extraction of anthocyanins from Hibiscus sabdariffa: Experimental kinetics and modeling.” Journal of Food Engineering, 2012: 16–21.
CLEMENTE, EDMAR, e DIRSEU GALLI. “Stability of the anthocyanins extracted from residues of the wine industry.” Ciência e Tecnologia de Alimentos, jul-set de 2011: 765-768.
CLIFF, MARGARET A., MARJOIRE C. KING, e JIMMY SCHLOSSER. “Anthocyanin, phenolic composition, colour measurement and sensory analysis of BC commercial red wines.” Food Research International, 2007: 92-100.
COELHO, MIGUEL TELESCA. PECTINA: Características e Aplicações em Alimentos. Pelotas: Universidade de Pelotas, 2008.
CONIDI, CARMELA, ALFREDO CASSANO, e ENRICO DRIOLI. “Recovery of phenolic compounds from orange press liquor by nanofiltration.” Food and Bioproducts Processing, 2012: 867-874.
CORNELLI, UMBERTO. “Antioxidant use in nutraceuticals.” Clinics in Dermatology, 2009: 175–194.
CORRALES, M., S. TOEPFL, P. BUTZ, D. KNORR, e B. TAUSCHER. “Extraction of anthocyanins from grape by-products assisted by ultrasonics, high hydrostatic pressure or pulsed electric fields: A comparison.” Innovative Food Science & Emerging Technologies, 2008: 85-91.
CORREIO RIOGRANDENSE. Correio Riograndense. 13 de outubro de 2004. http://www.esteditora.com.br/correio/4907/4907.htm (acesso em 19 de janeiro de 2009).
COSTA, J. E., e A. P. BELCHIOR. “Laboração e utilização dos produtos secundários da vinificação.” Lisboa, 1972.
COUTO, DANIEL SIMÕES, et al. “Evaluation of nanofi ltration membranes for the retention of anthocyanins of açai (Euterpe oleracea Mart.) juice.” Desalination and Water Treatment, Março de 2011: 108-113.
COWAN, MARJORIE MURPHY. “Plant Products as Antimicrobial Agents.” Clinical Microbiology Reviews, Outubro de 1999: 564-582.
DA PORTO, CARLA, ERICA PORRETTO, e DEBORHA DECORTI. “Comparison of ultrasound-assisted extraction with conventional extraction methods of oil and polyphenols from grape (Vitis vinifera L.) seeds.” Ultrasonics Sonochemistry, 2013.
DA SILVA, FELIPE C., et al. “Assessment of production efficiency, physicochemical properties and storage stability of spray-dried propolis, a natural food additive, using gum Arabic and OSA starch-based carrier systems.” food and bioproducts processing, 2013: 28–36.
181
DAS, D. K., e N. MAULIK. “Resveratrol inCardioprotection: A Therapeutic Promise of Alternative Medicine.” Molecular Intervention, 2006: 36 -47.
DAVIES, KEVIN M., e KATHY E. SCHWINN. “Molecular Biology and Biotechnology of Flavonoid Biosynthesis.” In: Flavonoids Chemistry, Biochemistry and Applications, edição: Oyvind M . Andersen e Kenneth R . Markham, 143-163. CRC Press, 2005.
DEIANA, A. C., M. F. SARDELLA, H. SILVA, A. AMAYA, e N. TANCREDI. “Use of grape stalk, a waste of the viticulture industry, to obtain activeted carbon.” Journal of Hazardous Materials, 2009: 13–19.
DEVESA-REY, R., X. VECINO, J. L. VARELA-ALENDE, M. T. BARRAL, J. M. CRUZ, e A. B. MOLDES. “Valorization of winery waste vs costs of not recycling.” Waste Management, 12 de julho de 2011: 2327-2335.
DÍAZ, A., J. BOLÍVAR, I DE ORY, I CARO, e A. BLANDINO. “Applicability of enzimatic extracts obtained by solid state fermentation on grape pomace and orange peels mixtures in must clarification.” LWT - Food Scinece and Technology, 2011: 840-846.
DÍAZ, M. J., E. MADEJÓN, F. LÓPEZ, R. LÓPEZ, e F. CABRERA. “Optimization of the rate from vinasse/grape marc for co-composting process.” Process Biochemistry, 2002: 1143-1145.
DÍAZ-REINOSO, BEATRIZ, ANDRÉS MOURE, HERMINIA DOMÍNGUEZ, e JUAN CARLOS PARAJÓ. “Ultra- and nanofiltration of aqueous extracts from distilled fermented grape pomace.” Journal of Food Engineering, 2009: 587-593.
DINUCCIO, E., P. BALSARI, F. GIOELLI, e S. MENARDO. “Evaluation of the biogas productivity potential of some Italian agro-industrial biomasses.” Bioresource Technology, 2010: 3780–3783.
DOS SANTOS, LEANDRA PEREIRA. Caracterização química e avaliação da propriedade antioxidante de diferentes variedades de uva. Maringá: Universidade Estadual de Maringá, 2009.
EIPESON, W. E., e R. S. RAMTEKE. “Utilization of By-Products of Fruit and.” Cáp. 28 em Handbook of Postharvest Technology Cereals, Fruits, Vegetables, Tea, and Spices, edição: H. S. Ramaswamy, G. S. V. Raghavan, A. Chakraverty e A. S. Mujumdar, 819-844. CRC Press, 2003.
EITEL, NATALIA BARBOSA. Processo de recuperação de compostos bioativos do bagaço proveniente do processamento do suco de uva. Rio de Janeiro: UFRJ, 2013.
ENCINAR, J. M., F. J. BELTRAN, A. BERNALTE, A. RAMIRO, e J. F. GONZÁLEZ. “PYROLYSIS OF TWO AGRICULTURAL RESIDUES: OLIVE AND GRAPE BAGASSE. INFLUENCE OF PARTICLE SIZE AND TEMPERATURE.” Biomass and Bioenergy, 1996: 397-409.
ERSUS, SEDA, e UNAL YURDAGEL. “Microencapsulation of anthocyanin pigments of black carrot (Daucuscarota L.) by spray drier.” Journal of Food Engineering, 2007: 805–812.
FALCÃO, ANA PAULA, EDUARDO SIDINEI CHAVES, EUGÊNIA MARTA KUSKOSKI, ROSEANE FETT, LEILA DENISE FALCÃO, e MARILDE TEREZINHA BORDIGNON-LUIZ. “Índice de polifenóis, antocianinas totais e atividade antioxidante de um sistema modelo de geléia de uvas.” Ciênc. Tecnol. Aliment., julho-setembro de 2007: 637-642.
FANG, ZHONGXIANG, e BHESH BHANDARI. “Effect of spray drying and storage on the stability of bayberry polyphenols.” Food Chemistry, 2011: 1139–1147.
—. “Encapsulation of polyphenols - a review.” Trends in Food Science & Technology, 2010: 510-523.
FARINELLA, N. V., G. D. MATOS, e M. A. Z. ARRUDA. “Grape bagasse as a potential biosorbent of metals in effluent treatments.” Bioresource Technology, 2007: 1940–1946.
182
FENNEMA, OWEN R. “Water and Ice.” In: Food Cehmistry, edição: OWEN R. FENNEMA, 17-94. New York: Marcel Dekker, Inc, 1996.
FIGUEIREDO-GONZALEZ, M., E. MARTINEZ-CARBALLO, B. CANCHO-GRANDE, J. L. SANTIAGO, M. C. MARTINEZ, e J. SIMAL-GANDARA. “Pattern recognition of three Vitis vinifera L. red grapes varieties based on anthocyanin and flavonol profiles, with correlations between their biosynthesis pathways.” Food Chemistry, 2012: 9-19.
FIOL, NÚRIA, CARLOS ESCUERDO, e ISABEL VILLAESCUSA. “Chromium sorption and Cr(VI) reduction to Cr(III).” Bioresource Technology, 2008: 5030–5036.
FOOD INGREDIENTS. “Dossiê Antioxidantes - Os Antioxidantes.” Food Ingredients Brasil 6 (2009): 16-31.
FRANCIS, F. J. “Analysis of anthocyanins.” In: Anthocyanins as food colors, edição: P. Maarkakis, 181 p. New York: New York: Academic Press, 1982.
FRANCIS, F. J. “Pigmentos y otros colorantes.” In: Química de los alimentos., edição: O. R. FENNEMA, 615 – 657. Zaragoza: Editorial Acribia, 1993.
FULEKI, T., e M. J. RICARDO-DA-SILVA. “Effects of cultivar and processing method on the contents of catechins and procyanidins in grape juice.” Journal of Agriculture and Food Chemistry, 2003: 640-646,.
GALVANO, F., et al. “Cyanidins: metabolism and biological properties.” Journal of Nutritional Biochemistry., 2004: 2-11.
GARCIA-PEREZ, J. V., M. A. GARCIA-ALVARADO, J. A. CARCEL, e A. MULET. “Extraction kinetics modeling of antioxidants from grape stalk (Vitis vinifera var. Bobal): Influence of drying conditions.” Journal of Food Engineering, 2010: 49-58.
GARRIDO, JORGE, e FERNANDA BORGES. “Wine and grape polyphenols—A chemical perspective.” Food Research International, 2011: 3134-3148.
GAZIANO , J. M., et al. “Moderate alcohol intake, increased levels of high-density lipoprotein and its subfractions, and decreased risk of myocardial infarction.” The New England Journal of Medicine, 1993: 1829-1834.
GEORGÉ, S., P. BRAT, P. ALTER, e M. J. AMIOT. “Rapid determination of polyphenols and vitamin C in plant-derived products.” Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2005: 1370-1373.
GHARSALLAOUI, ADEM, GAËLLE ROUDAUT, ODILE CHAMBIN, ANDRÉE VOILLEY, e RÉMI SAUREL. “Applications of spray-drying in microencapsulation of food ingredients: An overview.” Food Research International, 2007: 1107–1121.
GIBBS, BERNARD F., SELIM KERMASHA, INTEAZ ALLI, e CATHERINE N. MULLIGAN. “Encapsulation in the food industry: a review.” International Journal of Food Sciences and Nutrition, 1999: 213-224.
GIUSTI, M. M., e R. E. WROLSTAD. “Acylated anthocyanins from edible sources and their applications in food systems.” Biochemical Engineering Journal, 2003: 217-225.
—. Characterization and measurement of anthocyanins by UV-visible spectroscopy. New York: Wiley, 2001.
GÓMEZ-PLAZA, ENCARNA, ANGELES MIÑANO, e JOSE MARÍA LÓPEZ-ROCA. “Comparison of chromatic properties, stability and antioxidant capacity of anthocyanin-based aqueous extracts from grape pomace obtained from different vinification methods.” Food Chemistry, 2006: 87–94.
183
GONZÁLEZ-CENTENO, M. R., C. ROSSELLÓ, S. SIMAL, M. C. GARAU, F. LÓPEZ, e A. FEMENIA. “Physico-chemical properties of cell wall materials obtained from ten grape varieties and their byproducts:grape pomaces and stems.” LWT - Foos Science and Technology, 2010: 1580-1586.
GRIS, E. F., E. A. FERRERIA, L. D. FALCÃO, e M. T. BRODIGNON-LUIZ. “Caffeic acid copigmentation of anthocyanins from Cabernet Sauvignon grape extracts in model systems.” Food Chemistry, 2007: 1289-1296.
GUERRA, CELITO CRIVELLARO, e DANIELA BARNABÉ. “Vinho.” In: Tecnologia de Bebidas matéria-prima, processamento, BPF/APPCC, legislação, mercado., por G. W. Venturini Filho, 423 - 451. Botucatu, SP.: Editora Edgard Blücher, 2005.
GUERRA, CELITO CRIVELLARO, FRANCISCO MANDELLI, JORGE TONIETTO, MAURO CELSO ZANUS, e UMBERTO ALMEIDA CAMARGO. Conhecendo o essencial sobre uvas e vinhos. Bento Gonçalves: Embrapa Uva e Vinho, 2009.
GURAK, POLIANA D. Estudo da concentração de suco de uva por osmose inversa e posterior encapsulamento por liofilização. Rio de Janeiro: Universidade Federal do Rio de Janeiro, 2008.
GURAK, POLIANA D., ISABELLE SANTANNA, ANA PAULA GIL, SUELY PEREIRA FREITAS, MARIA HELENA ROCHA-LEÃO, e LOURDES CABRAL. “Grapes: cultivation, varieties and nutritional uses.” Cáp. 10 em Agiculture Issues and Policies: Grapes: cultivation, varieties and nutritional uses, edição: Ralph P. Murphy e Christopher K. Steifler, 201-247. New York: Nova Science Publishers, Inc., 2012.
GURAK, POLIANA D., LOURDES M. C. CABRAL, MARIA HELENA ROCHA-LEÃO, VIRGÍNIA M. MATTA, e SUELY P. FREITAS. “Quality evaluation of grape juice concentrated by reverse osmosis.” Journal of Food Engineering, 2010: 421–426.
GUSTAVSSON, J., C. CEDERBEG, U. SONESSON, R. van OTTERDJIK, e A. MEYBECK. “Global food losses and food waste. Extend, causes and prevention.” Food and Agriculture Organizationof the United Nations. , Roma, 2011, 1-30.
HABERT, A. C., C. P. BORGES, e R. NOBREGA. Processos de separação com membranas. Rio de Janeiro: E-papers, 2006.
HE, F., Q. PAN, W. SHI, e Q. DUAN. “Chemical synthesis of proanthocianidins in vitro and their reactions in aging wines.” Molecules, 2008: 3007-3032.
HELLSTRÖM, K., R. TÖRRÖNEN, e P. MATTILA. “Proanthocyanidins in common food products of plant origin.” Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2009: 7899-7906.
HERVERT-HERNÁNDEZ, DEISY, CONCEPCIÓN PINTADO, RAFAEL ROTGER, e ISABEL GOÑI. “Stimulatory role of grape pomace polyphenols on Lactobacillus acidophilus growth.” International Journal of Food Microbiology, 2009: 119–122.
HIGINO, CAROLINA CASRO BORGES. Estudo do comportamento reológico do extrato de bagaço de uva. Rio de Janeiro: Universidade Federal do Rio de Janeiro, 2012.
HUANG, H. T. “Decolorization of anthocyanins by fungal enzymes.” Journal of Agricultural and Food Chemistry, 1955: 141-146.
IACOPINI, P., M. BALDI, P. STORCHI, e L. SEBASTIANI. “Catechin, epicatechin, quercetin, rutin and resveratrol in red grape: Content,in vitro antioxidant activity and interactions.” Journal of Food Composition and Analysis., 2008: 589-598.
IBRAVIN - INSTITUTO BRASILEIRO DO VINHO. “UVAS PROCESSADAS PELAS EMPRESAS DO RIO GRANDE DO SUL - Como 2004-2011parati.” www.ibravin.org.br. 2011. http://www.ibravin.org.br/cadastroviticola.php?secao=1&m2=true (acesso em 13 de janeiro de 2013).
184
IDHAM, ZUHAILI, IDA IDAYU MUHAMAD, SITI HAMIDAH MOHD SETAPAR, e MOHD ROJI SARAMIDI. “Effect of thermal processes on Roselle anthocyanins encapsulated in different polymer matrices.” Journal of Food Processing and Preservation, 2012: 176-184.
JASKARI, J. Factors affecting gel formation of LM-pectin. Helsinki: University of Helsinki, 1990.
JIMÉNEZ-AGUILAR, D.M., A. E. ORTEGA-REGULES, J. D. LOZADA-RAMÍREZ, M. C. I. PÉREZ-PÉREZ, E.J. VERNON-CARTER, e J. WELTI-CHANES. “Color and chemical stability of spray-dried blueberry extract using mesquite gum as wall material.” Journal of Food Composition and Analysis, 2011: 889–894.
JU, ZHI YONG e LUKE R. HOWARD. “Subcritical water and sulfured water extraction of anthocyanins and other phenolics from dried red grape skin.” Journal of Food Science, 2005: S270-S276.
—. “Effects of Solvent and Temperature on Pressurized Liquid.” Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2003: 5207-5213.
KAHKONEN, M. P., A. I. HOPIA, e M. HEINONEN. “Berry phenolics and their antioxidant activity.” Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2001: 4076-4082.
KAMERER, D., A. CLAUS, R. CARLE, e A. SCHIEBER. “Polyphenol screening of pomace from red and white grape varieties (Vitis vinifera L) by HPLC-DAD-MS/MS.” Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2004: 4360-4367.
KAMPA, M., A.-P. NIFLI, G. NOTAS, e E. CASTANAS. “Polyphenols and cancer cell growth.” Rev. Physiol. Biochem. Pharmacol. 159 (2007): 79-113.
KATALINÍC, VIŠNJA, et al. “Polyphenolic profile, antioxidant properties and antimicrobial activity of grape skin extracts of 14 Vitis vinifera varieties grown in Dalmatia (Croatia).” Food Chemistry, 2010: 715–723.
KHANBABAEE, KARAMALI, e TEUNIS VAN REE. “Tannins: Classification and Definition.” Natural Product Reports Articles, 2001: 641–649.
KOSARAJU, S. L., D. LABBETT, M. EMIN, I. KONCZAK, e L. LUNDIN. “Delivering polyphenols for healthy ageing.” Nutrition & Dietetics, 2008: S48-S52.
KOSARAJU, S. L., L. D'ATH, e A. LAWRENCE. “Preparation and characterisation of chitosan microspheres for antioxidant delivery.” Carbohydrate Polymers, 2006: 163-167.
KOSSEVA, M. R. Processing of food wastes. Vol. 58, em Advances in Food and Nutrition Research, edição: S. L. TAYLOR, 57 - 136. Elsevier, 2009.
KRAEMER, M. E. P. “A questão ambiental e os resíduos industriais.” s.d. www.amda.org.br/objeto/arquivos/111.pdf (acesso em 10 de junho de 2010).
KUNDU, JOYDEB KUMAR, e YOUNG-JOON SURH. “Cancer chemopreventive and therapeutic potential of resveratrol: Mechanistic perspectives. Mini-review.” Cancer Letters, 2008: 243-261.
LABANDA, JORDI, STEFANIA VICHI, JOAN LLORENS, e ELVIRA LÓPEZ-TAMARES. “Membrane separation technology for the reduction of alcoholic degree of a white model wine.” LWT-Food Science and Technology, 2009: 1390-1395.
LANDBO, ANNE-KATRINE, e ANNE S. MEYER. “Enzyme-Assisted Extraction of Antioxidative Phenols from Black Currant Juice Press Residues (Ribes nigrum).” Journal Agricultural and Food Chemistry, 2001: 3169-3177.
185
LANGCAKE, P., e W. V. MCCARTHY, . “The relationship of piceid production to infection of grapevine leaves by Botrytis cinerea.” Vitis, 1979: 244-253.
LAPORNIK, B., M. PROSEK, e A. G. WONDRA. “Comparison of extracts prepared from plant by-products using different solvents and extraction time.” Journal ofFood Engineering, 2005: 214–222.
LEE, J., e R. R. MARTIN. “Influence of grapevine leafroll associated viruses (GLRaV-2 and -3) on the fruit composition of Oregon Vitis vinifera L. cv. Pinot noir: Phenolics.” Food Chemistry, 2009: 889–896.
LEE, JUNGMIN, e CHRISTOPHER RENNAKER. “Influence of extraction methodology on grape composition values.” Food Chemistry, 2011: 295–300.
LEE, JUNGMIN, e PATRICIA A. SKINKIS. “Oregon ‘Pinot noir’ grape anthocyanin enhancement by early leaf removal.” Food Chemistry, 2013.
LEIDENS, NATALY. Extração, Purificação e Fracionamento das Antocianinas do Bagaço de Uva. Porto Alegre: Universidade Federal do Rio Grande do Sul, 2011.
LEIFERT, W. A., e M. Y. ABEYWARDENA. “Cardioprotective actions of grape polyphenols.” Nutrition Research, 2008: 729-737.
LEITE-LEGATTI, ALICE VIEIRA, et al. “Jaboticaba peel: Antioxidant compounds, antiproliferative and antimutagenic activities.” Food Research International, 2012: 596–603.
LI, YUAN, et al. “Effect of energy density and citric acid concentration on anthocyanins yield and and solution temperature of grape peel in microwave-assisted extraction process.” Journal of Food Engineering, 2012: 274–280.
LIU, J., Q. WARG, H. MA, e S. WARG. “Effect of pretreatment methods on L-lactic acid production from vinasse fermentation.” Adv. Mater. Res., 2010: 1302-1305.
LUQUE-RODRÍGUEZ, J. M., e M. D. L., PÉREZ-JUAN, P. CASTRO. “Dynamic superheated liquid extraction of anthocyanins and others phenolics from red grape skins of winemaking residues.” Bioresource Technology, 2007: 27005-2713.
MACHADO, MARIANA T. C., BEATRIZ C. B. S. MELLO, e MIRIAM D. HUBINGER. “Study of alcoholic and aqueous extraction of pequi (Caryocar brasiliense Camb.) natural antioxidants and extracts concentration by nanofiltration.” Journal of Food Engineering, 2013.
MAKRIS, DIMITRIS P., STAMATINA KALLITHRAKA, e PANAGIOTIS KEFALAS. “Flavonols in grapes, grape products and wines: Burden, profile and influential parameters.” Journal of Food Composition and Analysis, 2006: 396-404.
MALACRIDA, C. R., e S. da MOTTA. “COMPOSTOS FENÓLICOS TOTAIS E ANTOCIANINAS EM SUCO DE UVA.” Ciência e Tecnologia de Alimentos, Out.-Dez de 2005, 25 ed.: 659-664.
MALIEN-AUBERT, C, O. DANGELS, e J. AMIOT. “Color stability of commercial anthocyanin-based extracts in relation to the phenolic composition. Protective effects by intra and intermolecular copigmentation. v. 49, p.” Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2001: 170-176.
MANACH, CLAUDINE, AUGUSTIN SCALBERT, CHRISTINE MORAND, CHRISTIAN RÉMÉSY, e LILIANA JIMÉNEZ. “Polyphenols: food sources and bioavailability.” American Journal of Clinical Nutrition 79 (2004): 727-747.
MARDIGAN, LAURA PAULINO, SHEILA LUCIANA SCHER, GISELE T. DE SOUZA SORA, e RENATA HERNANDES BARROS FUCHS. “Compostos fenólicos totais de extrato de uva Isabel e sua ação sobre bactérias ácido-láticas que causam limosidade em salsicha.” V EPCC Encontro Internacional de Produção Científica Cesumar, outubro de 2009.
186
MARKAKIS, P. “Stability of anthocyanins in foods.” In: Anthocyanins as food colors, edição: P. Markakis, 163-178. New York: Academic Press Inc., 1982.
MARTÍNEZ, MARÍA, NÚRIA MIRALLES, SORAYA HIDALGO, NÚRIA FIOL, ISABEL VILLAESCUSA, e JORDI POCH. “Removal of lead(II) and cadmium(II) from aqueous solutions using grape stalk waste.” Journal of Hazardous Materials, 2006: 203–211.
MARZAROTTO, V. “Suco de Uva.” In: Tecnologia de Bebidas: matéria-prima, processamento, BPF/APPCC, legislação, mercado., por G. W. Venturini Filho, 311 - 345. Botucato: Edgard Blücher, 2005.
MATEUS, NUNO. “A química dos sabores do vinho – os polifenois.” Revista Real Academia Gallega de Ciencias XXVIII (2009): 2-22.
MATTIVI, FULVIO, et al. “Profiling of Resveratrol Oligomers, Important Stress Metabolites,Accumulating in the Leaves of Hybrid Vitis vinifera (Merzling x Teroldego) Genotypes Infected with Plasmopara viticola.” Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2011: 5364-5375.
MAZZA, G. “Anthocyanins in grapes and grape products.” Critical Reviews in Food Science and Nutrition, 1995: 341-371.
MAZZA, G., e R. BROUILARD. “The mechanism of co-pigmentation of anthocyanins in aqueous solution.” Phytochemstry, 1990: 1097-1102.
MAZZA, G., L. FUKUMOTO, P. DELAQUIS, B. GIRARD, e B. EWERT. “Anthocyanins, Phenolics, and Color of Cabernet Franc, Merlot, and Pinot Noir Wines from British Columbia.” J. Agric. Food Chem., 1999: 4009-4017.
McCANN, DONNA, et al. “Food additives and hyperactive behaviour in 3-year-old and 8/9-year-old children in the community: a randomised, double-blinded, placebo-controlled trial.” The Lancet, 2007: 1560–1567.
MELLO, L. M. R. Atuação do Brasil no mercado vitvinícola mundial - panorama 2010. Bento Gonçalves: Embrapa Uva e Vinho, 2011.
—. Vitivinicultura brasileira - Panorama 2011. Bento Gonçalves: Embrapa Uva e Vinho, 2012.
—. Vitivinicultura brasileira: panorama 2010. Embrapa Uva e Vinho. 2010. www.cnpuv.embrapa.br/publica/artigos/prodvit2010.pdf (acesso em 16 de 07 de 2011).
—. Vitivinicultura mundial: principais países e posição do Brasil. Bento Gonçalvez, Rio Grande do Sul: Embrapa, 2012 (MELLO, 2012b).
MERCADANTE, A. Z., C. D. CAPITANI, E.A. DECKER, e I. A. Castro. “Effect of natural pigments on the oxidative stability of sausages stored under refrigeration.” Meat Science, 2010: 718-726.
MEYER, ANNE S., OCK-SOOK YI, DEBRA A. PEARSON, ANDREW L. WATERHOUSE, e EDWIN N. FRANKEL. “Inhibition of Human Low-Density Lipoprotein Oxidation in Relation to Composition of Phenolic Antioxidants in Grapes (Vitis vinifera).” J. Agric. Food Chem. 1997, 1997: 1638-1643.
MOLINA-ALCAIDE, EDUARDA, ABDELMAJID MOUMEN, e A IGNACIO MARTÍIN-GARCÍA. “By-products from viticulture and the wine industry: potential as sources of nutrients for ruminants.” Journal of the Science of Food and Agriculture, 2008: 597-604.
MONTEALEGRE, R. RODRÍGUEZ, R. ROMERO PECES, J. L. CHACÓN VOZMEDIANO, J. MARTINÉZ GASCUEÑA, e E. GARCÍA ROMERO. “Phenolic compounds in skins and seeds of ten grape Vitis vinifera varieties grown in a warm climate.” Journal of Food Composition and Analysis, 2006: 687–693.
187
MUÑOZ, O., M. SEPÚLVEDA, e M. SCHWARTZ. “Effects of enzymatic treatment on anthocyanic pigments from grape skin from chilean wine.” Food Chemistry, 2004: 487-490.
MURAKAMI, AUREANNA NAIRNE NEGRÃO, et al. “Concentration of phenolic compounds in aqueous mate (Ilex paraguariensis A. St. Hil) extract through nanofiltration.” LWT - Food Science and Technology, Dezembro de 2011: 2211-2216.
NAWAR, WASSEF W. “Lipids.” In: Food Chemistry - 3th edition, edição: Owen R. Fennema, 225-320. New York: MARCEL DEKKER, INC., 1996.
NAWAZ, H., J. SHI, G. S. MITTAL, e Y. KAKUDA. “Extraction of polyphenols from grape seeds and concentration by ultrafiltration.” Separation and Purification Technology, 2006: 176-181.
NAZCK, MARIAN, e FEREIDOON SHAHIDHI. “Extraction and analysis of phenolics in food.” Journal of Chromatography A, 2004: 95–111.
NAZZARO, FILOMENA, PIERANGELO ORLANDO, FLORINDA FRATIANNI, e RAFFAELE COPPOLA. “Microencapsulation in food science and biotechnology.” Current Opinion in Biotechnology, 2012: 182-186.
NEGRO, C., L. TOMMASI, e A. MICELI. “Phenolic compounds and antioxidant activity from red grape marc extracts.” Bioresource Technology, 2003: 41-44.
NETZEL, M., G. STRASS, I. BITSCH, R. KONITZ, M. CHRISTMANN, E R. BITSCH. “Effects of grape processing on selected antioxidant phenolics in red wine.” Jurnal of Food Engineering, 2003: 223-228.
NITAYAVARDHANA, S., e S. K. KHANAL. “Innovative biorefinery concept for sugar-based ethanol industries production of protein-rich fungal biomass on vinasse as an aquaculture feed ingredient.” Bioresource Technology, 2010: 9078-9085.
NÚÑEZ, V., M. MONAGAS, M. C. GOMEZ-CORDOVÉS, e B. BARTOLOMÉ. “Vitis vinifera L. cv. Graciano grapes characterized by its anthocyanin profile.” Postharvest Biology and Technology, 2004: 69–79.
OHKATSU, YASUKAZU, TAKASHI SAKURAI, e TAKUMA SATO. “Relationship between Chemical Structure and Antioxidant Function of Flavonoids.” Journal of the Japan Petroleum Institute, 2010: 213-221.
OLAYA, C.M. , M.P. CASTAÑO, e G.A. GARZÓN. “Stability of anthocyanins from Rubus glaucus and Solanum betaceum Cav.dark-red strain as affected by temperature and water activity.” Acta biol. Colombiana, 2009: 134-158.
OLIVEIRA, LUÍSA COSTA DE, AMANDA DESIREUX BARCELLOS, BRUNA APARECIDA SOUZA MACHADO, e JANICE IZABEL DRUZIAN. “Atividade antioxidante de compostos fenólicos em vinho tintos: Busca em bases científicas e tecnológicas.” Cadernos de Prospecção, 2012: 221-228.
OU, BOXIN, MAUREEN HAMPSCH-WOODIL, e RONALD L. PRIOR. “Development and Validation of an Improved Oxygen Radical Absorbance Capacity Assay Using Fluorescein as the Fluorescent Probe.” Journal Agricultural and Food Chemistry, 2001: 4619-4626.
PACHECO-PALENCIA, L. A., P. HAWKEN, e S. TALCOTT. “Juice matrix composition and ascorbic acid fortification affects on the phytochemical, antioxidant and pigment stability of açaí (Euterpe oleracea Mart.).” Food Chemistry, 2007: 28-35.
PALENZUELA, B., L. ARCE, A. MACHO, E. MUÑOZ, A. RIOS, e M. VALCARCEL. “Bioguided extraction of polyphenols from grape marc by using an alternative supercritical-fluid extraction method based on a liquid solvent trap.” Analytical and Bioanalytical Chemistry, 2004: 2021–2027.
188
PAN, MIN-HSIUNG, CHING-SHU ,LAI e CHING-TANG, HO. “Anti-inflammatory activity of natural dietary flavonoids.” Food and Function - The Royal Society of Chemistry , 13 de Setembro de 2010: 15-31.
PARANTHAMAN, R., R. VIDYALAKSHMI, S. MURUGESH, e K. SINGARAVADIVEL. “Effects of Fungal Co-Culture for the Biosynthesis of Tannase and Gallic Acid from Grape Wastes under Solid State Fermentation.” Global Journal of Biotechnology & Biochemistry, 2009: 29-36.
PARK, S. F. “The physiology of Campylobacter species and its relevance to their role as foodborne pathogens.” International Journal of Food Microbiology, 2002: 177-188.
PASSOS, CLÁUDIA P., RUI M. SILVA, FRANCISCO A. DA SILVA, MANUEL A. COIMBRA, e CARLOS M. SILVA. “Supercritical fluid extraction of grape seed (Vitis vinifera L.) oil. Effect of the operating conditions upon oil composition and antioxidant capacity.” Chemical Engineering Journal, 2010: 634–640.
—. “Enhancement of the supercritical fluid extraction of grape seed oil by using enzymatically pre-treated seed.” The Journal of Supercritical Fluids, 2009: 225-229.
PASSOS, CLÁUDIA P., SULE YILMAZ, CARLOS M. SILVA, e MANUEL A. COIMBRA. “Enhancement of grape seed oil extraction using a cell wall degrading enzyme cocktail.” Food Chemistry, 2009: 48-53.
PASTRANA-BONILLA, E., C. C. AKOH, S. SELLAPPAN, e G. KREWER. “Phenolic content and antioxidant capacity of Muscadine grapes.” Journal Agricultural and Food Chemistry, 2003: 5497-5503.
PATIL, GANAPATHI, e K. S. M. S. RAGHAVARAO. “Integrated membrane process for the concentration of anthocyanin.” Journal of Food Engineering, 2007: 1233-1239.
PATIL, GANAPATHI, M. C. MADHUSUDHAN, B. RAVINDRA BABU, e K. S. M. S. RAGHAVARAO. “Extraction, dealcoholization and concentration of anthocyanin from red radish.” Chemical Engineering and Processing, 2009: 364–369.
PEKÍC, B., V. KOVAC, E. ALONSO, e E. REVILLA. “Study of the extraction of proanthocyanidins from grape seeds.” Food Chemistry, 1998: 201-206.
PERES, LÁZARO, E. P. “Metabolismo Secundário.” Ebah. 2012. http://www.ebah.com.br/search?start=10&q=metabolismo+secundário (acesso em 03 de setembro de 2012).
PERESTRELO, ROSA, et al. “Phenolic profile of Sercial and Tinta Negra Vitis vinifera L. grape skins by HPLC–DAD–ESI-MSn Novel phenolic compounds in Vitis vinifera L. grape.” Food Chemistry, 2012: 94-104.
PÉREZ-ALONSO, C., C. I. BERISTAIN, C. LOBATO-CALLEROS, M. E. RODRIGUEZ-HUEZO, e E. J. VERNON-CARTER. “Thermodynamic analysis of the sorption isotherm of pure and blended carbohydrate polymers.” Journal of Food Engineering, 2006: 753–760.
PÉREZ-SERRADILLA, J. A., e M. D. LUQUE-DE-CASTRO. “Microwave-assisted extraction of phenolic compounds from wine lees and spray-drying of the extract.” Food Chemistry, 2011: 1652-1659.
— “Role of lees in wine production: A review.” Food Chemistry, 2008: 447-456.
PETTI, S., e C. SCULLY. “Polyphenols, oral health and disease: A review.” JOURNAL OF DENTISTRY, 2009: 413-423.
PIETTA, PIER-GIORGIO. “Flavonoids as Antioxidants - Review.” Journal of Natural Products, 2000: 1035-1042.
189
PINELO, M, M. RUBILAR, M. JEREZ, J. SINEIRO, e M. J. NUNES. “Effect of solvent, temperature, and solvent-to-solid ratio on the total phenolic content and antiradical activity of extracts from different components of grape pomace.” Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2005: 2111–2117.
PINELO, MANUEL, JORGE SINEIRO, e MARÍA JOSÉ NÚÑEZ. “Mass transfer during continuous solid–liquid extraction of antioxidants from grape byproducts.” Journal of Food Engineering, 2006: 57–63.
PING, LAN, NICOLAS BROSSE, LAURENT CHRUSCIEL, PAOLA NAVARRET, e ANTONIO PIZZI. “Extraction of condensed tannins from grape pomace for use as wood adhesives.” Industrial Crops Prod., 2011: 253-257.
PING, LAN, NICOLAS BROSSE, POULOMI SANNIGRAHI, e ARTHUR RAGAUSKAC. “Evaluation of grape stalks as bioresource.” Industrial Crops and Products, 2011: 200-204.
POMPEU, D. R., E. M. SILVA, e H. ROGEZ. “Optimisation of the solvent extraction of phenolic antioxidants from fruits of Euterpe oleracea using Response Surface Methodology.” Bioresource Technology, dezembro de 2009: 6076–6082.
PRODANOV, M. P., J. A. DOMÍNGUEZ, I. BLÁSQUEZ, M. R. SALINAS, e G. L. ALONSO. “Some aspects of the quantitative/qualitative assessment of commercial anthocyanin-rich extracts.” Food Chemistry, 2005: 585–596.
RATNASOORIYA, C. C., e H. P. V. RUPASINGHE. “Extraction of Phenolic compounds from grapes and their pomace using beta-cyclodextrin.” Food Chemistry, 15 de setembro de 2012: 625–631.
RAYNE, SIERRA, ERKAN KARACABEY, e G. MAZZA. “Grape cane waste as a source of trans-resveratrol and trans-viniferin: High-value phytochemicals with medicinal and anti-phytopathogenic applications.” Industrial Crops and Products, 2008: 335-340.
RÉ, M. I. “Microencapsulation by spray drying.” Drying Technology, 1998: 1195-1236.
RE, R., N. PELLEGRINI, A. PROTEGGENTE, A. PANNALA, M. YANG, e C. RICE-EVANS. “Antioxidant activity applying an improved ABTS radical cation decolorization assay.” Free Radical Biology & Medicine, 1999: 1231-1237.
REYES, L. F., e L. CÍSNEROS-ZEVALLOS. “Degradation kinetics and colour of anthocyanins in aqueous extracts of purple and red-flesh potatoes (Solanum tuberosum L.) Food Chemistry, v. 100, p. 885-894, 2007.” Food Chemistry, 2007: 885-894.
RHODES, M. J. C. “Physiologically-active compounds in plant foods: an overview.” Proceedings of the Nutrition Society, 1996: 371-397.
RIZZON, L. A., e J. MENEGUZZO. “Suco de Uva.” Embrapa: Informação tecnológica. Brasília, 2007.
ROCKENBACH, I. I., L. V. GOZAGA, V. M. RIZIELO, A. E. S. S. GONÇALVES, M. I. GENOVESE, e R. FETT. “Phenolic compounds and antioxidant activity of seed and skin extracts of red grape (Vitis vinifera and Vitis labrusca)pomace from Brazilian winemaking.” Food Research International, 2011: 897-901.
ROCKENBACH, ISMAEL IVAN, GRACIELA LESSA SILVA, ELISEU RODRIGUES, LUCIANO VALDEMIRO GONZAGA, e ROSEANE FETT. “Atividade antioxidante de extratos de bagaço de uva das variedades.” Rev Inst Adolfo Lutz, 2007: 158-163.
RODRÍGUEZ-DURÁN, LUÍS V., BLANCA VALDIVIA-URDIALES, JUAN C.L CONTRERAS-ESQUIVE, RAÚL RODRÍGUEZ-HERRERA, e CRISTÓBAL N AGUILAR. “Quimica y Biotecnologia de la Tanasa.” Revista Científica de la Universidad Autónoma de Coahuila, 2010.
190
RODRIGUEZ-SANOA, L. E., e R. E. WROLSTAD. “Extraction, isolation, and purification of anthocyanins.” In: Current Protocols in Food Analytical Chemistry, por R. E Wrolstad, Unit F1.1-F1.11. New York: Wiley, 2001.
RODRIGUEZ-SANOA, L. E., M GIUSTI. M., e R. E. WROLSTAD. “Color and Pigment stability of red radish and red-fleshed potato anthocyanins in juice model systems.” Journal of Food Science, 1999: 451-456.
ROGÉRIO, ALEXANDRE P., et al. “Anti-inflammatory effects of Lafoensia pacari and ellagic acid in a murine model of asthma.” European Journal of Pharmacology, fevereiro de 2008: 262-270.
RÓZEK, ALEKSANDRA, ISABEL ACHAERANDIO, CARME GÜELL, FRANCISCO LÓPEZ, e MONTSE FERRANDO. “Use of commercial grape phenolic extracts to supplement solid foodstuff.” LWT - Food Science and Technology, 2010: 623–631.
RUFINO, M. S. M., et al. “Metodologia Científica: Determinação da Atividade Antioxidante Total em Frutas pela Captura do Radical Livre ABTS +.” Vers. ISSN 1679-6535. Embrapa Agorindústria Tropical. 2007.
SAGNE, CAMILLE, CLAIRE FARGUES, RICHARD LEWANDOWSK, MARIE-LAURE LAMELOISE, e MARTINE DECLOUX. “Screening of reverse osmosis membranes for the treatment and reuse of distillery condensates into alcoholic fermentation.” Desalination, 2008: 335–347.
SALGADO, JOSÉ MANUEL, NOELIA RODRÍGUEZ, SANDRA CORTÉS, e JOSÉ MANUEL DOMÍNGUEZ. “Improving downstream processes to recover tartaric acid, tartrate and nutrients from vinasses and formulation of inexpensive fermentative broths for xylitol production.” Journal Science Food Agriculture, 2010: 2168-2177.
SÁNCHEZ-ALONSO, I., A. JIMÉNEZ-ESCRIG, F. SAURA-CALIXTO, e A. J. BORDERÍAS. “Effect of grape antioxidant dietary fibre on the prevention of lipid oxidation in minced fish: Evaluation by different methodologies.” Food Chemistry, 2007: 372–378.
SANGUANSRI, LUZ, e MARY ANN AUGUSTIN. “Microencapsulation in functional food product development.” In: Functional Food Prodcut Development, edição: Jim Smith e Edward Charter, 3-23. Charlottetown: Blackwell Publishing Ltd, 2010.
SANSONE, FRANCESCA, TERESA MENCHERINI, PATRIZIA PICERNO, MATTEO d’AMORE, RITA PATRIZIA AQUINO, e MARIA ROSARIA LAURO. “Maltodextrin/pectin microparticles by spray drying as carrier for nutraceutical extracts.” Journal of Food Engineering, 2011: 468–476.
SANT'’ANNA, VOLTAIRE, ADRIANO BRANDELLI, LIGIA DAMASCENO FERREIRA MARCZAK, e ISABLE CRISTINA TESSARO. “Kinetic modeling of total polyphenol extraction from grape marc and characterization of the extracts.” Separation and Purification Technology, 2012: 82-87.
SANTANA, ISABELLE. Avaliação do efeito da temperatura do processo de concentração por osmose inversa na qualidade do suco de uva (Vitis labrusca L.). Rio de Janeiro: Universidade Federal do Rio de Janeiro, 2009.
SANTIAGO, M. C. P. A. Avaliação via Cromatografia Líquida de Alta Eficiência do efeito da microfiltração do suco da amora-preta (Rubus spp.) sobre a composição de suas antocianinas majoritárias. Rio de Janeiro: UFRJ - Escola de Química, 2010.
SANTOS, M., F DIANEZ, M. de CASA, e J. C. TELLO. “Poossibilities of the use of vinasses in the control fungi phytopathogens.” Bioresource Technology, 2008: 9040-9044.
SANTOS, NADINE WORUBY. Silagem de resíduo de uva como fonte de antioxidante em dietas com óleo de soja para vacas leiteiras (dissertação de Mestrado). Maringá: Universidade Estadual de Maringá, 2011.
191
SAPEKIE, S. F., e T. A. RENSHAW. “Economics of drying concentration.” In: Engineering and Food V.2, edição: BRIAN M. McKENNA, 927-937. London, 1983.
SAURA-CALIXTO, F. “Antioxidant dietary fiber product: A new concept and a potencial food ingredient.” Journal Agricultural and Food Chemistry, 1998: 4303-4306.
SAUTTER, CLÁUDIA K., SANDRA DENARDIN, AUDREI O. ALVES, CARLOS A. MALLMANN, NEIDI G. PENNA, e LUISA H. HECKTHEUER. “Determinação de resveratrol em sucos de uva no Brasil.” Ciência e Tecnologia de Alimentos, julho-setembro de 2005: 437-442.
SCANDALIOS, J. G. “Oxidative stress: molecular perception and transduction of signals triggering antioxidant gene defenses.” Brazilian Journal of Medical and Biological Research, 2005: 995-1014.
SERRANO, JOSÉ, RIITTA PUUPPONEN-PIMIÄ, ANDREAS DAUER, ANNA-MARJA AURA, e FULGÊNCIO SAURA-CALIXTO. “Tannins: Current knowledge of food sources, intake, bioavailability and biological effects - Review.” Molecular Nutritional Food Research, 2009: S310 –S329.
SHAHIDHI, FEREIDOON, e MARIAN NAZCK. Food phenolics sources, chemistry, effects, applications. Lancaster, Pensylvania.: Technomic Publishing Company Co., 1995.
SHANMUGANAYAGAM, DHANANSAYAN, MARK R. BEAHM, HASHIM E. OSMAN, CHRISTIAN G. KRUEGER, JESS D. REED, e JOHN D. FOLTS. “Grape Seed and Grape Skin Extracts Elicit a Greater Antiplatelet Effect When Used in Combination than When Used Individually in Dogs and Humans.” The Journal of Nutrition, 2002: 3592–3598,.
SILVA JUNIOR, IBERÊ F., et al. “Evaluation of the antifungal activity and mode of action of Lafoensia pacari A. St.-Hil., Lythraceae, stem-bark extracts, fractions and ellagic acid.” Brazilian Journal of Pharmacognosy, Junho/Julho de 2010: 422-428.
SILVA, MANUEL LUÍS LOPES RODRÍGUES. “CARACTERIZAÇÃO DOS SUBPRODUTOS DA VINIFICAÇÃO.” Millenium - Revista ISPV, outubro de 2003: 123-133.
SILVA, POLLYANNA IBRAHIM, PAULO CESAR STRINGHETA, REINALDO FRANCISCO TEÓFILO, e ISADORA REBOUÇAS NOLASCO DE OLIVEIRA. “Parameter optimization for spray-drying microencapsulation of jaboticaba (Myrciaria jaboticaba) peel extracts using simultaneous analysis of responses.” Journal of Food Engineering, 2013: in press.
SILVEIRA, S. T., D. J DAROIT, e A. BRANDELLI. “Pigment production by Monascus purpureus in grape waste using factorial design.” LWT, 2008: 171-174.
SILVEIRA, S. T., D. J. DAROIT, V. SANT'ANNA, e A. BRANDELLI. “Stability modeling of red pigments produced by Monascus purpureus in submerged cultivations with sugarcane bagasse.” Food and Bioprocess Technology, 2013: 1007-1014.
SINGLETON, V. L., e J. A. ROSSI. “Colorimetry of total phenolics with phosphomolybdic-phosphotungstic-acid reagents.” American Journal of Enology and Viticulture, 1965: 144-168.
SLOMINSKI, A., D. J. TOBIN, S. SHIBAHARA, e J. WORTSMA. “Melanin pigmentation in mammalian skin and its hormonal regulation.” Physiological Reviews, 2004: 1155-1228.
SOARES, MÁRCIA, LUCAS WELTER, EUGÊNIA MARTA KUSKOSKY, LUCIANO GONZAGA, e ROSEANE FETT. “COMPOSTOS FENÓLICOS E ATIVIDADE ANTIOXIDANTE DA CASCA DE UVAS NIÁGARA E ISABEL.” Revista Brasileira de Fruticultura, Março de 2007: 59-64.
SOOBRATTEE, M. A., V. S. NEERGHEEN, A. LUXIMON-RAMMA, O. I. ARUOMA, e T. BAHORUN. “Phenolics as potential antioxidant therapeutic agents: mechanism and actions.” Mutation Research, 2005: 200-213.
.
192
SOUTO, A., M. C. CARNEIRO, M. SEFERIN, M. J. H. SENNA, A. CONZ, e K. GOBBI. “Determination of trans-Resveratrol Concentrations in Brazilian Red Wines by HPLC.” Journal of Food Composition and Analysis, 2001: 441-445.
SPANGHERO, M., A.Z.M. SALEMB, e P.H. ROBINSON. “Chemical composition, including secondary metabolites,and rumen fermentability of seeds and pulp of Californian (USA) and Italian grape pomaces.” Animal Feed Science and Technology, 2009: 243–255.
SPIESS, W. L., e W. R. WOLF. “Critical evaluation of methods to determine moisture sorption isotherms.” In: Water Activity: Theory and Applications to Food, por L. B. Rockland e L. R. Beuchat, 215-233. New York: Marcel Dekker Inc., 1987.
SPIGNO, GIORGIA, LORENZA TRAMELLI, e DANTE MARCO DE FAVERI. “Effects of extraction time, temperature and solvent on concentration and antioxidant activity of grape marc phenolics.” Journal of Food Engineering, 2007: 200–208.
SPRANGER, ISABEL, BAOSHAN SUN, ANA M. MATEUS, VÍTOR DE FREITAS, e JORGE M. RICARDO-DA-SILVA. “Chemical characterization and antioxidant activities of oligomeric and polymeric procyanidin fractions from grape seeds.” Food Chemistry, 2008: 519-532.
STRINGHETA, PAULO CÉSAR, e PAULO A. BOBBIO. “Copigmentação de antocianinas - uso de corantes naturais em alimentos processados.” Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento, 2000: 34-37.
SUN, BAOSHAN, e M. ISABEL SPRANGER. “Review: Quantitative extractionand analysis of grape and wine proanthocyanidins and stilbenes.” Ciência Téc. Vitiv., 2005: 59-89.
TAIZ, LINCOLN, e EDUARDO ZEIGER. “Metabólitos secundários e defesa vegetal.” In: Fisiologia Vegetal, tradução: Eliane Romanato Santarém, 309-333. Porto Alegre: Artmed, 2004.
TALCOTT, S. T., J. E. PEELE, e C. H. BRENES. “Red clover isoflavonoids as anthocyanin color enhancing agents in muscadine wine and juice.” Food Research International, 2005: 1205-1212.
TECCHIO, MARCO ANTÔNIO, ERASMO J. P. PIRES, MAURILO M. TERRA, e MARA F. MOURA. Cultura da videira: origem, importância econômica e botânica. Campinas, 2010.
TEIXEIRA, L, S. ANDRADE, e R. P. F. GUINÉ. “Projecto industrial de uma adega e centro de aproveitamento de subprodutos.” Millenium-Revista do Instituto Politécnico de Viseu, abril de 2008: 323-333.
TEIXEIRA, LUCIANA NASCIMENTO, PAULO CÉSAR STRINGHETA, e FABIANO ALVES OLIVEIRA. “Comparação de métodos para quantificação de antocianina.” Ceres, 2008: 297-304.
TONON, RENATA VALERIANO. Secagem por atomização do suco de açaí:Influência das variáveis de processo,qualidade e estabilidade do produto. Campinas: UNICAMP - (Tese em Engenharia de Alimentos), 2009.
TONON, R. V.; BRABET, C. e HUBINGER, M. D. “Anthocyanin stability and antioxidant activity of spray-dried acai (Euterpe oleracea Mart.) juice produced with different carrier agents”. Food Research International, 43, 2010: 907-914.
TSUI, ELIZA M., e MUNIR CHERYAN. “Characteristics of nanofiltration membranes in aqueous ethanol.” Journal of Membrane Science, 2004: 61-69.
TYLKOWSKI, B., B. TRUSHEVA, V, BANKOVA, M. GIAMBERINI, G. PEEV, e A. NIKOLOVA. “Extraction of biologically active compounds from propolis and concentration of extract by nanofiltration.” J. Membrane Science, 2010: 124–130.
193
VALDUGA, EUNICE, LEANDRA LIMA, ROBERTA PRADO, FRANCINE FERREIRA PADILHA, e HELEN TREICHEL. “Extração, secagem por atomização e microencapsulamento de antocianinas do bagaço de uva "Isabel" (Vittis labrusca).” Ciências e agrotecnologia, 2008: 568-1574.
VATTEM, D.A., e K. SHETTY. “Bological functionality of ellagic acid: a review.” Journal of Food Biochemistry, 2005: 234-266.
VERMERRIS, WILFRED, e RALPH NICHOLSON. “Families of Phenolic Compounds and Means of Classification.” In: Phenolic Compound Biochemistry, 1-32. Springer, 2006.
VILLAÑO, D., M. S. FERNÁNDEZ-PACHÓN, A. M. TRONCOSO, e M. C. GRACÍA-PARRILLA. “Influence of enological practices on the antioxidant activity of wines.” Food Chemistry, 2006: 394-404.
VINSON, J. A., K. TEUFEL, e N. WU. “Red wine, dealcoholized red wine, and especially grape juice, inhibit atherosclerosis in a hamster model.” Atherosclerosis, 2001: 67–72.
WADA, M., et al. “Chemiluminescent screening of quenching effects of natural colorants reactive oxygen species: Evalutation of grape seed, monascus, gardenia and red radish extracts as multi-funcional food additivies.” Food Chemistry, 2007: 980-986.
WANG, WEI, et al. “Distribution of resveratrol and stilbene synthase in young grape plants (Vitis vinifera L. cv. Cabernet Sauvignon) and the effect of UV-C on its accumulation.” Plant Physiology and Biochemistry, 2010: 142 -152.
WROLSTAD, R. E., R. W. DURST, e J. LEE. “Tracking color and pigments changes in anthocyanin products.” Trends in Food Science and Technology, 2005: 423-428.
WU, JIA-JIUAN, et al. “Extraction of antioxidative compounds from wine lees using supercritical fluids and associated anti-tyrosinase activity.” The Journal of Supercritical Fluids, 2009: 33-41.
XU, L., e S. WANG. “The Ginkgo biloba extract concentrated by nanofiltration.” Desalination, 2005: 305-313.
XU, R., L. FERRANTE, C. BRIENS, e F. BERRUTI. “Flash pyrolysis of grape residues into biofuel in bubbling fluid bed.” Journal of Analytical and Applied Pyrolysis, 2009: 58-65.
YANG, CHUNG S., JOSHUA D. LAMBERT, e SHENGMIN SANG. “Antioxidative and anti-carcinogenic activities of tea polyphenols.” Arch Toxicol 83 (2009): 11-21.
YANISHLIEVA-MASLAROVA, N.V. “Inhibiting oxidation.” In: Antioxidants in food: Practical applications, edição: Jan Pokorny, Nedyalka Yanishlieva e Michael Gordon. Cambridge: CRR Press, 2001.
YI, CHUN, et al. “Fatty acid composition and phenolic antioxidants of winemaking pomace powder.” Food Chemistry, 2009: 570–576.
ZHAO, Q., C-Q. DUAN e J. WANG. “Anthocyanins profile of grape berries of vitis amurensis, its hybrids and their wines.” International Journal of Molecular Sciences, 2010: 2212-2228.
ZULETA, A., M. J. ESTEVES e A. FRÍGOLA. “ORAC and TEAC assays comparison to measure the antioxidant capacity for food products.” Food Chemistry, 2009: 310-316.
194
9. ANEXOS
ANEXO A – TEMPERATURA E pH ÓTIMOS DE AÇÃO DA RAPIDASE TF
195
ANEXO B – OBTENÇÃO DE EXTRATO ANALÍTICO PARA DETERMINAÇÃO
DA ATIVIDADE ANTIOXIDANTE ADAPTADO DE (RUFINO et al., 2007).
196
ANEXO C – MECANISMO DE OXIDAÇÃO DA FLUORESCEÍNA PELO
RADICAL AAPH PROPOSTO POR (OU, HAMPSCH-WOODIL E PRIOR, 2001)
197
ANEXO D – PROCEDIMENTO PARA QUANTIFICAÇÃO DAS
ANTOCIANINAS TOTAIS E MONOMÉRICAS MODIFICADO.
198
ANEXO E - Procedimentos para quantificação do teor de fenólicos totais por Folin-Ciocalteu.
199
ANEXO F – ESTUDO DE PRÉ-VIABILIDADE ECONÔMICA PARA A
PRODUÇÃO DE MICROENCAPSULADO EM PÓ RICO EM COMPOSTOS
BIOATIVOS OBTIDOS A PARTIR DO EXTRATO DE BAGAÇO DE UVA VB.
O bagaço da uva tinta Pinot Noir vinificada em branco para a elaboração de
espumante foi material de estudo deste trabalho. Assim, para o estudo de pré-
viabilidade econômica, considerou-se como matéria prima para a elaboração do
microencapsulado VB, 50% do bagaço gerado com a produção de espumante na
Região Sul que em 2011 foi de cerca de 104 mil hectolitros (MELLO, 2012).
Considerou-se que para cada hectolitro de espumante produzido, 17 kg de bagaço
são gerados (SILVA 2003) As condições operacionais foram as mesmas
empregadas para a obtenção dos pós em escala piloto (etanol 30% em água com
pH 4,0 na razão de 9:1, solvente:substrato).
Os cálculos de investimento para a obtenção do pós basearam-se no trabalho
de Sapekie e Renshaw (1983), considerando os equipamentos (extrator,
encaixotadora, módulo de membranas, empacotadora, evapodaor em 4 estágioss e
spray dryer), instalação de uma fábrica como área total de 1.000 m² e o custo de
obra civil de R$ 800 o m² e estão apresentados na Tabela 9.1
Tabela 9.1 – Investimento para a produção de microencapsulados de extrato de bagaço de uva.
Investimento Total Investimento Total (R$) Investimento Fixo 4.797.311,38 Partida (15% Custo equipamentos) 342.626,69 Sub-total (Investimento Capital) 5.482.564,76 Capital de Giro (15% Investimento Capital) 822.384,71
Total 6.304.949,48
O custo de produção para cada quilo de pó foi de R$ 51,12 e os cálculos
considerados estão apresentados na Tabela 9.2.
200
Tabela 9.2 – Custos operacionais fixos e variáveis para a produção do micorencapsulado de bagaço
de uva VB.
CUSTOS VARIÁVEIS
Unidade Quantidade
anual Preço
ton/ano (R$) Custo anual
(R$) Custo por kg de pó (R$)
bagaço t 881,20 0,00 0,00 0,00
etanol L 2.379,23 2,17 5.160,95 0,02
acido citrico t 3.312,96 3154,40 10.450.401,02 37,89
água tratada m3 5.551,53 0,27 1.498,91 0,01
embalagem produto unidade 2.757.999,36 0,35 965.299,78 3,50
Produção por hora
0,00
16 operadores 2.592 4,77 197.821,44 0,72
9 assistentes 2.592 3 69.984,00 0,25
3 supervisores 2592 12 93.312,00 0,34
Consumo de energia kWh 187920 0,05 9.396,00 0,03 Custo operação do evaporador
36.482,79 0,13
Custo operação do spray dryer
119.024,39 0,43
Custo da Membrana (troca 1/3 por ano)
20.000,00 0,07
TOTAL DE CUSTOS VARIÁVEIS 11.968.381,28 42,89
CUSTOS FIXOS
Administração (5% do custo variáveis) 598.419,06 2,17 Distribuição (3% custos variáveis) 359.051,44 1,30 Marketing (5% custos variáveis) 598.419,06 2,17 Depreciação (10% do investimento de capital fixo) 548.256,48 1,99 Manutenção (2% do investimento de capital fixo 109.651,30 0,40 Despesas gerais (1% de investimento de capital fixo) 54.825,65 0,20 TOTAL DE CUSTOS FIXOS 2.268.622,99 8,23 TOTAL DE CUSTOS DE PRODUÇÃO 14.237.004,27 51,12
Para a conversão de moedas, foi utilizado o câmbio do dia 21/02/2013,
fornecido pelo Banco Central do Brasil (1.97 R$ por 1.00 US$). O estudo de pré-
viabilidade econômica considerou uma taxa mínima de atratividade (TMA) de 30% e
inflação de 5,86% ao ano sendo identificada uma taxa interna de retorno de 37,84%
e um valor presente líquido positivo quando o preço de venda do quilo do pó for de
R$ 102,23.
201
ANEXO G – ESTUDO DE PRÉ-VIABILIDADE ECONÔMICA PARA A
PRODUÇÃO DE MICROENCAPSULADO EM PÓ RICO EM COMPOSTOS
BIOATIVOS OBTIDOS A PARTIR DO EXTRATO DE BAGAÇO DE UVA BRANCA
CHARDONNAY SUBMETIDO À VINIFICAÇÃO TINTA.
O bagaço da uva branca Chardonnay submetida à vinificação tinta para a
elaboração de vinho branco foi material de estudo deste trabalho. Assim, para o
estudo de pré-viabilidade econômica, considerou-se como matéria prima para a
elaboração do microencapsulado VT, 50% do bagaço gerado com a produção de
vinho branco fino na Região Sul que em 2011 foi de cerca de 24 mil hectolitros
(MELLO, 2012). Considerou-se que para cada hectolitro de espumante produzido,
17 kg de bagaço são gerados (SILVA 2003) As condições operacionais foram as
mesmas empregadas para a obtenção dos pós em escala piloto (etanol 30% em
água com pH 4,0 na razão de 9:1, solvente:substrato).
Os cálculos de investimento para a obtenção do pós basearam-se no trabalho
de Sapekie e Renshaw (1983), considerando os equipamentos (extrator,
encaixotadora, módulo de membranas, empacotadora, evapodaor em 4 estágioss e
spray dryer), instalação de uma fábrica como área total de 1.000 m² e o custo de
obra civil de R$ 800 o m² e estão apresentados na Tabela 9.3.
Tabela 9.3– Investimento para a produção de microencapsulados de extrato de bagaço de uva VT
Investimento Total Investimento Total (R$) Investimento Fixo 4.797.311,38 Partida (15% Custo equipamentos) 342.626,69 Sub-total (Investimento Capital) 5.482.564,76 Capital de Giro (15% Investimento Capital) 822.384,71
Total 6.304.949,48
O custo de produção para cada quilo de pó foi de R$ 25,45 e os cálculos
considerados estão apresentados na Tabela 9.4
.
202
Tabela 9.4 – Custos operacionais fixos e variáveis para a produção do micorencapsulado de bagaço
de uva V.
CUSTOS VARIÁVEIS
Fatores considerados
Unidade Quantidade
anual Preço
unitário (R$) Custo anual
(R$) Custo por kg de pó (R$)
bagaço t 1.945,27 - - -
etanol L 5252,22 2,17 11.392,97 0,02
acido citrico t 3312,960 3.154,40 10.450.401,02 17,16
água tratada m3 12.255,19 0,27 3.308,90 0,01 embalagem produto
un 6.088.377,36 0,35 2.130.932,08 3,50
Produção por hora
16 operadores 16 2.592,00 4,77 197.821,44 0,32
9 assistentes 9 2.592,00 3,00 69.984,00 0,11
3 supervisores 3 2.592,00 12,00 93.312,00 0,15 Consumo de energia
kWh 187.920,00 0,05 9.396,00 0,02
Custo operação do evaporador 80.537,01 0,13
Custo operação do spray dryer 262.750,38 0,43
Custo da Membrana (troca 1/3 por ano) 20.000,00 0,03
TOTAL DE CUSTOS VARIÁVEIS 13.329.835,80 21,43
CUSTOS FIXOS
Fatores considerados Custo anual
(R$) Custo por kg de pó (R$)
Administração (5% do custo variáveis) 666.491,79 1,09 Distribuição (3% custos variáveis) 399.895,07 0,66 Marketing (5% custos variáveis) 666.491,79 1,09 Depreciação (10% do investimento de capital fixo) 548.256,48 0,90 Manutenção (2% do investimento de capital fixo 109.651,30 0,18 Despesas gerais (1% de investimento de capital fixo) 54.825,65 0,90 TOTAL DE CUSTOS FIXOS 2.445.612,07 4,02 TOTAL DE CUSTOS DE PRODUÇÃO 15.775.447,88 25,45
Para a conversão de moedas, foi utilizado o câmbio do dia 21/02/2013,
fornecido pelo Banco Central do Brasil (1.97 R$ por 1.00 US$). O estudo de pré-
viabilidade econômica considerou uma taxa mínima de atratividade (TMA) de 30% e
inflação de 5,86% ao ano sendo identificada uma taxa interna de retorno de 41,06%
e um valor presente líquido positivo de R$ 830.958,46 quando o preço de venda do
quilo do pó for de R$ 51,89