Enfermedad de Gaucher: Diagnóstico y

avances en el tratamiento

Dr. Miguel PocovíCatedrático de Bioquímica y Biología Molecular

Universidad de Zaragoza

Barcelona 22 Septiembre 2013

Phillip-Charles-Ernest Gaucher

Enfermedad de Gaucher– una EDL

• La enfermedad lisosomal mas frecuente.

• Autosómica recesiva.

• 1:15 judíos Ashkenazi son portadores y

1: 850 la padecen.

• Otras poblaciones 1:40.000 -1:100.000.

• Dispone de varios tipos de tratamiento.

• Deficiencia de Glucocerobrosidasa lisosomal.

Macrófagos tisulares

Células Kupffer

Matraz de Erlenmeyer

Osteonecrosis

Osteoesclerosis

Osteoclastos

Médula ósea

Anemia, trombocitopenia

Células de Gaucher

Infiltraciones

Fibrosis intersticial

Ocupación de los alveolos

Otros órganos

Corazón

Nódulos linfáticos

Sistema nervioso central

Riñones

Manifestaciones oculares

Manifestaciones cutáneas

Manifestaciones clínicas

Fenotipo Continuo

Hidrops

fetalis

Epilepsia

Mioclonia

Afectación

Bulbar

Movimientos

sacádicos

Asintomaticos Hepatoespleno-

megalia

Sidransky et al 2004

Tipo 1

Tipo 2

Tipo 3

Diagnóstico

¿Qué pretendemos con el

diagnóstico?

• Hacer un diagnóstico precoz, antes que

aparezca patología irreversible en:

• Recién nacidos

• Niños

• Adolescentes

• Familiares

• Población seleccionada, por ejemplo….

Estrategias de búsqueda de

pacientes con EG

• Trombocitopenia de origen no filiado o atribuida a

hiperesplenismo, sin marcadores de hepatopatía crónica de

origen cirrótico o trombocitopenia de origen inmune

• Esplenomegalia de origen no filiado asociada o no a cirrosis

hepática. Pacientes esplenectomizados sin diagnóstico

concreto

• Fractura espontánea de cadera no justificada. Osteomielitis

“aséptica”

• Fosfatasa ácida + esplenomegalia u otros?

Mistry PK et al. Am J Hematol 2011

Mistry PK et al. Am J Hematol 2011

Células de Gaucher

Aspirado de médula ósea:

Células

No aconsejable si es primera opción:

Existen metodos menos invasivos para diagnostico.

Presencia de celulas pseudo-Gaucher: mieloma múltiple, SMD, LMC….

Glucosilceramida Ceramida + Glucosa

glucocerebrosidasa

Leucocitos/fibroblastos

Como se diagnostica la EG? (I)

pH 5

Taurocholato

37ºC, 2h

4-metilumbeliferil-β-D-glucopiranósido(Sigma) β-D-glucopiranosa 4-metilumbeliferona

Como se diagnostica la EG? (II)

4MUλexcitación= 366 nmλemisión = 446 nm

Actividad enzimática (nmol/mgp.h)

0

2

4

6

8

10

12

14

16

18

20

22

24

26

28

30

Pacientes Portadores Sanos

En leucocitos o

fibroblastos

:Costoso

Necesidad de controles. Valores

estándares

Solapamiento

¿Qué nos aporta el análisis enzimático?

DNAActividad

enzimática

-glucocerebrosidasa

Casos especiales: Gota de sangre sobre

papel de filtro (FTA)

Análisis gen

GBA

Importancia de que las gotas de

sangre sean homogéneas

G actividad X 2X 3X

1 gota 2 gotas 3 gotas

Debe depositarse idéntica cantidad que en controles

Diagnóstico genético

Herencia: Autosómica recesiva

Defecto genético: Mutaciones en el gen de GBA (>300)(1)

Gen de GBACromosoma 1

Región q21

7 Kb

11 exones

GBA I II III V VI VII VIII IX X XIIV

Ψ-GBA

Del 55 pb

I II III V VI VII VIII IX X XI

Alu(313 pb)

Alu(626pb)

Alu(320 b)

Alu(277pb)

IV

Enfermedad de Gaucher

(1) www.tau.ac.il/~racheli/genedis/gaucher /gaucher.html

Sujeto sano

Sujeto portador

Sujeto enfermo

Alfonso P. Tesis Doctoral

Missense

V15M

G113E

R120W

M123T

R131C

T134P

P182L

N188S

G195W

R257Q

P266L

E326K

G202R

N = 66

Mutaciones en GBA

encontradas en España

N396T

V398I

D409H

L444P

R463C

R463H

R496H

Stop mut.

W(-4)X

R47X

R163X

R257X

R359X

H311R

W312R

Y313H

G325W

L336P

R359Q

S364N

S364R

N370S

G377S

D380N

P391L

V391I

R395C

Splicing

IVS4-2a>g

IVS5+1g>t

Other mutations

c.(-203)A>G

Recombinations

Rec all gene

Great rec ex5-...10

RecTL

RecNciI

Deletions

large deletion

c.42-65del24

c.225-227delTAC

c.708delC

c.953delT

c.1214-1215delGC

c.1263-1317del55

c.1439-1445del7

c.1451-1452delAC

c.1510-1512delTCT

Insertions

c. 84insG

c.500insT

Giraldo P et al Orphanet J Rare Dis. 2012 Mar 19;7

PacienteDNA

N370SL444PG377SD409Hdel55bp

AnálisisGenético

Familiares

FEETEGRegistro

Solicitante

SiPCR larga 7,3 Kb

PCR anidada

Secuenciación

Re-secuenciaciónNo

Diagrama de flujo para el

diagnóstico genético

Biomarcadores para EG

• Fosfatasa ácida

• Lisozima

-hexosaminidasa (A/B)

• Neopterina

• Adenosin desaminasa (ADA)

• Enzima convertidora de angiotensina (ECA)

• Quitotriosidasa

• CCL18-PARK9

QUITOTRIOSIDASA

Sustrato artificial: 4-metilumbelliferil -D-N, N´, N”-

- Presente en plasma humano:

Determinación de actividad

Función: DesconocidaAntifúngico: Candida, Aspergillus ?Nematodos filiformes: Filarias

Hollak C et al. J Clin Invest. 1994; 93: 1288–1292.

Actividad quitotriosidasa

(nmol/mL.h)

Pacientes Gaucher Portadores No-portadores Niños

n=109 n=121 n=89 n=37

13.991 ± 12.647 71 ±55 45 ±39 37 ±25

300 veces

Giraldo P, et al. Haematologica 2001;86:977

¿Para qué sirve la

quitotriosidasa?

Inicial 12 24 36 48

40.000Paciente # 5001

20.000

QT.nmol/ml.hr

meses

Inicial12 24 36 48 60

10.000

6.000

2.000Paciente # 716

72

Actividad quitotriosidasa en

pacientes con EG vs genotipo

Gen quito. N actividad quito. (nmol/mL.h)

Nor / Nor 74 17.387 ± 12.800

Dup / Nor 41 11.870 ± 10.430*

Dup / Dup 3 0

*p < 0.01

INCONVENIENTE

Genotipo del gen QUITOTRIOSIDASA

75 pb99 pb

ChsPCR

E2E1 E3 E4 E5 E6 E7 E8 E9 E11 E12E10

+/+ +/- -/-

24 pb

Chas

24 pb

Chs

Chas

24 pb

Alelo mayor

Alelo menor ( nulo )

Biomarcador CCL18/PARC

33 ng/mL

(rango 10-72 ng/mL)

948 ng/mL

(rango 237-2285 ng/mL)

Boot RG et al. Blood 2004; 103:33-39

X 29

paciente 1

0,00

200,00

400,00

600,00

800,00

1000,00

0 6 15 24 36

meses de tratamiento

CC

L18

0

2000

4000

6000

8000

10000

12000

Acti

vid

ad

de Q

T

CCL18

QT

paciente 2

0,00

200,00

400,00

600,00

800,00

1000,00

3 13 29 42 52 65 77

meses de tratamiento

CC

L18

0

2000

4000

6000

8000

10000

12000

Acti

vid

ad

de Q

T

CCL18

QT

paciente 3

0,00

200,00

400,00

600,00

800,00

1000,00

0 39 51 60 72 83 99 105

meses de tratamientoC

CL

18

0

2000

4000

6000

8000

10000

12000

Acti

vid

ad

de Q

T

CCL18

QT

Relación entre el descenso de los niveles

plasmáticos de CCL18 y actividad de QT

según nuestra experiencia

Resumen

• Análisis enzimático de Glucocerebrosidasa

– Diagnóstico

• Análisis genético Glucocerebrosidasa

– Estudio familiares (portadores / no portadores)

– Consejo genético

– Pronóstico

• Biomarcadores: quitotriosidasa y/o CCL18/PARC

– Valoración

– Respuesta a tratamientos

– Seguimiento

Posible caso

(Sospecha)

(Hospital)

Lab

(FEETEG)

Courier

Separación

especimenes

leucocitos

Plasma

DNA

-Glucocer

Otras lisoso.

Biomarcadores:

Activ Quitotrios,

CCL18 y MIP1

Diagnostico genético:

Glucocerebrosidasa mutaciones +

Quitotriosidasa genotipo

SMPD1, AGAL NPC1, NPC2 mutaciones

+

FEETEG

Diagnostico

REGISTRO FEETEG

SOLICITANTE

**

*

Análisis

Seguimiento de

pacientes

Muestra

(sangre o plasma

(Hospital)

Courier

Laboratorio*(FEETEG)

Plasma

Biomarcadores:

quitotriosidasa

actividad y

CCL18

Separación

alicuotado

REGISTRO FEETEG

SOLICITANTE

*

*

*

Tratamientos

Palmitoil-CoA + serina

Ceramida

UDP-glucosa

Glucosilceramida(glucocerebrósido)

Gangliósidos

Globósidos

Lactósidos

Ceramida + Glucosa

-Glucocerebrosidasa

Ceramida:glucosil-transferasa

Formación y degradación

de la glucosilceramida

Formación = Degradación

No hay depósito de glucosilceramida

Síntesis + catabolismo Globosidos, Gangliósidos..

Degradación

Formación

GlucocerebrosidasaGLUCOSILCERAMIDA

(SUBSTRATO)

Condiciones normales: Equilibrio

Enfermedad de Gaucher:

Desequilibrio entre entrada y salidaFormación > Degradación

(normal) (disminuida)

Síntesis + catabolismo Globosidos, Gangliósidos..

Degradación

Formación

Glucocerebrosidasa

GLUCOSILCERAMIDA

(SUBSTRATO)

Se deposita glucosilceramida

OPCIONES

TERAPÉUTICAS

Opciones terapéuticas : TES

Síntesis + catabolismo Globos., Gangli..

Degradación

FormaciónImiglucerasa

Velaglucerasa

Taliglucerasa

TES

GlucocerebrosidasaGlucocerebrosidasa

GLUCOSILCERAMIDA

(SUSTRATO)

1978

Descubrimiento de los receptores de manosa 6-

fosfato

Célula

Lisosoma

Lisosoma

Receptor

Manosa-6-P

Lisosoma

Enzima

Enzima

P

P

P

P

P

P

P

P

P

P

1990

Barton, Brady, Grabonski inician los primeros

tratamientos con enzima betaglucosidasa obtenida de placenta

Alglucerasa. Ceredasa. Genzyme Corp

1996Se comercializa la primera

enzima recombinante en CHO

QuikChangeTM Site-Directed Mutagenesis Kit

Strategene

Imiglucerase. Cerezyme. Genzyme-Sanofi

Glicoformas (decoración) típica

que se producen en mamíferos

Asn Asn Asn Asn

Mannosidase I

Asn

ER

Asn

Golgi

Glucose

AsnAsn

N-acetylglucosamine Mannose Galactose Sialic acid Fucose

Asn

Enzymatic

degradation

Como se consigue que la Imiglucerasa

tenga la glicosilación adecuada

(decoración)• Se permite que la síntesis en células CHO se complete

• Se realiza una digestión con neuraminidasa, beta-galactosidasay beta-N-acetilglucosaminidasa para eliminar los azucares terminales.

• De esta forma se dejan expuestos - 3 restos de manosa.

Asn Asn Asn Asn

Mannosidase I

Asn

ER

Asn

Golgi

Glucose

AsnAsn

N-acetylglucosamine Mannose Galactose Sialic acid Fucose

Asn

Enzymatic

degradation

Exposed Mannose

Velaglucerasa VPRIV (Shire). Recombinante expresada en células humanas

(comercializada marzo 2011)

Fibroblastos humanos

QuikChangeTM Site-Directed Mutagenesis Kit

Strategene

La glicosilación (decoración) adecuada

de la Velaglucerasa se consigue con

Kifunensine

• Se impide que la cadena de oligosacarido se modifiqueen el Golgi

• Impide que queden enmascaradas las manosas

Asn Asn Asn Asn

Mannosidase I

Asn

ER

Asn

Golgi

Glucose

AsnAsn

N-acetylglucosamine Mannose Galactose Sialic acid Fucose

Asn

Enzymatic

degradation

Exposed Mannose

Taliglucerase. Uplyso (Protalix)/

(Pfizer). Producida en células de zanahoria

(Aprobada por FDA pero no por EMA)

Sintesis de laTaliglucerase

Endoquitinasa

basica

Arabidopsis

thaliana

Quitinasa A

Tabaco

E F D L L V D T M

RE

Golgi

Vacuola

Asn

Asn

Asn

nucleous

Extracellular

space

Distribución de N-Gliproteinasen

células vegetales

Enzima

Señales de

Reconocimiento

N-acetil-glucosamina

Manosa

Glicosilación “Decoración” de las

Enzimas recombinantes

P

P

P

P

P

P

P

P

P

Tekoah Y et al Biosci Rep. 2013 Aug 28. [Epub ahead of print]

Captación de las enzimas

recombiantes

Taliglucerasa

Imiglucerasa

Velaglucerasa

Tekoah Y et al Biosci Rep. 2013 Aug 28. [Epub ahead of print]

Opciones terapéuticas en la EG:

Terapia Reducción Sustrato (TRS)

Síntesis + catabolismo Globos, Gangli..

Degradación

Formación

NB-DNJ, miglustat

(Zavesca®)TRS

Glucocerebrosidasa

GLUCOSILCERAMIDA

(SUSTRATO)

Ceramida:glucosiltransferasa

Palmitoil-CoA + serina

Ceramida

UDP-glucosa

Glucosilceramida(glucocerebrósido)

Gangliósidos

Globósidos

Lactósidos

Ceramida + Glucosa

-Glucocerebrosidasa

Ceramida:glucosil-transferasa

Miglustat(Iminoazucar)

Obtenido

de la corteza de la raíz

de la morera

Morus alba

Bacteria

streptomyces

TRS

N-butil-deoxynojirimicin Miglustat

Zavesca®

Actelion

Genz-112638. Eliglustat (Pendiente

aprobación) Genzyme-Sanofi

Similitud estructural Iminoazucares :

Miglustat vs glucosilceramida

Glucosylceramide

O

HN

OH

C13H27

O

C17H35

O

OH

OHHO

OH

Miglustat

N

OH

OHHO

OH

CH3

Glucose Ceramida

Similitud estructural:

Eliglustat vs Glucosilceramida

ß-Glu-Cer Glucosilceramida

O

HN

OH

C13H27

O

C17H35

O

OH

OHHO

OH

Eliglustat(pendiente aprobación)

Glucosa Ceramida

1-(4´-Hydroxy)phenyl-2-

palmitoylamino-3-pyrrolidino

-1-propanol

Otras opciones terapéuticas:

Chaperonas

5´´ mRNA

Lumen REProteina

Golgi Golgi

Proteina

Normal

Chaperonas

moleculares

¿Qué misión tienen las chaperonas?

LisosomasPH = 5

Degradación

Proteina

mutada

Chaperones

sintéticas

Como funcionan las chaperonas en las Enfermedades de Depósito Lisosomal

Proteína mal plegadaProteina-Chaperona Complejo

Chaperona

farmacológica

Reduce el estres

Celular e inflamación

Reduce el sustrato

acumulado

Sustrato acumulado

Reticuloendoplásmico

Aparato de

Golgi

Lisosoma

Facilita el tráfico

Opciones terapéuticas en EGRecuperar actividad de enzima mutada

del propio paciente

Síntesis + catabolismo Globos., Gangli..

Degradación

FormaciónChaperonas

FarmacológicasChaperonas

GlucocerebrosidasaGlucocerebrosidasa

GLUCOSILCERAMIDA

(SUSTRATO)

Tratamientos aprobados o en desarrollo.

• TES1,2

– Imiglucerasa (Cerezyme®)

– Velaglucerasa (VPRIV™)

– Taliglucerasa (FDA si, EMA no)

• TRS2-4

– Miglustat (Zavesca®)

– Eliglustat/Genz-112638 (pendiente)

• Chaperonas o enzyme enhancement therapy5,6

– Afegostat tartrate/AT2101 (Plicera™; desarrollo

interrumpido)

1. The Pharma Letter Web site. Available at: http://www.thepharmaletter.com/file/96654/protalix-gets-temporary-approval-for-gaucher-drug-taliglucerase-

in-france.html. 2. Sidransky E. Gaucher disease. Medscape Web site. Available at: http://emedicine.medscape.com/article/944157-print. 3. The Medical

News Web site. Available at: http://www.news-medical.net/news/20100212/Genzyme-announces-2-year-data-from-eliglustat-tartrate-Phase-2-trial-for-

Gaucher-disease.aspx. 4. Actelion Web site. http://www1.actelion.com/en/scientists/development-pipeline/phase-4/miglustat-zavesca.page. 5. Cigna

Web site. Available at: http://www.cigna.com/customer_care/healthcare_professional/coverage_positions/pharmacy/ph_1011_coveragepositioncriteria

_zavesca.pdf. 6. Reuters Web site. Available at: http://www.reuters.com/article/idUKN0250346520091002. 7. Pastores GM et al. In: Pagon RA et al.

GeneReviews [Internet]. 1993-2000. Available at: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/bookshelf/br.fcgi?book=gene&part=gaucher. 8. Grabowski GA. Lancet.

2008;372:1263-1271.

• Trasplante de médula ósea(TMO)7

– Solo Neuronopáticos

– TMO en algunos casos ha solucionado sintomas

– No aconsejable en mayoríacasos

• Terapia génica8

– Investigación