REACCIÓN ANTIBACTERIAL Y DÉRMICA DE HIDROXIAPATITA SINTÉTICA EN CONEJOS NUEVA ZELANDA PARA APLICACIONES BIOMÉDICAS

El tratamiento de enfermedades óseas en el área ortopédica

conlleva a la búsqueda de sustitutos óseos que posean

características similares a las del hueso natural proporcionando una

mayor eficacia en cuanto a biocompatibilidad y regeneración se

refiere.

Actualmente las cerámicas bioactivas e inertes han despertado gran

interés debido a su compatibilidad con el medio fisiológico

(Colutorios, 2015) por su limitada toxicidad, baja conductividad

eléctrica y control en su velocidad de degradación in vivo;

utilizándose con éxito en diversos casos clínicos (Méndez, 2013).

Una de las bio-cerámicas más estudiadas es la hidroxiapatita

Ca10(PO4)6(OH)2 (HAp), un fosfato cálcico con estructura similar al

hueso humano (Matsumoto, 2004) que puede obtenerse

directamente de este o de manera sintética arrojando un producto

de alta pureza, biocompatible y con mejores propiedades mecánicas

(Álvarez, 2014).

La sintesis de HAp vía hidrotermal presenta ventajas con relación a

su estructura química y cristalinidad; Wang et al. menciona que la

adición de surfactantes a esta síntesis inhibe su aglomeración y

mejora la nucleación de las nanopartículas al modificar su carga

superficial.

Investigaciones sugieren el uso de hidroxiapatita en implantes

biomédicos, debido a los efectos bactericidas que ha mostrado en

cepas de Staphylococcus aureus, Pseudomona aeuroginosa y

Escherichia coli, presentando hasta un 99% de inhibición de

microorganismos patógenos (Rodríguez, 2016).

El objetivo de este estudio fue la determinación de las propiedades

antibacteriales y la reacción dérmica provocada por la hidroxiapatita

en conejos Nueva Zelanda para aplicaciones biomédicas.

METODOLOGÍA

ESTUDIOS DE CARACTERIZACIÓN HA Y HA-CTAB

CONCLUSIONES

INTRODUCCIÓN

F. C. Salinas Pérez, A. Garrido Hernández, M. Quezada Cruz, L. E. Chávez Güitrón

C. Y. Eslava Monroy, G.G. Sánchez Gutiérrez

Los polvos de hidroxiapatita con y sin surfactante (HA y HA-

CTAB) fueron exitosamente sintetizados por el método

hidrotermal, obteniéndose en ambos casos una morfología de

varilla; el uso de surfactante aumentó la relación

longitud/diámetro de la partícula debido a la acción del CTAB

sobre su carga superficial, lo que influyó en la actividad

antibacteriana al observarse un mayor diámetro de inhibición en

las bacterias Streptococcus anginosa y Pseudomonas

aeuroginos con el polvo HA-CTAB. En la prueba de irritación

dérmica, se dio una reacción inflamatoria general debido a la

respuesta del organismo ante la entrada de una substancia

ajena a él, sin causar otro efecto adverso.

10 20 30 40 50

ICDD 74-0565

Inte

nsid

ad

(u

. a

.)

2q (grados)

HA

HA CTAB

(10

0)

(02

0)

(10

2)

(21

0)

(11

2)

(30

0)

(20

2)

(13

0)

(22

2)

(12

3)

(00

4)

a)

100 nm

c) HA

100 nm

d) HA - CTAB

0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

1.2

1.4

1.6

1.8

2.0

Escherichia coli

CDBB-B-1000

Pseudomonas

aeruginosa

CDBB-B-1011

Streptococcus

anginosus

CDBB-B-1311a

Staphylococcus

aureus

subsp. aureus

CDBB-B-1304

Tamaño

de sensidisco

Hidroxiapatita con surfactante catiónico

bromuro de cetiltrimetilamonio

(HA - CTAB)

Pro

medio

de d

iám

etr

o d

e z

ona d

e inhib

ició

n (

mm

).

0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

1.2

1.4

1.6

Hidroxiapatita sin surfactante (HAp)

Pseudomonas

aeruginosa

CDBB-B-1011

Escherichia coli

CDBB-B-1000Streptococcus

anginosus

CDBB-B-1311a

Staphylococcus

aureus

subsp. aureus

CDBB-B-1304

Pro

medio

de d

iám

etr

o d

e z

ona d

e inhib

ició

n (

mm

).

Tamaño

de sensidisco

Tabla 2 Tiempo (h)

Muestra Conejo Inoculación 1 h 24 h 72 h

CTAB

C (+) T C(-) C (+) T C(-) C (+) T C (-) C(+) T C(-)

1 ++++p ++++p ++++p ++++p 0 0 ++p +e 0 0 +i 0

2 ++++p ++++p ++++p ++++p 0 0 ++p ++e 0 0 0 0

HA 3 ++++P ++++p ++++p ++++P 0 0 ++p ++e 0 0 0 0

4 ++++P ++++p ++++p ++++P 0 0 ++p ++e 0 0 +i 0

ACTIVIDAD ANTIBACTERIANA

TEMPERATURA DE INOCULACIÓN EN CONEJOS NUEVA ZELANDA

Tabla 1

Tiempo

Tratamiento

C (+) HA C (-) CTAB

0 h 39.6±0.6 39.2±0.8 39.3±0.8 39.7±0.7

1 h 41.2±0.2 41.7±0.2 41.2±0.1 40.9±0.2

24 h 37.3±0.4 37.2±0.4 37.05±0.6 37.4±0.5

72 h 37.9±0.5 37.4±0.6 38.2±0.4 38.3±0.3

REFERENCIAS. Álvarez., J. L., Arráez, Á. & Arráez, M. E., 2014. Aplicaciones de las impresoras 3D en medicina. pp. 317-322.; Colutorios, 2015. colutorio.org. [En línea], Disponible en: https://colutorio.org/principio-activo/hidroxiapatita/#Mecanismo_de_accion_de_la_Hidroxiapatita; Matsumoto, T. y

otros, 2004. Hydroxyapatite particles as a controlled release carrier of protein. Biomaterials, Volumen 26, p. 3807–3812.; Méndez, E., 2013. Caracterización de hidroxiapatitas sintéticas nanoesructuradas mediante Espectroscopía Infrarroja (FTIR) y Difracción de rayos X (XRD).; Rodríguez, D. A. L.,

2016. Desarrollo de recubrimiento mediante proyección térmica por plasma en base a polvos de HA-nAg sintetizados mediante métodos verdes. Centro de investigación en materiales avanzados .; Wang, Y. y otros, 2006. Hydrothermal synthesis of hydroxyapatite nanopowders using cationic surfactant

as a template.. Mater Lett , Volumen 60, pp. 1484-1487.

Estudios de caracterización

realizados a polvos de HA y HA-

CTAB.

a) XRD muestran buena

cristalización en fase hexagonal

en ambas muestras sin

alteración de estructura

cristalina.

b) FT-IR existe gran similitud

entre las muestras y todas

corresponden al espectro de la

hidroxiapatita, no existe

evidencia de impurezas por el

surfactante.

c) y d) SEM en ambas muestras

se observa una morfología de

varilla con longitud de 100-300

nm y diámetro de 10-20 nm,

cambiando la relación

longitud/diámetro en la muestra

HA-CTAB. Se observan en

todos los polvos aglomerados

con geometría irregular.

Fotografía de Infrarrojo a la hora post inoculación; 1 y 2) C(+), 3 y 4) HA, 5 y 6) C(-). Tabla 1) Perfil

térmico de los sitios de inoculación, en todos se registró hasta una hora después un incremento de la

temperatura que supera a la corporal (38.3 °C) debido a una respuesta inflamatoria, a las 24 y 72

horas no aumentó la temperatura en ninguno de los sitios.

p= pápula; e= edema; i= induración.

Determinación en la

susceptibilidad

antibacteriana de

hidroxiapatita con y sin

surfactante (HA y HA-

CTAB) por el diámetro de

la zona de inhibición (DIZ).

Ambos polvos mostraron

actividad antibacteriana

con todas las bacterias

evaluadas; en el caso de

HA-CTAB se observó una

mayor inhibición contra

Streptococcus anginosa y

Pseudomonas

aeuroginosa.

Síntesis de polvos HA y HA-CTAB

• Método hidrotermal

• Surfactante

• Bromuro de hexadeciltrimetilamonio (CTAB)

• Estudios de caracterización

• Espectro de Infrarrojo (FT-IR)

• Difracción de rayos X (XRD)

• Microscopía electrónica de barrido (SEM)

Actividad antibacteriana muestras HA y HA-CTAB

• Prueba Kirby-Bauer

• Cuatro cepas de bacterias

• Gram (-)

• Pseudomonas aeruginosa CDBB-B-1011

• Escherichia coli CDBB-B-1000

• Gram (+)

• Streptococcus anginosus CDBB-B-1311

• Staphylococcus aureus CDBB-B-1304

Evaluación de irritación dérmica

•Conejos macho Nueva Zelanda •Dos individuos por hidroxiapatita •6 puntos se inoculación por conejo (1

mL/punto) •2 región superior – control positivo

C(+) •Coadyuvante de Caseína 3,5 mg/100

mL y Lactosa 5 g/100 mL. •2 región inferior – control negativo C(-) •Solución salina

•2 región central – muestra a evaluar T •Hidroxiaptita en solución

•Evaluó la presencia de eritema, edema, induración y necrosis. •Tiempo: 1, 24, 72 horas post

inoculación. •Método de evaluación deendiendo de

la gravedad de la lesión: +, ++, +++, ++++

Evaluación de la temperatura de inoculación

• Registro de la temperatura en cada sitio de administración intradérmica

• Cámara termográfica (Flir-Spot)

• Tiempo

• Finalizar la inoculación

• 1, 24, 72 horas post inoculación

• Análisis de resultados por ANDEVA y prueba de Tukey.

REACCIÓN DÉRMICA EN CONEJOS NUEVA ZELANDA

Tabla 2) Evaluación de la

inoculación intradérmica en

conejos; en todos los sitios

se observó la formación de

una pápula en el momento

de la inyección

manteniéndose hasta una

hora después. A las 72 horas

se reportó una reacción de

induración en el 50% de los

conejos tratados con HA y

HA-CTAB.

3500 3000 2500 2000 1500 1000 500

PO43-

Tra

nsm

ita

ncia

(u

. a

.)

Número de onda (cm-1)

HA

HA CTAB

n2(PO43-)

n3(PO43-)

PO43-

HPO43-

OH-

PO43-

b)

OH-

n3(CO32-)

n3(CO32-)

OH-