1  

2

Raport Stiintific “Sintetic” Proiect 184 / 2011 (intocmit pe toata perioada de executie a proiectului pana in prezent)

„Peroxinitritul: Relevanta pentru Siguranta Alimentara si Noua Metoda de Detectie Electrochimica (Peroxynitrite: Relevance for Food Safety and Novel Electrochemical Detection)”

   Acest raport stiintific este structurat pe Milestone-uri (M) si Task-uri (T) conform planului de lucru, cu exceptia unei introduceri cu rol explicativ pentru persoanele care nu activeaza in acest domeniu.  Motivatia si Semnificatia Proiectului

 

Peroxinitritul (ONO — ; ONOO—

sau pe scurt PON) este un produs de recombinare a radicalului liber oxid de azot cu anionul radical superoxid, ca in schema de mai jos, intr-o reactie foarte rapida, controlata de difuzie in intervalul (3 x 10-9 – 20 x 10-9) M-1 s-1 [2; 5-8]. Data fiind  viteza relativ mare de difuzie a NO si viteza de reactie dintre cei doi reactanti, este extrem de probabila formarea moleculei de ONOO— ori de cite ori oxidul de azot si superoxidul sunt in imediata vecinatate.

     

NO + O2 ONO2

 Unul din scopurile acestui proiect de cercetare exploratorie este investigarea rolului peroxinitritului in modularea oxidarii oximioglobinei si conversia la metmioglobina in tesutul scheletal muscular post-mortem (muschiul de carne, ca aliment), astfel producindu-se acea culoare bruna a carnii cruda, culoeare corelata cu lipsa de prospetime, deci nedorita de consumatori. In plus, orice schimbare perceputa in proprietatile organoleptice (aspectul, mirosul, culoarea) influenteaza direct perceptia calitatii carnii crude si proaspete.  Senzori electrochimici elaborati in acest proiect pot fi optimizati si miniaturizati pentru monitorizarea dinamicii unor specii nitro-oxidative (ca peroxinitritul) in alimente, cu perspective de a intelege mai bine implicatiile pentru calitatea si siguranta alimentara. Dupa dezvoltarea si miniaturizarea lor, acesti micro(bio)senzori electrochimici vor putea fi studiati si ca posibile alternative bioanalitice in studiul actiunii compusilor nitro-oxidativi, inclusiv in domeniu toxicitatii de mediu sau clinic-medical.

                                               

Figura 1. Caile majore de generare a peroxinitritului, tintele celulare precum si caile indirecte conducind la oxidarea sau nitr(ur)area constituentilor biologici si la perturbarea functiilor celulare vitale [24 ; 31].

2  

Dupa cum se vede si in Figura 1, peroxinitritul a fost semnalat ca un compus puternic citotoxic, inca de la începutul anilor 1990 [1; 2], dupa aprox. 10 ani dela identificarea oxidului de azot (NO) ca principalul actor implicat in multe procese fiziologice, inclusiv vasodilatarea [3; 4]. In fapt, recent, ONOO— s-a dovedit a fi culpabilul direct pentru multe cazuri care erau atribuite, in mod gresit, NO- ului. Iar acum, sunt stabilite deja o serie intreaga de reactii chimice relevante din punct de vedere fiziologic, unde in cele mai multe din cazuri, ONOO— are un rol daunator la concentraii chimice mult peste limita normala, iar in alte citeva cazuri PON pare a avea functia de protectie, la concentratii normale. In general insa, PON este implicat intr-o serie de stari patologice, si lista lor este in continua crestere. In organismele vii, NO este generat într-o oxidare catalitica in 2 pasi a L-argininei de catre enzima NO-sintaza (NOS), in timp ce ionul superoxid se poate „scurge” de la mai multe enxime oxidaze, prin complexe enzimatice ale lantului respirator asociat cu mitocondria, sau prin simpla decuplare a NOS-ului endotelial [24].  Urmeaza descrierea sintetica a rezultatelor proiectului structurate pe Milestone-uri (M) si Task-uri (T), conform planului de lucru.

       M1. Sinteza si caracterizarea filmelor electrocatalitice peroxnitrit (PON)-sensitive

   In vitro, chimia peroxinitritului este puternic dependenta de pH, iar in vivo se adauga si complexitatea mediului biologic si multitudinea de tinte celulare posibile pentru PON. De exemplu, la un pH 7,4 fiziologic, 80% din peroxinitrit este prezent in forma anionica in timp ce fractia complementara 20% este protonata in forma de acid peroxinitros (ONOOH, pKa = 6.8). Forma anionica poate reactiona cu

— tinte multiple, de exemplu cu CO2 formind aductul nitrosoperoxicarbonat (ONOOCO2—

— ). Homoliza

legaturii O-O in ONOOH (acidul conjugat al peroxinitritului) si prezenta ONOOCO2— genereaza

radicali daunatori cum ar fi OH, .NO2, sau CO3 .—. Acestia reprezinta un alt torent care determina impactul patologic al ONOO— [2; 6; 7; 11; 12]. Radicalii de hidroxil, dioxid de azot şi carbonat produc deteriorari ireversibile ale componentelor celulare, cum ar fi: perturbarea lipidelor membranare, oxidarea-nitrarea nucleo-bazelor, ruperea componentelor ADN, nitrurarea proteinelor [13-15].

 Considerind caile sale de degradare directa si indirecta, peroxinitritul are o durata de viata relativ scurta, de aprox. 1 s [7; 9; 10; 12]. Cu toate acestea, ONOO— afecteaza celulele situate intr-o arie pe o raza de 2,5-10 µm, iar fluxul de peroxinitrit poate fi sustinut, in unele conditii timp de mai multe ore la nivel nanomolar [9-11; 16; 17].

 Pe linga rolul de specie puternic nitro-oxidanta, este insa interesant ca peroxinitriul poate avea si rol cito-protector, inclusiv reglarea redox a cailor de semnalizare in situatii critice, ca de exemplu in apoptoza neuronala sau in ischemie-reperfuzie [7]. Se estimeaza ca dinamica nivelului de peroxinitrit generat în tesuturi, in conditii diferite, ca si echilibrul cu concentratiile locale ale altor specii prezente cum ar fi NO, par să moduleze rolul ONOO— in numeroase functii celulare vitale.  In ultima analiza, evaluarea rolului potential protector si de semnalizare al PON, in comparatie cu cel daunator si toxic depinde foarte mult de posibilitatea de a-l măsura precis si in timp real. Posibilitatea de cuntificare a prezentei PON in situ va conduce la clarificarea rolurilor lui fiziologice. Metodele existente pentru cuantificarea peroxinitritului includ in principal oxidarea probelor fluorescente, spectroscopia de rezonanta paramagnetica, chemi-luminescenta, imuno-histochimia [24, 31]. Aceste metode, fiind in general laborioase si virtual imposibil de utilizat in timp real in situ, ar fi de dorit dezvoltarea de metode si (micro)senzori electrochimici, care sunt ca principiu mai simplu de utilizat si se preteaza la un raspuns rapid [23] dupa miniaturizare.

3  

T1 = Prepararea peroxynitritului (PON) s-a efectuat in doua variante: prin sinteza din componente si prin eliberarea sa dintr-un complex chimic.  In prima varianta, s-a folosit anionul hidroperoxid in faza apoasa si isoamil nitritul in faza organica, sinteza fiind descrisa in detaliu de autor [23]. «Semnatura» PON este ilustrata in Figura 2 prin peak- ul de absorptie UV-Vis la 302 nm lungime de unda. A doua metoda este generarea PON prin eliberare graduala din complexul 3-morpholinosydnonimine (SIN-1) preparat in solutia tampon, in prezenta oxigenului atmosferic, conform reactiei din figura 2 dreapta si este descris in detaliu de autor [28]. Ambele metode sunt folosite si explicate pe larg in literatura, de exemplu in referinta [31].

 

Figura 2. Sinteza PON este masurata prin cresterea peak-ului de absorptie a PON (a.u.) in timp (stinga) si respectiv este generat de complexul SIN-1 in prezenta oxigenului atmosferic (dreapta).  Doua aspecte sunt absolut esentiale de cunoscut in detectia peroxynitritului: (i) natura analitului (PON) sintetizat din componente sau eliberat de complexul donator si (ii) modul de folosire din solutie.  

Figura 3. Peroxinitritul generat de SIN-1 in solutie tampon prezinta un spectru de absorptie UV-Vis cu trei peak- uri marcate Pk 1; 2; 3 care prezinta o variatie in timp, ca lungime de unda (nm) si intensitate A(a.u.). Intervalul de timp optim cind parametrii sunt practic constanti este aici intre scan-urile (09-22) adica cca. 30 minute.

4  

Peroxinitritul generat de SIN-1 in solutie tampon este ilustrat in Figura 3 si prezinta un spectru de absorptie UV-Vis cu trei virfuri de absorptie «peak-uri», cu peak-ul 3 de apsorpti UV-Vis dela 302 nm atribuit peroxinitritului si care prezinta o variatie in timp, atit ca lungime de unda (nm) cit si ca intensitate A (a.u.). Intervalul de timp optim cind cei doi parametrii sunt practic constanti este aici intre scan-urile numerotate (09-22) adica cca. 30 minute. Cunoasterea acestei comportari permite alegerea intervalului de timp optim pentru inceperea si incheierea testelor analitice.

     T2 = Prepararea si caracterizarea filmelor PON-senzitive pe electrozi s-a realizat cu mai multe variante de filme si de electrozi.  Pentru electrodul de lucru (WE) din carbune sticlos (glassy carbon) bunaoara, s-au folosit: hemina (Hm); Hm–PEDOT (polyethylenedioxythiophene); oxid de grafena redusa-hemina (rGO-Hm). De asemenea, s-au testat mai multe metode de depunere pentru filme pe electrozi: picatura aplicata pe suprafata electrodului urmata de evaporarea solventului (drop-cast), aplicare prin imersare in solutie (dip-coat), electropolimerizare cu electrodul imersat in solutie, si depunerea pe electrod din solutie cu evaporare in plasma (MAPLE).  Primele rezultatele obtinute au inclus prepararea unor filme de hemina (Hm), prin depunere electrochimica din solutie [22]. Astfel, Figura 4 prezintă o voltammograma ciclică (CV) tipica pentru monomerul de hemina 1,5 mM in diclorometan cu 0,1 M tetrafluoroborat de tetrabutilamoniu ca electrolit suport, pentru o viteza de scanare de 0,1 V/s. Reducerea cvasi-reversibilă a Heminei inregistrata la aprox. -0,4 V vs Ag/AgCl are la baza fierul si corespunde cuplului redox FeIII/FeII.

   

 

Figura 4. Voltamograma ciclica (CV) in solutie de 1.5 mM hemina monomer in diclorometan cu 0,1 M tetrafluoroborat de tetrabutilamoniu ca electrolit suport si viteza de scanare de 0,1 V/s (partea stinga). Scanari CV consecutive pe ramura oxidative in aceeasi solutie, evidentiiaza cresterea unui film de hemina polimerizat prin electro-depunere pe suprafata electrodului de lucru (WE) imersat in solutia de monomer (dreapta).

 Continuare scanarii la potentiale mai negative produce o a doua reducere a Fe, mai putin reversibila, respectiv FeII/FeI la cca. -1,26 V vs. Ag/AgCl. Aceasta imagine este conforma cu comportarea generala a porfirinelor, inclusiv in forma dimetilester a heminei in solventi organici [18-20]. Ramura anodica evidentiaza o comportare ireversibila la 1,25 V vs. Ag/AgCl, acesta fiind atribuita oxidarii ce produce cationul-radical de porfirina, observat si in alte sisteme similare. Scanarea repetata a oxidarii intre 0,0 V si 1,3 V produce creşterea unui film electroactiv de hemina, asa cum reiese de altfel si din creşterea treptată a curentului la virf, cum ilustreaza partea dreapta din Figura 4. O crestere similara a curentui a fost raportata pentru polimerizarea oxidativă a dimethylester-heminei. Initial, ciclurile consecutive indica formarea straturilor suprapuse de film electroactiv pe suprafaţa electrodului, capabil sa medieze în continuare electroliza monomerilor porfirinei la interfaţa de film-solutie. Dar, pe

5  

măsură ce grosimea peliculei creste treptat dupa primele 10-20 scanari, se evidentiaza o limitare a polimerizarii in continuare a heminei. Filmul de hemina a fost stabil la spalari repetate cu solvenţi organici sau aposi. Alte amanunte ale metodei sunt oferite de autor in referintele [22, 23].

       M2. Optimizarea filmelor electrocatalitice peroxnitrit (PON) -senzitive

   T3 = Modificarea electrozilor de lucru a presupus mai intii In urma testele preliminare voltametrice si amperometrice, inclusiv raspunsul la potentiale specii interferente.  In Figura 5A se pot observa curbele de raspuns ale Hm-GCE la PON si oxid de azot (NO). Eventualele interferente la nitrit si nitrat s-au investigat prin CV pentru Hm-GCE in solutii tampon in prezenta a 400 µM PON. Cum arata si figura 5B, s-au comparat raspunsul aceluiasi electrod Hm- GCE la 1 mM nitrit si 1 mM nitrat la viteza de scanare 150 mV/s.

Figura 5: (A) Curbele de raspuns ale Hm-GCE la PON si NO; (B) Cv-uri ale Hm-GCE in solutii tampon in prezenta a 400 µM PON si comparat cu raspunsul la 1 mM nitrit si 1 mM nitrat la viteza de scanare 150 mV/s.  Pentru confimarea acestor rezultate initiale, s-a continuat cu validarea senzorilor electrochimici prin studiul proprietatilor electrocatalitice ale filmului de hemin ain interactie cu peroxinitritul.  T4 = Validarea senzorilor electrochimici cu peroxinitrit (PON) in solutii tampon s-a realizat si printr-un studiu complex al proprietatilor electrocatalitice ale filmului de hemina in interactie cu PON.  In testele de voltametrie ciclica, raspunsul filmului de Hm la aditia de PON prezinta un peak de oxidare la 1070 mV vs. Ag/AgCl, in prezenta a 0,45 mM PON in solutie tampon. Acest peak nu este observat pentru electrozii curati «bare» care au un raspuns mai slab definit si produs doar la potentiale peste 1350 mV vs. Ag/AgCl. Curentul virfului de curent al valului voltametric al electrodului cu Hm in prezenta PON, raportat la acelasi curent masurat in absenta PON, determina eficienta catalitica (raportul I/Io) [22]. Acest raport I/Io depinde invers proportional de rata de scanare, adica o comportare tipica unui proces electrocatalitic la care oxidarea PON este mediata de filmul de Hm polimerizata. In Figura 6 A-D se poate observa dependenta I/Io de log-ul vitezei de scanare, pentru un GCE modificat cu Hm in solutie tampon, la concentratii de 0,55; 0,90; 1,45 mM de PON. Datele obtinute au fost comparate cu modelul Michaelis-Menten pentru un KM de 0,7 mM, astfel s-a observat faptul ca I/Io ca functie de concentratia de PON la 0,15 V/s viteza de scanare, corespunde cu acest model. Graficul inserat in Fig. 6B reprezinta varianta Lineweaver-Burk (‘’double-reciprocal plot’’) tot pentru KM de 0,7 mM. Analiza CV pentru evidentierea senzitivitatii fata de PON a filmelor Hm-GCE a fost realizata in solutie tampon la o viteza de scanare 150 mV/s cu adaosuri de 40-460 mM PON.

6  

Graficul inserat in Fig. 6C reprezinta potentialul varfului de curent catalitic «catalytic peak» ca functie de concentratia PON. Pentru a obtine limita de detectie si curba de calibrare din Fig. 6D, inserata s-a realizat amperograma pentru Hm-GCE, cu electrodul de lucru (WE) polarizat la +0,7 V vs Ag/AgCl.

 

Figura 6: (A) Dependenta eficientei catalitice I/Io de log. vitezei de scanare pentru un GCE modificat (Hm- GCE) cu hemina in solutie tampon la concentratii de 0,55; 0,90; 1,45 mM de PON. (B) Comportarea I/Io ca functie de concentratia de PON la 0,15 V/s viteza de scanare, corespunde cu modelul Michaelis-Menten pentru un KM de 0,7 mM. Graficul inserat reprezinta variant Lineweaver-Burk (‘’double-reciprocal plot’’) tot pentru KM de 0,7 mM. (C) Raspuns CV tipic al unui Hm-GCE in solutie tampon pentru 40-460 mM PON la 150 mV/s viteza de scanare. Graficul inserat reprezinta potentialul varfului de curent catalitic ca functie de concentratia de PON. (D) Raspuns amperometric tipic al Hm-GCE, polarizat la +0,7 V vs Ag/AgCl. Curba de calibrare este inserata.  Aceasta comportare nu este observata cu filmele de protoporfirina si deci indica un mecanism de reactie cu rol crucial jucat de atomul de fier legat din Hm, care se arata a fi necesar pentru turnover-ul catalitic al oxidarii PON, fapt relevat si de literatura. De exemplu, s-a raportat interactia chimica a PON cu centrul metalic asociat cu porfirine sau ftalocianine [14, 31]. Aceasta comportare in solutie este bazata la centrul Fe(III) si genereaza un produs de izomerizare, nitratul printr-o secventa de legare, disociere «in cage» si relansare utilizind intermediarul Fe(IV)=O.

   

Figura 7: Mecanismul de reactie al detectiei PON in care un rol cesential il are atomul de Fe legat din Hm, care se demostreaza a fi necesar pentru turnover-ul catalitic al oxidarii PON. Aceasta comportare in solutie este bazata la centrul Fe(III) si genereaza un produs de izomerizare, nitratul printr-o secventa de legare, disociare «in cage» si relansare utilizind intermediarul Fe(IV)=O. Fierul metalic Fe este esential si mediaza transferul de electroni dela substratul de PON la inelul porfirinei, cu rol de «antena» pentru oxidarea electrodica.

     Si aici, prezenta fierului metalic este esential si mediaza transferul de electroni dela substratul de PON la inelul porfirinei, cu rol de «antena» pentru oxidarea electrodica. Mecanismul de reactie este schitat in Figura 7 [22-24].

7  

T5 = Caracterizarea (macro) senzorilor, limita detectie, timpu raspuns, domeniului masura facuta initial, a relevant necesitatea unei optimizari si gasirea de solutii de imbunatatire in special a limitei de detectie.  Astfel, s-a decis studiul, sinteza si utilizarea grafenei reduse (rGO) prin incorporarea rGO cu hemina (Hm) in compusi rGO-Hm. Sinteza grafenei reduse rGO s-a efectuat ca in Figura 8, pornind de la oxidul de grafena (GO), prin reducere cu hidrazina [26, 27]. Reactia este insotita de schimbarea culorii, de la maron-deschis la negru. Dupa cca. 24 de ore, rezulta rGO momentul se evidentiaza prin separarea celor doua faze cu precipitarea rGO. Precipitatul a fost purificat prin spalare cu apa ultrapura si etanol [26, 27].

 

Figura 8: (A) Sinteza rGO prin reducerea GO cu hidrazina cu schimbarea de culoare B-C si precipitare D. (E) Reactia de sintera a complexului rGO/Hemina.

 La obtinerea complexului rGO-Hm s-a folosit o metoda «environmentally friendly» de reducere a grafenei GO fara a folosi hidrazina sau alti compusi toxici. In plus, complexul rGO-Hemin obtinut a dovedit o senzitivitate inalta pentru peroxinitrit [28, 31].

Figura 9: Caracterizarea rGO si GO prin spectrometrie de electroni de raze X (XPS) permite identificarea modificarilor chimice de suprafata in prezenta heminei studiind spectrul C1s (A), prezenta benzii Fe2p (B) si pozitia peak-ului N1s (C). Absorptia Uv-Vis este pezentata pentru hemina (rosu), GO (negru) si complexul rGO/Hemina (albastru) in A1. Spectrele RAMAN pentru GO (negru) si rGO-Hm (albastru) in B1. CV la 100 mV/s pentru GCE modificati cu rGO/Hemin (albastru), GCE modificat cu rGO si apoi imersat in solutie de hemina (rosu) si GCE curat (negru) in solutie tampon saturata cu azot.

8  

Complexul a fost caracterizat prin UV-VIS si comparat cu spectrele obtinute pentru hemina si GO. Caracterizarea filmelor si senzitivitatea la PON pentru GCE modificati cu rGO/Hemin (albastru), GCE modificat cu rGO si apoi imersat in solutie de hemina pentru 12 ore (rosu) si GCE curat (negru) in solutie tampon in care s-a barbotat azot s-a realizat prin voltametrie ciclica la 100 mV/s viteza de scanare.

 

 

Figura 10: (B) CV pentru GCE modificati cu rGO/Hemin (albastru), GCE modificat cu rGO si apoi imersat in solutie de hemina pentru 12 ore (rosu) si GCE curat in solutie tampon in care s-a barbotat azot, voltamograma realizata la 100 mV/s viteza de scanare. (C) CV in prezenta a 200 nM SIN-1 pentru GCE modificati cu complexul rGO/Hemin (albastru) si cu rGO si imersat in hemina (negru), viteza de scanare 100 mV/s.

   

 

Figura 11: (A) Amperometria pentru GCE modificat cu complexul rGO-Hm la aditia de 5 nM PON la potential de 1.1 V vs. Ag/AgCl. (B) Curbe de calibrare pentru GCE modificati cu complexul rGO-Hm (albastru) si cu rGO si imersat in Hm (rosu) in prezenta de PON obtinut din SIN-1.

9  

In Figura 10B se observa raspunsul in prezenta a 200 nM SIN-1 pentru GCE modificati cu rGO-Hm (albastru) si cu rGO si imersat in Hm (negru) la 100 mV/s, cu mecanismul de reactie ilustrat in 10C [28]. Figura 11A arata amperometria pentru GCE modificat cu rGO-Hm la aditia de 5 nM PON la potential de 1.1 V vs. Ag/AgCl. (B) Curbe de calibrare pentru GCE modificati cu complexul rGO-Hm (albastru) si cu rGO si imersat in Hm (rosu) in prezenta de PON obtinut din SIN-. In continuare, s-a investigat folosirea unei metode de depunere a filmelor prin Evaporare Laser Pulsata Asistata in Matrice (Matrix Assisted Pulsed Laser Evaporation, sau MAPLE) folosind un laser Nd-YAG 266 nm in puls de 6 ns, cu fluenta de 400 mJ/cm2, la o distanta dintre tinta si substrat de 3-4 cm, cu frecvente de 10 Hz. FIlme de grafena redusa (rGO) cu hemina (rGO-hemin) au fost depuse cu MAPE in vacuum din solutii 1,0 % w/w concentratie in dimetil formamida (DMF) ca solvent. Alte detalii sunt oferite in manuscrisul [29].

                                         

Figura 12: Descrierea grafica a metodei MAPLE (A; B; C) si aspectul SEM al filmelor rezultate (D;E;F) cu frecventa de 5 sau 10 Hz si durata de 10 sau 25 minute. In general se remarca aspectul neuniform al filmelor, cu insule de material inconjurate de zone in care suprafata este libera fara material.

 Figura 12 A-C ilustreaza schematic procesul MAPLE, iar aspectul filmelor obtinute este analizat cu microscopie electronica (scanning electron microscopy, sau SEM) in aceeasi figura, D-F. In general se remarca aspectul neuniform al filmelor, cu insule de material inconjurate de zone in care suprafata este libera fara material. Analiza morfologica a filmelor s-a realizat in continuare prin folosirea microscopiei cu forta atomica (atomic force microscopy, sau AFM). Morfologia tipica a filmelor depuse pe suprafata difera substantial in functie de tipul de material : rGO, hemina, sau rGO-hemina. Mai precis, filmele obtinute din solutii de hemina par sa fie netede, iar prezenta rGO pare sa genereze straturi tridimensionale cu pori ocazionali. Diferentele par sa fie corelate cu miscibilitatea imperfecta a solutiei de pornire pentru rGO si pentru rGO-hemina, prin comparatie cu solutiile de hemina.

Aceasta observatie este confirmata de analiza imaginilor tridimensionale AFM pentru filme depuse cu MAPLE pe suprafata de siliciu sunt ilustrate in Figura13 pentru rGO (a), hemina (b) si (c) rGO-hemina.

10  

Pentru suprafata filmelor de rGO s-a calculat o rugozitate tipica de 447 nm, prin comparatie cu 23 nm pentru filmele de hemina si 50 nm pentru filmele obtinute din solutii avind complexul (rGO-hemina) [29]. Se presupune ca exista o corelatie intre aceste valori ale rugozitatii si parametrii de perfromanta a filmelor, ca: senzitivitate (sensibilitate) sau durabilitatea sau durata de viata (lifetime). Insa, pentru a ajunge la o concluzie definitiva sunt necesare mai multe date si in final se doreste optimizarea solutiilor de pornire.

Figura 13. Imagini tridimensionale microscopiei de forta atomica (atomic force microscopy, or AFM) pentru filme realizate cu metoda MAPLE din solutii de (a) rGO; (b) hemina; (c) rGO-hemina dizolvate in dimetil formamida (DMF). Suprafata filmelor de rGO au tipic rugozitatea de 447 nm, comparat cu 23 nm pentru hemina si 50 nm pentru complexul rGO-hemina.

Raspunsul filmelor de hemina (Hm) si rGO-hemina (rGO-Hm) depuse prin metoda MAPLE pe GCE au fost interogate cu voltametrie ciclica (CV) in prezenta solutiilor de peroxinitrit avind concentratiile de 0 (zero); 0,17; 0,31; 0,60 ;1,00; si 1,43 nM si au prezentat peak-uri de reducere si oxidare, ca in Figura 14. Interactiunea electrochimica dintre analit – peroxinitritul – si filmele de Hm si rGO-Hm inregistrata prin voltametrie ciclica (CV) se evidentiaza printr-un virf oxidativ la 1,17 V vs. Ag/AgCl ca in Figura 14A. Acest val oxidativ este aproape de cel atribuit – in prealabil – potentialului de oxidare al heminei si mecanismul este deja prezentat mai sus cu referire la Figura 10, si in detaliu in lucrarile [28; 31]. Pe scurt, oxidarea electrocatalitica a peroxinitritului pare sa fie determinata de centrele de hemina oxidat. Centrul de fier (Fe3+) din filmul de rGO-hemina este oxidat la un atom de fier in stare de valenta superioara, de exemplu [Fe4+ = O] ca

11  

«oxo intermediar de fier» care in prezenta peroxinitritului se re-reduce inapoi la (Fe3+) si ciclul electrocatalitic continua. Acest val oxidativ dela E=1,17 V a fost folosit in testele amperometrice. Amperometria tipica este ilustrata in Figura 14B in care s-a facut testarea cu peroxinitrit in alicoti de concentratii de 5; 25; 50; si 100 nM in tampon fosfat pH 7,4. Raspunsul este reversibil asa cum se vede din figura 14B, dupa re-imersie in tampon fosfat. Initial curentul s-a stabilizat la 49 nA, iar dupa adaugarea tuturor alicotilor si imersia in tampon fosfat nou, curentul a scazut rapid stabilizindu-se la 48 nA adica practic a revenit la linia de baza, dupa o oscilatie de scurta durata. Timpul de raspuns este in acest caz aprox. 10 secunde. Miniaturizarea senzorilor va aduce imbunatatirea acestuia si in plus va permite masuratori in medii fara agitare, cum ar fi gelurile semi-solide moi ca modele pentru unele tesuturi de origine animala sau vegetala.                                                                    

Figura 14: (A) Raspunsul filmelor de Hm si rGO-Hm depuse prin metoda MAPLE pe GCE au fost interogate cu

voltametrie ciclica (CV) in prezenta solutiilor de PON cu concentratiile de 0 (zero); 0,17; 0,31; 0,60 ; 1,00; si 1,43 nM si au prezentat peak-uri de reducere si oxidare; (B) Amperograma tipica s-a facut cu polarizarea WE la 1,17 V vs Ag/AgCl si arata si reversibilitatea raspunsului; (C) Curbele d calibrare indica o crestere de 2 ori a senzitivitatii la PON la filmul rGO-Hm in comparatie cu filmul de Hm fara rGO.

12  

Intre timp, aceste rezultate de pina in prezent obtinute la detectia electrochimica a peroxinitritului au fost recunoscute prin publicarea in reviste de prestigiu si se pot compara foarte favorabil cu cele obtinute in laboratoare recunoscute din Franta, China sau Coreea dupa cum se poate remarca din tabelul de mai jos. Este evident ca urmatoarea provocare majora o constituie detectarea peroxinitritului in matrici reale. Acestea, spre deosebire de solutiile tampon prezinta numerosi compusi activi dintre are unii sunt electroactivi si interfera cu semnalul senzorului de peroxinitrit.

M3. Cuantificarea prezentei PON) in solutii tampon cu microsenzori in timp real  

 T6 = Micro-miniaturizarea senzorilor s-a realizat inclusiv prin prepararea unui electrod de lucru (WE) din fibra de Carbon de 10 sau 30 µM dia. incastrate etans prin topire in sticla, cu un fir de contact electric. Electrozii auxiliar (Aux) si de referinta (Ref) au fost aceiasi pentru moment, respectiv Platina si Ag/AgCl – impreuna denumit microsenzor cu fibra de carbune (µFE) multe detalii fiind in referinta [23].

 

T7 = Testarea microsenzorilor (µFE) electrochimici cu peroxinitrit (PON) in solutii tampon s-a efectuat cu peroxinitrit sintetizat «in-house» care necesita solutii tampon de minim pH 9.  Detallii suplimentare sunt oferite de autor in [22-24]. Depunerea filmelor senzitive pe s-a realizat in acelasi mod ca cel descris inainte, ilustrata in Figura 7, s-a realizat prin depunerea filmului de hemina pe electrod de micro fibra de carbon (µFE). Senzitivitatea fata de peroxinitrit s-a analizat prin cronoamperometrie la potential de +0.7 V vs Ag/AgCl. Figura 15 ilustreaza raspunsul amperometric pentru µFE, curat si respectiv modificat cu hemina, polarizat la +0.7 V vs. Ag/AgCl (A) si o metoda de ascutire a µFE folsind o torta de gaz butan (B) impreuna cu schita prepararii µFE.

13  

                                           

Figura 15: (A) Raspunsul amperometric pentru µFE, curat si modificat cu hemina, polarizat la +0.7 V vs. Ag/AgCl. (B) O metoda de ascutire a µFE folosind torta de gaz butan; prepaprarea µFE utilizind un micromanipulator cu vizualizare la microscop.

  T8 = Testarea microsenzorilor (µFE) respectiv limita detectie, timp raspuns, domeniu masura. A fost realizata in pahar cu amestecare cu mini-bara magnetica (stirred beaker) dar si in celula in flux.  Rezultatele, descrise pe larg in publicatiile autorului [22-24], sunt ilustrate in Figura 16 pentru celula in flux «flow-cell» (16A), ca amperograme pentru fibra de carbon modificata cu hemina si «bare» (16B) cu graficul de calibrare inserat.

 

Figura 16: (A) Raspunsul la PON pentru celula in flux realizata «in house» (16A), sub forma unor amperograme suprapuse pentru GCE-Hm si «bare» GCE(16B) impreuna cu graficul de calibrare inserat.

14  

M4. Cuantificarea reactiei dintre Peroxinitrit (ONOO—) si hemoglobina in timp real  Reamintim ca un scop principal este investigarea rolului peroxinitritului (ONOO— ; PON) din tesutul scheletal muscular post-mortem (muschiul de carne cruda, ca aliment), in posibila modulare a oxidarii oximioglobinei si conversia la metmioglobina [32, 33]. O consecinta a acestui proces este schimbarea culorii carnii crude, din cularea rosie perceputa de consumatori ca si «carne proaspata» intr-o culoare bruna care se identifica mai ales cu lipsa de prospetime la carnea cruda, deci total nedorita de consumatori. Proprietatile organoleptice (miros, vaz si pipait de catre consumator) sunt corelate direct cu perceptia calitatii. Aici, Task-ul 9 a demarat si este in curs, rezultatele prezentate fiind preliminare.  T9 = Reactia Peroxinitritului (ONOO—) cu Mioglobina in Solutii Tampon este prezentata ca model simplificat mai jos conform unor studii desinteza [32, 33]:  MbFe(II) + ONOOH => MbFe(IV) + HNO2

 

 MbFe(IV)=O + ONOOH => MbFe(III) + ONOO• + OH—

   Ciclul de modificari chimice a derivatilor mioglobinei in carnea proaspata pe durata pastrarii dupa sacrificare este ilustrat in modelul simplificat din Figura 17. Oximioglobina MbFe(III) care confera carnii culoarea rosu aprins poate fi oxidata la metmioglobina MbFe(III) care schimba culoarea spre brun (maro roscat) si anionul superoxid, care este asistat de enzima superoxid dismutaza SOD «dismuteaza» in oxigen O2 si apa oxigenata H2O2 . Atita timp cit agentii reducatori sint prezenti, MbFe(III) poate fi redusa la deoximioglobina MbFe(II) de catre enzima metmioglobin reductaza MMR iar pe de alta parte, MbFe(II) leaga oxigenul O2 si aceasta reface aspectul pigmentat in rosu aprins.

                                       

Figura 17. Model simplificat pentru ciclul de modificari chimice a derivatilor mioglobinei in muschiul de carne proaspata imediat dupa sacrificare. Oximioglobina MbFe(III) care confera carnii culoarea rosu aprins poate fi oxidata la metmioglobina MbFe(III) care schimba culoarea spre brun (maro roscat). Anionul superoxid care este asistat de enzima superoxid dismutaza SOD «dismuteaza» in oxigen O2 si apa oxigenata H2O2 . Atita timp cit actorii reducatori sint prezenti, MbFe(III) poate fi redusa la deoximioglobina MbFe(II) de catre enzima metmioglobin reductaza MMR iar pe de alta parte, MbFe(II) leaga oxigenul O2 si aceasta reface aspectul pigmentat in rosu aprins.  In acest sens, este interesant de investigat detectia electrochimica a mioglobinei (Mb). Rezultatele preliminare obtinute in Figura 18 (partea stinga) se refera la un GCE modificat cu Hm, pentru o rata de scanare de 100 mV/s in fereastra de potential (-1,0; +0,2 V) vs Ag/AgCl. Mioglobina a avut concentratia de 0,9 mg/10 mL in 0,1 M de PBS cu pH 7,4. CV-urile arata raspunsul filmului de Hm in PBS (negru) si in Mb (albastru) comparat cu cel al GC curat in Mb (rosu). Raspunsul GCE-Hm in Mb

15  

evidentiaza peak-ul dela aprox. -250 mV vs Ag/AgCl in acord date publicate in literatura [30].  Pentru a sublinia efectul electrochimic al modificarilor aparute in solutia de SIN-1 ca functie de timp, partea din dreapta din Figura 18 arata amprenta electrochimica a unei solutii apoase de 100 µM SIN-1 preparat proaspat, in comparatie cu aceeasi solutie SIN-1 dupa 60 minute. Acest fenomen este interesant si merita investigat in continuare inainte de a formula concluzii.

                                               

Figura 18. (Stinga) Electrod GCE modificat cu Hm, pentru o rata de scanare de 100 mV/s in fereastra de potential (-1,0 ; +0,2 V) vs Ag/AgCl. Mioglobina a avut concentratia de 0,9 mg/10 mL in 0,1 M de PBS cu pH 7,4. (Dreapta) Amprenta electrochimica a unei solutii apoase de 100 µM SIN-1 preparat proaspat (rosu), in comparatie cu aceeasi solutie SIN-1 dupa 60 minute (negru) – cind se observa aparitia celui de al doilea peak.

     Celelalte etape ale proiectului, inclusiv Task-urile (T9 si T10) si Milestone-uri (M5 cu T11 si T12) sunt esentiale si vor fi dezvolate in timpul ramas din 2013 si in anul 2014. Aici, urmeaza diseminarea.

     M6. Diseminarea si/sau exploatarea rezultatelor proiectului

 

 In prezent, membrii echipei de proiect sunt implicati in colaborari internationale cu China, Ungaria, Franta si Statele Unite, actiuni care asigura mentinerea unui nivel ridicat de excelenta a rezultatelor acestei cercetari. Principalele publicatii si manuscrise din perioada 2011-2013 sunt referintele [22-25; 28; 29; 31; 34; 35].  Tabelul de mai jos prezinta sintetic performanta de ansamblu structurata pe indicatorii respectivi. Pentru perioada proiectului de Idei nr.184, din 2011 pina in prezent Decembrie 2013, echipa de proiect (EP) coordonata de directorul de proiect (DP) a inregistrat un numar total de 25 (douazeci si cinci) de publicatii: articole ISI, brevete internationale, prezentari orale sau postere, capitole si carti. Alte performante semnificative includ: 3 proiecte bilaterale (China, Franta, Ungaria), 2 workshopuri internationale cu 10 profesori straini invitati, 7 profesori straini invitati special pentru seminarii, si un total de 240 de zile de mobilitati internationale dintre care 210 zile rezervate pentru tinerii cercetatori.

16  

Indicatori Performanta Proiect 184/2011 in perioada 2011 pina in prezent, decembrie 2013.  

Indicatori de Performanta

Alte precizari Anul

0 1 2 3 4 5       2011 2012 2013 1 Articole ISI Publicate «Electroanalysis», «Analytica

Chimica Acta», «Analyst» 1 2

2 Brevete Internationale Semnificative pt. Proiect 4 1

3 Conf. Internat. Prezentare Orala   2 5 4 Carti Publicate   1

5 Capitole de Carti   2 1 6 Conf. Internationale Poster   1 2 3

7 Proiecte bilaterale Internationale Spin-Off din Proiect 1 2  

8 Profesori Straini la Workshop Organizat si Co-Prezidat de DP

 

   

Actiuni semnificative si avind la baza

Proiectul de «Idei»

5 5

9 Mobilitati Internationale 90 zile

120 zile

30 zile

10 Profesori Straini Invitati pentru Seminarii/Conferinte in Romania

 2

 3

 2

             La aceste publicatii de mai sus se adauga inca 3 manuscrise trimise pentru evaluare si publicare la jurnale internationale indexate ISI [29; 34; 35]. Celelalte etape ale proiectului, inclusiv Task-urile (T9 si T10) si Milestone-uri (M5 cu T11 si T12) ramin esentiale pentru succesul acestuia si sunt dezvoltate in timpul ramas din 2013 si 2014. Pentru anul 2014, acest efort va continua masiv, in strinsa corelatie cu achizitia de noi echipamente si aparatura necesara si specifica pentru realizarea task-urilor si milestone-urilor respective cu caracter puternic aplicativ experimental. Bibliografie Selectiva  

(1) Beckman, J. S. Nature 1990, 345, 27.  

(2) Beckman, J. S. et al, Proc Natl Acad Sci U S A 1990, 87, 1620.  

(3) Furchgott, R. F.; Khan, M. T.; Jothianandan, D. Federation Proceedings 1987, 46 385. (4) Khan, M. T.; Furchgott, R. F. Federation Proceedings 1987, 46, 385. (5) Blough, N. V.; Zafiriou, O. C. Inorg Chem Res Toxicol 1985, 24, 3502. (6) Pacher, P.; Beckman, J. S.; Liaudet, L. Physiological Reviews 2007, 87, 315. (7) Ascenzi, P.; di Masi, A.; Sciorati, C.; Clementi, E. Biofactors 2010, 36, 264. (8) Radi, R.;et al, Free Radic Biol Med 2001, 30, 463. (9) Alvarez, M. N.; et al., Arch Biochem Biophys 2004, 432, 222.

 

(10) Denicola, A.; Souza, J. M.; Radi, R. Proc Natl. Acad. Sci. USA 1998, 95, 3566.

17  

(11) Marla, S. S.; Lee, J.; Groves, J. T. Proc Natl. Acad. Sci. USA 1997, 94, 14243. (12) Szabo, C.; Ischiropoulos, H.; Radi, R. Nature Reviews Drug Discovery 2007, 6, 662. (13) Bartesaghi, S.; Valez, V.; Trujillo, M.; Peluffo, G.; Romero, N.; Zhang, H.; Kalyanaraman, B.;

Radi, R. Biochemistry 2006, 45, 6813. (14) Radi, R.; Beckman, J. S.; Bush, K. M.; Freeman, B. A. J Biol Chem 1991, 266, 4244. (15) Niles, J. C.; Wishnok, J. S.; Tannenbaum, S. R. Nitric Oxide 2006, 14, 109. (16) Nalwaya, N.; Deen, W. M. Chem. Res. Toxicol. 2005, 18, 486.

 

(17) Quijano, C.; Romero, N.; Radi, R. Free Radic. Biol. Med. 2005, 39, 728. (18) Younathan, JN, K.S. Wood, T. J. Meyer, Inorg. Chem. 1992, 31, 3280. (19) Kadish, KM, D. G. Davis, Ann. N. Y. Acad. Sci. 1973, 206, 495. (20) Kadish, KM, G. Larson, Bioinorg. Chem. 1977, 7, 95. (21) English, DR, D. N. Hendrickson, K. S. Suslick, Inorg. Chem. 1983, 22, 367. (22) Peteu, S.F., M. Bayachou et al, Analytica Chimica Acta 2013, 780, 81. (23) Peteu, S.F., M. Bayachou et al, Biosens. & Bioelectr. 2010, 25, 1914.   (24) Peteu, S.F., M. Bayachou et al, in «Oxidative stress and antioxidants: diagnosis and therapy»,

Editor Andreescu, ACS Symposium Series 2011, ISBN 9780841226845.  

(25) Perera, RH, P.M. Peris, S.F. Peteu, M. Bayachou, Electroanalysis 2012, 24, 37. (26) Kaminska, I., S. Szunerits, et al, ACS Appl. Mater. Interfaces 2012, 4, 1016. (27) Kaminska, I., S. Szunerits et al, Chem. Commun. 2012, 48, 1221. (28) Peteu, S.F., S. Szunerits et al, Analyst 2013,138, 4345. (29) Peteu, S.F., V. Dinca, et al, manuscript 2013, submitted.

(30) Pakapongpana, S. et al, Electrochimica Acta 2011, 56, 6831. (31) Peteu S.F., and Szunerits S. in «Detection Challenges in Clinical Diagnostics», Editors Peteu &

Vadgama, © RSC 2013, ISBN 9780841226845. (32) Carlsen L.H. et al, Coord. Chem. Rev. 2005, 249, 485. (33) Moller K.S. and Skilbsted L.H., Quim Nova 2006, 29, 1270. (34) Peteu, S.F., Boukerroub, R., Szunerits, S. manuscript 2013, submitted. (35) Maior, I., Peteu, S.F. et al, manuscript 2013, submitted.