raport dirk hermann 2018 - umfcv.ro dirk... · infarctului, atrofia cerebrala, atrofia corpului...
TRANSCRIPT
Raport stiintific
privind implementarea proiectului PCE: Efectul exozomilor derivati din celule stem
mezenchimale asupra plasticitatii si remodelarii creierului imbatranit (EXOSTROKE); PN-III-
P4-ID-PCE-2016-0215.
Studii recente au aratat ca efectele regenerative ale celulelor stem ar putea fi mediate de
exozomi. Ca urmare a unei comparații directe anterior realizata de grupul nostru, am
evidentiat faptul că exozomii derivati din celulele stem mezenchimale (MSCs) s-au dovedit la
fel de eficiente ca celulele stem mezenchimale pentru reducerea deficitelor neurologice
după accidente vasculare cerebrale ischemice (AVC) la șoarecii tineri. De aceea, exozomii
sant candidati terapeutici promitatori pentru pacientii cu AVC.
Insa majoritatea pacientilor cu AVC sunt varstnici. Deoarece eficacitatea terapeutică este
diferită între tineri și vârstnici, dorim să testam eficacitatea exozomilor in recuperarea dupa
AVC pe animale batrane. AVC va fi provocat la sobolani tineri (3 luni) prin ocluzia arterei
cerebrale medii. Vehicul, MSC (2x106 MSCs /kg corp) sau exozomi izolati din măduva osoasă
(echivalent cu 2x106 MSCs/kg corp) vor fi administrate intravenos, de trei ori, la 24 de ore si
la 28 zile dupa AVC. Deficitul neurologic va fi evaluat folosind teste motorice, senzoriale si de
memorie specifice (rotarod, grip test, adhesive tape removal, water maze, forced swimm) la
7, 14, 28, 42 si 56 zile dupa AVC. Animalele vor fi sacrificate după 14 zile (n = 12
animale/grup), 28 de zile (n = 12 animale/grup) si 42 de zile (n = 18 animale/grup). Volumul
infarctului, atrofia cerebrala, atrofia corpului calos, leziunile neuronale diseminate,
infiltrarea leucocitara cerebrală, activitatea microglială, formarea cicatricei astrogliale, vor fi
evaluate imunhistochimic. Neurogeneza endogena și angiogeneza vor fi evaluate
imunhistochimic utilizand incorporarea de BrdU. In cazul unui rezultat favorabil, un studiu
proof-of-concept va fi initiat la pacientii cu accident vascular cerebral, deoarece protocoalele
pentru producția larga, purificarea si stocarea de exozomi derivati din MSC sunt în prezent
stabilite la Spitalul Universitar din Essen.
Etapa II Efectul tratamentului timpuriu cu exosomi obtinuti din celule mesenchimale asupra
recuperarii neurologice dupa accident vascular ischemic la sobolani tineri.
Schema de tratament este aratata in imaginea de mai jos:
Experimental Design
Procedure P1
P2
P3 S 1 2 3 4 5 6 7 8 9 1
0 11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
23
24
25
26
27
28
Physiological constants
Monitoring food and water intake
Behavioral Tests Stroke BrdU administration
Treatment Perfusion
Activitati
1.1. Ocluzia ireversibilă a arterei cerebrale medii
Infarctul cerebral a fost indus prin cauterizarea arterei cerebrale medii. Optsprezece ore
înainte de intervenția chirurgicală, șobolanii au fost privați de hrană. Apa a rămas disponibilă
în orice moment. Artera cerebrală medie dreptă a fost ridicată cu un cârlig de tungsten
atașat la un micromanipulator (Maerzhaeuser Precision Micro-manipulator Systems, Fine
Science Tools) si cauterizata. Ambele artere carotide comune au fost apoi ocluzionate timp
de 90 de minute prin strângerea unei bucle pre-poziționate folosind un stereomicroscop 5x
şi având la dispoziţie instrumente chirurgicale specifice. De-a lungul operației, anestezia a
fost menținută prin inhalare spontană de halotan 1-1,5% într-un amestec de 75% protoxid
de azot și 25% oxigen. Amestecul a fost administrat cu ajutorul unei cuşti etanşe, din
plexiglas. Cuşca a fost folosită pentru inducerea anesteziei, iar pentru menţinerea anesteziei
pe tot parcursul intervenţiei chirugicale s-a folosit o mască special concepută pentru acest
scop. Temperatura corpului a fost permanent monitorizaţă cu ajutorul unei sonde
intrarectale şi menținută la aproximativ 37°C cu ajutorul unei pături homeotermice
(Homeothermic Blanket System-Harvard Apparatus).
1.1 Cuantificarea numarului de celule fluorescente. Celule s-au numarat pe 3 campuri
microscopice aleatorii dar care sa cuprinda 30% din aria infarctului pe fiecare a 20-a
sectiune de 25 micrometri. Numarul total de celule pe volumul de infarct s-a obtinut
prin integrarea numarului de celule sectiune (metoda Cavalieri). S-a observat ca
numarul de celule scade cu crsterea timpului dupa AVC.
1.2 Fenotipizarea celulelor neurogenice dupa stroke. Am dezvoltat tehnici de marcare
dubla si tripla a celulelor neurogenice dupa AVC dupa cum urmeaza.
Protocol de fenotipizare:
Anticorp primar: Rabbit anti NeuN, dilutie 1/1000; MS anti Doublecortin/dilutie 1/4000.
Anticorp secundar: Goat anti Rb CFL 555 dilutie 1/1000; Goat anti Ms POD polimer dilutie 1/10.
Ziua 1: Aplicare primul anticorp primar (rabbit); Spalare 3x3 min cu 1XPBS/0.2% Tween
Fixare cu PFA 4% , 10 min; Spalare 3x3 min cu 1XPBS/0.2% Tween
Blocare 1 h cu blocking : 3% Goat serum , 0.1% Triton din 10% Triton, 1% , restul 1xPBS /0.2%
Tween. Inlocuire blocking cu anticorp primar: Rabbit anti Neu N 1/1000 in 3% GS, restul 1x PBS
/0.2% Tween. Pastrare la 4 gr C peste noapte.
Ziua 2: Spalare de 3x3 min cu 1xPBS/0.2% Tween; Anticorp secundar : Goat anti Rb CFL 555
dilutie 1/1000 in 1% GS , restul 1xPBS; Mentinere pe sectiuni cca 5 ore la RT , sub agitare.
Spalare 3x3 min cu 1XPBS/0.2% Tween. Fixare cu PFA 4%, 10 min. Spalare 3x3 min cu
1XPBS/0.2% Tween. Blocare 1 h cu blocking : 3% Goat serum , 0.1% Triton din 10% Triton, 1% ,
restul 1xPBS /0.2% Tween. Inlocuire blocking cu al doilea anticorp primar: Ms anti Doublecortin,
dilutie 1/4000, peste noapte la 4 gr C in 3% GS, restul 1x PBS /0.2% Tween.
Anticorp secundar: Goat anti Ms POD polimer dilutie 1/10 in 1% GS, restul 1xPBS. Pastrare sub
agitare timp de 5 ore la temp. camerei.
Coloratie sistem Tiramida –FITC. Dilutia finala pe lama 1/500.
II. Stabilirea de teste recuperatorii dupa accidente vasculare Evaluarea recuperării memoriei spaţiale prin testul labirintului radial
Pentru această evaluare, animalele au fost testaţe într-un labirint radial. ce prezintă o
zonă centrală, de la care pleacă radiar 8 braţe simetrice, conturând o formă circular-octogonală.
Acest dispozitiv a fost ridicat la 60 cm înălţime, pentru a evita ieşirea Animlanilor din labirint
peste peretele braţelor.
Animalele au fost plasaţi la capătul unuia dintre cele 8 braţe, folosit totdeauna ca start,
iar celelalte trasee (braţe) fiind considerate ca destinaţii. Compartimentul de start şi fiecare
dintre cele 8 destinaţii au fost etichetate cu simboluri albe şi negre, de diferite forme geometrice,
pentru orientarea animalelor.
Animalele, privaţi de hrană din seara precedentă, au fost plasaţi în labirint în braţul de
start şi, la capătul unuia dintre celelalte braţe, a fost plasată hrană. Aceştia, după ce au găsit
hrana, au fost scoşi din labirint, urmând ca după un interval de 30 de minute să fie plasaţi în
acelaşi labirint, cu hrana în aceeaşi poziţie, fiind nevoiţi să „îşi reamintească” braţul cu
recompensa alimentară.
Notarea şi cuantificarea rezultatelor a fost efectuată astfel:
Ø 0 pentru un parcurs de succes, în care Animlanul a găsit recompensa alimentară, reamintindu-şi
poziţia acesteia;
Ø 1 pentru eşecul găsirii hranei într-un timp mai mic de 3 minute, considerându-se că acest interval
de timp este suficient pentru un găsirea recompensei.
4. RotaRod
Evaluarea funcţiei vestibulo-motorie prin testul barei rotative
Acest test evaluează funcţiile vestibulară şi motorie fină, în cazul recuperării după ischemia
cerebrală, la model animal. Fiecare animal a fost testat în ceea ce priveşte capacitatea de a se
adapta la trecerea peste o punte rotitoare, a cărei viteză de rotaţie poate fi modificată.
Dispozitivul constă într-un cilindru cu o lungime de 160 cm şi diametru de 12 cm,
acoperit cu o suprafaţă semidură, pentru a nu permite animalelor să alunece. Cilindrul se poate
roti, cu ajutorul unui potenţiometru, putând ajusta viteza de la 0 la 6 rotaţii pe minut.
Animalul a fost plasat pe cilindru, măsurându-se timpul necesar pentru a traversa
cilindrul şi de a ajunge la capătul distal, unde se găseşte un grup de animale, plasate într-o cuşcă,
pentru a favoriza deplasarea acestuia. Rezultatele au fost exprimate sub forma a două entităţi:
timpul necesar traversării şi scorul acordat de către examinator comportamentului animalului de
experienţă în timpul traversării, după următoarea schemă:
Ø 0 - Animalul cade imediat după plasarea pe cilindru, fără a se putea deplasa;
Ø 1 - Animalul rămâne pe rotor, dar nu avansează, menţinându-şi totuşi poziţia;
Ø 2 - Animalul avansează, dar cade înainte să ajungă la capătul distal al cilindrului;
Ø 3 - Animalul traversează, dar membrele sunt folosite asimetric, cu preponderenţă membrul
stâng se dovedeşte a fi deficitar;
Ø 4 - Animalul traversează, dar membrul stâng este folosit mai puţin de 50% din timpul necesar
traversării;
Ø 5 - Animalul traversează cu succes, dar având mici dificultăţi în a-şi menţine echilibrul;
Ø 6 - Animalul traversează fără greşeală cilindrul, prezentând mişcări simetrice ale membrelor.
Pentru acest test, animalele trebuie antrenate cel puţin 10 zile înainte de intervenţia chirurgicală,
iniţial fără rotire, dar apoi crescând uşor viteza de rotaţie a cilindrului, până se ajunge la 6 rotaţii
pe minut.
Rezultate
1.1.3. Evaluarea efectului asupra neurogenezei prin imunhistochimie
DCX/BRDU -NEUROGENEZA
CD31/BRDU-ANGIOGENEZA
REZULTATE: Teste de recuperare
Director proiect
Prof. univ. dr. Dirk Hermann
D a y -7
D a y 3
D a y 7
D a y 14
D a y 21
D a y 28
0
5
1 0
1 5
2 0
2 5
R o ta t in g P o le 6 rp m - A D U L T
D a y s p o s t-s tro k e
Tim
e(s
)
1xT
1 /1 0 x T
C
D a y -7
D a y 3
D a y 7
D a y 14
D a y 21
D a y 28
0
1 0
2 0
3 0
4 0
C y lin d e r T e s t - A d u lt
D a y s a f te r s tro k e
Nr.
of
tou
ch
es
1xT
1 /1 0 x T
C