pythiosis canina
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PYTHIOSIS CANINA.
M.V. MCs. FRANCISCO ZAPATA BOLÍVAR
1.- Pitiosis.
Generalidades.
La Pitiosis es una enfermedad producida por el Pythium insidiosum, que se
encuentra distribuido a nivel mundial, ha causado un gran impacto económico sobre
la agricultura. Su ocurrencia primaria se ha presentado en áreas tropicales y
subtropicales de todo el mundo. También ha sido reportado en Australia, Indonesia,
Japón, Nueva Guinea, Tailandia y en Estados Unidos de Norteamérica se ha
observado en todos los estados que bordean las costas del Golfo de México (Foil,
1996).
Se conoce poco sobre el Pythium insidiosum, pero parece ser el único entre las
especies que puede encontrar el modo para colonizar los tejidos cutáneos y
subcutáneos de varias especies (Foil, 1996). Desde los años 70 creció en forma
significativa el número de casos reconocidos en pequeños animales. La patogenia no
se comprende del todo, pero el Pythium insidiosum se considera un patógeno
verdadero y no un oportunista. En esta enfermedad se pueden ver afectados los
tejidos cutáneos, subcutáneos y sistema digestivo en varias especies, incluyendo al
hombre (Foil, 1996; Cock et al, 1987).
En el pasado el Pythium insidiosum se clasificaba dentro de la categoría de
enfermedades fitomicóticas, las cuales se describían como patologías causantes de
lesiones granulomatosas con estructuras hifales y se responsabilizaba a agentes
Zigomicoticos. Hoy se sabe que el Pythium insidiosum es un chromista que esta
clasificado taxonómicamente en la clase Oomyceto. Este tipo de microorganismo
verdaderamente acuático produce zoosporas móviles responsables de la migración y
diseminación del agente en el medio ambiente (Foil, 1996; Mendoza et al., 1987).
Por consiguiente, se asume que las zoosporas son inducidas en la naturaleza
durante los meses calidos, lo cual coincide con la observación de que la mayoría de
los casos son reconocidos a fines del verano y comienzo del otoño. Se cree que las
zoosporas son liberadas al ambiente e infectan al animal cuando contactan la piel
lesionada o al ser ingeridas. No se conoce a ciencia cierta si para desarrollar la
infección digestiva debe existir una lesión previa en la mucosa intestinal (Foil, 1996;
Dyskstra et al., 1999).
La Pitiosis es una enfermedad multisistémica que evoluciona a procesos
granulomatosos obliterantes en intestino que afectan seriamente a perros, gatos,
bovino, equinos, osos, dromedarios y humanos. Diversos reportes mencionan
implicaciones en diferentes especies. Dyskstra et al. (1999) señala que el Pythium
insidiosum ha sido el agente etiológico aislado en 60 caninos investigados con signos
de dermatitis granulomatosa. Wanachiwanawin et al. (1993) reportan cuadros de
arteritis y aneurismas carotídeos en humanos al cual se les identifico el Pythium
insidiosum como agente causal. Infecciones oculares registradas en humanos,
diagnósticos como celulitis orbital y queratitis ulcerativas fueron reportados por
Virgile et al, (1993) y Badenouch et al., (2001).
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Diferentes especies de Pythium y varias afecciones en órganos y tejidos han
sido registradas a nivel mundial, pero es importante señalar que los equinos y caninos
son las especies animales más comúnmente afectadas (Foil et al., 1984; Virgile, 1993;
Dyskstra et al., 1999; Grootes et al., 2003).
Mediante técnicas de inmunodifusión y anticuerpos fluorescente, Mendoza et
al., (1987) demostraron que el P. insidiosum aislado de casos de Pitiosis en caninos,
caballos y humanos son idénticos antigénicamente y diferentes al Pythium spp no
patógeno aislados de las plantas y de la tierra. Mas tarde Mendoza y Marin (1989) a
través de inmunodifusión observaron seis bandas en común entre el antígeno del P.
destruens y P. insidiosum aislados de humanos y animales con Pythiosis,
concluyendo que el agente etiológico de la Pythiosis es una sola especie, el P.
insidiosum.
Schurko et al.(2003), aportaron resultados que demuestran que existen
variantes geográficas del P. insidiosum, a través de la secuenciación de ADN,
estableciendo las relaciones filogenéticas entre 23 casos donde se aisló P. insidiosum,
los cuales fueron divididos según su ubicación geográfica en tres clases distintas, la
clase I aisladas del Norte, Centro y Sur America, en la clase II incluyeron los aislados
de Asia y Australia, mientras que en la clase III ubicaron los aislados de Tailandia y
EE.UU.
2.1.- Pitiosis Canina.
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La Pitiosis canina por lo general afecta a animales jóvenes con edad promedio
de 3 años. Los machos de razas grandes son los más predispuestos (Thomas y Lewis,
1998).
Las lesiones tegumentarias suelen ser solitarias o múltiples, siendo común
observarla a lo largo de las extremidades, base de la cola, periné y con menor
frecuencia sobre el rostro (Foil et al., 1984; Dysstra et al., 1999). La forma
subcutánea y nasofaríngea ha sido reportada en caninos, pero es infrecuente en felinos
(Bissonnette et al., 1991).
Las lesiones tempranas se presentan como una placa ulcerada o erosiva que
puede confundirse con un granuloma de lamido, a medida que avanza la lesión su
aspecto se torna nodular, ubicándose en regiones corporales atípicas para los
granulomas por lamido (Thomas y Lewis, 1998).
En un estudio de 15 casos que presentaron lesiones nodulares ulcerosas
distribuidas a lo largo del periné y miembros posteriores, 14 de los 15 caninos
presentaron una eosinofília periférica, y todos una cronicidad promedio de 3 meses.
El diagnostico fue realizado por histopatología donde se empleo el método de tinción
de Gomori Methenamine de plata para coloración e identificación del hongo
(Dyskstra et al., 1999).
Por su parte, Inkrle (1998) reportó un caso en un canino con una masa larga de
superficie ulcerada y supurativa ubicada en el periné y cara posterior de los miembros
posteriores que se extendía hasta el área poplítea, sus medidas abarcaban 20 cm. de
largo y 7 cm. de ancho. El diagnóstico se basó en citología e histopatología, donde se
confirmó la presencia de Pythium insidiosum a través de inmunohistoquímica.
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Las lesiones de la piel en algunos casos son altamente pruriginosas,
involucrando largos nódulos fistulizados, en ocasiones ulcerados y con contenido
serosanguinolento. Áreas de profunda necrosis y desprendimientos de tejidos suelen
ser vistas (Foil et al., 1984; Dysktra et al., 1999). El trauma cutáneo o la compresión
de la piel, sumado a factores inmunosupresivos, pueden representar un factor
predisponente a la infección.
La forma gastrointestinal es la predominante en los caninos. Las más
afectadas son perros de talla grande con una edad promedio de 3 años (Miller, 1985).
Los labradores Retriever representan en los Estados Unidos la raza con mayor
incidencia, debido posiblemente a su condición de trabajo en el medio acuático
(Miller, 1985).
Los signos clínicos encontrados por la afección digestiva varían de acuerdo al
sitio de crecimiento (Helman, y Oliver, 1999). Los signos encontrados son: masas
abdominales palpables 11 %, pérdida progresiva de peso 26 %, diarrea hemorrágica
que no cede a la terapia 14 %, anorexia 12 %, vómitos 34 % y depresión 5 %. Helman
y Oliver (1999) reportan la disfagia, la diarrea, el vómito y grandes masas
abdominales palpables como signos característicos de la Pythiosis canina. Las
lesiones están caracterizadas por engrosamiento transmural difuso e irregular de la
pared intestinal, el cual puede comprender de 5 a 25 centímetros de asa intestinal
(Foil et al., 1984). Los signos sistémicos progresan cuando la obstrucción, el infarto o
la perforación intestinal se hacen presentes (Foil, 1996; Bentinck-Smith et al., 1989).
En cuanto a ubicación, un estudio realizado por Miller (1985) en 25 caninos
que presentaban la forma digestiva, revela la ubicación de las masas abdominales
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causadas por el Pythium insidiosum, reportándolo en: estómago 8 %, intestino
delgado 36 %, estómago e intestino delgado 9 %, válvula ileocecal 27 %, intestino
grueso 9 %, otros lugares 5 %, e implicando mesenterio 6 %. Ocasionalmente pueden
estar afectados nódulos linfáticos mesentéricos y omentos (Foil et al., 1984).
3.- Métodos de Diagnóstico de Pitiosis.
El diagnóstico de la Pitiosis esta basado en la demostración del agente causal
en las lesiones. Existen diferentes métodos; entre ellos se encuentra la histopatología,
serología a partir de tejidos, la técnica de inmunohistoquímica y los cultivos para
colonias hifales (Foil et al., 1984; Mendoza et al., 1986; Brown, 1988; Mendoza,
2001). Sin embargo, a pesar de que el diagnóstico temprano es esencial para el éxito
del tratamiento, las herramientas diagnósticas disponibles aún son limitadas.
El diagnóstico clínico esta basado en las características clínicas, edad del
animal, perfil hematológico y radiológico, por lo cual se puede utilizar el protocolo de
diagnóstico de alteraciones de aspecto tumoral en vías digestivas en caninos con
diarrea hemorrágica crónica diseñado por Capodagua (2004), que orienta como
diferenciar la Pitiosis gastrointestinal.
El perfil hematológico en paciente con Pitiosis en general no es específico. Se
puede observar anemia en la fase crónica, con leucocitosis de estrés. La
hipercalcemia es un signo que ocasionalmente es detectado y se presenta en
enfermedades que cursen con procesos granulomatosos (Barsanti et al., 1975;
Mendoza et al., 1987).
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3.1.- Histopatologia.
Histopatológicamente la Pitiosis gastrointestinal se caracteriza por una
inflamación piogranulomatosa que abarca la mucosa, submucosa y muscular (Millar,
1985). Estas afecciones presentan una infiltración eosinofílica o neutrofílica con
predominio de células plasmáticas y elementos hifales invadidos por macrófagos,
células epitelioides y gigantes.
Por otra parte, la Pitiosis cutánea se caracteriza por lesiones necróticas
totalmente contaminadas y que histopatológicamente revelan alto contenido de
neutrófilos causando de esta manera un agregado mixto dentro de la formación de los
granulomas; en estados avanzados se observan severos cuadros de fibrosis con
piogranulomas acompañados de un intenso infiltrado eosinofílico (Foil et al.1984;
Grooders et al., 2002). Millar et al. (1984) y Brown et al. (1988), afirman que el
tamaño de las hifas con medida aproximada de 6 – 8 μm, pueden estimular de manera
exagerada la agregación eosinofílica en cuadros de Pythiosis. En lesiones invasivas
gastrointestinales se han reportado necrosis licuefactiva con trombosis de la pared
arterial invadida totalmente de hifas.
El Pythium insidiosum no es coloreado por la hematoxilina y eosina, por tanto
el estadiaje y secciones hifales no pueden ser delimitados (Foil et al., 1984; Dyskstra
et al., 1999). Las coloraciones como Gridley y Gomory son reportadas como óptimas
para observar estudios hifales en buen estado (Bentinck-Smith et al., 1989;
Thianprasit et al., 1996; Dyskstra et al., 1999; Grooders et al., 2002). Se pueden
apreciar bajo estas coloraciones hifas de diferentes formas, presentando un diámetro
que oscila entre 2,5 – 8,9 μm en comparación con hifas aisladas en las
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enterophoecosis con un diámetro mayor de 10 μm, acompañadas de un intenso
infiltrado eosinofílico a su alrededor (Brown et al., 1988).
3.2.- Aislamiento (Cultivo) de Pythium insisdiosum.
Se han intentado muchos métodos diagnósticos de aislamiento e identificación
en esta patología. El método diagnóstico de inmunoperoxidasa indirecta es una
técnica que demuestra el desarrollo hifal a partir de los tejidos (Brown et al., 1988;
Santuario et al., 1998; Herman y Oliver, 1999). Esta técnica es empleada para el
aislamiento tanto en las especies caninas y equinas, demostrando una alta
especificidad y sensibilidad (Howerth et al., 1989).
El Pythium insidiosum no es relativamente fácil de cultivar a través de medios
para hongos. Existe un rápido crecimiento observado en dextrosa Sabouraud (SAB) y
agar sangre. Varios extractos vegetales pueden ser adicionados como la triptosa
dentro del agar sangre a razón de 5 ml/lt dentro del agar; estos suelen utilizarse como
extracto para reforzar el crecimiento del Pythium insidiosum.
Este microorganismo es sensible en su crecimiento a altas temperaturas que
provocan deshidratación, igualmente el enfriamiento elevado compromete la vida del
microorganismo durante su cultivo. La incubación en agar con agua estéril se realiza
entre 35 ºC a 37 ºC experimentándose un rápido crecimiento en 24 horas (Mendoza et
al., 1988; Thomas y Lewis, D. 1998; Bissonnette et al., 1999).
Típicamente la coloración de la colonia es amarilla, o ligeramente amarilla
con irradiaciones en el gel que sobresalen del punto de cultivo. Las colonias con
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cultivos de SAB agar son más propensas a poseer dichas irradiaciones lo cual
caracteriza el cultivo de este germen (Mendoza et al., 1987; Millar et al., 1983).
Es indispensable cultivarla en un medio húmedo para que se pueda producir
las zoosporogonias y las zoosporas biflageladas que son en definitiva la forma
infectiva. Las hifas provenientes de cultivos de tejidos jóvenes realizados con (SAB)
son abundantes y de formas variadas, presentando una medida promedio de 4 a 10 μm
(Mendoza et al., 1988).
3.3.- Pruebas Serológicas y PCR.
Los test de inmunofluorecencia e inmunodifusion gel no son ofrecidos
comercialmente para la determinación e identificación del cultivo de este
microorganismo (Mendoza et al., 1986). Sin embargo el Centro de Control y
Diagnóstico de Atlanta suministra esta alternativa diagnóstica (Bentinck-Smith et al.,
1989). Estos test son específicos para la identificación de diferentes especies de
Pythium, específicamente de la familia Zygomicetos (Mendoza et al., 1987).
Los estudios inmunológicos para la Pythiosis han sido desarrollados a través
del test en inmunodifusion en agar gel doble y complementando para su diagnóstico
con el test de fijación de complemento para detectar anticuerpos contra el Pythium
spp. (Bentinck-Smith et al., 1989; Bissonnette et al., 1991; Santuario et al., 1998).
El Centro de Control y Aislamiento de la Universidad de Louisiana
recomienda que el transporte de los tejidos para practicar aislamiento se debe realizar
en soluciones salinas estériles con ampicilina preparada a 100 μg/ml y preservada a
temperaturas que oscilen de 36 ºC a 37 ºC.
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Los test diagnósticos de ELISA son desarrollados en la universidad del Estado
de Louisiana y proveen una alta sensibilidad en la detección de anticuerpos contra el
Pythium spp. en equinos y caninos (Taboada, 1992).
Mendoza et al. (1997) desarrollaron y evaluaron un ensayo inmunoenzimático
(ELISA) empleando un antígeno soluble de fragmentos hifales del P. Insidiosum. El
estudio fue realizado con suero de cinco humanos y de ocho animales con Pitiosis
probada por cultivo e histología. Algunos de estos sueros eran negativos en la prueba
de inmunodifusión para Pitiosis. La prueba de de inmunodifusión detectó solamente 8
(61.5%) de un total de 13 casos con Pitiosis, mientras que el ELISA detecto el 100%.
Las pruebas de inmunodifusión y ELISA son específicas y dieron resultados
negativos o títulos bajos respectivamente, con los sueros de seres humanos y de
animales con infecciones fúngicas heterólogas o sin enfermedad evidente. Los
resultados indican que el ELISA es una prueba serodiagnóstica confiable para la
Pitiosis, es tan específica como la prueba de la inmunodifusión pero más sensible.
Debido a su sensibilidad, la prueba ELISA puede tener valor para diagnosticar las
etapas tempranas y crónicas de la enfermedad y para estudios epidemiológicos.
Krajaejum et al. (2002) afirman que ELISA ofrece un 100 % de sensibilidad y
especificidad siendo muy útil en el desarrollo y evaluación de ensayos para el
monitoreo temprano de la Pitiosis humana.
Los últimos estudios en el desarrollo del diagnóstico en la investigación del
Pythium spp. a nivel mundial están basados en su determinación por PCR (Helman et
al., 1992; Thitythanyanonta et al., 1998). En un estudio realizado por Grooters et al.
(2002) reportaron aislamiento de tres nuevas especies de Pythium spp a través de la
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técnica de Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR) realizado en muestras de
intestino y piel. Las nuevas especies se les denominó: Pythium aphanidermatum,
Pythium acathicum y Pythium myriotyum y actualmente se encuentran en estudio.
A partir de una biopsia de intestino de un canino mestizo de 11 meses de edad
con diagnóstico Histopatológico compatible con Pitiosis realizaron
inmunofluorescencia directa y junto con PCR corroboraron que el patógeno
involucrado era el Pythium insidiosum. Esto lo lograron cubriendo los cortes
desparafinados con una gota de los anticuerpos específicos fluorescentes de P.
Insidiosum (FA) y analizados bajo el microscopio de fluorescencia. Además, el ADN
genómico del P. Insidiosum fue extraído y amplificado de tejidos parafinados. Como
control usaron cortes histológicos de una variedad de micosis, obteniendo en ellos
resultados negativos al usar los reactivos del FA. La presencia de los elementos
hifales fue confirmada por PCR y demostraron total igualdad con las secuencias
registradas en el banco de genes del P. Insidiosum.
A partir de cortes histológicos de tejidos provenientes de bovinos con
diagnóstico de Pitiosis epizoótica de los bóvidos, Pérez et al. (2005) realizaron
inmunofluorescencia, cuyo resultado fue la identificación de hifas ramificadas de P.
Insidiosum. También utilizando la inmunodifusión, ELISA y Western blotting
demostraron que en los sueros obtenidos de los bóvidos afectados se encontraban las
inmunoglobulinas Anti-P. Insidiosum.
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