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UNIVERSIDAD AUTÓNOMA METROPOLITANAUNIDAD IZTAPALAPA
CIENCIAS BIOLÓGICAS Y DE LA SALUDCBS
“PUNTAS DE MICROSCOPIO DE FUERZAATÓMICA CON NANOTUBOSPARA MUESTRAS BIOLÓGICAS”
Proyecto de Investigación (PDI)como uno de los requisitos para
obtener el grado de :
Licenciatura en Biología Experimental
Presenta:
José Manuel Sánchez Ávila
Asesor:
Prof. Dr. Nikola Batina
Lugar Realización:Laboratorio de Nanotecnología e Ingeniería Molecular, Área de ElectroquímicaDepartamento de Química, Ciencias Básicas e Ingeniería CBI UAM-Iztapalapa
México, D.F. Diciembre 2006.
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ÍNDICE
Páginas
RESUMEN.……………………………………………………………………………………..…………..…. III
INTRODUCCIÓN
1.1 MICROSCOPÍA DE FUERZA ATÓMICA……………………………………………..……………….. 1
1.2 PUNTAS DE AFM…………………………………………………………………………………………... 2
1.3 NANOTUBOS DE CARBONO……………………………………………………………………….…... 10
1.4 UNIÓN NANOTUBOS-PUNTAS AFM………………………………………………..………………… 13
1.5 PUNTA NORMAL PARA AFM Y COMPARACIÓN CON PUNTA AFM MAS NANOTUBO… .. 13
1.6 ESTUDIOS EN BIOLOGÍA MOLECULAR A TRAVÉS DE PUNTA AFM/ NANOTUBO……… 18
JUSTIFICACIÓN……………………………………………………………………………………………... 20
OBJETIVO.………………………………………………………………………………………………….… 20
OBJETIVOS PARTICULARES…………………………………………………………………..… .…….. 20
METODOLOGÍA.……………………………………………………………………………………….……. 20
RESULTADOS Y DISCUSIÓN…….…………………………………………..………………………..…. 23
CONCLUSIONES…………………………………………………..…………………………………….….. 49
BIBLIOGRAFÍA………………………………………………………………………………………...…… 50
III
PUNTAS DE MICROSCOPIO DE FUERZA ATÓMICA CON NANOTUBOS PARA MUESTRASBIOLÓGICAS
RESUMEN
Los últimos desarrollos de nuevos materiales con propiedades específicas como son los nanotubos decarbono, en forma tubular con diámetro desde 1 nanómetro tienen extraordinaria fuerza mecánica. Abren laposibilidad de que este material particular sea usado como punta para Microscopía de Fuerza Atómica(AFM) de alta resolución [Neil et al 2002]. Esta idea muy buena y novedosa, en los últimos años ha tenidomuy poco éxito por la falta de instrumentación y metodologías para manejar, ensamblar e integrar nanotubosdentro del equipo de AFM [Cheung et al 2000]. La idea en este trabajo es desarrollar una metodología simpley accesible para conectar nanotubos de carbono en la punta de AFM, así como evaluar el funcionamiento enla resolución de imágenes dada por el barrido de un nanotubo como punta de AFM sobre muestrasbiológicas.
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INTRODUCCIÓN
1.1 MICROSCOPÍA DE FUERZA ATÓMICA
Históricamente, los microscopios han sido instrumentos ampliamente utilizados en ciencias biológicas, desdelos más sencillos microscopios ópticos hasta los más modernos microscopios de resolución atómica. Elmicroscopio de fuerza atómica se incluye en un amplio grupo de técnicas denominadas “microscopías desonda” (SPM). Todas las técnicas de SPM se basan en un barrido de la superficie de la muestra por unapalanca (cantilever) en la que se encuentra acoplada una sonda muy fina, generalmente en forma de punta,que se desplaza sobre la muestra siguiendo líneas paralelas. Las alteraciones de la posición de esta puntaproporcionan información de las propiedades de la superficie de la muestra y dan lugar a la imagen.
La obtención de imágenes son debidas al movimiento de un complejo piezoeléctrico, sobre el que descanza lamuestra a analizar [Binnig et al, 1986].
Para poder medir las fuerzas sufridas por el cantilever, se enfoca un haz laser sobre la superficie superior delcantilever, de manera que su reflejo sea captado por cada una de las partes de un fotodetector dividido encuatro cuadrantes. El desplazamiento vertical y la curvatura del cantilever (producida por la atracción orepulsión de la muestra) es medida a través de la posición Y de la proyección del haz en el fotodetector ytransformado en un voltaje Vy. Las fuerzas laterales son medidas por la posición X de la proyección del hazsobre el fotodetector y es transformado a un voltaje Vx. Por ley de Hooke, ∆Vy resulta ser un valorproporcional a la fuerza que esta actuando sobre el cantilever.
La muestra a estudiar es fijada sobre un dispositivo de posicionamiento fino llamado scanner. Este scannerpermite el movimiento de la muestra en los tres ejes coordenados, su resolución y rango de movimiento es laresolución y rango de medición de todo el microscopio. La resolución puede ser de 100 picómetros y losrangos varían entre 1 µm y 200 µm.
La posición vertical fina de la muestra es controlada automáticamente por un sistema electrónico deretroalimentación o regulación, el que compara el voltaje Vy (proporcional a la fuerza vertical), con unvoltaje de referencia Vyref y ajusta la posición vertical de la muestra. El ajuste se hace de manera que sehaga cero la diferencia entre Vy y Vyref hasta lograr un equilibrio. En otras palabras el regulador controla elmovimiento vertical del scanner, ergo la posición vertical de la muestra, de manera que la fuerza deinteracción entre esta y el cantilever se mantenga siempre constante.
De manera completamente independiente, un software genera un barrido de valores para X y Y el que esamplificado y luego aplicado a los ejes respectivos del Scanner. De esta manera, se realiza el barrido de lasuperficie de la muestra mientras paralelamente este mismo software recoge información por cuatro canalesanálogos y relaciona en cada momento sus valores con las coordenadas X, Y sobre las que se encuentra elcantilever.
Así se obtiene un mapeo de los voltajes de cada canal para cada punto X, Y, lo que significa que encontrandola calibración correspondiente de estos voltajes es posible hacer mapas de las características físicas de lamuestra a escala nanométrica. Lo importante es que estos datos son tomados mientras el sistema deregulación mantiene en equilibrio Vy y Vyref lo que significa que la sonda se mantiene a una distanciaconstante de la muestra durante todo el barrido.
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Para un AFM común la información entregada a los canales de datos es la posición vertical de la muestra, loque significa que la información encontrada es un valor para la posición Y para cada valor de lascoordenadas (X, Z). Esto es la forma de la superficie, su topografía [Hermans Z. R., 2001].
El AFM tiene la ventaja de poder ser utilizado para observar muestras no conductoras, como las biológicas.Su aplicación en muestras biológicas comenzó dos años después de ser desarrollado, [Worcester et al., 1988],aunque debido a las dificultades observadas en la manipulación y observación de este tipo de muestras, nofue hasta 1992 cuando se estableció su uso biológico [Bustamante et al, 1992]. A diferencia de otrosmicroscopios de buena resolución, el AFM en adición, permite la visualización de muestras biológicas sinnecesidad de tinción previa y en solución, permitiendo la observación de muestras en tiempo real y encondiciones biomiméticas (condiciones fisiológicas; pH 7, entre otras).
Durante la visualización de muestras biológicas, para prevenir la deformación de las mismas, la fuerzavertical aplicada por el cantilever se ajusta a fuerza mínima (50-100 pN). A fuerzas aplicadas de entre 100 y1000 pN, la muestra se deforma de manera reversible, mientras que a fuerzas superiores a 1000 pN, lamuestra biológica es deformada de manera irreversible [Fotiadis et. al., 2002].
Las ventajas que presenta el AFM frente a otros tipos de microscopios [Firtel y Beveridge, 1995; Dufrêne yLee, 2000], son:
• Relación señal-ruido muy elevada que permite la visualización de superficies a una resolución de 1 nm.• Capacidad para estudiar la nanoestructura de la superficie de películas de lípidos y cambios
conformacionales de biomoléculas en medio acuoso y en tiempo real.• Posibilidad de manipulación de la muestra durante el proceso de visualización de la misma.
El AFM puede ser manejado en dos principales modos: el modo de fuerza constante y el modo de alturaconstante. La diferencia entre ambos es si el sistema de retroalimentación se encuentra activo o norespectivamente. El sistema de retroalimentación es un sistema que permite corregir la distancia entre lapunta y la muestra, dependiendo de la señal recibida correspondiente a la fuerza de interacción atómica.[citado en Tapia M. 2005].
Si el sistema de retroalimentación está activado, entonces el material piezoeléctrico, conforme la punta semueve sobre la superficie, responderá a cualquier cambio en la fuerza, alterando la separación de la punta yla muestra con el fin de restablecer el valor predeterminado de la fuerza. De este modo la fuerza ejercida porel material, sobre la punta, se mantiene constante y por ende se trata del modo fuerza constante [citado enTapia M. 2005].
Si por el contrario, el sistema de retroalimentación está desactivado, entonces el AFM operará con unaseparación entre la punta y la muestra constante; modo altura constante.
1.2 PUNTAS DE AFM
Desde la invensión del microscopio de fuerza atómica, las palancas ó cantilevers medidores de fuerzas hansido fabricados de diversas maneras. Los primeros cantilevers eran alambres con puntas grabadas, ó puntaspegadas a piezas de aluminio metálico, este tipo de ensambles eran inexactos para la medición de pequeñasfuerzas. Poco tiempo pasó para que los cantilevers a base de silicio dominaran, debido a que a la fecha seproducen en masa y son de tamaño microscópico [Randal et. al. 2002]. Los cantilevers microfabricadosofrecen muchas ventajas como por ejemplo: disponibles en un amplio intervalo de constantes de fuerzas, y sutamaño diminuto, permite frecuencias resonantes altas. Es relativamente sencillo su uso, pero su tamañodiminuto impide mediciones de sus propiedades mecánicas [Ogletree et. al. 1996]. Para visualizar muestras
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frágiles o blandas, se requiere de un cantilever con una baja elasticidad constante, esto debido a que dichasmuestras pueden verse afectadas si son medidas con un material no apto [Randal et. al. 2002].
La geometría de la punta usada en el barrido por AFM tiene ún rol importante en la calidad de imágenes, enespecial lo concerniente a la resolución lateral. Cuando la superficie de una muestra es barrida a una distanciaconstante, la punta “se aproxima” con ella, producto de esa colisión se desprenden partículas, y dependiendodel área de la punta, dependerá el área que puede ser barrida y por lo tanto vizualizada [Costa et. al. 2003].
El cantilever donde se localiza la punta debe cumplir con propiedades específicas para lograr resoluciónatómica; este debe tener propiedades elásticas, por lo que debe ser de material resistente pero flexible; elcantilever debe cumplir con la ley de Hook, la cual de forma simple, establece que para cualquierdeformación que implique un desplazamiento de magnitud ∆Z, existe una fuerza de restitución FR dada por:
FR = K ∆Z
Donde K es la constante de resorte o de restitución, que para un cantilever como el usado, esta relacionadocon su longitud, el módulo de Young E y su momento de inercia I; por medio de :
K= 3EI/L3
Así, para una resolución atómica, las flexiones del cantilever serán de algunos angstroms, por lo que se puededeterminar que K debe ser de entre 10-2 a 102 Newton/metro [Manzano , 2002].
Aunque el catálogo de puntas usadas para realizar barridos en AFM es amplio, hay dos tipos de puntasmucho muy empleadas en AFM que son las de modo contacto y modo Tapping (figura 1-2) que en sutotalidad son hechas de silicio barnizado antimonio (tabla 2).
Algunos aspectos importantes, son su tipo de geometría, que puede ser isotrópica (tienen las mismaspropiedades físicas en todas las direcciones) ó anisotrópica (que son diferentes en distintas direcciones), laaltura, el tipo de ángulo, entre otras.
Figura 1. Punta modo contacto sin nanotubo. A) Micrografía de microscopía electrónica de barrido ( SEM) de lapunta de nitruro de silicio para AFM, modo contacto tipo NP-S Wafer # 113-129-20, B) Imágen a mayor aumento
de la punta de AFM. https://www.veecoprobes.com/probe_detail.asp?ClassID=87
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Algunos parámetros importantes que se deben tener en cuenta para poder llevar a cabo ún barrido de lamuestra a analizar por medio de puntas tipo contacto, son dados en la tabla 1:
Material: nitruro de silicioGeometría: de molde
Altura de la punta: 2.5µm - 3.5µmÁngulo frontal: 35°Ángulo de lado: 35°
Radio de la punta (Nom.): 10nmRadio de la punta (máx.): 40nmEspesor (grosor), Nominal: 0.6µmEspesor (grosor), rango: 0.4µm - 0.7µm
Tabla 1. Propiedades de puntas modo contacto.
En este modo –contacto- la superficie de la muestra está en contacto todo el tiempo con la punta de la sondadonde actúan fuerzas de repulsión iónica. Este modo permite identificar las diferencias de fricción en lasuperficie y variaciones en las propiedades de la muestra. Es decir está en régimen repulsivo de las fuerzasinteratómicas. Para el modo de fuerza constante, la deflexión del brazo de la palanca producida por lainteracción entre la punta y la muestra se utiliza para reajustar la posición en el eje z del materialpiezoeléctrico de tal forma que la deflexión se mantenga constante durante el movimiento de la punta sobrela superficie.
Un problema que se presenta se dá cuando: al momento en que la punta recorre la superficie, ésta seencuentre con una protuberancia que crece muy rápido y dada la velocidad de barrido, no le dé tiempo delevantarse, llevándose consigo parte de la muestra. Si la protuberancia en la superficie no crece muy rápido,se podría evitar el daño por medio del sistema de retroalimentación, que regula la distancia entre la punta y lamuestra. La separación de la muestra es monitoreada durante el análisis y se incorpora como una señal deentrada para el sistema de retroalimentación. Cuando aparece una diferencia en la separación de la muestra,el AFM la utiliza para corregir la separación y contrarrestar dicha diferencia [citado en Tapia M., 2005].
Figura 2. Punta modo tapping tipo TESP wafer #10558L093 sin nanotubo. A) Micrografíade microscopía electrónica de barrido ( SEM) de la punta para AFM, B) Imagen aumentadauna punta modo tapping. https://www.veecoprobes.com/probe_detail.asp?ClassID=106
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Material: antimonio (n) silicio barnizadoGeometría: anisotrópica
Altura de la punta: 10µm – 15µmÁngulo frontal: 25°Ángulo de lado: 22.5 °
Radio de la punta (Nom.): <10nmRadio de la punta (máx.): 15nmEspesor (grosor), Nominal: 4µmEspesor (grosor), Rango: 3.5µm – 4.5µm
Tabla 2. Propiedades de puntas modo tapping
Por otra parte, en el modo tapping el brazo de palanca oscila a su frecuencia natural de resonancia en formavertical (figura 3), usualmente del orden de cientos de kHz. Tal vibración se consigue por medio de otromaterial piezoeléctrico colocado en la base del brazo de la palanca. La punta al estar vibrando tocaintermitentemente la superficie, es decir, entra a la parte repulsiva del potencial intermolecular y de estemodo la punta está en contacto con la superficie solo por un lapso corto, reduciendo la fuerza lateral sobre lapunta y el riesgo de producir un daño inelástico a la superficie, como el llevarse material consigo. Por elreducido tiempo de contacto entre la muestra y la punta, este modo es conveniente para muestras suaves, paraminimizar daño [Acosta G. C., 2005].
Figura 3. Modo Tapping. La punta del AFM toca intermitentemente la superficie de la muestra,el tiempo de contacto es menor, lo que reduce el riesgo de daño [Acosta G. M. C., 2005].
El modo tapping ú oscilante fue originalmente ideado para analizar muestras bajo condiciones normales demedio ambiente [Citado en Acosta G. M. C., 2005]. Dicho modo es ideal cuando queremos estudiar muestrassuaves y obtener una imagen con alta resolución, ya que la energía que se le transfiere a la muestra durante ellapso de tiempo que está en contacto se puede modificar, pues es proporcional a la amplitud de la oscilacióny a la fuerza que se le imprime al brazo de palanca.
Otras imágenes se pueden obtener por medio del modo oscilante, como por ejemplo la imagen de fase. Labase de esta técnica es la disipación de la energía durante la oscilación. Si se analiza una cierta área en la cualhay cambios en la viscoelasticidad, tendremos un cambio en la frecuencia de oscilación de la punta (figura4). Dicha imagen se obtiene midiendo las diferencias de fase entre las oscilaciones del material piezoeléctricodel brazo de palanca y las oscilaciones detectadas [Acosta G. C., 2005]. Por medio de las imágenes de fase sepueden estudiar propiedades como dureza y viscoelasticidad de la muestra [Citado en Acosta G. M. C.,2005].
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Figura 4. Diferencias de fase entre las oscilaciones del material piezoeléctrico.El cambio en la frecuencia de oscilación de la punta, permite estudiar diferenciasde viscoelasticidad o adhesión en la superficie de la muestra [Giesssibl F., 2005].
Si no se toman estos parámetros en cuenta, las imágenes obtenidas, pueden presentar fallas y/o alteraciones,que influyen en la interpretación de las mismas.
Existe otro tipo de puntas para estudios de muestras biológicas por medio de AFM, dentro de las cualesdestacan las que han sido modificadas, insertándoles partículas moleculares en la parte más afilada de lapunta. Son útiles para caracterizar superficies, al estudiar las fuerzas moleculares presentes, funcionalizandoa la punta por medio de un autoensamblado de monocapas de silanos (figura 5) ó tioles, adheridoscovalentemente a la superficie de puntas para AFM comerciales (figura 6). A partir de esta modificación,pueden ser adjuntados grupos funcionales moléculares, como por ejemplo: aminas, biotina, streptavidina,anticuerpos (figura 7).
Figura 5. Diagrama de punta para AFM modificada con silanos.modificado de: www.novascan.com/products/chemical_afm_tips.php
Figura 6. Diagrama de punta para AFM modificada con tioles.modificado de: www.novascan.com/products/chemical_afm_tips.php
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Figura 7. Esquema de punta comercial para AFM modificada con grupos funcionales.modificado de: www.novascan.com/products/chemical_afm_tips.php
Así los puntos clave en donde ejercen acción este tipo de puntas es en medición de fuerzas intermoleculares,reconocimiento químico y sensores, interacciones hidrofílicas/hidrofóbicas, regímenes atractivos/repulsivos,fuerzas de adhesión, fuerzas de desprendimiento, mapeo de superficie.
También existe otro tipo de puntas, que son muy específicas. Tomando en cuenta que el AFM permiteobservar en condiciones fisiológicas ó biomiméticas a muestras biológicas celulares, es necesario así elelaborar puntas para AFM que tengan ún óptimo desarrollo al momento de realizar el barrido del materialbiológico. Estas puntas trabajan en modo contacto, y a diferencia de las otras puntas “normales”, como lasque se muestran en la tabla 3 (solo algunas, de un amplio catálogo), éstas puntas “híbridas” (hechas a base denitruro de silicio) muestran una constante de fuerza muy baja, comprendida entre 0.03 N/m – 0.26 N/m, asícomo una punta tipo piramidal con radio menor a 15 nm terminada con óxido, con una altura de 3.5 micras ylo más importante, el cantilever (brazo) donde descanza la punta está recubierto con una capa de 80 nm deespesor, compuesta de cromo-titanio-oro, para una excelente reflectividad del laser (figura 8).
Figura 8. Punta de AFM de diseño especial, para material biológico en condicionesfisiológicas modificado de: www.nanoworld.com/print/HN-01.html .
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Especificaciones de algunas puntas para AFM Cantilever Punta
Puntas FIB1-100 – Series ESP
Material: antimonio dopado de silicio, espesor de la palanca; nominal: 4 µm con rango de: 3.5 µm - 4.5 µm. geometría: anisotrópica, altura de la punta: 10 µm – 15 µm, ángulo frontal: 2° , ángulo de atrás: <->, Ángulo lateral: 2°,radio de la punta (nominal.): 15 nm, radio de la punta (max.): 20 nm, compensación de vibración de punta: 13°, prolongación de la punta(nominal): 1.5 µm.
https://www.veecoprobes.com/probe_detail.asp?ClassID=21
Puntas DDESP - Series ESP, cubierta de diamante dopado
Material: antimonio dopado de silicio, espesor de la palanca; nominal: 4 µm con rango de: 3.5 µm - 4.5 µm, geometría: anisotrópica, altura de la punta: 10 µm – 15 µm, ángulo frontal: 25°, ángulo de atrás: <->, ángulo lateral:22.5°, radio de la punta (nominal): 35 nm, radio de la punta (max.): 50nm.
https://www.veecoprobes.com/probe_detail.asp?ClassID=10
Puntas OSCM-PT – Series ESP, cubierta de platino
Material: silicio, espesor de la palanca; nominal: 2.7 µm, con rango de: 1.7µm – 3.7 µm, geometría: anisotrópica, altura de la punta: 12 µm – 16 µm,ángulo frontal: 0°, ángulo de atrás: <->, ángulo lateral: 35°, radio de la punta(nominal): 15 nm, radio de la punta (max.): 25 nm, lado central frontalrecubierto: 10 nm de Ti, capa externa: 20 nm de Pt.
https://www.veecoprobes.com/probe_detail.asp?ClassID=92
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Especificaciones de algunas puntas para AFM Cantilever Punta
Puntas BESP – Series ESP – Cubierta de Cobalto/Cromo
Material: antimonio dopado de silicio, espesor de la palanca; nominal: 3 µm con rango de: 2.5 µm – 3.5 µm, geometría: anisotrópica, altura de la punta: 10 µm – 15 µm, ángulo frontal: 25°, ángulo de atrás: <->, ángulo lateral:22.5°, radio de la punta (nominal): 25 nm, radio de la punta (max.): 65 nm,lado central frontal recubierto: 1- 10 nm de Cr, capa externa: 10 – 150 nm deC0/Cr, lado central trasero recubierto: 1- 10 nm de Cr, capa externa: 10 – 150nm de Co/Cr.
https://www.veecoprobes.com/probe_detail.asp?ClassID=2
Puntas TESPA-HAR – Series ESP – afiladas
Material: antimonio dopado de silicio, espesor de la palanca; nominal: 4 µm con rango de: 3.5 µm – 4.5 µm, geometría: anisotrópica, altura de la punta: 10 µm – 15 µm, ángulo frontal: 5°, ángulo de atrás: <->, ángulo lateral: 5°, radio de la punta (nominal): <10 nm, radio de la punta (max.): 15 nm, compensación de vibración de punta: 0°, prolongación de la punta(nominal.): 1.5 µm, con rango de 1.25 µm – 2 µm.
https://www.veecoprobes.com/probe_detail.asp?ClassID=108
Puntas TESP-SS – Series ESP - Super afiladas
Material: antimonio dopado de silicio, espesor de la palanca; nominal: 4 µm con rango de: 3.5 µm - 4.5 µm, geometría: anisotrópica, altura de la punta: 10µm – 15 µm, ángulo frontal: 25°, ángulo de atrás: <->, ángulo lateral: 22.5°, radio de la punta (nominal): 2 nm, radio de la punta (max.): 5 nm, compensación de vibración de punta: 0°, prolongación de la punta (nominal): 1.5 µm, con rango de 0.15 µm – 0.25 µm.
https://www.veecoprobes.com/probe_detail.asp?ClassID=111Tabla 3. Diferentes puntas usadas para realizar barridos por microscopía de fuerza atómica.
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1.3 NANOTUBOS DE CARBONO
Varios científicos coinciden en que es requerido un cantilever con una constante de fuerza baja (1- 5 pN/nm)y una frecuencia de resonancia alta (100 kHz) [Kramer, et. al., 2004]. Así como una punta ultrafina [Randal,et. al., 2002].
Así, estas afirmaciones conducen hacia los nanotubos de carbono. Para la década de los 70 Morinobu Endopublicaba imágenes de nanotubos de carbono de una y varias capas. Harold Kroto en 1985 descubreestructuras de solo carbono a las que denominó buckmisterfulerenos [Terrones M.y Terrones H., 2004]. Pocodespués Sumio Iijima descubre estructuras de partículas poliédricas de grafito [Sumio Iijima, 1991].
Pero, ¿qué es un nanotubo de carbono?Es una forma tubular tridimensional, que es medible en escala nanométrica (1 x 10-9 metros). Su arreglomolecular es en hexámero, en cada punto de este, se encuentra un solo átomo de carbono que se une conotros tres átomos (cuando forma nanotubos), poseen propiedades eléctricas, mecánicas y químicas. Sudiámetro es variado, y los hay desde 1 nanómetro con una longitud de varias micras (figura 9).
Figura 9. Esquema e imagen de nanotubos por SEM. A) Se muestra un esquema de un nanotubo de carbono tipo comercialCARBOLEX-SWCN (USA) batch: clap B237. B) Imagen SEM de nanotubos de carbono tipo comercial CARBOLEX-SWCN
(USA) batch: clap B237 de longitud desde 2-5 micras y diámetro entre 1.2-1.4 nanómetros. http://www.sesres.com/nanotubes.asp#
Es posible construir un tubo de carbón con estructura híbrida sp2, al enrollar una hoja hexagonal de grafito(figura 10), lo cual dará un arreglo quiral y uno no quiral [Terrones, 2003]. La quiralidad se define por mediodel vector quiral Cn (Cn = ma1 + na2), el que determina el diámetro del tubo d. Este vector da la direccióndel enrollamiento de la hoja de grafito. Que es representado como un punto en la latitud (m, n); por default lacoordenada (0,0), así el diámetro de un tubo de carbon se expresa como:
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Donde a corresponde a la constante de latitud en la hoja de grafito. La distancia entre carbón y carbón es de1.42 angstroms para el tipo sp2 [Terrones, 2003]. Su estructura electrónica es conformada por 1S 2 2S 2 2P 2
[Qian et. al. 2002].
Figura 10. Esquema de una hoja de grafito a partir de la cual sepuede construir un nanotubo de carbono [Iijima e Ichihashi, 1993].
Cuando los átomos de carbón se combinan para formar grafito, ocurre la hibridación SP 2. En este proceso,ún orbital S y dos orbitales P se combinan para formar tres orbitales híbridos SP 2 (enlace) en un plano conun ángulo de 120 ° (figura 11). Este enlace se le conoce como sigma (σ); y es un enlace muy fuerte del tipocovalente, lo que le dá una gran estabilidad y solidez al nanotubo de carbón. El orbital P remanente, esperpendicular al plano de los enlaces S. Contribuye en la interacción intercapa; se le conoce como enlace pi(π) [Qian et. al. 2002].
Figura 11. Estructura básica de enlace de carbón en forma hexagonal de unalámina de grafito; átomos de carbón (círculos azules), enlaces Pi fuera delplano ó deslocalizados (línea punteada) y los enlaces sigma conectan losátomos de carbón entre sí en el plano (color rosa) [Qian et. al. 2002].
En los nanotubos no quirales (silla, zigzag), las disposiciones hexagonales en las partes extremas del tubo sonsiempre paralelas al eje del tubo. Esta distribución de los átomos, junto con un diámetro adecuado permiteque los electrones accedan libremete a los estados de conducción. Dependiendo del diámetro del tubo, losque están en forma de silla son conductores, y los otros son semiconductores.
En los nanotubos quirales, los hexágonos definen un cierto ángulo con respecto al eje del tubo. Estaorientación de los átomos dificulta el acceso de los electrones a los estados de conducción. En virtud del
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ángulo de torsión (quiralidad) pueden ser conductores o semiconductores (figura 12) [Terrones M. y TerronesH., 2004].
Figura 12. Esquema de nanotubos de carbono quiral y no quiral a partirde hoja de grafito. Modificado de: Bravo G. y Valenzuela J., 2004.
La obtención de nanotubos es a través de:I Técnica ARC; descarga de flujo calorimétrico acelerado(Accelerating Rate Calorimetry)II Técnica CVD; deposición química de vapor (Chemical Vapour Deposition)III Pirrólisis
I.- Los experimentos de ARC con carbón se llevan a cabo en un reactor donde fluye un gas inerte (He, Ar) apresión constante, se aplica un potencial de ~18 V en corriente directa ó corriente alterna entre 2 puntas degrafito -una de ellas es más pequeña que la otra- dentro del reactor, como las puntas están muy cerca seproduce una descarga de electrones que da como resultado un plasma. Una de las puntas se consume -la máschica- mientras en la otra (cátodo) se forma un depósito carbonáceo, se forman estructuras de carbónelemental en estado sólido y en forma sp2. Si es empleada una atmósfera total de helio, la síntesis denanotubos se dá en forma multicapa, si se emplea otro gas (Ar), la síntesis se da en unicapa.
II.- La técnica de CVD consiste en la condensación de partículas de carbono, producto de la reacción dehidrógeno y metano, que también funciona con C2H4 . De esta reacción, los átomos de carbono “libres” sevan acumulando en una superficie. Cabe mencionar que está técnica requiere de varios accesorios físicos yquímicos, como lo es una presión constante, energía en forma de calor, así como una atmósfera inerte (el gasmás utilizado es el argón).
III.- A través de la pirrólisis del benceno en la presencia de hidrógeno, introduciendo vapor de benceno ehidrógeno en un tubo de cerámica o cuarzo donde un pedazo de carbono actúa como sustrato aplicándoletemperaturas elevadas.
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1.4 UNIÓN NANOTUBOS-PUNTAS AFM
Algunas de las técnicas para adherir nanotubos de carbono en puntas de AFM son presentadas en la siguientetabla 4:
Autor MétodoHongjie D., et. al.1996
Usa acrílico adhesivo.
Hafner H., et. al.1999
Usa metales como catalíticos, depositados en la punta de AFM y luego aplica técnicaCVD usando etileno y Fe-Mo por 3 minutos con C2H4:H2:Ar (1:200:300) a 800 °C.
Akita S., et. al.1999
Nanotubo se fija en la punta AFM por deposición de carbono por flujo de electrones.
Cheung, et. al. 2000Aplana la superficie más externa de la punta AFM, usa electrodos de platino a 2.1 Vpor 1.5 min, para crear poros de 1 µm, luego deposita por método electroquímicoFeSO4 0.01 M/H2SO4 0.05 Ma 1.4 v y aplica CVD.
Hafner H., et. al.2001
Hace crecer nanotubos vía CVD en sustrato de silicón, luego usa adhesivo de pegadoUV (loctite 3105) una vez tomado el nanotubo con la punta de AFM se cura en UVpor 30 minutos.
Hall A., et. al. 2003Tendencia anisotrópica del nanotubo para alinearse debido a campo magnéticointroducido en punta AFM, metalizando la punta, luego poniéndola en contacto consuspensión de nanotubos, alternando el campo magnético.
Tang J., et. al. 2005 Dielectrofóresis, usa punta AFM-silicio como electrodo y un anillo metálico, como elotro electrodo.
Tabla 4. Unión de nanotubos a puntas para AFM.
1.5 PUNTA NORMAL PARA AFM Y COMPARACIÓN CON PUNTA AFM MAS NANOTUBO
Otra técnica adicional a las ya mostradas es la desarrollada por Ono T. et. al., 2002, donde somete a campoeléctrico a un nanotubo de carbono por medio de un filamento a alta temperatura, bajo deposición química devapor. En la figura se aprecia en forma esquemática una similitud en el proceso de hacer crecer el nanotuboen una punta de AFM por medio de CVD, (figura 13).
Figura 13. Diagrama esquemático del mecanismo de campo eléctricopara el crecimiento de nanotubo en punta de silicio [ Ono T. et. al., 2002].
De esa manera, Ono y su equipo [Ono T. et. al. 2002] experimentaron usando una punta normal en modotapping y otra con nanotubo. Hicieron un barrido de un chip hecho a base de carbono-silicio (SiC), susresultados se muestran en la figura 14.
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Figura 14. Imágenes obtenidas de patrones de puntos de chip SiC (a) adquiridacon nanotubo de carbono (b) adquirida con punta de silicio normal (tamaño de
imagén 1 µm2) [Ono T. et. al. 2002].
Las imágenes obtenidas al usar nanotubo de carbono en punta de silicio (figura 14 a) muestra una diferenciaen la resolución. Puede apreciarse una excelente definición al usar el nanotubo de carbono como punta paraAFM a diferencia de la figura 14 b donde se muestra que hay mucho espacio que no fué reconocido por unapunta normal sin nanotubo.
El problema básico de la punta normal sin nanotubo es que al realizar el barrido de una muestra, la punta sevé limitada al llegar a valles pronunciados, menores a su radio nominal, impidiendole esto, el penetrar amayor profundidad y así visualizar con exactitud el como está constituida una muestra, como se aprecia en lafigura 15.
Figura 15. La aparente amplitud puede ser influida por la sonda. La cual debe mostrar unaexcelente obtención de medidas. Lo cual no es así, debido al radio final de la punta y a las
diversas muestras a analizar.
Lo fundamental para obtener imágenes en modo no contacto es mantener fuerzas de Van der Waalssuficientes entre la punta y la muestra, para asegurar que la punta no está en contacto directo con la muestra.Esto es un reto importante para la punta con nanotubo de carbón, ya que su diámetro es muy pequeño, y porende las fuerzas de Van der Waals entre el nanotubo y la muestra también, al ser comparadas con la punta desilicio. Ambas fuerzas atrayentes en modo no contacto (tapping ú oscilante), así como fuerzas de repulsióndebido a la oscilación provoca una reducción en la amplitud, la fase debe ser examinada cuando se trabaja enun sistema de amplitud.
La figura 16 muestra como la distancia entre la punta y una reja de silicio como muestra decrece en laamplitud y la fase de una sonda común de AFM. En teoría dinámica de microscopía de fuerza, la fase delcantilever al inicio se mantiene alta. Al hacer contacto con la muestra esta fase, dá un salto y comienza así a
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bajar, entre tanto la punta comienza a realizar el barrido de la muestra. Así, la fase puede ser monitoreadapara asegurar que la punta opera en forma de atracción. La figura 12-a-b, muestra la amplitud y fase de unapunta de AFM con un nanotubo de carbón de 250 nm adherido a la punta. Se aprecia que la amplitud en estecaso no decrece abruptamente, pero se vá aplanando y aumenta un poco después de que ha hecho contactocon la muestra. Ofrece un comportamiento similar con la punta para AFM normal, pero ese pico de transiciónentre las regiones atractivas y repulsivas no es aparentemente amplia, haciendo más difícil garantizar que lapunta con nanotubo opera en modo de atracción.
En la figura 17 b, se aprecia que la imágen obtenida de una muestra realizada con el barrido de un nanotubopresenta un borde distorsionado. Parece ser que este artefacto proviene de la adhesión del nanotubo con unlado de la muestra, creando así un decremento en la amplitud, lo cual es interpretado como una topografíaelevada.
Figura 16. Gráfica que muestra la amplitud y fase comparada con la distancia entre punta-muestra para puntas normales de AFM(A) y con nanotubo (B) [Strus M. y Raman A., 2004].
Figura 17. Rastreo de una reja de silico de 100 nm con una punta para AFM normal (A) y una con una punta con nanotubo(B) [Strus M. y Raman A., 2004].
Las puntas con nanotubo de carbón tienen al menos 20 veces más de vida que las convencionales y ofrecenuna mejor resolución en todas las etapas. El desgaste de la muestra se minimiza con la punta con nanotubo de
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carbón, además de mostrar buena capacidad para rastrear en ambiente acuoso (hidrofobicidad del nanotubo)[citado en Larsen T. et. al., 2002].
En la figura 18, se muestra la comparación en resolución con un nanotubo (a) y con una punta normal (b) alusar esferas de cobalto (Co) sobre Silicio (111). Muestra también la habilidad del nanotubo para realizar elbarrido en zonas profundas (d) contrario al barrido de una punta normal (c).
Figura 18. Imágenes obtenidas de AFM de una monocapa de 10 nm deesferas de Co depositadas en Silicio (111). a) con nanotubo de carbón,b) punta normal. c) muestra la imagén de resolución dada por la puntanormal, d) con nanotubo, muestra una resolución hasta de 2 micras deprofundidad y de 1 micra de ancho del valle [Larsen T. et. al. 2002].
Al hacer un exámen de las características que se requieren, lo sofisticado de la técnica de puntas paramicroscopio de fuerza atómica. Además de los problemas, ó inconvenientes que se presentan en el AFM enrelación al uso de las puntas para AFM clásicas, al tener las imágenes, en comparación con lo deseable de laspuntas para AFM con nanotubos, se tienen varios inconvenientes, de los cuales son tratados en la tabla 5 quea continuación se detalla.
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Mejora requerida Problema Tecnología puntade Si actual
Tecnología depunta para AFMcon nanotubo
Comentariosadicionales
1. Análisiscuantitativo y unamejor precisión
Daño en la punta yen la muestra
Puntas de Simecánicamente sonfrágiles- el tamañode la punta y suforma cambiandurante elescaneado
Estructuras a basede carbón grafito,son química ymecánicamentemás resistentes
Las puntas connanotubos muestrangran resistenciamecánica, aúndespues de 10 h deescaneo
2. Una mejorresolución lateral
El radio de la puntade Si se ensanchacon el escanéo
Puntas de Si conradio menor a 5 nmson inestables
Punta con nanotubode varias paredesson estables y conradio < 5 nm
Muestra una buenaelasticidad depuntas connanotubos de paredmúltiple de radio <5 nm
3. Característica deimágen con altotrazo de la muestra(amplitud < 100nmy longitud > 1micra)
Puntas de Si conalto trazofabricadas porradiación iónicacuentan con undiámetro grande yson mecanicamenteinestables
Puntas grandesfabricadas por FIBno sirven paraalgunasaplicaciones
Su pequeño radio ylongitud permiteobtener una imágencon alto trazo en lasuperficie de lamuestra
Se han obtenidoimágenes demuestras de hasta70 nm de amplitudy >500 nm enprofundidad
4. Puntas establesen condicionesmecánicas yquímicas
Puntas de Simodificadasquímicamente noson estables y nocuentan con unadensidad única
Puntas de Sicubiertas con oropara sumodificaciónquímica
En uno de susextremos elnanotubo contienegrupos carboxílicospara hacermodificacionesquímicas
La elasticidad delnanotubo es ventajapara el escaneo encualquiera de losdiferentes modosdel AFM
Tabla 5. Inconvenientes asociados con la tecnología de punta para AFM para nanometrología [Citado en Nguyen V. et. al. 2005] .
Las puntas con nanotubos de carbón ofrecen al microscopio de fuerza atómica el realizar un barrido de unamuestra, sin destruirla y con una menor invasión.
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Figura 19. La gráfica muestra curvas de interacción en modo tapping-AFM de una punta con nanotubo.
En la gráfica de la figura 19 se aprecia la amplitud (curva a) y la deflección (curva b) de un nanotubo decarbón de pared única (single wall carbon nanotube-SWCN). Se nota una fluctuación en la amplitud vsdistancia de Z debido al contacto entre la punta y el substrato (muestra), puntas normales -sín nanotubos- notienen dicha fluctuación, muestran un línea recta que se aproxima a cero. Donde en dicho punto la defleccióncomienza a notarse.
En este caso, la deflección se mantiene sin cambio alguno a la vez que la punta con nanotubo está en contactocon la muestra. [Nguyen V. et. al., 2001].
1.6 ESTUDIOS EN BIOLOGÍA MOLECULAR A TRAVÉS DE PUNTA AFM/ NANOTUBO
La AFM ha sido aplicada al estudio estructural de células, como los glóbulos rojos o hematíes, para entendermejor su función en el transporte de oxígeno y bióxido de carbono. También se ha reportado la aplicación delAFM en la caracterización de las proteínas canal octaméricas que forman las uniones intercelulares (gapjunctions) en la membrana plasmática de ovocitos de Xenopus [citado en Díaz M. et. al. 2002].
Dentro de los estudios más avanzados en relación con la funcionalidad de los nanotubos de carbono enpuntas para AFM (figura 20) en estudios a nivel biología molecular, son llevados a cabo por Hafner entreotros [Hafner H. et. al., 2001], donde explica que este sistema de sonda (AFM/nanotubo) puede caracterizarsistemas biomoleculares complejos. Argumenta que estos nanotubos funcionalizados en puntas de AFM sonun buen conducto para estudiar la estructura tridimensional que tienen las biomoléculas.
Usando los nanotubos, se ha investigado acerca de la agregación protéica beta-amiloidea así como unremodelaje de la cromatina.
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Figura 20. Imagen TEM de un nanotubo unido a la punta de nitruro de silicio, obtenida deTang J. et. al. 2005.
En otro experimento Hafner [Hafner H., et. al., 2001], prueba la resolución que tiene un nanotubo alfuncionalizarlo en la punta de nitruro de silicio para AFM en una proteína involucrada en el plegamientoproteínico; sistema chaperona GroEL/GroES con diámetro aproximado de 8 nm, encontrando que al hacer elbarrido de la biomolécula con la punta AFM/nanotubo, se visualiza dos conformaciones estructurales: unaestructura tipo anillo con un diámetro de 11 nm, así como una estructura interna al anillo. La otra estructuraes en forma de domo con un diámetro de 11 nm. Hipotéticamente explica que estas dos conformaciones sonlos dos lados de los hepatámeros de GroES (figura 21).
Figura 21. Imagen obtenida a través de punta AFM/nanotubo de una molécula aislada de GroES.Muestra las dos conformaciones de dicha molécula; tipo domo y anillo, representando los ladosdel heptámero de GroES. B) imagén de alta resolución, obtenida por AFM, donde se muestra laestructura heptamérica en forma de anillo. C) es una estructura cristalina de GroES. escala 5 nm.D) Comparación de una curvatura de radio 5 nm de punta AFM con una molécula de GroES
(Cheung et. al., 2000).
Otro experimento, donde se usó los nanotubos de carbono, fue en la visualización de la DNA glicosilaza, lacual preserva la integridad de la información genética reconociendo las bases dañadas en el genoma ycatalizando su exclusión. Llevado a cabo por Liwei Chen [Chen L. et. al., 2002].
También se ha visualizado los haplotipos de heterocigotos individuales en loci críticos, con un riesgo apadecer cáncer, detectando sitios polimórficos así como fragmentos de DNA de 10 kb.
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El uso de nanotubos/punta AFM es ideal para muestras biológicas, ya que permite obtener una mayorresolución a nivel molecular, mejor que las puntas normales para AFM. Sin embargo la producción de puntasAFM/nanotubos, su mantenimiento, así como su manejo, es delicado y complejo.
JUSTIFICACIÓN
El desarrollo de la nanotecnología moderna demanda la necesidad de la visualización de superficies dediferentes materiales a escala molecular.
En el caso del AFM, este problema se concentra en el desarrolo de puntas más finas que permite laobservación en el ámbito molecular y nanométrico. El uso de nanotubos de carbono es una ideaprometedora a la fecha, con mucho potencial. Sin embargo, se realiza solo en algunos laboratorios y no enforma comercial. El desarrollo de nueva metodología accesible para este tipo de puntas es un gran reto parael campo de aplicación de la nanotecnología en biología molecular, nanomedicina, nanoelectrónica, entreotras.
OBJETIVO
Desarrollar una metodología y procedimiento para el uso de nanotubos como puntas en microscopía defuerza atómica para visualizar material biológico.
Desarrollar puntas para microscopío de fuerza atómica (AFM) empleando nanotubos de carbono.
OBJETIVOS PARTICULARES
1.- Revisar bibliografía y familiarizarse con metodologías existentes para el diseño de puntas con nanotubosde carbono.2.- Diseñar y trabajar experimentalmente en dirección del desarrollo de procedimientos sencillos paraadjuntar los nanotubos de carbono de origen comercial con puntas de AFM.3.- Optimizar y verificar la calidad de imágenes de AFM, en relación al uso de puntas de nanotubos decarbono.
METODOLOGÍA
Metodología 1:
Se procedió a realizar un experimento, en el cual la base principal para la producción de nanotubos de fué elcarbono, se propuso una fuente rica en dicho elemento que fuera de fácil obtención. Se optó por unamolécula simple como lo es la que constituye a la mantequilla comestible, que es rica en triacilglicéridos dedonde se derivan los ácidos butírico (butanoico), caproico (hexanoico), caprílico (octanoico), caprico(decanoico) y laúrico (dodecanoico), con formula C nH 3-CH2-CH2-COOH.
Hecho eso, se disolvió esta materia orgánica en tolueno, se metió al horno de microondas a diferentestemperaturas: 40 ° C, 100 ° C, 150 ° C, 200 ° C y 250 ° C por un periodo de 1 minuto (en el caso de T = 250° C, fueron 2 tiempos uno de 2 min. 30 s y 4 min.). De dichos experimentos solo los que fueron a T > 200 ° Cobtuvieron reacción y al parecer solo fue la volatilización de la materia disolvente (tolueno) y del oxígeno ehidrógeno procedente de la materia orgánica.
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Metodología 2:
Pegamos nanotubos de carbono CARBOLEX-SWCN (USA) batch: clap B237, directamente a la punta modocontacto, tipo NP-S Wafer # 113-129-20 para AFM, de manera mecánica con un pegamento resistente ybarato: Kola Loka, marca QuickTite Loctite (Henkel Mexicana).
Se puso una cantidad mínima de pegamento en la punta modo contacto, tipo NP-S Wafer # 113-129-20 paraAFM, por medio de un alambre tubular de tungsteno tratado electroquímicamente para hacer una punta muyfina en uno de los extremos de dicho alambre (diámetro 0.25 mm). Manualmente se colocó el pegamento conel alambre de tungsteno en la punta modo contacto, tipo NP-S Wafer # 113-129-20 para AFM, con la ayudade un microscopio óptico de aumento 2x, y de una cámara conectada a otro microscopio con aumento 400xcon salida a un monitor. Posteriormente se aplicó una cantidad mínima de nanotubos sobre el pegamento. Sedejo secar por 1 hora, y se quitó el exceso de impurezas al dejar caer gotas de alcohol mediante una pipetapasteur, una vez seca la punta modo contacto, tipo NP-S Wafer # 113-129-20 para AFM + nanotubo, sesometió a tratamiento por ultravioleta (UV) por 1 minuto, después se limpio otra vez con alcohol, todo esteproceso se esquematiza en la figura 22.
Figura 22. Metodología 2. A) muestra en modo esquematizado los pasos para la fijación de un nanotubosobre la punta de AFM, B) esquematiza la forma en que se quitan las impurezas o exceso de nanotubos.
Se colocó una pequeña cantidad de nanotubos, tipo CARBOLEX-SWCN batch: clap B237, en un tubo deensayo, al cual se le depositó 1 ml de agua destilada, posteriormente esta solución fué sometida al sonicadortipo BRANSON 2510, por 15 minutos. Una vez concluido el tiempo, se tomó una alícuota de 0.2 ml y fuédepositada en una placa de Au(111), se dejó reposar hasta que el agua se evaporara y se procedió a lavisualización por SEM.
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Metodología 3:
Otro método empleado, fué el hacer pasar una descarga eléctrica con un piezo encendedor –encendedor decocina- por la punta modo tapping, tipo TESP wafer #10558L093 para AFM. Este piezo fué adaptado a unabase de acrílico para su mejor manejo (figura 23). La idea es que al dar varias descargas eléctricas a la puntade AFM, los nanotubos tipo CARBOLEX-SWCN (USA) batch: clap B237, quedaran adheridos al área demenor superficie de la punta, de tal manera que solo un nanotubo (CARBOLEX-SWCN (USA) batch: clapB237) quedara de forma funcional y sirviera para realizar el rastreo de la superficie de una muestra biológica.
Figura 23. Metodología 3. Modo esquematizado de las partes fundamentales de la descarga eléctrica pormedio de un encendedor piezoeléctrico a una punta para AFM modo tapping tipo TESP wafer #10558L093.
A una punta para AFM modo tapping, tipo TESP wafer #10558L093, con nanotubos, tipo CARBOLEX-SWCN batch: clap B237, fué sometida a irradiación laser con Lumonics HY 1200 Nd:YAG en eldepartamento de física UAM-I (figura 24) por 1 pulso (7 ns) y una energía de 22 mjoules.
Figura 24. Aparato para irradiación lasser Lumonics HY 1200 Nd:YAG.
Con la finalidad de hacer crecer nanotubo en la punta para AFM, aprovechando la impureza de lacomposición de los nanotubos, tipo CARBOLEX-SWCN batch: clap B237, que es de 65-75% y que contiene
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metales (Fe) y material de carbón, esencial para la formación de nanotubos. Se usó el dispositivo antesdescrito (figura 24), pero ahora colocado a tierra (figura 25).
Figura 21. Método descarga eléctrica colocado a tierra.
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
Se abandonó la metodología 1, debido a que no es lo suficientemente eficaz, así como por cuestiones deseguridad.
Se tomaron imágenes reales del proceso descrito en la metodología 2, que se pueden apreciar en la figura 26,después se procedió a montar la punta de AFM modo contacto, tipo NP-S Wafer # 113-129-20 (fig. 1), con elnanotubo en la cabeza del microscopio de fuerza atómica para realizar la exploración de una muestrabiológica (células HeLa).
Realizamos un barrido con la punta “mejorada” (punta AFM + nanotubo funcional) sobre la superficie de unacélula HeLa, montada en una capa de Au (111), con tamaño de muestra de 21.5 micras. También se realizóotro barrido pero con una punta normal, ambos experimentos se llevaron a cabo en modo contacto.
La figura 27 muestra la resolución del barrido de AFM realizado a 21.5 micras donde se aprecia los detallesde la superficie de la célula HeLa y del sustrato de Au (111), esta imagen fue obtenida en modo contacto conpunta normal, sin nanotubo.
El estudio comparativo presentado en la figura 28 y 29, donde se muestra el barrido en el rango nanométricocon medidas de 550 nm x 550 nm, corresponde a la figura 28; esta imagen tomada con punta de AFM sinnanotubo en modo contacto muestra muy pocos detalles al nivel nanométrico, mientras que la figura 29, esuna imagen obtenida con la punta de AFM + nanotubo preparada en el proceso anterior, donde se aprecia amás detalle dicha superficie celular de HeLa, cabe destacar que las imágenes de las figuras 28 y 29 sontridimensionales, con la escala a la derecha de la imagen, las partes más altas corresponden a las áreas masclaras y las partes mas bajas en la muestra corresponden a un color mas oscuro.
Después de este experimento se propuso el uso de microscopía electrónica de barrido (SEM modelo ZEIZZDSM 940 A) para determinar sí efectivamente existía un (os) nanotubo(s) de carbono en punta modocontacto, tipo NP-S Wafer # 113-129-20, para AFM + nanotubos de carbono, CARBOLEX-SWCN (USA)batch: clap B237 .
Al momento de obtener la imagen vía SEM de la punta modo contacto, tipo NP-S Wafer # 113-129-20, paraAFM con supuesto(s) nanotubo(s), la punta fue rota debido a que no soportó el bombardeo del haz de
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electrones a 12 kv. Invalidando así el discernimiento de sí en realidad había o no nanotubo(s) de carbono enla punta modo contacto para AFM (como se puede apreciar en la figura 20, aunque vía TEM ó microscopíade transmición electrónica, SEM y TEM son microscopías muy parecidas).
También se llevó a cabo esta metodología en una punta modo tapping, tipo TESP wafer #10558L093 paraAFM, la cual fué sometida a SEM para confirmar que además del material antimonio silicio barnizado con elque esta hecha existía el material depositado (Kola Loka marca QuickTite Loctite Henkel Mexicana ynanotubos, tipo CARBOLEX-SWCN batch: clap B237) sobre esta punta. También fueron visualizados losnanotubos, tipo CARBOLEX-SWCN batch: clap B237 por SEM.
Así, se obtuvieron 6 imágenes vía SEM de este tipo de puntas, empleándose un voltaje de 5-30 Kv y 27-28µA (figura 30; A-D). Las imágenes de nanotubos, tipo CARBOLEX-SWCN batch: clap B237, sonapreciadas en la figura 26; E y F, donde se observa que la mayoría es carbón amorfo, es difícil la purificacióndel 100 % de nanotubos de carbono, debido a su tamaño y base elemental, que es el carbono.
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Figura 26. Preparación de puntas con nanotubos de carbono. A-C) punta de nitruro de silicio delgada pequeña modo contacto, tipo NP-S Wafer # 113-129-20. D – F) punta denitruro de silicio gruesa pequeña, modo contacto tipo NP-S Wafer # 113-129-20. A) muestra una gran cantidad de nanotubos sobre el cantiliver que soporta a la punta de AFM,B) tratamiento con alcohol, para quitar el exceso de nanotubos, C) tratamiento con UV por 1 min, se nota una punta mucho más limpia. D) se observa la gota del adhesivo en
demasía y con exceso de nanotubos, E) se observa que después del lavado con alcohol la punta se ve mucho mas definida, F) tratamiento con UV por 1 minuto, puedeapreciarse una punta mucho más limpia.
Punta AFM
Nanotubos
Gota KolaLoka
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Figura 27. Imagen de AFM de una célula HeLa sobre la superficie de Au (111), tomada en modo contacto sin nanotubo,con tamaño de muestra de 21.5 micras x 21.5 micras.
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Figura 28. Imagen tomada en modo contacto, sin nanotubo, de una célula HeLa sobre superficie de oro Au(111), zona de barrido: 550 nanómetros x 550 nanómetros.
Figura 29. Imagen tomada de una célula HeLa en modo contacto con nanotubo, zona de barrido de 576nm x 576 nm sobre superficie de oro Au (111).
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Figura 30. Imágenes por SEM. Muestra una punta del tipo Tapping (A- D),así como una mezcla de nanotubos con carbón amorfo (E y F). El voltaje(kv), longitud de campo (lc), el aumento (x) de cada imágen es para: A, B,D de; 5kv, lc=9µm, x10000,y C) 10kv, lc=9µm, x 10000, E) 30kv, lc=9µm,
x10000 F) 30kv, lc=4.5µm, x20000.
Después de este experimento, se procedió a visualizar una punta modo tapping, tipo TESP wafer#10558L093, por medio de SEM (dentro de la metodología 3), como se aprecia en la figura 31. En la figura31 A, se observa la punta modo tapping, tipo TESP wafer #10558L093, tratada con descarga eléctrica conpartículas de carbón adheridas a la superficie de la punta. En la figura 31 B, se puede observar partículas decarbón en la punta para AFM, también puede visualizarse en la figura 31 C, que dicha partícula de carbono esde aproximadamente 100 x 100 nanómetros, muy posiblemente en esa área se encuentren nanotubos. Esaenorme área de material de carbón, es producto de la pureza con la que vienen los nanotubos de carbono, tipoCARBOLEX-SWCN batch: clap B237, que está entre 65-70 %. Con este método se demuestra que es posibleadjuntar partículas a base de carbón por medio de descarga eléctrica.
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Figura 31. Imagen SEM de punta modo tapping tipo TESP wafer #10558L093 paraAFM tratada con descarga eléctrica por medio de un encendedor piezoeléctrico. A)
amplificado a 20000, B) amplificado a 50000, C)amplificado a 100000.
La punta que fué tratada con rayo lasser con Lumonics HY 1200 Nd:YAG (figura 24) la sometimos a SEMcomo se aprecia en la figura 28. Al comparar con la punta tipo TESP wafer #10558L093 modo tapping paraAFM en condición normal (figura 2 B) se aprecia un daño (figura 32), observándose una ruptura en la menorárea debido al tratamiento lasser y que es fundamental en el rastreo ó barido de muestras. Desechando así elempleo de este aparato en condiciones ambientales para el crecimiento de un nanotubo sobre la punta paraAFM.
Figura 32. Imagen SEM de punta tipo TESP wafer #10558L093 paraAFM tratada con pulso lassér. lc= 18 µm, x=5000, 8 kv.
A otra punta para AFM modo tapping tipo TESP wafer #10558L093 se le hizo pasar varias descargaseléctricas usando el dispositivo colocado a tierra (figura 25). Con el fin de que la energía emitida por el piezoencendedor tuviera un mejor efecto. Se obtuvo su imagen vía SEM (figura 33), se encontró que la puntamuestra una diferencia muy significante comparada con la imagen de la figura 2 B.
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Figura 33. Imagen SEM de punta para AFM modo tapping, tipo TESPwafer #10558L093, tratada con varias descargas eléctricas y colocada
a tierra. lc= 18 µm, x=5000, 8 kv.
Puede apreciarse en la figura 33 como la punta tipo TESP wafer #10558L093, modo tapping muestra muchasprotuberancias, pareciera estar muy sucia, pero este efecto es debido a la colocación del dispositivo a tierra,lo que es de importancia, ya que de esa manera la probabilidad de adjuntar nanotubos de carbono a la puntaes mucho mayor, debido a la gran cantidad de material diferente a la composición de la punta (antimoniosilicio barnizado). Se alcanza a notar (figura 33) nanomaterial de carbono que está en el intervalo de 150-300nanómetros de espesor y longitud de más de 2 micras.
Posterior a esto, se procedió a tomar imágenes por AFM en modo tapping, con la punta tipo TESP wafer#10558L093, modo tapping tratada por la metodología tres de material celular; en este caso se vizualizó unacélula granular de cerebelo de rata sobre superficie de oro Au(111), y con una punta tipo TESP wafer#10558L093, sin tratamiento. Las imágenes tomadas con la punta con nanotubo (figura 33), corresponden alas figuras 34 – 41; las tomadas con punta normal, corresponden a las figuras 42 - 50.
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Figura 34. Imágen de AFM de una célula granular de cerebelo de rata sobre superficie de oro, Au(111) tomada con punta, tipo tapping mode, con nanotubo, derivada de la metodología tres. superficie de barrido 35 µm x 35 µm.
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Figura 35. Imágen de AFM de una célula granular de cerebelo de rata sobre superficie de oro, Au (111) tomada con punta, tipo tapping mode, connanotubo, derivada de la metodología tres. Superficie de barrido 10 µm x 10 µm.
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Figura 36. Imágen de AFM tridimensional de una célula granular de cerebelo de rata sobre superficie de oro, Au (111) tomada con punta, tipotapping mode, con nanotubo, al emplear la metodología tres.
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Figura 37. Imágen de AFM sobre el análisis seccional de una célula granular de cerebelo de rata sobre superficie de oro, Au (111) tomada con punta, tipotapping mode, con nanotubo, obtenida con la metodología tres. superficie de barrido 10 µm x 10 µm.
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Figura 38. Imágen de AFM de una célula granular de cerebelo de rata sobre superficie de oro, Au (111) tomada con punta, tipo tapping mode,con nanotubo, obtenida de la metodología tres. Corresponde a una prolongación citoplasmática, superficie de barrido 4 µm x 4 µm.
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Figura 39. Imágen de AFM tridmensional de una célula granular de cerebelo de rata sobre superficie de oro, Au (111) tomada con punta, tipotapping mode, con nanotubo, obtenida de la metodología tres. Se observa estrucutras tipo “rosetas” (r).
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Figura 40. Imágen de AFM tridmensional de una célula granular de cerebelo de rata sobre superficie de oro, Au (111) tomada con punta, tipo tappingmode, con nanotubo, obtenida de la metodología tres.
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Figura 41. Imágen de AFM de una célula granular de cerebelo de rata sobre superficie de oro, Au (111) tomada con punta, tipo tapping mode, connanotubo, obtenida de la metodología tres, superficie de barrido 2.434 µm x 2.434 µm.
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Figura 42. Imágen de AFM de una célula granular de cerebelo de rata sobre superficie de oro, Au (111) tomada con punta, tipo tappingmode, se aprecia el soma celular y prolongaciones citoplasmáticas, superficie de barrido 35.08 µm x 35.08 µm.
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Figura 43. Imágen tridimensional de AFM de una célula granular de cerebelo de rata sobre superficie de oro, Au (111) tomada con punta, tipo tapping mode.
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Figura 44. Imágen de AFM de una célula granular de cerebelo de rata con grandes prolongaciones somáticas, sobre superficie de oro, Au (111) tomadacon punta, tipo tapping mode, con superficie de barrido de 30 µm x 30 µm.
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Figura 45. Imágen de AFM en modo altura de una célula granular de cerebelo de rata sobre superficie de oro, Au (111) tomada con punta, tipo tappingmode; superficie de barrido de 10.03 µm x 10.03 µm. Se nota el soma de la célula y algunas de sus prolongaciones.
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Figura 46. Imágen tridimensional de AFM de una célula granular de cerebelo de rata sobre superficie de oro, Au (111) tomada con punta, tipotapping mode, es observado en la mayoría el soma de la célula, junto a una prolongación citoplasmática.
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Figura 47. Imágen de AFM de una célula granular de cerebelo de rata sobre superficie de oro, Au (111) tomada con punta, tipo tapping mode, con superficiede barrido de 4 µm x 4 µm.
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Figura 48. Imágen tridimensional de AFM de una célula granular de cerebelo de rata sobre superficie de oro, Au (111) tomada con punta, tipo tapping mode.
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Figura 49. Imágen de AFM de una célula granular de cerebelo de rata sobre superficie de oro, Au (111) tomada con punta, tipo tappingmode, con superficie de barrido de 2.43 µm x 2.43 µm.
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Figura 50. Imágen tridimensional de AFM de una célula granular de cerebelo de rata sobre superficie de oro, Au (111) tomada con punta, tipo tapping mode, se observa unaconformación variada de la célula.
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La figura 34 es una imágen de altura por AFM, que fué tomada con la punta modo tapping, tipo TESP wafer#10558L093 con nanotubo, obtenida de la metodología tres. Se observa parte de una célula granular decerebelo de rata sobre sustrato de oro (111), la superficie de dicha célula, no muestra irregularidades en susuperficie, ya que hay muy pocas zonas de baja altura, así como de elevaciones muy pronunciadas, lo que seaprecia son prolongaciones celulares del soma ó cuerpo de la célula granular, debido a que en teoría lascélulas neuronales tienen un tamaño del cuerpo celular desde 5 hasta 135 micras, en la imagen, el largo deesa parte de la célula tiene aproximadamente 35 micras, y un ancho menor a 10 micras. A juzgar, laresolución es buena, porque se puede apreciar la diferencia entre el sustrato Au (111) y el material celular, enun área de 35 µm x 35µm.
En la imagen 35, obtenida por el mismo método que la imagén 34, se puede observar el mismo tipo dematerial celular, pero en una área de 10 µm x 10 µm, donde apreciamos que la resolución y definición delrelieve de la célula sobre la superficie de oro Au(111) es buena, y muestra moléculas menores a unmicrómetro. En su imágen tridimensional (figura 36), es apreciado que el dominio de z (el eje que dá elaspecto tridimensional) tiene 60 nm/div, lo que significa que el mayor volúmen de esta célula es de 6 micras,que posiblemente corresponda a una zona del cuerpo celular que conecta a sus prolongaciones. Para saberque tanta diferencia hay en el relieve de la célula, a partir de la imagen anterior, es presentado un análisis desección, mostrado en la figura 37, en la línea de trazo de dicho análisis seccional, la zona más alta es ubicadapor los indicadores de color rojo, el cual ofrece una cifra menor a los 8 nm, así como la zona de más bajaaltura, que podría estar entre -2 nm a -4 nm de profundidad, otro dato que muestra dicha imágen (figura 37)es jústamente la distancia vertical y horizontal, ó longitud, que es de 7.587 nm y 1.484 micrasrespectivamente. Con estos datos puedo establecer que se tiene una buena resolución, ya que Z está ennanómetros.
La figura 38, nos ofrece una resolución a 4.004 micras y un valor en Z de hasta 7 nm, la parte visualizadacoresponde a prolongaciones citoplasmáticas de la célula neuronal, se alcanza a apreciar "rosetas", las cualespodrían ser proteínas de membrana o algún otro tipo de material celular, exceptuando a la composición basalde la membrana (lípidos), estas "rosetas" tienen un área menor de la media micra, también se puede apreciarotras áreas, en las que predomina una forma cuasioval, donde descanzan dichas "rosetas" que bien puedesuperar a las 2 micras longitud, en su imágen tridimensional, ofrecida en la figura 39, nos muestra que para elvalor de Z por cada división alcanza un valor de 39.337 nm, en está imágen tomada en ángulo se puedeapreciar con mayor nitidéz el contorno y la definición de dichas "rosetas".
Al hacer un acercamiento mayor sobre la superficie de la célula neuronal, aún así la punta, tipo tappingmode, con nanotubo, derivada de la metodología tres, tiene una buena resolución, como se aprecia en lafigura 40, donde tenemos una imágen tridimensional, notando valles y crestas del material celular con granresolución, podemos apreciar "granos" y/o cavidades que pudieran ser vesículas ó canales iónicos, ya queaproximadamente tienen una longitud menor a los 0.025 micras (25 nm). En la figura posterior (41) muestrala imágen anterior, pero en modo de altura, observándose que se mantiene una altura constante que fluctúa delos 0.0 nm - 3.3. nm, de igual forma, es apreciado material celular mucho menor a la micra.
Las figuras posteriores fueron tomadas en modo tapping mode, con punta normal, comenzando con la figura42, que muestra una superficie de barrido de 35.08 µm x 35.08 µm (su imágen tridmensional la figura 43 noofrece gran diferiencia, ya que no se aprecia a profundidad el relieve que tiene la célula), el valor más alto endicha imágen, corresponde a 86.8 nm, y que justamente, es al parecer el soma celular, ya que las otrasprolongaciones toman un valor desde 0 nm - < 80 nm y que a lo mucho alcanzan un valor de Z de 60 nm. Alhacer una comparación con las imágenes arrojadas del barrido de material celular (en este caso célulasneuronales) con nanotubo y sín nanotubo, se tiene que: aunque no son las mismas zonas de barrido, existeuna marcada diferencia entre la figura 34 y la 42, donde ambas son tomadas a la misma velocidad que es de
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1.001 Hz y en una zona de barrido de 35 micras x 35 micras, ya que en una figura (42), no es apreciado adetalle como en la 34.
La figura 44, muestra la célula granular de cerebelo de rata sobre superficie de oro, Au(111) tomada conpunta, tipo tapping mode, sin nanotubo, con superficie de barrido 30 µm x 30 µm, en modo altura, se apreciauna mayor zona de barrido, mostrándonos parte del soma celular, así como sus prolongaciones celulares, quetienen más de 25 micras de longitud, como se puede observar, no se tiene una resolución muy óptima, ya queno apreciamos algo similar como en la figura 34, que corresponde a la imágen tomada con punta tappingmode, con nanotubo, derivada de la metodología tres.
En la figura 45 tenemos una superficie de barrido de 10 µm x 10 µm, se aprecia en gran parte el soma celular,se tiene muy pocas zonas de baja altura, la imágen, es uniforme en cuanto a relieve (no hay grandes alturas)solo algunas zonas cuentan con más de 4 micras de altura, en su imágen tridimensional, figura 46,observamos parte del sustrato de Au (111) así como justamente el cuerpo celular citoplasmático de la célulagranular, vemos que las partes más cercanas al soma son zonas más irregulares, contrastando con laprolongación celular que, es de menor volúmen. Comparando estas dos figuras anteriores con la figura 35 ycon la 36, observamos que sí hay una diferencia, ya que en las imágenes tomadas con el nanotubo (figuras 35y 36) sí apreciamos a finura, los rasgos del relieve del soma y de las prolongaciones celulares, estosresultados pueden ser debido a que efectivamente se logró unir un nanotubo a la punta de AFM.
La siguiente figura (47), es una imágen tomada en una zona de barrido de 4 micras x 4 micras, es una zonabastante irregular que no se puede discernir a que zona corresponde el área; si al soma ó a una prolongaciónsomática. en su imágen tridimensional ofrecida en la figura 48 podemos apreciar mucho mejor que esa zonacorresponde a la parte final del soma celular y el comienzo de la prolongación celular, porque "hacia atrás"de la imágen la superficie de la célula es bastante irregular, se tienen partes muy bajas y a la vez altas,mientras que en la zona "frontal" mantiene un nivel semiregular. La comparación de estas dos anterioresfiguras, con las obtenidas con la punta de AFM mejorada (38 y 39), distan mucho de ser parecidas, ya que lasobtenidas con el nanotubo ofrecen una mejor resolución porque son menos confusas, es decir ofrece unainformación más detallada de la superficie celular, a diferencia de la figura 48.
Al continuar con el barrido con la punta normal de AFM hasta una zona de 2.43 micras x 2.43 micras, susimágenes ofrecidas en las figuras 49 y 50 no muestran un mayor cambio comparadas con las dos anteriores(47 y 48), pero las imágenes tomadas con la punta de AFM mejorada presentadas en las figuras 40 y 41, siofrecen una resolución más detallada de la superficie de esa zona. Por lo que la metodología tres, usada enéste trabajo, si tiene efecto en la obtención de imágenes por AFM.
CONCLUSIÓN
Este estudio comparativo demuestra el valor del uso de puntas de AFM con nanotubos de carbono paramuestras biológicas, siendo así una gran ventaja en término de obtener una mejor resolución.
El objetivo principal de este estudio fue revisar el uso de puntas de AFM con nanotubos, después de unarevisión detallada, se decidió por experimentar la obtención de estas por 3 métodos:
1. Formación y colocación de nanotubos de carbono por medio de un horno de microondas.2. Colocación de nanotubos de carbono por medio de metodología manual por medio de un pegamento
(Kola Loka).3. Aplicación de descarga eléctrica para colocación de nanotubos de carbono en puntas para AFM.
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Los resultados demuestran que es más factible la tercera opción, utilizando este método, se prepararon variaspuntas de origen comercial, con nanotubos también de origen comercial. Cabe mencionar que las puntas queson adecuadas para realizar muestreo sobre cualquier superficie a investigar en AFM, son las usadas en modotapping, debido a que éstas pueden ser visualizadas por SEM, para confirmar que la punta modo tappingcontiene en su parte más afilada un conglomerado de nanotubos. De dicho grupo, solo uno es el adecuadopara realizar el reconocimiento de la superficie de la muestra estudiada. También se puede usar las puntasmodo contacto para la adhesión de nanotubos de carbono, solo que al someter estas puntas a SEM no esposible visualizarlas, debido a que son más rígidas. Al ser sometidas a SEM a un kilovoltaje mayor de 7 kv ya una distancia de trabajo dada (menor a 3 mm) éstas puntas oscilan fuera de su rango y por lo tanto serompen. Esto impide comprobar que efectivamente el nanotubo funcional esté presente.
El usar la punta mejorada (punta AFM + nanotubo) para obtener imágenes del células HeLa, y de células decerebelo de rata, muestran una gran ventaja en términos de resolución, sin embargo con dificultad esverificada la posición del nanotubo de carbono en la punta de AFM, que es posiblemente debido al equipo demicroscopía electrónica.
Estos resultados son de gran aporte en el campo de la nanotecnología, porque este tipo de puntas, hasta ahorasolo son producidas en pocos laboratorios del mundo.
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