prŮtokovÁ cytometrie v botanice 2) měření velikosti genomu rostlin petr koutecký, 201 2

PRŮTOKOVÁ CYTOMETRIE V BOTANICE

2) Měření velikosti genomu rostlin

Petr Koutecký, 2012

Vytvořeno v rámci projektu Molekularizace biologických

oborů PřF JU

2 / 38

Velikost genomu

► různé definice, třeba pečlivě rozlišovat:► holoploidní velikost genomu► 1C hodnota – obsah DNA v 1 buňce, která má jeden

„chromosome complement“ (sada chromozómů, která při pohlavním rozmnožování jde od jednoho rodiče) = má n chromosomů» u mechorostů (a někt. řas) dominatní fáze, gametofyt» u cévnatých kytek (a spousty živočichů) pouze gamety

► 2C hodnota – u cévnatých kytek (aj. diplofazických organismů) obsah DNA v jedné somatické buňce, která právě neprochází buněčným dělením, tj. má 2n chromosomů» právě toto se většinou rozumí pod pojmem velikost genomu

► analogicky 3C (např. endosperm), 4C, 8C,…

3 / 38

Velikost genomu

► holoploidní velikost genomu = bez ohledu na skutečný ploidní stupeň

► monoploidní velikost genomu – přepočet podle ploidie► 1Cx hodnota – obsah DNA jedné chromozómové sádky► haploid: 1Cx = 1C (n chromosomů; n = x)► diploid

» u haplofazického organismu (např. mech)1Cx = ½ 1C (n chromosomů; n = 2x)

» u diplofazického organismu (např. cévnatá kytka)1Cx = 1C, resp. ½ 2C (2n chromosomů; 2n = 2x)

► tetraploid » u diplofazického organismu (např. cévnatá kytka)

1Cx = ½ 1C, resp. ¼ 2C (2n chromosomů; 2n = 4x)

4 / 38

Velikost genomu

► jednotky:» pg [pikogram] DNA (= jednotka hmotnosti)

» Mbp nebo Gbp (= počet bazí)

» 1 pg ~ 978 Mbp (1Mbp = 106 bp)

» 1 pg ~ 0.978 Gbp (1Gbp = 109 bp)

» 1 Gbp ~ 1.022 pg (= 1 / 0.978)

5 / 38

Fáze buněčného cyklu

► před dělením se replikuje DNA = velikost genomu buňky se v průběhu buněčného cyklu mění

► G1-, S-, G2, M-fáze

► Jemnější dělení ještě na základě obsahu RNA» proto píšeme G1/G0 fáze

(obsahem DNA se neliší)

► Neplést s C-hodnotami:» např. u diploida cykluje buňka

mezi 2C (G1-fáze) a 4C (G2-fáze)

» u tetraploida 4C (G1-fáze) a 8C (G2-fáze)

» neexistuje G4, G8,… -fáze ! Shapiro 2003

6 / 38

Velikost genomu + buněčný cyklus

Jak to všechno spolu souvisí

Odontites vernus s.l.2 ploidie

» diploid» tetraploid

malá míra endopolyploidie

Silná endopolyploideGymnocalycium (kaktus)

2C (2Cx)

4C (4Cx)

standard

8C (8Cx)

G1 – 2C-buňky

G2 – 2C-buňkyneboG1 – 4C-buňky

G2 – 4C-buňky

standard

2C (4Cx) G1

4C (8Cx) G2standard

2C

4C16C

8C

32C

64C

log scale

7 / 38

Standardy & standardizace

► cytometr nemá absolutní jednotky

► měříme proto vždy relativně – porovnání vzorku s už dříve stanoveným standardem» chemické metody (kdysi)

• izolace DNA z určitého kusu tkáně (známý počet buněk), kvantifikace, obsah na buňku

» FCM, FD apod.• ty použily nějaký jiný standard

» sekvenování genomů

► uvědomit si, co měříme! rostlinné standardy 2C, vzorek různě (např. mechy 1C, cévnaté kytky 2C)» měření 1C × 2C nevadí, jen to správně přepočítat a uvádět

8 / 38


Tři typy standardizace

► externí – cytometr seřízen tak, aby standard byl v určité pozici, do vzorků se již nepřidává» poměr vzorek / standard počítán proti původní pozici standardu

» předpoklad, že není náhodný posun mezi vzorky apod. (standard by vždy byl na „svém“ místě)

» zanedbává vliv sekundárních metabolitů

» v praxi použitelné pouze na odhad ploidií, nikdy na přesná měření velikosti genomu

» největší zdroj chyb u starších prací (vnitrodruhová „variabilita“ velikost genomu apod.)

9 / 38



► interní – standard přidáván ke vzorku, zpracováván a měřen spolu s ním» ideální (jediný možný) postup pro přesné měření velikosti

genomu

» není ovlivněna náhodným posunem přístroje

» malé (žádné?) ovlivnění sekundárními metabolity – všechna jádra (standard i vzorek) jsou ve stejném prostředí a tedy ovlivněna stejně

► endogenní – zvláštní situace, kdy část jader slouží jako interní standard» studie endopolyplodie – 2C pík × ostatní

» analýzy semen – embryo × endosperm

10 / 38



► pseudointerní – standard izolován zvlášť, přidán ke vzorku až před měřením a měřen spolu s ním» není vliv náhodného posunu přístroje

» neodstraňuje vliv sekundárních metabolitů

» pro přesná měření nepoužitelné

» pozor! použití některých obvyklých fixovaných standardů je pseudointerní standardizace:

• CRBC (chicken red blood cells) – fixované kuřecí červené krvinky,trout erythrocytes – fixované červené krvinky pstruha, apod.

• může být problém i s různou dobou a podmínkami skladování (dvě různé sady CRBC nemusí dát stejné výsledky…)

11 / 38


Požadavky na standard► biologický materiál, podobný vzorku

» rostlinný standard pro rostliny, hmyzí pro hmyz,…

» podobný typ tkáně a metabolický stav• podobný stav chromatinu (vliv na vazbu interkalačních barviv?)• bez (většího) obsahu sekundárních metabolitů

► známý obsah DNA, ověřený více laboratořemi, atd.

► přiměřeně blízká velikost genomu standardu a vzorku» velké rozpětí velikostí genomu, neexistuje univerzální standard

» ne méně než ~20% (jinak překryv píků, nepřesný odečet)

» ne více než 4-násobek (nelinearita měření)

► (dostupnost standardu)

12 / 38

Standardy & standardizace► v naší laboratoři používaná sada standardů

laboratoř molekulární cytogenetiky a cytometrie, ÚEB, Olomouc:» Raphanus sativus ‘Saxa‘ 2C = 1.11 pg» Lycopersicon esculentum ‘Stupické polní ranné‘

2C = 1.96 pg» Glycine max ‘Polanka‘ 2C = 2.50 pg» Zea mays ‘CE-777‘ 2C = 5.43 pg» Pisum sativum ‘Ctirad‘ 2C = 9.09 pg» Secale cereale ‘Daňkovské‘ 2C = 16.19 pg» Vicia faba ‘Inovec‘ 2C = 26.90 pg» Allium cepa ‘Alice‘ 2C = 34.89 pg

» Bellis perennis 2C = 3.38 pg (Schönswetter 2007) 2C = 3.60 pg (oproti Pisum sativum)

2C = 3.77 pg (oproti Glycine max)

13 / 38


► hodnoty jsou kalibrované oproti člověku, 2C = 7.00 pg (Tiersch et al. 1989, Cytometry A, 10: 706-710)

► problémy» hodnota pravděpodobně nadsazená o 5-10%

» není shoda; rozmezí 6.0-7.0 pg, nejčastěji 6.2-6.4 pg

» zatím není kompletní sekvence pro srovnání (repetitivní úseky)

» viz Doležel & Greilhuber 2010, Cytometry A, 77: 635-642

► alternativa» Oryza sativa ‘Nipponbare‘; téměř osekvenovaný genom

(~95%) → snad celkem přesné (Veselý et al. 2012, Ann. Bot. 109: 65-75; Šmarda et al. 2012, New Phytol. 193: 513-521)

» hodnoty o cca 10% nižší než obvyklé

» nevýhody: malý genom (2C = 0.777 Gbp = 0.79 pg), zatím není v FCM obecně akceptováno, sekvence není kompletní

14 / 38


► problémy 2» tabelované hodnoty rostlinných standardů na sebe přesně

nesedí

► závěr:

uvádět kromě jména standardu i jeho velikost genomu použitou při výpočtu» možnost přepočítat výsledky v budoucnu

» nutná informace pro interpretaci rozdílů mezi studiemi apod.

» pokud možno používat některý ze „zavedených“ standardů

15 / 38

Příprava vzorku (trocha alchymie)

Výběr tkání

► lze analyzovat prakticky cokoliv

► pokud možno bez sekundárních metabolitů» nezbarvené struktury (bez antokyanů)

» ne hodně mladé

► listy» nejčastější, nejsnáze dostupné

» někdy problém se sek. metabolity (včetně slizů apod.)• méně v řapících než v čepeli

» u mladých listů někdy výrazný podíl G2-fáze

» v pletivu cévních svazků někdy endopolyploidie

16 / 38


Výběr tkání► pokožka stonku

» podobný charakter jako listy

» relativně málo buněk → víc materiálu

» dobrá alternativa u hnijících, vadnoucích,… vzorků

► koruny» obvykle méně sek. metabolitů (ale ne vždy)

» obvykle méně problémů s endopolyploidií

» málo buněk, hůř se shání, míň vydrží,…

► kořeny» relativně vydrží

» spíš více sek. metabolitů, horší kvalita analýz, někdy výrazný podíl 4C buněk

17 / 38


Výběr tkání► semena

» vydrží dlouho, lze přivést i z odlehlých lokalit

» prakticky bez inhibitorů (sek. metabolitů)

» většinou o něco horší kvalita analýz (CV)

» jiné zacházení než s vegetativními tkáněmi• jiné doby barvení, někdy nutno použít speciální pufr,…• někde omezení malými rozměry semene

» většinou mírně (~ procenta) jiné výsledky než z listů, nelze přímo srovnávat

• jiná struktura chromatinu• jiné chemické prostředí (méně nukleáz, méně inhibitorů,…?)

» jiný jedinec než mateřská kytka, třeba analyzovat víc semen• hybridi, neredukované gamety,…

18 / 38


Složení izolačních pufrů

► látky stabilizující pH (Tris, MOPS,HEPES) – většinou pH > 7

► stabilizace chromatinu (Mg2+ nebo spermine)

► chelatační látky (EDTA, citrát sodný) – vazba kationtů – kofaktorů nukleáz (Mn2+, Mg2+) (ale viz předchozí bod)

► soli určující iontová síla roztoku (NaCl, KCl)

► detergenty (Tween20, Triton-X-100) – lepší uvolnění jader, snižují agregaci částic, oddělení zbytků buněk apod.

► antioxidanty (2-mercaptoethanol, DTE, PVP,…) – udržují strukturu proteinů v chromatinu, působí proti fenolickým látkám

19 / 38


Otto I + II pufry – zvláštní případ

► tzv. dvoustupňová metodika

► Otto I - fixace jader kys. citronovou (+ detergent)» stabilizace jader

» homogenizuje strukturu chromatinu (snižuje rozdíly dané různou jeho kondenzací)

► Otto II – stabilizace pH, citrát-fosfátový pufr (McIlvaine’s buffer)» při poměru 1:4 výsledné pH ~ 7.3

» přidáváme antioxidanty (2-mercaptoethanol)

20 / 38


Postup izolace jader

► mechanická homogenizace ve vhodném pufru» vzorek i standard spolu, množství třeba vyzkoušet

» sekání žiletkou, drcení mezi listy šmirgl papíru,…

» vhodný pufr třeba vyzkoušet, nejčastěji Otto I nebo LB01

► přefiltrování (tkanina 42 μm)

► stabilizace jader» dobu třeba experimentálně vyzkoušet (<1 min – desítky minut)

► přidání barviva, barvení» dobu třeba experimentálně vyzkoušet (větš. do několik min)

21 / 38


Fluorescenční barviva

► DAPI, AT-selektivní» citlivější, většinou nízká CV

» stanovení ploidie, prokázání drobných rozdílů ve velikosti

► propidium jodid (PI), interkalační,bez specifity k bázím» méně přesné (vyšší CV)

» vazba i na dsRNA – přidání RNasy

» stanovení velikosti genomu v absolutních jednotkách

► saturované koncentrace» 4 μg/ml pro DAPI; 50 μg/ml pro PI a RNasu

Doležel et al. 2007

22 / 38

Sekundární metabolity

► jeden z hlavních zdrojů problémů

► zejména polyfenoly (polyphenolics)» odvozené od fenolu, s mnoha volnými OH

skupinami, tvorba vodíkových můstků)

» více skupin, např. taniny (třísloviny),flavonoidy (kondenzované taniny; patří sem i antokyany),…

» pomocí vodíkových můstků se vážína proteiny i DNA

» v oxidované formě (chinony) se váží kovalentně na karboxylové skupiny

• mimo jiné proto se dávají do pufrů antioxidanty

ellagic acid (kys. ellagová)

tannic acid

23 / 38

Sekundární metabolity

► snižování fluorescence (inhibice)»zabraňují vazbě barviv na DNA

»možná „zhášení“(quenching) fluorescence ?

► zvyšování fluorescence (coatings of debris)

»vazba polyfenolů naproteiny jádra

»vazba („nabalování“) různých autofluores-cenčních molekul

»shluky malých molekul → pozadí

Loureiro et al. 2006,Ann. Bot 98: 515-527

24 / 38

Sekundární metabolity, degradace

► test na přítomnost inhibitorů»porovnání fluorescence standardu

samotného a ve směsi se vzorkem

► in silico oddělení „čistých“ jader (gating)»fluorescence × SSC

25 / 38

Stanovení velikosti genomu

► počítán poměr vzorek / standard» lineární škála, linearita měření

► obvyklé nároky na kvalitu:» interkalační barviva (PI, EtBr)

» interní standard

» jeden jedinec / vzorek

» nejméně 5000 částic u dobrých vzorků (ideálně píktvořen > 1000 částicemi)

» přesnost: CV ≤ 3.0%

» reproducibilita: 3 opakovanáměření jedince v různé dny,rozpětí ≤ 2%

» nejméně 3 jedinci / populace

Batrachium415,89

Bellis (2C = 3,60 pg)206,18

poměr2,017

Batrachium 2C = 2.017 * 3.60

Batrachium 2C = 7.26 pg

26 / 38

Stanovení velikosti genomu

Srovnatelnost výsledků(při dodržení standardní metodiky a kvalitních vzorcích)

► v rámci jedné laboratoře OK

► mezi laboratořemi často rozdíly:» různé interní standardy

» různé izolační pufry

» rozdíly mezi konkrétními přístroji (a to i stejného typu od stejného výrobce !)

► rozdíly v řádu jednotlivých % jsou celkem dobrá shoda

► někdy rozdíly i okolo 10%(Doležel et al. 1998, Ann. Bot. 82, suppl. A: 17-26)

27 / 38

Stanovení ploidie

► menší nároky než stanovení velikosti genomu» často stačí 3000 jader

» nejsou třeba opakovaná měření

► lze použít AT-selektivní (GC-selektivní) barviva» v rámci rodu / skupiny druhů poměr bází ± stabilní

► lze kombinovat více jedinců do 1 vzorku» třeba vyzkoušet na umělé „směsi“ – v kolika jedincích se

spolehlivě rozliší 1 jedinec jiné ploidie

» u dobrého materiálu i 10 ks / vzorek → až 1000 ks / den !

28 / 38

Stanovení ploidie

► ploidie odhadována nepřímoz velikosti genomu

► předpoklad, že velikostgenomu sleduje násobky počtu chromozómů» neplatí přesně (např.

genome downsizing)» druhy stejné ploidie se

mohou lišit» agmatoploidie apod.

► je třeba kalibrace přímým počítáním chromozómů► rozlišovat!

» ploidní úroveň – kalibrovaná chromozómovými počty» DNA ploidní úroveň – nekalibrovaná chromozómovými počty

29 / 38

Aneuploidie, homoploidní variabilita

► zvýšené nároky na přesnost – nízké CV → použití DAPI

► při stejné výšce píků (!) spolehlivě detekovatelný rozdíl ~dvojnásobku CV» u většiny materiálu ≥ 4%» odchylka o 1 chromozóm

u počtů do max. cca 25

► rozlišovat mezi rozdílem dvou vzorků a rozdílem průměrů více vzorků» rozdíl 2% mezi vzorky je pod chybou měření» rozdíl o 2% mezi průměry může být statisticky průkazný

a může reálně něco znamenat

► kalibrace přímým počítáním chromozómů

30 / 38

Fixované tkáně

Chemická fixace► obvykle poměrně složité, vyžadující laboratoř, často -20°C,…► použitelné výsledky i po několika týdnech / měsícíchKolář et al. 2012, Chromosome Res. 20: 303-315 [Otto I + glycerol]

Vysušené tkáně – herbáře, silikagel► většinou použitelné jen na stanovení ploidie (analýzy s DAPI)► horší kvalita analýz (ale ne vždy), snížení fluorescence až o 10%

» druhově a tkáňově specifické, nepredikovatelné» vyšší ploidie / větší genomy degradují v průměru rychleji» pokud možno analyzovat po jednom jedinci

► životnost vzorků výrazně prodlužuje zamražení (-20°C / -80°C)► asi 75% druhů nejméně po několika týdnech i za pokojové tepl.Suda & Trávníček 2006, Cytometry A, 69: 273-280 [herbáře]

Suda & Trávníček 2006, Current Protocols in Cytometry, Willey [silikagel]

31 / 38

Endopolyploidie, buněčný cyklus

► výskyt více velikostí genomu (píků) v rámci jedince» problémy při interpretaci (poloha 1. píku)

► větší počet buněk v G2 fázi» mladé rychle rostoucí orgány» někdy semena

► endopolyploidie» buňky se zreplikovanými chromozómy

bez dělení buňly» specifická pro někt. taxony (Brassicaceae,

Caryophyllales, polopar. Orobanchaceae)» v některých tkáních výraznější (dělohy,

řapíky, stonky, cévní svazky,…)

► artefakt – slepená jádra» většinou nevýznamné; odlišný peak width

32 / 38

Reprodukční systém

FCSS – flow cytometric seed screen

► dvojité oplození krytosemenných rostlin

► normálně: embryo (1C♀ + 1C♂) a endosperm (2C ♀ + 1C♂)

► sexuální heteroploidní hybridizace (jiný druh nebo neredukované gamety):» 2x♀ × 4x♂ → embryo 3x + endosperm 4x

» 4x♀ × 2x♂ → embryo 3x + endosperm 5x

► různé odchylky:» autonomní endosperm

» apomixie různého typu

33 / 38


Matzk et al. 2000

34 / 38


Matzk et al. 2000, Plant Journal 21: 97-108

► příprava vzorku (drcení / sekání semen), seed buffer, základní interpretace výsledků

► ve zralém semeni nejsou zachována žádná buněčná jádra pocházející od matky (+ totéž plucha / pluška u trav)

► endosperm zachován jen jako tzv. aleuronová vrstva

► obvykle dvě ploidie – embryo (a dělohy) + endosperm» analyzovány společně – embryo jako endogenní standard

» externí standardizace pro určení ploidie embrya

» vzácně endopolyploidie v endospermu (Arabidopsis, Zea,…)

► z ploidií embrya i endospermu dedukován způsob vzniku semene

35 / 38


Příklad – rod Sorbus (M. Lepší, P. Vít, et al.)» diploidi: sexualita

» polyploidi: pseudogamie,vzácně sexualita

sexualitared. gamety

apomixie: pseudogamie

pyl 2x (S.danubialis)endosperm 2*3x +

2x

pyl 3x (S.eximia)endosperm 2*3x +

3x

pyl 3x (S.eximia)endosperm 2*3x + 2*3x2× oplození centr. jádra

36 / 38

Pyl

► technické potíže» většinou nelze celá pylová zrna – autofluorescence, velikost,

nepropustnost pro barviva,…

» izolace jader obtížná – mnoho metodik, žádná univerzální

► interpretace» různý vývoj pylových zrn u různých skupin rostlin

» různá ploidie jader (nemusí být všechna 1C)

» nutno znát u konkrétního materiálu

► neredukované gamety» možná kontaminace vegetativní tkání prašníku

» odlišení slepených jader od skutečných neredukovaných gamet - kritické hlavně při vzácnosti nered. pylu (peak width)

» jádra v G2 fázi (neodlišitelné)

37 / 38

GC/AT poměr

► zastoupení bází v genomu» u kytek 47-70% AT

► porovnání fluorescence specifické (např. DAPI) ainterkalační (např. PI) barvy

► GC/AT poměr standardu» kompletně sekvenované

organismy (→ skoro nejsou)» pro Pisum sativum odhad

61.5% AT, 38.5% GC

► přesnost = hrubý odhad» 1% z 1Gbp genomu je 10 Mbp!

Barow & Meister 2000, Cytometry 47: 1-7Šmarda et al. 2008, Ann. Bot. 101: 421-433

Doležel et al. 2007

38 / 38

GC/AT poměr

► poměry fluorescencí = dye factor► binding length – pro DAPI = 4► z dye factor a binding length

počítáno zastoupení bází► nelze spočítat přesně, různé

zjednodušené rovnice neboiterativní postupy http://www.sci.muni.cz/botany/systemgr/download/Festuca/ATGCFlow.xls

► několik zdrojů chyb, ale FCMnení horší než chemické metody» nenáhodné rozložení bází, např. repetitivní sekvence» neznámá binding length» rozdíly ve vazbě barev mezi sekvencemi (AATT × ATAT)

(PI))F / (PI)(F

(DAPI))F / (DAPI)(F DF

stdsamp

stdsamp

1/Sstdsamp DF*p(AT)p(AT)

std

stdn

std p(AT)1p(AT)

p(AT)-1

n S

F = fluorescencen = binding lengthp(AT) = podíl AT

prŮtokovÁ cytometrie v botanice 2) měření velikosti genomu rostlin petr koutecký, 201 2

Documents