prueba de sensibilidad de antibióticos
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El conocimiento de la sensibilidad a los antibióticos, del microorganismo causante de una enfermedad, no es sólo importante para hacer la selección inicial del agente terapéutico correspondiente, sino que además en aquellos casos en los cuales el paciente presente intolerancia a determinado fármaco, permite seleccionar el más adecuado para ese paciente en particular.TRANSCRIPT
Unidad Profesional Interdisciplinaria de Biotecnología
Ingeniería de Productos Biológicos
Prueba de efectividad de antibióticos en diferentes microorganismos
Integrantes
HERNÁNDEZ VILLAR SANDRA VIRIDIANA
MORA GUTIERREZ EDGAR OMAR
MORENO RODRÍGUEZ ANTONIO CUAUHTÉMOC
VÁZQUEZ TREJO ANA ESPERANZA
GRUPO: 8FV2
OBJETIVOS
Objetivo General
Determinar la eficacia de diferentes antibióticos.
Objetivo Específico
Conocer los métodos que existen para determinar la eficacia terapéutica de un antibiótico.
Realizar la curva patrón de penicilina, estreptomicina y tetraciclina de acuerdo a la farmacopea.
INTRODUCCIÓN
El conocimiento de la sensibilidad a los antibióticos, del microorganismo causante de una enfermedad, no es sólo importante para hacer la selección inicial del agente terapéutico correspondiente, sino que además en aquellos casos en los cuales el paciente presente intolerancia a determinado fármaco, permite seleccionar el más adecuado para ese paciente en particular.
La Concentración Mínima Inhibitoria 90 (CIM90 o MIC90), para cada patógeno, entendiéndose como tal a “la menor concentración de antimicrobiano necesaria para impedir o inhibir el crecimiento bacteriano (in vitro) del 90% de las cepas estudiadas, en un ensayo de laboratorio utilizando la técnica de dilución”.
El estudio de la sensibilidad de los microorganismos a los antimicrobianos se realiza principalmente por técnicas de dilución o de difusión.
Las técnicas de dilución proporcionan resultados cuantitativos (concentración mínima inhibitoria, CMI) y las de difusión cualitativos (sensible, intermedio, resistente). Ambos métodos son comparables ya que hay una correlación directa entre el diámetro del halo de inhibición con un disco y la CMI. Las técnicas bioquímicas y genéticas permiten detectar el mecanismo o el gen de resistencia en minutos u horas.
El antibiograma es la prueba microbiológica que se realiza para determinar la susceptibilidad (sensibilidad o resistencia) de una bacteria a un grupo de antibióticos. Las técnicas de antibiograma son las utilizadas en el laboratorio de microbiología para estudiar la actividad de los antimicrobianos frente a los microorganismos responsables de las infecciones.
El estudio de la sensibilidad a antimicrobianos de las diferentes bacterias aisladas en muestras biológicas tiene 2 objetivos fundamentales: guiar al clínico en la elección del mejor tratamiento individual, y monitorizar la evolución de la resistencia bacteriana con objeto de revisar el espectro del antimicrobiano y poder actualizar los tratamientos
empíricos.
La tetraciclina es una molécula producida por el género de microorganismos Streptomyces. Las tetraciclinas son bacteriostáticas para muchas bacterias gram positivas y gram negativas. Una vez que la tetraciclina se encuentra en el interior de la célula bacteriana inhiben la síntesis de proteínas y se ligan a la subunidad 30S de los ribosomas, impiden el acceso del aminoacil-RNAt al sitio aceptor del complejo RNAm ribosomal, lo cual tiene como consecuencia la no adición de a.a. a la cadena peptídica en crecimiento.
DIAGRAMA DE BLOQUES
Preparación del estándar de tetraciclina
Preparación del inoculo y medio de cultivo
Pesar la cantidad necesaria de tetraciclina
Realizar 5 diluciones, como punto medio
Concentración 0.24 mg/mL
Método turbidimétrico
Esterilizar 11 cajas petri.
Esterilizar medio de cultivo 1 y 2, caldo
nutritivo.
Inocular 24 horas B.subtilis y
Sthaphylococcus aureus en caldo
nutritivo.
Agregar 0.1 mL de B. subtilis y S. aureus al
medio 1.
Agregar 20 mL medio #2 en cada caja petri
y dejar solidificar.
Agregar 10 mL de medio 1 a cada caja,
dejar solificar.
Colocar 2 cilindros en cada placa y agregar
50 mL de cada dilución.
Incubar a 37 °C por 24 horas, medir halo
de inhición .
Agregar 9 mL de medio de antibióticos en 7
tubos.
Agregar en 5 tubos 1 mL de cada una de las
diluciones de tetraciclina.
Agregar a los anteriores 5 tubos 0.01 ml de inoculo.
En 1 tubo solo agregar 1 mL de dilución de mayor
concetración tetraciclina (estandar)
En un tubo solo agregar 0.01 mL de
inoculo.
ANÁLISIS DE RESULTADOS
En el método de Kirby Bauer, el microorganismo es inoculado en la superficie de una placa de agar, sobre el cual se colocan discos impregnados con una concentración conocida del antibiótico. Las placas se incuban por 16-18 horas a 35- 37°C. Durante la incubación, el antibiótico difunde radialmente desde el disco a través del agar, por lo que su concentración va disminuyendo a medida que se aleja del disco. En un punto determinado, la concentración del antibiótico en el medio es incapaz de inhibir al germen en estudio. El diámetro del área de inhibición alrededor del disco puede ser convertido a las categorías de sensible, intermedio o resistente (S, I, o R) de acuerdo a tablas (Ver Anexo) publicadas por los organismos encargados del control de tales métodos, por ejemplo el Comité Nacional de Estandar de Laboratorios Clínicos de los Estados Unidos de Norteamérica (National Committee for Clinical Laboratories Standards), (Pedrique, Magaly, 2002).
En la práctica realizada se esperaba obtener la eficiencia terapéutica del antibiótico tetraciclina, esto sería posible midiendo el halo de inhibición a diferentes concentraciones; sin embargo esto no ocurrió debido a dos posibles factores. El primer factor se pudo deber a una alta concentración de tetraciclina, la cual impidió el crecimiento de Staphylococcus aureus y Bacillus subtilis. El segundo factor pudo ocurrir al momento de la inoculación, en donde posiblemente el medio #1 aún se encontraba bastante caliente y al momento de adicionar el inoculo este se quemo al no estar a una temperatura adecuada.
De acuerdo con la tabla 1 del anexo, Interpretación del Método de Kirby-Bauer, para una concentración de disco de 30 µg de tetraciclina, se esperaría observar un halo de inhibición de 14 mm de diámetro para cepas resistentes, de 15 a 18 mm para sensibilidad intermedia, y mayor a 19 mm para cepas sensibles.
De acuerdo con la tabla 2 del anexo, Controles del Método de Kirby-Bauer, el diámetro de inhibición en S. aureus debería ser de 19 a 28 mm.
Según la metodología empleada en la que se colocan cantidades medidas de sustancias a ensayar en placas con medio de cultivo #1 con un microorganismo adecuado. Las placas se incuban para permitir el desarrollo del microorganismo. Durante la incubación, el agente antimicrobiano difunde hacia la zona que lo rodea y establece un gradiente de concentración, alcanzándose la concentración inhibitoria mínima a cierta distancia, es decir, entre más lejana sea la difusión menos es la concentración inhibitoria por lo cual el microorganismo posee la capacidad de crecer, mientras que al estar más cercano del cilindro la concentración es mayor inhibiendo su crecimiento.
Medios
Los medios empleados para la preparación del inóculo microbiano y para la realización del ensayo están constituidos por los componentes que se indican a continuación. Generalmente en éste tipo de ensayos se admiten modificaciones menores de los componentes individuales o el empleo de medios deshidratados reconstituidos, siempre que los medios resultantes posean iguales o mejores propiedades para estimular el desarrollo microbiano y proporcionen una curva dosis-respuesta, similar.
Se deben disolver los componentes y agregar agua hasta obtener un litro. Se requiere que las soluciones se ajusten con hidróxido de sodio 1 N o con ácido clorhídrico 1 N de manera que luego de la esterilización se obtenga el pH especificado. En la práctica, no se ajustó el pH de los medios, por lo que conlleva otro error en el ensayo y otra posible causa de la ausencia de crecimiento de los microrganismos.
Seed Agar: Utilizado para ensayos con beta-lactámicos y otros antibióticos.
Peptona, Caseína, extracto de levadura y extracto de carne actúan como: Nutrientes y factores de crecimiento.
Dextrosa actúa como fuente de carbono.
Medio para antibióticos No. 1
Medio estándar utilizado para preparar capa los ensayos de la potencia antibiótica de preparaciones.
Peptona .................................................................................................................. 6,0 g
Digerido pancreático de caseína ........................................................................... 4,0 g
Extracto de levadura .............................................................................................. 3,0 g
Extracto de carne vacuna ...................................................................................... 1,59,
Dextrosa ................................................................................................................. 1,0 g
Agar ....................................................................................................................... 5,0 g
Agua c.s.p......................................................................................................... 1000 ml
pH después de la esterilización: ..................................................................... 6,6 ± 0,1.
Medio para antibióticos No. 2
Este medio es utilizado ampliamente para ensayos de diversos antibióticos. Es el medio estándar utilizado para preparar la base de la capa en el ensayo microbiológico de antibióticos. Se utiliza en ensayos microbiológicos de antibióticos tales como bacitracina, cloranfenicol y penicilina (CONDALAB).
Peptona .................................................................................................................. 6,0 g
Extracto de levadura .............................................................................................. 3,0 g
Extracto de carne vacuna ...................................................................................... 1,5 g
Agar...................................................................................................................... 15,0 g
Agua c.s.p. ........................................................................................................ 1000 ml
El método turbidimétrico se basa en la inhibición del crecimiento de un cultivo microbiano en una solución uniforme del antibiótico de un medio líquido que promueva su rápido crecimiento en ausencia del antibiótico. El método turbidimétrico se efectúa en un medio de cultivo líquido inoculado con un microorganismo de ensayo, al que se le agregan concentraciones crecientes del antibiótico. Luego del período de incubación se determina la turbidez producida por el desarrollo microbiano, la cual esta en función de la concentración del ántibiótico.
En la práctica se preparó una solución madre de tetraciclina de 1,000 µg/ml a partir de la cual se hicieron diluciones, hasta llegar a las que se ocuparon en el esayo, que son las
siguientes: 1 µg/ml, 0.500 µg/ml, 0.25 µg/ml, 0.125 µg/ml y 0.0625 µg/ml, sin embargo cabe mencionar que la slocucion madre resultó una solución saturada, puesto que una gran cantidad de tetraciclina no se pudo disolver a pesar de que se agi´to vigorosamente, se usó vortex e incluso sonificación, éste oncnveniente es fue un gran determinante de error para las subsecuentes disoluciones, además de que la tetraciclina daba una coloración amariillenta a las soluciones.
Si bien, el mpetodo tubidimpetrico es rápido, presenta las siguientes limitaciones (Cárdenas Maud, 2008), en nuestro caso la más evidente fue la solubilidad de la tetraciclina:
a) La sustancia a examinar y estándar deben solubilizarse.b) La sustancia a examinar no debe dar color.c) El medio de cultivo no debe de aumentar de coloración a causa de la sustancia
que se está examinando.d) La sustancia a examinar preferentemente debe ser estéril y no debe contener
nutrientes; debido a que promoverían un mayor crecimiento de los microorganismos en comparación del cultivo con la sustancia de referencia.
e) No aplica para microorganismos que formen aglomerados. La ejecución del proceso es engorroso y puede dar turbidez variable.
Medio para antibióticos No. 3
En el método de discos en placas, el Antibiotic Medium N°3 se utiliza para resuspender el inóculo en el ensayo de la potencia para la penicilina, eritromicina, neomicina, clortetraciclina y cloranfenicol. El método de dilución en serie se utiliza para el ensayo de la penicilina. Por último, este medio también puede ser utilizado en la determinación turbidimétrica de la potencia de la bacitracina, estreptomicina y terramicina (CONDALAB).
Un antibiótico es una sustancia química producida por un ser vivo o derivada sintéticamente de ella; que a bajas concentraciones mata por su acción bactericida o impide el crecimiento por su acción bacteriostática de ciertas clases de microorganismos sensibles. Todos los antibióticos poseen un modo de acción y un mecanismo de acción que le confiere sus propias características para que estos puedan actuar contra las bacterias.
En el caso de la tetraciclina ésta bloquea los pasos necesarios para la síntesis proteica, actuando sobre los ribosomas en las unidades 30S y 50S encargados de sintetizar proteínas a partir de la información genética en forma de ácido ribonucleico mensajero (ARNm) y en esta forma la vida de la bacteria queda afectada.
Las tetraciclinas ejercen un efecto bacteriostático, inhibiendo reversiblemente la síntesis proteica en células procariotas que contiene ribosomas 70S. Se fijan con gran
afinidad a la subunidad 30S y bloquean la unión del aminoacil-ARNt con el sitio aceptor (locus a) en el complejo formado por el ARNm y el ribosoma, esto impide el agregado de nuevos aminoácidos en la cadena peptídica en formación.
Para que las tetraciclinas lleguen al sitio de acción en los ribosomas deben llegar por transporte pasivo a través de la membrana plasmática. Actúan contra bacterias Gram positivas y Gram Negativas. Lo cual le confiere una alta efectividad y un amplio espectro como antibiótico; ya que aún a bajas concentraciones es inhibitorio.
Las tetraciclinas ingresan al microorganismo en parte de forma pasiva y en parte por un proceso dependiente de energía de transporte activo. Las células susceptibles concentran el fármaco intracelularmente.
Una vez dentro de la célula, las tetraciclinas inactivan irreversiblemente los ribosomas en la subunidad 30S del ribosoma.
Imagen 1. Esquema del mecanismo de acción de tetraciclina.
Clasificación de antimicrobianos:
a) Concentración dependiente: El efecto terapéutico se incrementa a medida que aumenta la concentración del antimicrobiano por sobre el CIM. Ej: Aminoglucósidos, Fluorquinolonas, Penicilinas.
b) Tiempo dependiente: El efecto terapéutico se ejerce cuando existen concentraciones ligeramente sobre el CIM pero persistentes en el tiempo.
a. Efecto menos persistente: Ej. Betalactámicos (Amoxicilina), Eritromicina, Florfenicol.
b. Efecto prolongado: Ej. Tetraciclinas.
CONCLUSIONES
En la práctica no se logro obtener la eficacia de la tetraciclina. La tetraciclina es dependiente del tiempo. Teóricamente logramos conocer que la tetraciclina tiene un alto efecto
terapéutico al contar con diferentes factores que favorecen su acción.
BIBLIOGRAFÍA
Mendoza Patiño, Nicandro, Departamento de Farmacología, Actualidades farmacológicas Tetraciclinas, Facultad de Medicina, UNAM 2008
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Microbiología Clínica, “control de microorganismos”, 2002-2003. Disponible en:http://www.unavarra.es/genmic/microclinica/tema08.pdf
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Maud Cárdenas Danitza, Tesis: Evaluación de un método de ensayo microbiológico para determinar la potencia antibiótica de tirosina, FACULTAD DE FARMACIA Y BIOQUÍMICA, UNIVERSIDAD NACIONAL MAYOR DE SAN MARCOS, Lima-Perú 2008
http://infoleg.mecon.gov.ar/infolegInternet/anexos/85000-89999/86181/ dto202-2003-84.htm
Laboratorios CONDALAB, Pruebas para susceptibilidad de bacterias a antibióticos (PSA). Disponible en: http://www.condalab.com/pdf/Antibiotic_Susceptability_Test_esp_new.pdf
ANEXO
