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PRRStradiagnosievaccinazione:qualelasequenzavincente?
MicheleDrigo
UniversitàdegliStudidiPadova
Dipar5mentodiMedicinaAnimale,ProduzionieSalute
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Non-structural proteins Structural proteins
1a1b
23
45
67
GP2 & 2b GP4 M
GP5GP3 N
Ivirus:PRRSV-1&PRRSV-2
• PRRSV-1:PaesiBassi,Lelystadvirus(Wensvoortetal.1991)
• PRRSV-2:USA,VR-2332(Collinsetal.1992)• EnvelopedssRNAvirus• Mininidoviridaefamiglia
– Betaminidovirusgenere
• Specie:betaminidovirussuid1(PRRSV-1)
• Species:betaminidovirussuid2(PRRSV-2)
(n=12)
(ca.80%delgenoma)
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Mininidoviridae(Arteriviridae)tassonomia
In2012 In2016
Qualeilprossimo?
Faabergetal.2012,FamilyArteriviridae. Kuhnetal.ArchVirol.161,2016
11simianarterivirusaltamentedivergen5indiversiprima5Africani;1nuovoarterivirusnelAfricanforestgiantpouchedrat,1nuovoarterivirusnelbrushtails(possum)comuneinNewZealand
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0.03
PRRSV-2
PRRSV-1
PRRSV-1 and PRRSV-2 sono due specie virali diverse che causano una malattia - PRRS
DendrogrammadaJuanAbrahante,UniversityofMinnesota.
>50%
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PerchèilsequenziamentoèuElenellostudiareilvirusdellaPRRS?
• IlgenomadiPRRSVèaltamentepredispostoamutare• La sequenza dell’acido nucleico (l’ordine dei nucleo5di) diogni s5pite virale è unica (quindi la sequenza è comeun’improntadigitale!)
• DiscriminaretralespeciediPRRSV(geno5pi)èfaciletramitePCR(ilorogenidifferisconodel40-50%!!)
• Madiscriminaretras5pi5richiedeilsequenziamento
1 aggctggtaacttac 3 tcacgctggtaacttac 4 caggctggtatctt 5 agagt---aacttac =
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DNAsequenziamentoeanalisi
EstrazioneRNA CorsadiPCRCampione
Sangue(manonsolo)
Amplifica5messinelSequenziatore
1 aggctggtaacttac 3 tcacgctggtaacttac 4 caggctggtatctt 5 agagt---aacttac vac1
vac2vac33
41
257
8910
111213
1714
1516
Ada>atodaM.P.Murtaugh
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Cos’èlafilogenesi?
L’obiegvo del la filogenesi ( ingenerale) è quello di cogliere lerelazionievolu5vetraspeciediverse!(coglierelerelazionitras.pi.viralinelnostrocaso!)
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• Laricostruzionediunalberofilogene5co(cioè lerelazioni)èuna PROCEDURA di STIMA in cui la storia evolu5va vienefahasullabasediINFORMAZIONIINCOMPLETE
• Cagvaqualitàdellesequenze,oimpropriaselezionedelsetdireferenzapossonoportareaconclusionierrate
ATTENZIONE:moltospessolastoriaevoluEvadiPRRSVèricostruitasullabasedisequenzanucleoEdichediunafrazionemoltopiccoladelgenomaintero!![menodi1000nucleoEdi(ORF5+ORF7)su15000(interogenoma)]
Non-structural proteins Structural proteins
1a1b
23
45
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GP2 & 2b GP4 M
GP5GP3 N
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Phylogenetic analysis of ORF5 and ORF7 sequences ofporcine reproductive and respiratory syndrome virus (PRRSV)
from PRRS-positive Italian farms: A showcase for PRRSVepidemiology and its consequences on farm management§
Patrizia Pesente a,*, Valeria Rebonato b, Gianpietro Sandri c,Davide Giovanardi a, Luigi Sperati Ruffoni a, Sandra Torriani b
a Laboratorio Tre Valli, Corte Pellegrina, San Martino Buon Albergo, 37036 Verona, Italyb Dipartimento Scientifico e Tecnologico, Universita degli Studi di Verona, Strada Le Grazie 15, 37134 Verona, Italy
c Montorsi Francesco & Figli S.p.A., Magreta di Formigine, 41010 Modena, Italy
Received 28 June 2005; received in revised form 10 November 2005; accepted 15 November 2005
Abstract
We investigated the dynamics of porcine reproductive and respiratory syndrome virus (PRRSV) variability in a range ofswine PRRS-positive farms located in Northern Italy, to provide insights into the epidemiology and diffusion of the virus,particularly throughout the entire swine production chain. In this context, we also examined the effectiveness and the criticalpoints of a recently developed gilts acclimatization program in swine breeder farms. To achieve these aims, we designed newprimers and determined 64 complete open reading frame 5 (ORF5) sequences, representing Italian PRRSV field strains and theEuropean vaccine Porcilis strain (Intervet); in addition, the more conserved ORF7 of 11 PRRSV strains were sequenced. Thedomains’ prediction of their putative protein sequences was performed as well. Based on these sequences, phylogenetic treeswere inferred which revealed a high degree of variability among the PRRSV Italian strains. The outcomes of the phylogeneticanalysis showed that the most frequent source of infection in PRRS-positive farms (sow herds, nursery sites, fattening units) wasthe introduction of animals carrying a new variant and not the modification of already present variants; moreover, the integrationof data from phylogenetic analysis and from the clinical and serological status of the swine herds suggested that theacclimatization program could be a valid tool to stabilize the PRRS clinical picture in farms, only when applied in combinationwith rigorous bio-security routine management and avoid the incoming of new PRRSV variants.# 2005 Elsevier B.V. All rights reserved.
Keywords: PRRSV; ORF’s PCR; Epidemiology; Acclimatization strategies
www.elsevier.com/locate/vetmicVeterinary Microbiology 114 (2006) 214–224
§ GenBank accession no. of sequences reported in this paper are: AY730551, AY739958–AY740012, AY743931–AY743937, AY749417–
AY749428.
* Corresponding author. Tel.: +39 045 8794319; fax: +39 045 8794329.
E-mail address: [email protected] (P. Pesente).
0378-1135/$ – see front matter # 2005 Elsevier B.V. All rights reserved.
doi:10.1016/j.vetmic.2005.11.061
Filogenesi=strumentoepidemiologicoedimanagement (valutazionedellabiosicurezza)
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ORF5tree ORF7tree
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La5pizzazionegene5cadeiPRRSVèunostrumentomoltoimportantepertracciare
epidemiologicamente(raggruppare)ivirusdellaPRRS
ma…
ilnumerodisequenzedisponibiliinEuropaèlimitato
cosi…
iden5ficarelefon5diunos5pitediPRRSVèspessononpossibile!
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Alcuneesperienzeitalianealivelloglobaleelocale….
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DueCladesprincipalibendisEnE!
ORF7ORF5
CladeA
CladeBsubtypeII
subtypeI
Drigoetal,2014,JVirolMethods,(97sequenze)+
SequenzedaGenBank(Forsberg-2002;Pesente-2006;Stadejek-2008;Toplak-2012)
Inter-clade(12%)Intra-clade(8,3%/4,1%)
Inter-clade(15,3%)Intra-clade(12,4%/8,8%)
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CosacomportaunaampiavariabilitàgeneEca?
1) Differen5 dinamiche delle diverse popolazioni virali nel tempo e nellospazio
2) Possibiliripercussionisuperformancesdiagnos5che(PCR)-“mismatches”
3) Possibiliripercussionisulrapportovirus-ospite
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CosacomportanoDUEClade?
1) Differentedinamicadipopolazioneviralenel
tempoperorigine,trend,evoluzione
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2)PossibiliripercussionisuperformancesdiagnosEche(PCR)–“mismatches”
EndpointRT-PCRprimers
ProbesEU1/EU2
qRT-PCRprimers
CladeA
Drigoetal,2014,JVirolMethods
3/62(-)
5/62(-)
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EndpointRT-PCRprimers
ProbesEU1/EU2qRT-PCR
primers
NecessitàdiaggiornamentoprobesperlaCladeB(inrossolesequenzedicampionifalsamentenega5viallametodicaconprobe;inbluquellefalsamentenega5veadunKITcommercialesempreconProbe)
CladeB
Drigoetal,2014,JVirolMethods
22/31(-)
1/31(-)
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Allevamento dello stesso
proprietario
PRRSV-1
Aborto Italiane
Allevamento
PRRSV-2 Albero filogenetico ORF7
24gruppidiscrofehe(7kg), acclimatate conesposizione naturale,m o n i t o r a g g i olongitudinale e cross-sec5onal dello s5pitec i r c o l a n t e e s u adivers ificazione neltempo;Un episodio di PRRSreproduc5ve!
<1%in24mesi
StudioalivelloLOCALE…
>8%
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S5pi5diPRRSV-1possonoricombinareS5pi5diPRRSV-2possonoricombinare
LaricombinazionetraPRRSV-1ePRRSV-2
nonèmaistataevidenziata
Laricombinazionetradues5pi5èpossibilesoloseinfehanocontemporaneamenteunacellulaospiteallo
stessotempo(coinfezione)
LaricombinazionegeneEcaaumentaladiversitàgeneEcadiPRRSV?
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‘’6delle66sequenzeconcatenate(ORF5+ORF7)eranoricombinan.”‘’Lalimitatadiffusionespaziotemporaledeglis.pi.ricombinan.deponeafavorediunalimitatafitnessdeiricombinan.rispeIoaglis.pi.parentaliequindianchediunruoloepidemiologicomarginalediquestofenomeno”
StudioalivelloGLOBALE…
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• Allevamentofrancesechestavaseguendounprogrammadistabilizzazione,primausandoUNISTRAIN(HIPRA)epoiconPorcilisPRRS(MSD)
• Allafinedel2013unabandadi500suinegèstatavaccinatapersbaglioconentrambiivacciniapochesegmanedidistanza.
• Los5pitePRRS-FR-2014-56-11-1fuisolatodalsierodisuinegsaniraccoltonel2014• 3even5diricombinazionesonosta5evidenzia5traUNISTRAIN(parentemaggiore)eilPorcilis
PRRS(parenteminore)inORF1
• Nessunsegnoclinicoosservatoinallevamento!
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LecaranerisEchegeneEchediunosEpitedeterminanolasuapatogenicità?
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ApparentementeSI…
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Bor,Bielorussia
Ili,Russia
18794,Denmark
SU-1BelLena
ORF5albero
Los5piteBielorussoPRRSV-1BOR59(group3)erasignifica5vamentepiùpatogenodialtris5pi5impiega5nell’esperimentoLos5piteRussoPRRSV-1ILI6(group2)appenapiùpatogenodellos5pitedanese18794(group1)
[cortesiadiStadejeck]
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LarispostaèSI,manonsappiamoesanamentedoveguardare!
NonsonostaEancoraidenEficaEiMarkerdi
Virulenza!
…epoiPRRSVnonagiscedasolo…
LecaranerisEchegeneEchediunosEpitedeterminanolasuapatogenicità?
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• Novembre2010uncasodiPRRSmoltograve(severe)avvenutoinciclochiusodelloJutland(DK)
• Mortalitàpre-svezzamentofinoal50%• Finoal.70%dife5mummifica5• Campionisonorisulta5posi5viperPRRSV-2,enega5viperPCV2,
PPV,leptospira
• Leperditetotaliperladuratadel’episodiodi15segmanesonostatedel30%
• Leperditemedieinsalapartodel9.3%
• E’entratounnuovosEpitealtamentepatogenoinDanimarca??
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Infezionesperimentale
• Los5pitediPRRSV-2isolatodalcasoclinicoeramoltosimileaglialtris5pi5danesi
– ‘’IngelvacPRRSMLVrelated”
• LosEpitediPRRSV-2isolatodalcasoclinicohafallito nell’indurre segni clinici, lesionipatologicheealElivellidiviremia
QUINDI:
• Lagravitàclinicaincampodeveessere stata causata da altrifanori rispeno o in aggiunta aPRRSV
• I segni clinici in campo, nonsonosempreaffidabiliindicatoridellavirulenzadiPRRSV!
• Suinegdi4segmanenega5vidapatogenispecifici(Mhyo,PRRSV,App1,2,3,4,5,6,7,9,10)
• VaccinazioneconIngelvacPRRSMLVechallengeconl’isolatodalcasoclinicodelloJutland
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PerchèeComefarediagnosidiPRRS?
• PerdiagnosEcarelaformaclinica(riproduqvaorespiratoria)– RilievotramitePCRdiPRRSVinfe5,polmoni
• PerdiagnosEcarelaformasub-clinica(performanceridone)– RilievotramitePCRdiPRRSVealtrifahoriingruppichestannoperformandomale
– RilievodellasieroconversionetramiteELISAingruppichestannoperformandomale
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PerchèeComefarediagnosidiPRRS?
• Perpianificareemonitorareglieffeqdiprogrammidicontrollo– PCRperilrilievodiPRRSVinsuinegsvezza5duranteilprogrammadistabilizzazione
– ELISAperconfermarel’esposizionedellescrofehe(neiprotocollidiacclimatamento)
– DNAsequenziamentoperiden5ficarecambiamen5neglis5pi5circolan5
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ConsiderazionisuiMetodidiagnos5ci• Laselezionedel(i)metodo(i),edelcampionamento
dipendedall’obieqvofinale.• Piùambiziosoèl’obieqvo,piùcomplessoilprotocollo
diagnosEcodeveessere– SuinoInfehoononinfeho?– PerchèilprogrammadicontrollodellaPRRSnonfunziona?
• SensibilitàoSpecificità?– NONsipossonomassimizzareentrambe,sipuòsoloogmizzarle– Quale/cosasacrificare?
• Nessunmetodoèperfeno,quindimegliosesierologia,PCResequenziamentovengonocombinaEinmodosistemaEcoemanieralogica.
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ELISA
PRO• Elevatorendimento• Veloce• Pococostosa• Abbastanzafaciledaeseguire• AmpiaspecificitàperdiversevarianE
CONTRO• Ritardodirilievodell’infezione• Confermadiesposizione(odi
immunitàpassiva),nondistatodiinfezioneedistatoimmunitario
• U5leperdiagnosidipopolazionenonperdiagnosisusingolo
• Dovrebbecontenereentrambiigeno5piperunasensibilitàogmale
• LadiscriminazionedeigenoEpièdifficile
• PossibileproblemadisingolifalsiposiEvi(scrofe!-IDEXXX3100%Sp!)
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(RT-)PCRPRO• Permehediindividuaresingoliinfeg• DiscriminaPRRSV-1daPRRSV-2• Campionidipopolazionepossono
essereesegui5inpool(conminimaperditadisensibilità)
• Puòessereimpiegatasuunampiorangedimatrici,inclusiifluidioralieilseme
CONTRO• Inclineallacross-contaminazione• LaSensibilitàèinfluenzatadalla
variabilitàgene5ca• LaSpecificitàèinfluenzatada
reagen5esonde(‘’lateraisers”)…importanzadelCtvalue…
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• 20s5pi5,differen5diluizioni• Type1,sonoEpi2,3,4• Type2,inclusiHP-PRRS• 8KitcommercialiReal-TimePCR
• Ikithannotrovatodal50al95%deicampioni• Solo3kits(I,VIIandVIII)hannotrovatotuq
glisEpiEdiPRRSV• IlkitIIInonhatrovatonessunodeglisEpiE
sonoEpo3
QUINDI:molBdeikitdisponibiliincommerciodirealBmeRT-PCRnonsonoingradodirinvenireiso>oBpi
esteuropeidiPRRSVType1[PRRSSymposium,Gent2015]
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EvoluzionePRRSVediagnosEca:
1. NonesisteunaPCRchevadabenepertugisoho5piealcunimetodirisentonoanchedell’influenzadelClade!Quindiinsituazionipar5colari,accoppiarepiùtest!
2. Diagnos5cabiomolecolarevacon5nuamentesaggiatae
aggiornata!(ringtesteconfrontoinsilicoconsequenze).
3. Necessitàdisequenziaredipiùeancheporzionidiverseda
ORF5eORF7,condividendoleinformazioni!
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Riassumendoalcuniconceg(1)
• IvirusdellaPRRSsonoviruscon5nuamenteerapidamenteevolu5vi
• L’emergenza locale di varian5 diverse diPRRSV sono molto più probabili comeintroduzionidaaltrove indicatoridibio(in)sicurezza– Movimentazione di suini, camion, persone, vaccinivivimodifica5…
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Riassumendoalcuniconceg(2)• LacomplessanaturadellaPRRSrichiedeprotocollidiagnos5ci solidi e strumenE propriamentevalidaEma allo stesso tempo anche strategie dicontrollocomplesseebasatesulleevidenze[IDEXXX3ELISArimaneilgoldstandardperla diagnosisierologicaeilmonitoraggiodelleaziendesuinicole]
• L’analisigeneEcanonpermenedipredirrelavirulenzadiunosEpitediPRRSVol’efficaciavaccinale ma è un essenziale strumento dimonitoraggio della biosicurezza e di tracingepidemiologico!
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Relaxnow…