proteômica cromatografia prof. dr. luciano pinto
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Proteômica
Cromatografia
Prof. Dr. Luciano Pinto
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Cromatografia
• Chroma + graphein = cor + escrita
-1903: Mikhail Sémionovitch Tswett (1872-1919)
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Definição
• Método fisico-químico de separação de substâncias
• Presença de duas fases: Estacionária e móvel
• Separação ocorre devido a diferença de interação entre as substâncias e as fases
• Podendo ser uma analise qualitativa e/ou quantitativa
Cromatografia em papel
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Tipos de cromatografia
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Cromatografia por exclusão moleculargel filtração
• A fase estacionária (matriz) consiste num gel com poros de diferentes tamanhos
• Proteínas de menor massa percorreram o ‘caminho’ dos poros
• Separa moléculas de diferentes tamanhos
• Resina usada – SEPHADEX, SUPERDEX
• – polímero de glicose- gel formado por esferas com poros
• Proteínas maiores são “excluídas” saindo primeiro na coluna
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Gel Filtração
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Característica da MatrizSuperdex
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Típica cromatografia de gel filtração
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Cromatografia de afinidade
• Resina usada AGAROSE- polímero de açucares de algas ao qual se liga um composto pelo qual a proteína tenha afinidade
– enzima - o ligante é o seu substrato;– anticorpo - o ligante é o antígeno;– receptor de hormônio - ligante é o hormônio;
• É a mais específica de todas.
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Tipo de cromatografia de afinidade
• Pode ter o antígeno ligado
• Pode ter o anticorpo ligado
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Cromatografia de troca iônica
• Resina usada - CELULOSE ligada covalentemente a grupos com carga positiva ou negativa
– carboximetilcelulose (- negativa)– dietilaminoetilcelulose (+ positiva)
• Proteínas com a mesma carga da resina saem primeiro da coluna
• Moléculas carregadas ligam-se a grupos de carga oposta que se situam na matriz
• Remoção das proteínas que se ligaram à matriz é feita alterando as características do meio
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Troca iônica: adsorção das moléculas
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Troca iônica : eluição das moléculas
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Troca iônica: eluição das moléculas e equilíbrio da coluna
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Cromatógrafos
Análise em escala laboratorial- pequenas purificações
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Cromatógrafos
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Cromatógrafos
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Colunas de cromatografia
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Purificação seqüencial: Típica Aplicação
• Captura e purificação de:
• Proteínas, ex.: – Anticorpos
monoclonais – Sangue/ fatores do
plasma – Proteínas
recombinantes • Peptídeos • Polissacarídeos • Oligonucleotídeos • Vírus
Diferentes tipos de colunas em linha