PROTEINE RIBELLI…(REBELS ARE WE...)

Un saluto e un augurio di curiosità culturale sempre viva…

Dr. Stefano GestriL.S. “Niccolò Copernico”Prato, 04-10-2014

TABLE OF CONTENTSAbstracIntroductionProteins foldingProteic misfoldingAmyloidosesFibrils characterizationAny question?Polyphenols: sources, metabolism and activitiesFighting against the amyloidosesConclusionsBibliography (and more)Looking forward…

ABSTRACT (I)

Amyloidosis encompasses a large group of diseases characterized by tissue deposition of proteins generally assembled in antiparallel β-strands

Over 20 human proteic molecules, intact or fragmented, have resulted amyloidogenic in vivo, and connected with disorders such as Alzheimer’s, Parkinson’s and type II diabetes diseases. Amyloidoses are often divided into neurodegenerative disorders, non-neuropathic localized amyloidoses and systemic amyloidoses

ABSTRACT (II)

Polyphenols are nutraceuticals widely diffused in the human diet, and used in the phytopharmaceutical industry for their antioxidant properties

According to their structure, they are divided in phenolic acids, flavonoids, stilbenes, and lignans

Some of them are described as efficient in vitro inhibitors of amyloid fibril formation; several results suggest their possible future uses, in nutraceutical or pharmaceutical forms, for amyloidosis prevention or treatment

INTRODUCTION (I): THE BEGINNING L'encefalopatia

spongiforme bovina (BSE, ossia Bovine Spongiform Encephalopathy) fu scoperta nel Regno Unito nel 1986

Fa parte di un gruppo di malattie denominate encefalopatie spongiformi trasmissibili (TSE)

S. Prusiner, Nobel per la medicina per la sua ricerca sui prioni, ha mostrato legami tra BSE e una variante della malattia di Creutzfeldt-Jakob (vCJD) che colpisce l’uomo

INTRODUCTION (I): CLINICAL DATA

Morbo di Alzheimer: si stima che entro il 2050 a livello mondiale ne sarà affetta 1 persona su 85

Negli adolescenti statunitensi il diabete di tipo 2 viene ormai diagnosticato con una frequenza simile al diabete di tipo 1…

PROTEINS FOLDING Struttura primaria,

secondaria, terziaria e quaternaria delle proteine

Folding cotraduzionale o (nella cellula eucariota) dal reticolo endoplasmatico all’apparato di Golgi

Processo guidato dalle proteine chaperonine

Foldone: 2 β-strand e 1 α-elica

Paradosso di Levinthal (1968)

Misfolding o aggregazione

PROTEIC MISFOLDING

Aggregazione amiloide delle proteine: deposizione tissutale di strutture proteiche supramolecolari organizzate in foglietti β. Il tutto si evolve fino alla formazione di fibrille, il cui asse risulta perpendicolare ai filamenti β, paralleli o antiparalleli. Si parla di strutture cross β

Sono stati elaborati algoritmi per il calcolo della propensione ad aggregare di una qualsiasi sequenza aminoacidica (per ogni aminoacido si determina Zagg, partendo dal contesto molecolare dei 3 aminoacidi precedenti e dei 3 successivi)

HISTORY

Il termine amiloide fu introdotto nel 1854 dal medico tedesco Rudolph Virchow, che notò come anomali corpi tissutali del cervello si colorassero in blu pallido se trattati con iodio, e in violetto dopo la successiva aggiunta di acido solforico, e pensò si trattasse di cellulosa o amido. “Amido” deriva dal latino “amylum”, che, traducendo il termine greco “amylon”, indica un materiale “non macinato”

Nel 1959 Friedereiche e Kekulè dimostrarono, valutandone l’alto contenuto in azoto, che la sostanza amiloide contiene proteine

In vivo gli aggregati amiloidi risultano costituiti da proteine unite ad apprezzabili quantità di glicidi

AMYLOID FIBRILS FORMATION(ENERGY LANDSCAPE MODEL)

L’aggregazione sembra richiedere delle condizioni di parziale unfolding; può addirittura coinvolgere proteine o peptidi che nel loro stato nativo sono unfolded

Spesso la fase d’accrescimento esponenziale è preceduta da una fase di latenza (lag phase)

Protofibrille: perline in catene o anelli; 2-5 nm di diametro; costituite da 2-6 monomeri proteici

Protofilamenti: 2-6 superavvolti in ogni fibrilla; 2-5 nm di diametro; costituiti dall’impilamento di uno o più strand b

Fibrille: 7-13 nm di diametro; lunghezza micrometrica

FIBRILS TOXICITY I primi studi

sull’aggregazione amiloide in vitro risalgono al 1998

Gli aggregati solubili (“inclusioni cellulari”, fino alle protofibrille) sono assai citotossici (forse scompaginano i 3-8 mm di fosfolipidi membranali, con ingresso di calcio e apoptosi)

Sono citotossiche anche le fibrille mature (il termine è usato per lo più per strutture extracellulari)

AGGREGATING PROTEINS AND RELATED DISEASES

Amiloidosi umane (oltre 40):• neurodegenerative• localizzate non-

neuropatiche• sistemiche non-

neuropatiche

Il diabete di tipo 2 è un fattore di rischio per il morbo di Alzheimer (considerato “diabete di tipo 3”)

Alcuni antidiabetici promuovono la neurogenesi e riducono la neuroinfiammazione

PROPERTIES OF THE AMYLOID AGGREGATES Permettono di definire un

aggregato proteico “fibrilla amiloide”, se copresenti: la birifrangenza in verde dopo la colorazione con Congo red (CR), la morfologia fibrillare e la predominanza di foglietti β

Le fibrille amiloidi sono state studiate al microscopio elettronico a trasmissione (TEM, con potere risolutivo di 2 nm) negli anni ’50; sono state usate anche la STEM, la cryo-EM e l’AFM (microscopia a forza atomica, nata nel 1986, utile per la determinazione dello spessore)

Informazioni sul diametro delle varie particelle presenti possono ottenersi anche dal dynamic light scattering (DLS)

STUDYING AMYLOID AGGREGATES

Per la determinazione della struttura secondaria delle fibrille amiloidi la tecnica originariamente usata è stata la diffrazione dei raggi X

Hanno poi contribuito: risonanza magnetica allo stato solido (SSNMR) e spin labeling sito-specifico accoppiato alla risonanza paramagnetica elettronica (SDSL-EPR)

Meno costoso è risultato il dicroismo circolare (CD) - segnale a 216 nm

Con quantitativi di proteina intorno al mg può essere utilizzata la spettroscopia infrarossa in trasformata di Fourier (FTIR); fa risparmiare campione la tecnica della riflessione totale interna attenuata (ATR)

SCREENING ON AMYLOID AGGREGATES

Test del Congo red (CR) – segnale a 540 nm, descritto oltre 50 anni fa

Dosaggio fluorimetrico tramite tioflavina T (ThT) – segnale a 485 nm, in seguito a red-shift

…TO BE CONTINUED

AGAINST AMYLOID AGGREGATION

Il termine “nutraceutico” fu coniato nel 1989 dal medico Stephen DeFelice

Talvolta si parla anche di alimenti funzionali

POLYPHENOLS: CLASSIFICATION Oltre 8000 in natura; metaboliti secondari di

piante, spesso con funzione difensiva Classificazione chimica di J. B. Harborne (anni

’80 del secolo scorso) Oltre 4000 flavonoidi (pigmenti dei fiori),

talora glicosilati Oltre 200 antocianine (flavonoidi rosso-

violetti)

Analisi per lo più con HPLC/DAD/MS

Acidi fenolici

POLYPHENOLS: SOURCES AND BIOAVAILABILITY

Principali fonti alimentari: frutta e succhi di frutta, ortaggi, tè, cioccolata, vino rosso

1 g/die (2/3 di flavonoidi) Le fibre, i metalli

bivalenti e le proteine ne diminuiscono la biodisponibilità

Antiossidanti quali le vitamine C ed E possono ridurne la degradazione intestinale

POLYPHENOLS: METABOLISM Il 75-99% dei polifenoli ingeriti

non si ritrova nelle urine immodificato

I flavonoli e le antocianidine possono essere assorbiti glicosilati

Il ramnosio è staccato dalla α-ramnosidasi della microflora del colon

Alcuni polifenoli possono essere assorbiti per trasporto attivo

Massime concentrazioni ematiche dopo 1,5-5,5 h

Coniugazione con acido glucuronico (soprattutto per gli isoflavoni) nel reticolo endoplasmatico

Emivite di alcune ore Escrezione urinaria dei

polifenoli: 0,3-43%

CBG = Cytosolic beta-glucosidase (EC 3.2.1.21)LPH = Lactase-phlorizin hydrolase (EC 3.2.1.108)COMT = Catechol-O-methyltransferase (EC 2.1.1.6)UDPGT = UDP glucoronosyl transferase (EC 2.4.1.17)SULT = Phenol sulfotransferase (EC 2.8.2.1)

POLYPHENOLS: BIOLOGICAL ACTIVITIES I polifenoli sono usati come

antiossidanti per preparati farmaceutici e alimentari (l’epicatechina gallato è la più efficace)

L’ossidazione delle LDL sembra essere un fenomeno aterogenetico (i radicali liberi dell’ossigeno - ROS - sono in grado di perossidare gli acidi grassi polinsaturi); inoltre i polifenoli inducono vasodilatazione

“Paradosso francese” I polifenoli sono stati testati contro il

melanoma, i tumori della prostata e del seno

I flavonoidi potrebbero essere impiegati contro la resistenza multipla alla chemioterapia dovuta al trasporto attivo (vedi glicoproteina P) fuori dalla cellula dei farmaci

Alcuni polifenoli sono antifungini Antibatterici polifenolici sono noti da

oltre 30 anni Alcuni polifenoli sono attivi contro

virus erpetici, influenzali, dell’immunodeficienza

I polifenoli si possono legare a proteine, glicidi, vitamine e minerali

POLYPHENOLS AND AMYLOIDOSES

Gli effetti neuroprotettivi dei polifenoli non sembrano dovuti al solo potere antiossidante

I composti fenolici sembrano inibire in vitro la formazione di fibrille amiloidi (inibizione poco attiva, molto attiva, selettiva; della nascita di oligomeri, di oligomeri/fibrille, di fibrille) o destabilizzare le fibrille stesse

CONCLUSIONS

I polifenoli sembrano dare tossicità a lungo termine solo quando rappresentano l’1-5% dell’alimentazione

Composti molto attivi come inibitori dell’aggregazione amiloide sono l’acido tannico e l’acido rosmarinico fra gli acidi fenolici, e l’epigallocatechina gallato, la keracianina, l’hinokiflavone e il cumestrolo fra i flavonoidi

La coesistenza di più di una struttura fenolica (con molteplici possibilità di legami a idrogeno) sembra essere un requisito indispensabile

In particolare gli antociani, stabili a livello gastrico, dove sono in parte già assorbiti, e in grado di attraversare la barriera ematoencefalica, risultano assai promettenti

A livello di estratti vegetali gli effetti antiamiloidogeci sembrano essere più pronti e amplificati

Il molecular modeling potrà fornire un valido aiuto nell’allestimento di screening

SOME REFERENCES… Chiti F and Dobson CM, 2006. "Protein misfolding, functional amyloid, and

human disease". Annu. Rev. Biochem. 75(75): 333-66 Rivière C, Richard T, Vitrac X, Mérillon JM, Valls J and Monti JP, 2008. "New

polyphenols active on beta-amyloid aggregation". Bioorg. Med. Chem. Lett. 18(2): 828-31

Stefani M and Dobson CM, 2003. "Protein aggregation and aggregate toxicity: new insights into protein folding, misfolding diseases and biological evolution". J. Mol. Med. 81(11): 678-99

Vendruscolo M and Dobson CM, 2005. "Towards complete descriptions of the free-energy landscapes of proteins". Philosophical transactions. Series A, Mathematical, physical, and engineering sciences 363(1827): 433-50; discussion 450-2

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