protein therapeutics intracellular delivery · 2015-12-15 · Ο «όρος» protéine ....
TRANSCRIPT
protein therapeutics
Intracellular delivery
Παπαδοπούλου Χ. Λευκοθέα Αναπληρώτρια Καθηγήτρια Φαρμακολογίας
Ο «όρος» protéine πρωτάθηκε το 1838 από τον
Jöns Jakob Berzelius (Σουηδός χημικός, 1779-1848)
από την ελληνική λέξη “π ρ ώτ ο ς”
( first, foremost, in time, place, order, importance)
« η οργανική ύλη που αποτελεί τη γενική βάση -πρωτεύουσα-
όλων των τμημάτων που απαρτίζουν το σώμα των οργανισμών»
Methods Mol Biol. 2012; 899:1-26. Therapeutic proteins Dimitrov DS Ετυμολογικό Λεξικό Νέας Ελληνικής Γλώσσας Γ. Μπαμπινιώτη
DNA
A T G C
A A T C
G
T
mRNA
Ριβόσωμα
Messenger RNA Codon
Modified from Harald H Sitte, MD Medical University of Vienna, Austria and Bioinformatics and Functional Genomics by J Pevsner
Γενετικός κώδικας
πρωτεϊνη Φαινότυπος
http://www.virtualsciencefair.org/2005/anna5m0/public_html/images/chromosome.gif
Βασικό δόγμα της Μοριακής Βιολογίας
αρχικά, είχαμε
απομόνωση των πρωτεϊνών του
ενδιαφέροντος για θεραπευτικούς σκοπούς
από ζωικούς ιστούς
Iνσουλίνη από πάγκρεας ζώων
http://www.nytimes.com/2010/10/05/health/05insulin.html?pagewanted=2&_r=1&th&emc=th
11/1/1922 χορήγηση ινσουλίνης από βόειο πάγκρεας σε διαβητικό άτομο, ετών 14 στο Πανεπιστήμιο του Τορόντο, Καναδά
Το παιδί απέφυγε το θάνατο από ΔΙΑΒΗΤΙΚΟ ΚΩΜΑ Νobel 1923 Frederick Banting and Charles Best
1. Οι διαρκώς αυξανόμενες ανάγκες σε πρωτεϊνη 2. Οι παρενέργειες, λόγω απομόνωσης από ιστούς ζώων (μολυσματικότητα – αλλεργικές αντιδράσεις) 3. Η ανάπτυξη της τεχνολογίας του ανασυνδυασμένου DNA
Παραγωγή των θεραπευτικών πρωτεϊνών
βιοτεχνολογικά
Stanford University Medical School 1972-73
http://ocw.mit.edu/courses/biology/7-01sc-fundamentals-of-biology-fall-2011/recombinant-dna/
«Πέψη» με το ΙΔΙΟ ένζυμο περιορισμού (πχ. EcoRI)
«Μίξη» των DNAs «Σύνδεση» με το ένζυμο λιγάση
Μεταμόρφωση των βακτηριακών κυττάρων
Επιλογή των βακτηριακών κλώνων που μεταμορφώθηκαν με το ανασυνδυασμενο DNA
ΤΕΧΝΟΛΟΓΙA ΤΟΥ ΑΝΑΣΥΝΔΥΑΣΜΕΝΟΥ DNA Απομόνωση
α) DNA του ενδιαφέροντος β) πλασμιδιακού DNA από βακτήρια
PCR
DNA encoding γονίδιο
ενδιαφέροντος
Κλωνοποίηση
Πλασμίδιο έκφρασης
Barney Graham, M.D., Ph.D. http://www.vrc.nih.gov/clintrials/clinslides.htm
Ενίσχυση - Απομόνωση του γονιδιακού υλικού
Dingermann T.
Απομόνωση του γονιδίου ενδιαφέροντος
κλωνοποίηση Τεχνολογίες Ανασυνδυασμένου DNA
Κύκλος παραγωγής
Έκφραση στα κατάλληλα κύτταρα
Μεταμόρφωση των κατάλληλων επιδεκτικών κυττάρων ξενιστή
επιτρέπει την επαγωγή έκφρασης της αντίστοιχα κωδικοποιούμενης
ανασυνδυασμένηςπρωτεϊνης
Γλυκοσυλίωση: προσθήκη υδατανθράκων στη βασική
πρωτεϊνική δομή (μετα-μεταφραστική τροποποίηση)
• Πάνω από το 70% των πρωτεϊνών των ανώτερων οργανισμών είναι γλυκοσυλιωμένες
Folded protein structure (schematic) Satya S. Sahoo, Amit P. Sheth, William S. York, John A. Miller
Figure 3. Manufacture of a biopharmaceutical: opportunities for variation between manufacturers
Dingermann T.
Έλεγχος βιολογικής δραστικότητας In vitro In vivo
Κύκλος παραγωγής βιοτεχνολογικών θεραπευτικών πρωτεϊνών
Tυποποίηση
Ταυτοποίηση της πρωτεϊνης Ηλεκτροφόρηση
Ανοσοαποτύπωση HPLC
Φασματοσκοπία Μάζας (MALDI-TOF) Προσδιορισμός δομής
με NMR και με X-ray κρυσταλλογραφία
Απομόνωση του γονιδίου ενδιαφέροντος
Κλωνοποίηση Έκφραση Απομόνωση Καθαρισμός
Modified from
Dingermann T. Biotechnology J, 2008, 3: 90-97
Exome sequencing
The human Genome Project
http://news.sciencemag.org/biology/2015/11/3230-genes-you-can-t-do-without
modified from Claire T. Driscoll Director, Technology Transfer Office National Human Genome Research Institute National Institutes of Health
Βιοτεχνολογικά Προϊόντα κυτταρικές θεραπείες
Αλληλούχιση του ανθρώπινου γονιδιώματος
Γενετική ποικιλομορφία Μεταλλάξεις Παθολογικός φαινότυπος
Επιστήμη της Βιοπληροφορικής
Αλληλούχιση του ανθρώπινου γονιδιώματος
Συγκριτική Γενωμική
Νέα εποχή στην
Ιατρική Εξατομικευμένη
θεραπεία
Βιοτεχνολογικά Βιοφαρμακευτικά
Προϊόντα
Ανασυνδυασμένες Πρωτεϊνες
Εμβόλια υπομονάδας
Μονοκλωνικά Αντισώματα
Προϊόντα βασισμένα σε νουκλεϊνικά οξέα
πρωτεϊνική θεραπεία
γονιδιακή θεραπεία /
RNA interference
διακρίνονται βάσει: (1) της Φαρμακολογικής δράσης τους Αντικατάσταση μιας πρωτεϊνης; PRT Ενίσχυση κάποιου βιοχημικού μονοπατιου Παρεμβολή σε κάποιο μόριο ή οργανισμό, Για τη χορήγηση άλλων ενώσεων (ραδιονουκλίδια, κυταροτοξικά φάρμακα, κλπ)
(2) της Κατηγορίας των μορίων αντισώματα, πρωτεϊνες σύντηξης, Αντιπηκτικά, παράγοντες αίματος, ανασυνδυασμένες πρωτεϊνες, ορμόνες, κυτταροκίνες, θρομβολυτικά φάρμακα
(3) του Μοριακού Μηχανισμού Δράσης ένζυμα, μονοκλωνικά αντισώματα (mabs), Methods Mol Biol. 2012;899:1-26. Therapeutic proteins. Dimitrov DS1
Papadopoulou and Tsiftsoglou, Pharmaceutical Research, 2011
Πρωτεϊνική θεραπεία (> 130 προϊόντα)
Πρωτεϊνική / Ενζυμική Θεραπεία
Αντικατάστασης
Μονοκλωνικά Αντισώματα (mabs)
εμβόλια
διαγνωστικά
sales of US$108 bln
Δράση πρωτεϊνών:
1. στο πλάσμα (π.χ. παράγοντες πήξης)
2. μετά από σύνδεση με υποδοχείς
στην επιφάνεια του κυττάρου (π.χ. ινσουλίνη)
3. ενδοκυτταρικά
απαραίτητη: η είσοδος εντός του κυττάρου
Insulin
http://en.wikipedia.org/wiki/File:Insulin_glucose_metabolism_ZP.svg
Δράση της Ινσουλίνης στους υποδοχείς της στην κυτταρική μεμβράνη
Harald H Sitte, MD Medical University of Vienna, Austria
•1982 άδεια κυκλοφορίας (από το FDA) της ανασυνδυασμένης ινσουλίνης
Οι πιο συνηθισμένες διαταραχές των παραγόντων πήξης αφορούν έλλειψη :
• α) του παράγοντα FVIII (αιμοφιλία Α) • β) του παράγοντα FΙΧ (αιμοφιλία Β)
• γ) του παράγοντα von Willebrand
Hoffbrand and Pettit. Clinical Hematology Illustrated. An intergrated text and Color atlas. (W.B. Saunders Company) (1987)
in vitro
II
TF δράση
στο πλάσμα
παράγοντες πήξης
ΘΕΡΑΠΕΥΤΙΚΗ ΑΝΤΙΜΕΤΩΠΙΣΗ- ΠΡΟΣΕΓΓΙΣΗ
Ανασυνδυασμένα προϊόντα
(recombinant DNA technology),
ελεύθερα μολυσματικών ιών
Biogen Idec Releases Promising Hemophilia Data
Blood. 2015 Oct 22;126(17):1975-6. doi: 10.1182/blood-2015-08-664052.
rVWF: treatment finally reaches the modern age. Metjian AD.
2005
T1/2 = 20 min
T1/2 = 4 min
2 bolus injections
30 min apart
Θρομβολυτικά φάρμακα
Chinese Ηamster Οvary cellls
Etanercept : Πρωτεϊνη σύντηξης http://en.wikipedia.org/wiki/Etanercept
Διαλυτό τμήμα του υποδοχέα 2 του TNF
Το τμήμα Fc ενός ανθρώπινου αντισώματος IgG1
Σύνδεση με περίσσεια του TNF στο πλάσμα
π.χ. ψωρίαση
προσέλκυση των κυττάρων του ανοσοποιητικού
Εξουδετέρωση της διεγερτικής του ανοσοποιητικού συστήματος δράσης του TNF
Interferon beta Molecular weight: 19.000 Da Aspirin
Molecular weight : 180
μεγάλα - πολύπλοκα μόρια
(protein therapeutics as biological medicines)
μόνο ζωντανοί οργανισμοί (βακτήρια, μύκητες, έντομα, καλλιέργειες ανθρώπινων
κυττάρων) μπορούν να τις παράγουν
Oι πρωτεΐνες είναι πολύ ευαίσθητες στις
συνθήκες παρασκευής Μικρές αλλαγές μπορεί να επηρεάσουν σημαντικά
τη βιολογική δραστικότητα
Η πολυπλοκότητα αυτή οδηγεί σε ένα βαθμό ετερογένειας
της παραγόμενης πρωτεΐνης
[Adapted with permission from European Journal of Hospital Pharmacy, 2004, vol3, published by Pharma Publishing and Media Europe bvba, Belgium (Schellekens (2004b)].
Μοριακή ετερογένεια της ανασυνδυασμένης ερυθροποιητίνης (epoetin alfa)
μεταξύ των προϊόντων από διάφορες περιοχές του κόσμου
Korea Argentina
Indi
a
Chi
na
Eur
ope
διαφορετικό «προφίλ» γλυκοσυλίωσης (μετα-μεταφραστικής τροποποίησης) μπορεί να επηρεάσει τη βιολογική δραστικότητα
http://www.ema.europa.eu/docs/en_GB/document_library/Medicine_QA/2009/12/WC500020062.pdf
για τα βιο-ομοειδή
(biosimilars, biosimilar medicines) που «αναπτύσσονται»
μετά τη λήξη της πατέντας των πρωτότυπων (reference biological medicines),
απαιτείται
συγκριτική αξιολόγησή τους, παράλληλα με το αντίστοιχο πρωτότυπο,
σε κλινικό επίπεδο πριν την τελική έγκρισή τους
για θεραπευτική χρήση
Regenerative Medicine Vol. 10, No. 1, Pages 65-78, 2015
σε αρκετές περιπτώσεις,
μπορεί να ακολουθήσει
PEG-υλίωση των παραγόμενων ανασυνδυασμένων πρωτεϊνών
Δηλαδή,
σύζευξη με το πολυμερές
πολυαιθυλενογλυκόλη (PEG) -(CH2-CH2-O)n-
Vol 10, Issue 21, 1 November 2005, Pages 1451-1458
η PEG-υλίωση των πρωτεϊνών οδηγεί σε:
Aύξηση μεγέθους, μείωση νεφρικής κάθαρσης ΑΥΞΗΣΗ του χρόνου ημιζωής
Aύξηση διαλυτότητας, λόγω της υδροφιλικότητας της PEG
Μειωμένη «προσβασιμότητα» σε πρωτεολυτικά ένζυμα και αντισώματα
επιμηκύνει
το χρόνο ημιζωής της ιντερφερόνης
(σταθερότερη στο πλάσμα)
και αυξάνει
την αντιϊκή του δράση
http://www.roche-australia.com/content/dam/internet/corporate/roche/en_AU/files/anti_virals/pegasys-pi.pdf
Θα ήταν δυνατόν βιοτεχνολογικές πρωτεϊνες να χρησιμοποιηθούν για τη
θεραπεία γενετικών – μεταβολικών νόσων λόγω
της απουσίας ή δυσλειτουργίας κάποιας
ενδοκυτταρικής πρωτεΐνης ή ενζύμου
Mattias Belting, Staffan Sandgren, and Anders Wittrup Advanced Drug Delivery Reviews 57(4): 505-527 2004
Κυτταρική μεμβράνη
μηχανισμοί εσωτερίκευσης μακρομορίων
η δυνατότητα εισόδου μέσα στα κύτταρα
viruses
The nature of cell membranes
prevents peptide entry (unless there is an active transport mechanism)
except for short peptides
(<6aa; <600Da).
Delivery across BBB restricted to even smaller peptides
Ανάπτυξη τεχνολογιών
ενδοκυτταρικής εισαγωγής μακρομορίων
Ηλεκτροδιάτρηση (Electroporation)
Μικροέγχυση (Microinjection)
χρήση Λιποσωματίων – Νανοσωματίων
κυτταροτοξικότητα
hydrophobic drug - protein
hydrophilic polyoxyethylene
lipids
aqueous soluble drug - protein encapsulated in
aqueous compartment
http://www.pharmj.com/editorial/19990828/education/parenteral.html
http://the-scientist.com/2011/10/01/a-small-revolution/
http://www.fda.gov/ohrms/dockets/ac/01/slides/3794s2_01_verma/sld004.htm
Modified from Ogawa et al, Acta Med. Okayama, 2009, Vol. 63, No. 1, pp. 1-7
, active
Γονιδιακή θεραπεία
Πρωτεϊνική θεραπεία
Φυσική ικανότητα των ιών να εισέρχονται στα κύτταρα με δυνατότητα έκφρασης των
ένθετων γονιδίων στα κύτταρα στόχο
ενδοκυττάρια μεταφορά εξωγενώς χορηγούμενων
ανασυνδυασμένων πρωτεϊνών
Τεχνολογία ΠΡΩΤΕΪΝΙΚΗΣ ΜΕΤΑΓΩΓΗΣ
Protein Transduction Domains (PTDs)
or
Cell Penetrating Peptides (CPPs)
Μικρού μεγέθους πεπτίδια (10 - 20 aa )
που έχουν τη δυνατότητα να διαπερνούν
σχεδόν όλες τις βιολογικές μεμβράνες,
δίνoντας τη δυνατότητα εισαγωγής και
των συζευγμένων μακρομορίων, ως “cargo”, μέσα στα κύτταρα
Domains of the HIV-1 TAT protein
TAT peptide
Adv Drug Deliv Rev. 2005 Feb 28;57(4):597-608
Representation of the occurrence for the study and the use of various cell penetrating peptides (CPP) described in the review of Dietz and Bahr and entitled “Delivery of bioactive molecules into the cell: the Trojan horse approach”. “Tat” stands for the Tat-derived peptide, “Ant” for the Antennapedia derived peptide or Penetratin, “VP22” for the VP22 protein from herpes virus, “Tpt” for Transportan and “poly+” for cationic peptides such as poly-lysine or poly-arginine. J Control Release. 2005 Dec 5;109(1-3):77-85
www.neuronlab.org/images/1228729118.jpg
I.Green et al . Trends in Pharmacological Sciences,24(5):213-215, 20
(help of chaperones?)
Tat ?
Pharm Res. 2007 Apr 19; [Epub ahead of i t]
J Pharmacol Exp Ther. 2015 Apr 28. Viral and other cell penetrating peptides as vectors of therapeutic agents in medicine. Durzyńska JŁ1, Przysiecka Ł2, Nawrot R3, Barylski J3, Nowicki G3, Warowicka A2, Musidlak O3, Goździcka-Jozefiak A3.
CPPs are either protein derived peptides (like the 11aa TAT peptide from the HIV-1 TAT full length protein) or synthetic peptides (like the R9) or even chimeric peptides (like the transportan)
5 < R < 15
TAT
R9 transportan
In vivo biodistribution and efficacy of peptide mediated delivery
Jarver et al, 31(11), 528–535, 2010
PTD-cargo molecules and modifications to increase specificity of cargo delivery. Fusion proteins and peptides having a Protein Transduction Domain (PTD) on the N-terminal or C-terminal deliver cargo to virtually any cell.
To facilitate cargo release, a reducible disulfide linker can be introduced between the
cargo and the PTD. Homing peptides such as AHNP (anti-HER-2/neu peptide mimetic) or DV3 (d-amino acid peptid derived from vMIP-II CXCR4 ligand) direct the PTD-cargo molecule to specific cell types.
The stability of the PTD-cargo molecule can be attenuated by the introduction of an oxygen-dependent degradation (ODD) motif to selectively stabilize it in the hypoxic tumor environment. Cationic PTDs can be inactivated by an anionic peptide linked via a protease cleavable linker, activating the PTD in a protease rich environment.
Protein transduction domain delivery of therapeutic macromolecules Arjen van den Berga - Steven F Dowdy Current Opinion in Biotechnology 2011, 22:888–893
το TAT “ανοίγει” την πόρτα των κυττάρων
Piyush M Vyas - Ronald M Payne Molecular Therapy vol. 16 no. 4 april 2008
Δυνατότητα στόχευσης
συγκεκριμένων οργανιδίων
Μιτοχόνδρια
Κύρια πηγή ενέργειας του κυττάρου Ημιαυτόνομα οργανίδια με το δικό τους DNA (mtDNA) ~ 100 - 1000 μιτοχόνδρια / κύτταρο ~ 2 - 10 αντίγραφα mtDNA / μιτοχόνδριο ~1000- 1500 πρωτεϊνες
( ~1% του ανθρώπινου πρωτεώματος )
Μιτοχόνδρια
http://neuromuscular.wustl.edu/mitosyn.html
http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S15677249100010
“Primary” Mitochondrial Disorders
DiMauro S, Schon EA. N Engl J Med. 2003 Jun 26;348(26):2656-68
Οξειδωτική Φωσφορυλίωση
37
• Συμπτωματική θεραπεία – σπασμοί, – διαβήτης, – απώλεια ακοής, – πτώση βλεφάρων, – καρδιομυοπάθεια – …
• Αερόβια άσκηση επάγει
– οξειδωτική φωσφορυλίωση – μιτοχονδριακές λειτουργίες
• Διατροφή πλούσια σε λίπη β-οξείδωση έναντι της γλυκόλυσης
Di Mauro Acta Myol. 2010 29(2): 333–338
• Φαρμακολογική προσέγγιση – Απομάκρυνση τοξικών μεταβολιτών (πχ. Νευροτοξικό γαλακτικό οξύ με διττανθρακικό νάτριο )
– Απομάκρυνση ελευθέρων ριζών (αντιοξειδωτικά)
– Χορήγηση • βιταμινών (C, Β1, Β2, Ε) • CoQ10 • L-καρνιτίνης • κρεατίνης
• Ενίσχυση της βιογένεσης των μιτοχονδρίων
• Γονιδιακή θεραπεία
• Κυτταρικές θεραπείες • Πρωτεϊνική θεραπεία
Προγεννητικός έλεγχος
http://www.bbc.com/news/health-31069173
http://www.thelilyfoundation.org.uk/animation/
Shokolenko et al Environmental and Molecular Mutagenesis 51:451-461 (2010)
Δυνατότητα στόχευσης
οργανιδίων, όπως
Τα ΜΙΤΟΧΟΝΔΡΙΑ
Gene therapy
Protein therapy
ΤΑΤ-L-Sco2-HA
Παραγωγή της ανθρώπινης TAT-L-Sco2-HA πρωτεϊνης σύντηξης σε βακτηριακό σύστημα έκφρασης ανασυνδυασμένων πρωτεϊνών
L-SCO2
TAT-L-Sco2-HA
Μεταγωγή των ανθρώπινων ανασυνδυασμένων πρωτεϊνών στα μιτοχόνδρια
ΤΑΤ-L-Sco2-HA
ΤΑΤ-L
Sco2-HA ΤΑΤ-L
ΤΑΤ-L-Sco2-HA
2011; 28(11):2639-56
Mol Ther. 2008 Apr;16(4):691-7.
TAT-mediated delivery of LAD restores pyruvate dehydrogenase complex activity in the mitochondria of patients with LAD deficiency
Successful TAT-mediated enzyme replacement therapy in a mouse model of mitochondrial E3 deficiency
Werner et al, N ENGL J MED 366, 1132-1141, 2012
Χ Χ
Cel
l-pen
etra
ting
pept
ides
: stra
tegi
es fo
r ant
ican
cer t
reat
men
t. R
auch
er D
, Ryu
JS
.
Tr
ends
Mol
Med
. 201
5 S
ep;2
1(9)
:560
-70
http://crdd.osdd.net/raghava/cppsite/