Proposal Praktikum MandiriHari, tanggal: Rabu, 6 Mei 2014Teknologi BioindustriGolongan: P1Dr. Ir. Mulyorini Rahayuningsih, M.Si.

Dosen: Asisten:1. Heldinnie Gusty Atiqah (F34100012)2. Sutresno (F34100022)

PEPTON KACANG KEDELAI OLEH ENZIM PAPAIN

Oleh :Kelompok 3

Youvita Rosiyana(F34100061)Fahri Budiman(F34110001)Irni Indriani Pramesti(F34110015)Mutiatul Chosyiah(F34110017)Muhammad Nurdiansyah(F34110022)Fadila(F34110025)

DEPARTEMEN TEKNOLOGI INDUSTRI PERTANIANFAKULTAS TEKNOLOGI PERTANIANINSTITUT PERTANIAN BOGORBOGOR2014PENDAHULUAN

Latar Belakang

Pepton merupakan turunan dari hidrolisat protein yang larut air dan tidak mengalami koagulasi pada air panas (Sumardjo 2009). Hidrolisat protein merupakan hasil penguraian protein menjadi peptida sederhana dan asam amino melalui proses hidrolisis baik oleh asam, basa atau enzim. Di dalam sistem pencernaan manusia, terdapat enzim pepsin di dalam lambung yang berfungsi untuk mengubah protein menjadi pepton.Pepton memberikan asupan nitrogen yang dibutuhkan bakteri untuk tumbuh. Oleh bakteri, pepton dapat diuraikan menjadi asam amino. Kemudian asam amino ini akan diserap untuk digunakan sebagai sumber energi dan membangun sitoplasma. Hal ini menyebabkan pepton seringkali digunakan sebagai salah satu medium kultivasi bakteri.Di dalam aktivitas rumah tangga, para ibu seringkali menggunakan daun pepaya yang telah diremas-remas untuk melunakkan daging. Peremasan tersebut mengeluarkan enzim papain yang dikandung oleh daun pepaya. Hal ini sesungguhnnya merupakan bioproses sederhana di mana enzim papain tersebut memiliki kemampuan untuk memecah serabut daging sehingga daging menjadi empuk ketika akan dimasak.Sebagaimana pepsin, papain merupakan salah satu jenis enzim protease, yakni enzim yang dapat memecah protein menjadi senyawa yang lebih sederhana. Hal tersebut menjelaskan mengapa mendiamkan daging mentah bersama remasan daun pepaya dapat membuat daging menjadi lunak.Salah satu sumber protein nabati adalah kacang-kacangan. Kacang hijau memiliki 22 gram kandungan protein dalam 100 gram, atau setara dengan 22% (Rukmana, 2007). Kadar protein dari kacang hijau yang cukup tinggi ini menjadi lebih ekonomis untuk dimanfaatkan dalam pembuatan pepton menggunakan papain. Apabila dibandingkan dengan menggunakan daging, akan membutuhkan waktu yang relatif lama untuk mengembangbiakkan ternak sehingga cukup besar dan layak untuk disembelih, serta dagingnya dimanfaatkan untuk pembuatan pepton. Di samping itu, permintaan daging yang cukup tinggi mengakibatkan daging lebih baik dijual dalam bentuk daging saja, tidak terlebih dahulu diubah menjadi pepton.Praktikum mengenai pembuatan pepton dari kacang hijau dengan menggunakan enzim papain ini menjadi penting untuk dilakukan karena memiliki prospek yang potensial untuk dikembangkan. Pepton yang selama ini beredar di Indonesia sebagian besar merupakan produk impor dengan harga yang mahal. Produksi pepton dari kacang hijau dengan menggunakan enzim papain secara masif akan sangat potensial untuk dilakukan di Indonesia mengingat pasar yang masih amat sangat luas serta pesaing yang belum banyak.

Tujuan

Tujuan dilaksanakannya praktikum mandiri kali ini adalah untuk mengetahui cara pembuatan pepton dari kacang hijau dengan menggunakan enzim papain.METODOLOGI

Alat dan BahanBahan yang digunakan adalah kedelai, NaOH 1N, heksan, air destilata, enzim papain, dextrose, biakan (Bacillus subtilis, Pseudomonas aeruginosa, Escherichia coli, Streptococcus fecalis, dan Staphylococcus aureus), kaldu nutrient, agar, kapas, dan air destilata steril. Alat yang digunakan adalah baskom, oven, alat soxhletasi, pHmeter, penangas air, gelas piala, sentrifus, freeze dryer, botol MacCartney, otoklaf, cawan petri, tabung ulir, pipet mikrometer, dan spektrofotometer.

Prosedur Analisis Data1. Pembuatan peptonSTART

Kedelai disortasi

Kedelai direndam lalu disortasi lagi

Dikeringkan dalam oven dengan suhu 500oC

Diekstrak lemaknya dengan soxhletasi menggunakan heksan sebagai pelarut

Lalu ditambahkan air destilata 200 mL pada 40 g bubuk kedelai hingga menjadi bubur

pH diatur hingga mencapai 6.5 dengan penambahan NaOH 1N

Enzim papain ditambahkan

Dibiarkan selama 3 jam dengan pengaturan pH (penambahan dengan NaOH 1N)

Naikkan suhu hingga 80oC selama 5 menit untu menginaktifasi enzim

Lakukan sentrifugasi lalu pisahkan larutan peptonnya

Lakukan freeze drying untuk mendapatkan pepton

END

2. Evaluasi terhadap pepton dengan biakan mikrobaSTART

Kaldu pepton dibuat dengan komposisi 0.5% pepton dan 0.1% dextrose dari air destilata dan atur pH hingga mencapai 7 dengan penambahan NaOH 1N

Kaldu pepton dimasukkan ke dalam beberapa botol MacCartney sebanyak 10 mL

Lakukan otoklaf selama 15 menit dengan suhu 121oC

Kaldu pepton ditambahkan agar (tidak semua)

Lakukan pengenceran berseri pada biakan yang telah diinokulasikan pada kaldu nutrien selama 18 jam

Dilakukan inokulasi pada pengenceran 10-4 ke dalam pepton agar dan kaldu pepton rangkap dua

Inkubasi selama 24 jam pada suhu 37oC

Lakukan pengujian kekeruhan dengan spektrofotometer 540 nm (kontrol: pepton agar dan kaldu pepton tanpa inokulasi)

END

ANALISIS

Analisis dilakukan untuk mengetahui mutu karateristik pepton yang dihasilkan. Menurut (Wijayanti 2009), analisis yang perlu dilakukan antara lain:

1. Analisis proksimat Analisis proksimat dilakukan untuk mengetahui komposisi kimia dari pepton kacang kedelai.

a. Kadar air Penentuan kadar air didasarkan pada perbedaan berat sampel sebelum dan sesudah dikeringkan. Cawan kosong dikeringkan dalam oven selama 30 menit pada suhu 105 oC, kemudian didinginkan di dalam desikator selama 15 menit, dan ditimbang. Sampel sebanyak 5 g dimasukkan ke dalam cawan, kemudian dikeringkan selama 5 jam dan ditimbang kembali. Kadar air ditentukan dengan rumus:

Keterangan: W1 = berat sampel awal (g) W2 = berat sampel setelah dikeringkan (g)

b. Kadar abu Cawan dibersihkan dan dikeringkan dalam oven selama 1 jam pada suhu 105 oC, lalu didinginkan selama 15 menit di dalam desikator dan ditimbang hingga didapatkan berat yang konstan. Sampel 5 g ditimbang kemudian dimasukkan ke dalam cawan dan dipijarkan di atas nyala api bunsen hingga tidak berasap lagi. Setelah itu, diletakkan dalam tanur pengabuan dengan suhu 400 oC sekitar 1 jam dibakar hingga diperoleh abu berwarna putih. Cawan lalu didinginkan dalam desikator dan ditimbang. Kadar abu ditentukan dengan rumus:

c. Kadar protein dan total nitrogen Pengukuran kadar protein dilakukan dengan metode Kjedahl. Sampel ditimbang sebanyak 0,5 g, kemudian dimasukkan ke dalam labu Kjedahl 50 ml, lalu ditambahkan kjedahl dan 25 ml H2SO4 pekat. Sampel didestruksi sampai cairan berwarna hijau bening lalu dibiarkan sampai dingin. Sampel yang telah dingin lalu dipindahkan ke labu ukur dan dilakukan pengenceran dengan akuades. Sampel selanjutnya dimasukkan ke dalam alat destilasi dan ditambahkan 10 ml NaOH pekat hingga berwarna coklat kehitaman, lalu didestilasi. Hasil destilasi ditampung dalam erlenmeyer berisi 125 ml H3BO3 dan indikator (BCgMM), lalu dititrasi dengan HCl 0,02 N. Larutan blanko dianalisis seperti sampel. Perhitungan kadar protein dan total nitogen dengan rumus:

Keterangan : a = ml titrasi sampel b = ml titrasi blankoN = Normalitas HCLfp = faktor pengencan kadar protein = 10 faktor pengenceran total nitrogen = 5

d. Kadar lemak Kadar Lemak ditentukan dengan menggunakan metode ekstraksi soxhlet. Labu lemak dikeringkan dalam oven, didinginkan dalam desikator dan ditimbang. Sampel sebanyak 5 gram dibungkus dalam kertas saring dan ditutup dengan kapas bebas lemak. Sampel yang telah dibungkus kemudian diletakkan di dalam alat ekstraksi soxhlet. Larutan heksana ditambahkan ke dalam labu lemak, kemudian dilakukan refluks selama minimum 5 jam hingga pelarut turun kembali ke labu lemak menjadi jernih. Pelarut yang ada dalam labu lemak didestilasi sampai habis, kemudian pelarutnya ditampung. Labu lemak setelah destilasi dipanaskan di dalam oven pada suhu 105 oC sampai berat labu tetap dan didinginkan dalam desikator. Labu beserta lemaknya ditimbang. Kadar lemak ditentukan dengan rumus:

2. Rendemen pepton kacang kedelai

Keterangan : A = berat pepton setelah dikeringkan (g) B = berat kacang kedelai utuh (g)

3. Kadar asam amino Komposisi asam amino ditentukan dengan HPLC. Sebelum dipakai, perangkat HPLC harus dibilas terlebih dahulu dengan eluen yang akan digunakan selama 2-3 jam. Begitu pula dengan syringe yang akan digunakan harus dibilas dengan akuades. Analisis asam amino dengan menggunakan HPLC terdiri atas 4 tahap, yaitu: (1) pembuatan hidrolisat protein; (2)pengeringan; (3) derivatisasi; (4) injeksi, serta analisis asam amino.(1) Pembuatan hidrolisat protein Preparasi sampel yaitu dilakukan dengan membuat hidrolisat protein. Sampel ditimbang sebanyak 0,1 g dan dihancurkan dan sampel yang telah hancur ditambah dengan HCl 6 N sebanyak 5-10 ml larutan tersebut dipanaskan dalam oven pada suhu 100 oC selama 24 jam. Hal ini dilakukan untuk menghilangkan gas atau udara yang ada pada sampel agar tidak menganggu kromatogram yang dihasilkan. Setelah pemanasan selesai, hidrolisat protein disaring menggunakan milipore berukuran 45 mikron.(2) PengeringanHasil saringan diambil sebanyak 10 l dan ditambahkan 30 l larutan pengering. Larutan pengering dibuat dari campuran antara metanol, natrium asetat, dan trimetilamin dengan perbandingan 2:2:1. Sampel dikeringkan dengan pompa vakum untuk mempercepat proses dan mencegah oksidasi.(3) DerivatisasiLarutan derivatisasi sebanyak 30 l ditambahkan pada hasil pengeringan. Larutan derivatisasi dibuat dari campuran antara larutan metanol, pikoiodotiosianat, dan trimetilamin dengan perbandingan 3:3:4. Proses derivatisasi dilakukan agar detektor mudah mendeteksi senyawa yang ada pada sampel. Selanjutnya dilakukan pengenceran dengan cara menambahkan 10 ml asetonitril 60 % dan natriun asetat 1 M lalu dibiarkan selama 20 menit. Hasil pengenceran disaring kembali dengan menggunakan milipore berukuran 45 mikron.(4) Injeksi ke HPLC Hasil saringan diambil sebanyak 20 l untuk diinjeksikan ke dalam HPLC. Perhitungan konsentrasi asam amino pada bahan dilakukan dengan pembuatan kromatogram standar menggunakan asam amino standar yang telah siap pakai yang mengalami perlakuan yang sama dengan sampel. Kondisi alat HPLC saat berlangsungnya analisis asam amino:

Temperatur kolom: 38 oC Jenis kolom : Pico tag 3,9 x 150 nm colummKecepatan alir eluen : 1 ml / menit Program : Gradien Tekanan : 3000 psi Fase gerak : Asetonitril 60 % dan Natrium asetat 1 M 40 %Detektor : UV / 254 nm Merk : Waters Kandungan asam amino pada bahan dapat dihitung dengan rumus yaitu persentase asam amino dalam 100 gram sampel : Keterangan : BMA = Berat Molekul Asam amino

4. Uji pertumbuhan mikroorganisme Pengujian kemampuan pepton sebagai sumber nitrogen dalam medium pertumbuhan mikroorganisme dilakukan dengan mengunakan jenis mikroorganisme dengan karakteristik yang berbeda. Mikroorganisme yang digunakan berasal dari isolat murni yang mewakili bakteri Gram postif dan Gram negatif yaitu Escherichia coli dan Staphylococcus aureus. Bakteri sebelum digunakan dilakukan penyegaran dulu pada media nutrient agar selama 24 jam, kemudian dipindahkan ke nutrient broth selama 24 jam, sebelum bakteri dipindahkan ke media pepton, nutrient broth diukur nilai absorbansinya sampai 0,6, apabila nilai absorbansinya telah mencapai lebih dari 0,6 maka bakteri telah siap dipindahkan pada media pepton. Medium pertumbuhan dibuat dengan melarutkan ekstrak pepton sebanyak 1 g ditambahkan air hingga 100 ml sehingga konsentrasi protein dalam media diasumsikan sebanyak 1 % (b/v). Bubuk pepton komersial digunakan sebagai media pembanding dalam menguji kemampuan daya dukung pepton kacang kedelai.Masing-masing media ditambahkan yeast extract sebanyak 0,50% dan NaCl 1%. Setelah itu medium yang telah diatur pH-nya dengan menggunakan HCl atau NaOH terlebih dahulu kemudian disterilisasi (untuk bakteri pH 7,00 0,01). Inokulasi kultur mikroba murni dilakukan dengan mengambil 1 ml kultur murni dan dimasukkan ke dalam 9 ml media yang telah diberi pepton, kemudian kultur yang telah dimasukkan ke dalam media di inkubasi dalam suhu 37 oC selama 24 jam. Pengamatan OD (Optical Density) dengan menggunakan spektrofotometer pada panjang gelombang 600 nm dilakukan untuk mengetahui tingkat pertumbuhan bakteri setiap 2 jam sekali.

5. Kelarutan dalam air Uji kelarutan air menggunakan metode gravimetri. Kertas saring dikeringkan dalam oven dengan suhu 105 oC s lama 3 jam, lalu ditimbang. Sampel sebanyak 1 g ditambah 150 mL akuades kemudian disaring dengan kertas dengan bantuan pompa vakum.

Keterangan : a = Kertas saring ditambah residub = Kertas saring awal c = berat sampel KA = Kadar air

RANCANGAN BIAYA

Jenis KeperluanJumlah Harga

A. Bahan-bahan

Kedelai1 kgRp. 7.500/kg

NaOH1 Liter Rp. 57.000/L

Heksan1 LiterRp. 69.700/L

Aquades1 LiterRp. 13.800/L

Enzim Papain10 mlRp. 10.000

Desxtrose10 grLab

Biakan Bacillus subtilis10 mlLab

Eschericha coli10 mlLab

Strepcoccus fecalis10 mlLab

Staphylociccusaureus10 mlLab

Kaldu Nutrien10 mlRp. 55.000

Media Agar10 grRp. 85.500/ 25 gr

Kapas1 BungkusRp. 10.000

B. Alat-Alat

Pengangas Air1 SetLab

Baskom1 SetLab

Oven1 SetLab

Soxhletasi1 SetLab

Gelas Piala1 SetLab

Sentrifus1 SetLab

Freezedryer1 SetLab

Otoklaf1 SetLab

Cawan Petri1 SetLab

Spektofotometer1 SetLab

Pipet Mikrometer1 SetLab

Botol MacCartney1 SetLab

Tabung Ulir1 SetLab

pH Meter1 SetLab

C. Kesekretariatan

Cetak Laporan 3 BuahRp. 10.000/Buah

Pembuatan Proposal2 BuahRp. 10.000/Buah

Total Biaya adalah Rp. 310.500,-

DAFTAR PUSTAKA

Sumardjo Damin. 2009. Pengantar Kimia; Buku Panduan Kuliah Mahasiswa Kedokteran dan Program Strata 1 Fakultas Bioeksakta. Jakarta: Penerbit Buku Kedokteran EGC.Rukmana Rahmat. 2007. Kacang Hijau; Budidaya dan Pascapanen. Yogyakarta: Penerbit Kanisisus.Wijayanti, A. T. 2009. Kajian Penyaringan dan Lama Penyimpanan dalam Pembuatan Fish Peptone dari Ikan Selar Kuning. (terhubung berkala). http/: repository.ipb.ac.id. [6 Mei 2014].