Propane diol

Abstrak Gliserol merupakan sumber daya terbarukan untuk itu dibentuk sebagai hasil sampingan selama biodiesel produksi. Karena volume produksi yang besar, tampaknya menjadi ide yang baik untuk mengembangkan teknologi yang mengubah limbah ini menjadi produk bernilai tinggi, misalnya, untuk 1,3-propanediol (1,3-PD) .Kami menyarankan biokonversi enzimatis dalam reaktor membran yang NAD koenzim dapat diregenerasi, dan tiga enzim kunci dipertahankan oleh ultrafilter 10-kDa membran. Sayangnya, beberapa produk sampingan juga terbentuk selama sukses gliserol untuk 1,3-PDbiokonversi berjalan, seperti yang biasa kami solusi enzim kasar dari Klebsiella pneumoniae. belajarkemungkinan untuk menghindari pembentukan produk sampingan ini, kami membangun deskripsi matematissistem ini. Model ini juga digunakan untuk bioconversions simulasi konsentrasi gliserol tinggidengan dan tanpa penghapusan pembentukan produk sampingan dan operasi terus-menerus.Kata kunci 1,3-Propanediol. Klebsiella pneumoniae. Biokonversi enzimatik. Pemodelan

Pengenalan1,3-propanadiol (1,3-PD) telah menjadi salah satu bahan baku yang paling menarik untuk kimiaindustri di 15 tahun terakhir karena bewidely dapat digunakan di daerah yang berbeda frominks untuk medisaplikasi (misalnya, salah satu turunannya dapat digunakan untuk mencegah penolakan organ baru setelahTransplantasi [1]). Selain itu, 1,3-PD itu yang paling banyak digunakan dalam industri polimersejak tahun 1995, ketika Shell Chemical meluncurkan teknologi sintetik baru yang efisien untuk perusahaanproduksi sebagai monomer untuk plastik baru yang disebut Corterra. Ini jenis baru plastik terbuktimenjadi paling menguntungkan untuk memproduksi serat dan tekstil untuk digunakan dalam industri pakaian.Saat ini, produksi 1,3-PD dunia adalah lebih dari 100.000 t tahunan. Meskipun Bioproduksi1,3-PD akan lingkungan lebih ramah daripada sintesis kimia, Degussamulai hanya pada tahun 2006 bioproses pertama berdasarkan fermentasi Escherichia coli rekombinan.Teknologi ini memanfaatkan glukosa sebagai bahan baku, yang pertama dikonversi ke gliserol olehproduk gen gen Saccharomyces cerevisiae, dan gliserol yang kemudian dikonversi menjadi 1,3-PDoleh produk gen dari regulon dha dari Klebsiella pneumoniae. Proses ini membutuhkanSelain dari agak mahal koenzim B12 yang mutlak diperlukan untuk dehidrasigliserol oleh gliserol-dehidratase (GDHt, EC 4.2.1.30), dan E. coli tidak dapat menghasilkan inikofaktor. Sebuah kelemahan tambahan dari proses fermentasi de novo adalah bahwa mereka biasanyamemiliki hasil produk yang lebih rendah sebagai konsekuensi dari pertumbuhan sel yang diperlukan dan pemeliharaankarbon dan kebutuhan energi dan pembentukan sesekali sampingan.Tujuan utama dari penelitian ini adalah untuk mengembangkan teknologi biologis baru memanfaatkanlebih baik didefinisikan proses enzimatik untuk produksi 1,3-PD. Metodologi ini adalah untuk menerapkantiga enzim kunci: gliserol-dehidratase, (GDHt, EC 4.2.1.30), 1,3-propanadiol-oxydoreductase(PDOR, EC 1.1.1.202), dan gliserol-dehidrogenase (GDH, EC 1.1.1.6) dalam batch diadukreaktor membran, di mana koenzim NAD + / NADH2 dibuat ulang, dan B12 dapat dipertahankandengan teknik imobilisasi yang tepat. Sketsa teoritis bioproses ini ditunjukkan pada Gambar. 1.Dalam tulisan ini, kami menjelaskan hasil eksperimen kami memperoleh dengan biokonversi awal kamisistem dioperasikan dengan larutan campuran enzim kasar diambil dari disonikasi K. pneumoniaesel dan menerapkan 4-8 g / l gliserol sebagai konsentrasi substrat awal dan mengandungtambah B12 dan NAD +. Model matematika kita dibangun atas dasardiukur data dengan sistem yang disederhanakan ini dan simulasi diwujudkan dengan model inimembantu studi menyeluruh dari beberapa fitur dari sistem; sedangkan berbagai ide muncul dibagaimana untuk menghindari reaksi samping.Bahan dan MetodeK. pneumoniae diperoleh dari DSMZ (no. 2026). Pemeliharaan ketegangan, media kulturdan parameter fermentasi, dan metode persiapan larutan enzim yangditerbitkan sebelumnya [2]. Untuk resuspending sel dipanen, HEPES penyangga pH = 7,4mengandung 50 mM N- (2-Hydroxyethyl) -piperazine-N '- (asam 2-ethanesulfonic) dan 0,1 mMMnCl2, dan 2 mM dithiothreitol digunakan.

Gliserol, NAD, dan MnCl2 diperoleh dari Reanal (Hungaria); bahan kimia lainnyaberasal dari Sigma.Aktivitas enzim PDOR diukur dengan metode Lin yang dimodifikasi [3]. PengujianCampuran terkandung 100 mM NAD +, 100 mM 1,3-PD, dan 100 mM pH = 9,0 penyangga bikarbonatdengan 30 mM (NH4) 2SO4 dalam 1 cm3 volume akhir. Perubahan absorbansi (yang disebabkan olehpembentukan mengurangi NADH) diikuti photometrically di 340 nm dan 25 C. Karenapenggunaan larutan enzim mentah mengandung banyak senyawa lain yang berbeda, kami dipantauperubahan absorbansi 8 menit lama sebelum memulai reaksi, dan ketika absorbansiperubahan yang disebabkan oleh reaksi latar belakang telah berhenti, kami memberi substrat 1,3-PD kecampuran assay dan terus memantau perubahan absorbansi untuk lebih lanjut 7 menit.Aktivitas GDH ditentukan sama menggantikan 1,3-PD dengan 1 M gliserolsolusi sebagai substrat. Kegiatan GDHt diukur dengan metode Toraya ini MBTH [4].Biokonversi itu dilakukan dalam pelarut Tahan Sel Diaduk (Millipore) dilengkapidengan pengaduk magnet dan 10-kDa ultrafilter membran untuk mempertahankan enzim selamasampling.Komposisi sampel yang diambil dari fermentasi dan reaksi enzim kaldu yangdianalisis dengan kromatografi cair kinerja tinggi Waters Breeze (HPLC) sistemdilengkapi dengan RI detektor dan autosampler dengan BioRad Aminex HPX-87H 300 7,8 mmkolom pada 65 C dan 0,5 ml / menit debit air ultra murni yang mengandung 5 mM H2SO4.Sebagai gliserol dan dihidroksiaseton tidak dapat diukur pada saat yang sama dari yang samasampel dengan metode kromatografi ini, gliserol ditentukan photometrically pada 37 Cdan 500 nm menggunakan kit enzim reagen (GPO; Reanal, Hungaria; http://www.reanal.hu/magyar / humagy / triglicerid-m-a.pdf).1,3-Dihydroxyacetone (DHA) diukur dengan o-toluidin reagen kit (Sigma T-1199).Berkeley Madonna 8.01 software yang digunakan untuk simulasi model matematika.Hasil dan DiskusiBioconversions enzimatik sukses dilakukan dengan larutan enzim kasar dari K.pneumoniae. Campuran reaksi mulai terdiri dari 4 g / l gliserol, 0,28 g / l NAD +, dan0,25 g / l B12 dalam 20 ml volume reaksi. Konsentrasi enzim yang 0,015 U / mlPDOR, 1,365 U / ml GDH, dan 0,085 U / ml GDHt. Setelah 24 jam, konversi adalah 88%, dancampuran reaksi mengandung 46% 1,3-PD, 10% DHA dan 15% asam asetat (AcOH). Itupenampilan asam asetat sampingan berarti bahwa harus ada serangkaian sisiReaksi ini setelah fosforilasi DHA karena dapat diikuti pada Gambar 2. Untuk membuatkemungkinan untuk menghindari reaksi samping yang tidak diinginkan, kami telah menetapkan suatu matematikadeskripsi sistem ini.

Bangunan ModelMerumuskan persamaan model matematis yang menggambarkan biokonversi gliserol danreaksi metabolisme lebih lanjut sesuai dengan peta pada Gambar. 2, kami menggunakan Michaelis- sederhanaMenten (misalnya, Persamaan. 1) reaksi satu-substrat untuk reaksi tidak ada. 1, 5, 8, 9, 11, dan12; sedangkan mekanisme bi-bi acak reaksi dua-substrat diasumsikan untuk beroperasidalam kasus reaksi koenzim-linked ada. 2-4, 6, 7, 10, dan 13 (sebagai contoh, lihatEq. 2).

Reaksi tidak ada. 1-13 diperhitungkan untuk pemanfaatan non dipisahkanenzim "sup" dalam model matematika pertama kami. Deskripsi matematis ini terdiri daripersamaan laju reaksi pada Gambar 13. 1 dan 21 ekspresi keseimbangan massa untuk 18berbagai senyawa dan tiga enzim kunci (GDHt, BAU, dan GDH) dari jalur tersebut.Karena sampel diambil dari sistem reaksi melalui membran ultrafilter, yangenzim dipertahankan dalam sistem. Pada saat yang sama selama 24 jam biokonversi, yangtotal volume menurun; Namun, perubahan volume ini diperhitungkan dalam massapersamaan keseimbangan.Konstanta kinetik Sayangnya tidak semua yang diperlukan untuk K. pneumoniae enzim dapatditemukan dalam sumber-sumber sastra; dengan demikian, kami menggunakan Brenda Enzim Data Bank untuk menentukan lebih rendahdan batas yang lebih tinggi mungkin untuk parameter yang tidak diketahui atas dasar mikro lainnya

organisme. Selama proses estimasi parameter, model software pas diizinkanuntuk bergerak di antara Restrains ini untuk menghindari lebih dari satu "terbaik pas" parameterkombinasi yang biasanya terjadi ketika seseorang memiliki model multiparameter dan sejumlahdiukur data.Menurut reaksi tidak ada. 4, 7, 10, dan 13 dari Gambar. 2, pembentukan asetat sampingankebutuhan adenosine triphosphate / adenosin difosfat (ATP / ADP) yang hadir dalamenzim "sup" pada konsentrasi yang tidak diketahui. Dengan demikian, konsentrasi ini juga parameteryang akan ditentukan. Parameter dari model pertama menggambarkan 1,3-PD sebagai produk utamadan ditentukan oleh model pas dikumpulkan dalam Tabel 1.Dengan kombinasi ini parameter model, perilaku diprediksi reaksisistem mengikuti garis kontinyu pada Gambar. 3 bersama dengan poin diukur.Atas dasar korespondensi relatif baik antara kurva model danData diukur, kami mencoba untuk memprediksi perilaku eksperimen biokonversi lain di manasolusi enzim berasal dari lain run fermentasi. Namun, matematikamodel dengan parameter Tabel 1 tidak dapat benar menggambarkan perilaku merekaeksperimen di mana bukan 1,3-PD dan pembentukan DHA saja, AcOH muncul dengan 83%hasil dan 96% konversi (PDOR, 0,003 U / ml; GDH, 0,258; GDHt, 0,025 U / ml; V = 0,06 l,tanpa membran ultrafilter, yakni dengan limbah enzim karena sampling). Untuk mengertibagaimana mantan asetat sampingan menjadi produk utama, kami mencoba untuk meningkatkan model kami.Bottleneck dari model pertama kami adalah bahwa ketika aktivitas enzim terlalu sedikit hadir dijalan 1,3-PD, NADH2 dihasilkan dari jalur Gliserol-DHA-AcOH tidak bisaregenerasi efektif. Karena, menurut model, pembentukan asam asetat tidak bisareoxidize NADH2 ke NAD +, yang akan digunakan kembali di jalur asam asetat, dan modeltidak bisa memprediksi seperti hasil tinggi asam asetat, konsentrasi, dan konversi sebagai diukurnilai. Biebl et al. [5] menggambarkan pemanfaatan piruvat di Enterobactericae. Mereka mengklaimbahwa dari piruvat, asam laktat dapat timbul menggunakan NADH2 sepanjang gliserol anaerobikpemanfaatan jalur. Meskipun kami mampu mendeteksi munculnya laktat, namunKonsentrasi sangat kecil sehingga tidak dapat diukur secara kuantitatif baik dalamfermentasi kaldu atau setelah biokonversi tersebut. Belajar Database Brenda Enzim, kamimenemukan bahwa laktat 2-monooxygenase (EC 1.13.12.4) dapat mengkonversi asam laktat untuk asetatasam dalam satu langkah. Namun demikian, reaksi ini masih belum cukup untuk NADH2 diperlukanregenerasi; apalagi, untuk memetakan seluruh jalur itu bukan tujuan utama kami. Kami membangunReaksi-17 ke dalam model (berikut Michaelis-Menten kinetika) sebagai "kotak hitam"penyederhanaan, dengan yang NADH2 dapat diregenerasi untuk NAD +.Di sisi lain, banyak sumber literatur merujuk pada fakta bahwa enzim GDHt mengalamibunuh diri inactivationwith koenzim yang (koenzim-B12) setelah mengkonversi satu molekul gliserol(Konstanta peluruhan dari GDHt kd, 1 = 0,1489 [1 / h]) [6]. Dalam sel-sel hidup, ada sebuah mengaktifkankompleks protein, yang dapat memisahkan dan mengaktifkan kembali koenzim dan juga enzim.Sementara itu, kami belajar [7] bahwa mekanisme GDH ini dikenal, dan ia mengikuti sebuah memerintahkankinetika multisubstrate bi-bi.Kami menyelesaikan Model 1 dengan fitur ini, mendapatkan Model baru 2 dan pas keData eksperimental, yang mengakibatkan 1,3-PD sebagai produk utama (Gambar 4;. Tabel 1, keduakolom).Sebagai langkah kedua, kita dipasang Model 2 dengan yang data eksperimen, di mana asam asetat adalahproduk utama terbentuk. Selama proses fitting ini, semua ri, nilai max yang baruditentukan karena larutan enzim berasal dari fermentasi yang berbeda run, sehinggakonten enzim dari sel-sel berbeda dari mantan satu. ATP awal dan konten ADP daricampuran reaksi (awalnya hadir dalam larutan enzim kasar) juga baru dipasang(Gambar 5;. Tabel 1, 2 Model untuk AcOH).

Ini pengembangan model dua langkah dan prosedur pas akhirnya mengakibatkan parameternilai yang ditetapkan, sama-sama cocok untuk cukup baik dijelaskan baik 1,3-PD dan pembentukan AcOH.Penghambatan Studi dengan Model SimulasiTampaknya menjadi ide yang baik untuk mencegah konversi lebih lanjut dari DHA untuk DHAP melaluifosforilasi dalam reaksi langkah no. 4 (Gambar. 2) dengan menghambat aktivitasdihidroksiaseton-kinase enzim (EC 2.7.1.29).Eksperimen simulasi dilakukan dengan menjalankan percobaan pertama (di mana utamaproduk adalah 1,3-PD), menerapkan model untuk menguji cara yang mungkin untuk mengurangipembentukan produk sampingan dengan DHA struktur analogons sebagai potensi kompetitif atau ireversibelinhibitor. Gambar 6 menunjukkan efek dari berbagai jenis penghambatan Dhak menurutmodel simulasi.Dalam studi inhibisi ini, kami harus mematikan "kotak hitam" reaksi (no. 17), karenaterus reoxidized NADH2 secara independen pada penghambatan Dhak, meskipun tentuharus ditempatkan setelah fosforilasi DHA.Hal ini diketahui [8] yang Chloro-3-hydroxyacetone (Clha) adalah inhibitor kompetitif untuk Dhak.Gambar 6a menggambarkan hasil simulasi dengan inhibitor kompetitif ini, Clha. Penambahaninhibitor kompetitif ini tidak berpengaruh pada konsentrasi akhir dari produk. Bukan itumengejutkan karena Bowden [11] menyatakan bahwa hambatan kompetitif (di sel-sel hidup) yangrelevan, dan tidak kompetitif hambatan bermain lebih peran regulasi. Gambar 6b menunjukkansimulasi dengan menambahkan inhibitor nonkompetitif fiktif dengan Ki yang seharusnya menjadisama dari Clha. Dengan cara ini, dapat mencapai konsentrasi inhibitor yang efektif, di manaProduk hanya 1,3-PD dan DHA dengan hasil ca. 47 dan 53%. Namun, secara teoritis, ituakan lebih menguntungkan untuk menggunakan inhibitor ireversibel (Gambar. 6c), yang akansepenuhnya menghilangkan enzim yang tidak diinginkan (Dhak) dan reaksinya. Dengan cara ini, itusimulasi dengan hipotesis pertama agar pembusukan dari Dhak (kami seharusnya sebuah kd sangat tinggi, 4 =0,0405 [1 / h]). Namun demikian, dengan menggunakan inhibitor seperti itu dapat mengakibatkan hanya 48% 1,3-PD dan 48%DHA samping dari 4% AcOH jika inhibitor diterapkan di 0,0002 g / l konsentrasi. Lebih tinggikonsentrasi inhibitor ireversibel tidak menguntungkan karena jika aktivitas total Dhakadalah dihilangkan, ATP / ADP tidak dapat diregenerasi; meskipun ATP yang dibutuhkan oleh GDHtregenerasi (Gbr. 2, reaksi tidak ada. 14). Tanpa ATP regenerasi, regenerasi GDHt akanjuga berhenti dan, tentu, pembentukan produk, juga. Dalam hal ini, hanya pembentukan produk sedikit

terjadi karena sampai ATP awal berkurang dari sistem, GDHt akan terusdiregenerasi, dan ketika ATP adalah benar-benar kelelahan, GDHt perlahan habis.Sebagai kesimpulan dari penelitian ini penghambatan, kita dapat menyatakan bahwa tanpa hambatan, 1,3-PDdan AcOH sebagai produk utama akan terbentuk; Namun, menambahkan inhibitor nonkompetitif,produk utama akan DHA dan 1,3-PD di samping AcOH sedikit. Selain itu, menerapkaninhibitor ireversibel dalam konsentrasi lebih rendah dari Dhak, situasi yang sama seperti diKasus kompetitif; sedangkan konsentrasi inhibitor ireversibel tinggi adalah menguntungkan.Pembentukan asam asetat hanya dapat dihilangkan dengan menerapkan kompetitifinhibitor; Namun, dalam kasus itu, konsentrasi yang sangat tinggi dari inhibitor yang dibutuhkan, dan lebihDHA dari 1,3-PD akan terbentuk (1,3-PD lebih berharga).Simulasi Pengaruh Enzim dan Gliserol KonsentrasiUntuk meningkatkan kinerja bioreaktor, cara paling sederhana adalah untuk meningkatkan konsentrasibioconverting enzim dan substrat awal. Untuk mengkonversi jumlah yang lebih tinggi dari gliserol untuk 1,3-PD, kita harus memiliki aktivitas enzim yang lebih tinggi dalam reaktor. Untuk mensimulasikan percobaan ini, kami menggunakanfaktor konsentrasi untuk enzim, yang dapat dibilang dicapai, misalnya, dengan berkonsentrasisolusi enzim dengan ultrafiltrasi. Hal ini dapat dilihat pada gambar. 7a bahwa 20 kali lipat terkonsentrasilarutan enzim mengkonversi 100 g / l gliserol menjadi 45 g / l 1,3-PD dan 19 g / l AcOH

tanpa inhibitor (akumulasi intermediers kehabisan sangat lambat [ca 560 h] danakhirnya membentuk AcOH 56 g / l). Menerapkan 1 g / l dari inhibitor nonkompetitif (Gambar. 7b) mencapaikonversi ke 53 g / l 1,3-PD dan 38 g / l DHA samping dari 5 g / l AcOH di operasi batch cukupcepat. Menggunakan 0,0031 g / l hasil inhibitor ireversibel di 51 g / l 1,3-PD dan 46,4 g / l DHAsamping dari 2,5 g / l AcOH (Gambar. 7c).Pemodelan Mode OperasiDeskripsi matematis ini juga cocok untuk mensimulasikan sistem bekerja secara kontinyumodus operasional. Kami seharusnya bahwa koenzim dipertahankan oleh membran reaktor,karena mereka benar-benar dapat bergerak secara eksperimental [12-14]. Pada Gambar. 8, contoh tanpapenghambatan ditunjukkan di mana dua bagian yang berbeda dari proses biokonversi harusdibedakan: (1) angkatan memulai dan (2) terus beroperasi pada tingkat umpan konstan. Sebuah stabilnegara terjadi di mana 8 g / l gliserol dengan F = 0,0001 l / h hasil tingkat pakan campuran reaksimengandung 0.81 g / l AcOH, 1,21 g / l DHA, 4 g / l 1,3-PD, dan 0,25 g / l gliserol belum bertobat.Menurut simulasi, 1,3-diphospho-glycerate menyetarakan keseimbangan massa, yang stabilKonsentrasi negara 1.56 g / l.Seperti yang disarankan mengenai studi inhibisi, menerapkan inhibitor ireversibel dalamkonsentrasi lebih rendah dari Dhak, AcOH selalu tetap sebagai produk sampingan (0,17 g / l).Namun, jika konsentrasi inhibitor lebih tinggi dari konsentrasi Dhak, asam asetatpembentukan berhenti, tapi pada saat yang sama, ATP regenerasi langkah akan dihilangkan, yangakibatnya istirahat GDHt regenerasi dan pembentukan produk, juga.

Penghambatan kompetitif (3 g / l konsentrasi inhibitor) menyebabkan 4,6 g / l DHA dan 3 g / l 1,3-PD, dan 0,13 g / l tersisa gliserol (Gambar. 9). Asam asetat cukup baik dihilangkan (0,21 g / l).Simulasi kami menunjukkan bahwa tujuan asli dari kami kerja yaitu DHA simultandan produksi 1,3-PD pada gliserol substrat-tidak dapat direalisasikan dengan campuran enzim bakuK. pneumoniae karena baik AcOH terbentuk sebagai produk sampingan, atau jika produksinya berada di bawahberbagai hambatan, maka jalur ATP-memproduksi juga dihilangkan. Dengan demikian, ATPdependentGDHt regenerasi tidak dapat mengaktifkan kembali bunuh diri tidak aktif B12-GDHt-kompleks.Satu-satunya kemungkinan untuk mengatasi masalah ini adalah dengan menggunakan enzim dari sepertimikroorganisme yang GDHt tidak perlu regenerasi ATP-dependent. Satu-satunyabakteri dengan GDHt seperti adalah Clostridium butyricum VPI1718 [15] karena GDHt nyamenggunakan S-adenosyl-metionin sebagai koenzim. Enzim ini dan koenzim tidak membentuk apapunkompleks tidak aktif, sehingga tidak ada kebutuhan untuk regenerasi. Kami menyarankan bahwa menggunakan iniEnzim Clostridium dapat memecahkan masalah sampingan pembentukan, untuk kegiatan Dhak bisadihilangkan bagaimanapun (misalnya, menghapus enzim ATP-dependent atau ATP atau menerapkaninhibitor).KesimpulanAkan sangat menguntungkan untuk mengembangkan biokonversi enzimatik koenzim-regenerasidalam reaktor membran untuk produksi 1,3-PD. Dengan enzim kunci mentah (lebihbenar bahwa enzim "sup") dari K. pneumoniae, kami membuat beberapa gliserol suksestransformasi untuk 1,3-PD dan mengatur model matematika yang kompleks untuk menggambarkan keseluruhanproses. Simulasi ini jelas menunjukkan bahwa tidak mungkin untuk menghasilkan DHA dan 1,3-PD sebagai produk utama tunggal dengan campuran ini enzim karena AcOH selalu diproduksisebagai hasil sampingan unfavored. Simulasi juga menunjukkan bahwa pembentukan produk sampingan initidak bisa dihilangkan dengan cara apapun karena berfungsi tidak hanya produk sampingan yang tidak diinginkan, tetapi jugaATP, yang penting untuk regenerasi enzim kunci pertama (GDHt). Didasar kami percobaan in silico, itu adalah probabilitas tinggi yang tidak mungkin untuk melaksanakangliserol ini biotransformasi untuk 1,3-PD dan DHA bersamaan dengan minyak mentah iniSumber enzim unpurified dari K. pneumoniae. Adanya enzim lain yang mungkinsumber, yaitu, Clostridium butyricumVPI1718 dapat memecahkan masalah sampai sekarang dibahas sebagaienzim GDHt yang tidak perlu regenerasi ATP-dependent. Sukses gliserolbiotransformations untuk 1,3-PD dengan campuran enzim tersebut akan disajikan dalam berikutnyalaporan.