projeto rm da neuromelanina como biomarcador da …
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CANDIDATURA À BOLSA DE INVESTIGAÇÃO FUNDAÇÃO ASTRAZENECA / FACULDADE DE MEDICINA DA UNIVERSIDADE
DE LISBOA
PROJETO RM da Neuromelanina como biomarcador da associação entre
Melanoma e Doença de Parkinson
Candidato: Carla Filipa Pestana Leão Guerreiro, MD
Orientador: Sofia Cristina Pereira Coutinho Reimão, MD, phD
Unidade de investigação: Clínica universitária de Imagiologia da FMUL
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Índice
Título........................................................................................................................... 3 Palavras-chave ........................................................................................................... 3 Introdução ................................................................................................................... 3 Objectivos ................................................................................................................... 5 Programa de trabalho e calendarização ..................................................................... 5 Equipa de projecto ...................................................................................................... 8 Resultados previsíveis ................................................................................................ 9 Implicações éticas ...................................................................................................... 9 Orçamento detalhado ............................................................................................... 10 Referências bibliográficas ......................................................................................... 10
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Título RM da neuromelanina como biomarcador da associação entre Melanoma e Doença de Parkinson
Palavras-chave Doença de Parkinson, Melanoma, Neuromelanina
Introdução
Doença de Parkinson (DP)
A DP é a segunda doença neurodegenerativa mais frequente em todo o mundo e tem
uma prevalência estimada em Portugal de cerca de 18.000 doentes (1), com um
aumento esperado de incidência na próxima década com o envelhecimento da
população (2). A idade é o principal fator de risco associado ao desenvolvimento da
DP, que é conhecido por aumentar significativamente após os 60 anos (3).
Pensa-se que a DP resulta de uma interação complexa entre genes e fatores
ambientais. O facto da maioria dos casos de DP serem esporádicos, sendo apenas
cerca de 10% de casos familiares (4), sugere que os fatores de risco podem
desempenhar um importante papel etiológico. Um grande número de estudos
epidemiológicos demonstrou fortes associações de risco positivo e negativo para
desenvolvimento de DP com vários fatores ambientais, como o consumo de cafeína
e o tabagismo (4–7). Esses fatores podem ser uma pista para compreender a
fisiopatologia da doença e até mesmo abrir uma possibilidade para o desenvolvimento
de intervenções modificadoras da doença.
DP e Melanoma
O melanoma é um tumor maligno de células produtoras de melanina (melanócitos),
com apresentação normalmente na pele. Apesar de não ser a forma mais comum de
cancro da pele, a sua incidência tem vindo a aumentar paulatinamente ao longo dos
anos (8).
Vários estudos epidemiológicos descreveram uma maior incidência de melanoma em
doentes com DP e vice-versa (5,6). O maior estudo prospetivo de melanoma na DP
relatou um aumento de sete vezes do risco relativo de melanomas nesta população
(7). Outro estudo associou o diagnóstico de melanoma a um aumento do risco de
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desenvolvimento subsequente de DP em 50%(9). Também dados de um estudo que
incluiu 160 000 indivíduos sem doença neurológica mostrou que indivíduos com
história familiar de melanoma têm mais que o dobro do risco de desenvolver DP (10).
Além disso, a associação negativa entre o tabagismo e a incidência de DP favorece
a noção de que a melanose do fumador potencialmente protege contra melanomas e
DP (11).
Neuromelanina (NM): o elo de ligação entre DP e Melanoma?
A DP é patologicamente caracterizada pela depleção neuronal dopaminérgica da
substancia nigra (SN) pars compacta e pela presença de corpos de Lewy e neurite
de Lewy, inclusões intracelulares primárias compostas de alfa-sinucleína (α-SYN)
(12). A perda de pigmentação da SN, também uma característica conhecida da DP,
está relacionada com perda de um pigmento negro chamado NM, uma alteração que
ocorre no início da doença e que até foi descrita em estágios pré-clínicos (13). A perda
de NM foi também descrita em associação com o envelhecimento (14).
Apesar da ser há muito conhecido que a despigmentação característica da SN na DP
se relaciona com a perda NM, a investigação do papel da NM na fisiopatologia da DP
é uma área recente de investigação.
A NM é uma substância resultante do metabolismo da dopamina e da noradrenalina,
que se pensa proteger os neurónios do stress oxidativo mediado por metais livres ou
radicais livres (15). Este pigmento de melanina deriva do aminoácido tirosina e as
enzimas tirosinase (TYR) e tirosina hidroxilase (TH) estão envolvidas na sua
biossíntese (16). Estas enzimas, envolvidas na biossíntese de melanina e dopamina,
estão presentes tanto em melanócitos cutâneos (17) como em células
dopaminérgicas da SN (18). A descoberta de que a α-SYN pode interagir com a TYR
(19) e inibir a TH (16) implica a α-SYN na regulação da síntese de NM, possivelmente
explicando a associação entre DP e melanoma. Por outro lado, também foi
demostrado que a cafeína modula a α-SYN, o que implica mais uma vez a NM na
associação negativa entre consumo de cafeína e a incidência de DP (20).
Sequências de ressonância magnética (RM) sensíveis à NM
Em estudos recentes (21–24), nomeadamente do nosso grupo de investigação (21)
(anexo 1), foi utilizada uma sequência específica de imagem de RM para o estudo da
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NM na SN (21,22,25), uma vez que as propriedades paramagnéticas deste pigmento
resultam em hipersinal em sequências de RM específicas ponderadas em T1. Nestes
estudos foi descrita uma redução significativa no sinal gerado pela NM na SN de
doentes com DP (22,25,26), permitindo a deteção in vivo da degenerescência de
neurónios da SN com um padrão característico, que reproduz as alterações
patológicas conhecidas na DP e permite o diagnóstico em estádios muito precoces
de doença e até em estádios pré-clínicos (21). Estes achados sugerem a NM como
um possível biomarcador válido de degenerescência da SN em pacientes com DP.
Estas sequências de RM são um método amplamente disponível e livre de risco para
investigar a relação entre melanoma e DP, estudando a NM.
A identificação de alterações na NM em doentes com melanoma poderá contribuir
para a compreensão da fisiopatologia da DP e ainda poderá permitir a identificação
de uma ligação adicional entre melanina cutânea e neuromelanina.
Objectivos Os objetivos específicos deste trabalho são:
Objetivo primário: Comparar a NM na SN de doentes com diagnóstico de
melanoma e de controlos.
Iremos avaliar quantitativamente a NM (área e intensidade de sinal) na SN
usando sequências de RM específicas.
Objetivo secundário: Estudar a melanina da pele e correlacionar a melanina
cutânea com a NM da SN.
Iremos comparar os valores de NM obtidos por RM com a melanina cutânea,
medida através de espectrofotometria e quantificação de tecido (biópsia).
Programa de trabalho e calendarização Para estudar a relação entre melanoma e a neuromelanina na SN, vamos realizar um
estudo prospetivo caso-controlo, de cariz multidisciplinar, com a colaboração das
especialidades de Neurorradiologia, Neurologia e Dermatologia do Centro Hospitalar
de Lisboa Norte.
Este estudo incluirá duas visitas: a primeira visita para avaliação do potencial para
inclusão no estudo; a segunda visita para colheita de dados epidemiológicos, para
avaliação clínica neurológica, para avaliação dermatológica e para o estudo por RM.
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1) Participantes
Serão recrutados os participantes que concedam um consentimento informado e que
cumpram os seguintes critérios de inclusão:
• Casos: Doentes com diagnóstico de melanoma realizado no Departamento de
Dermatologia do Centro Hospitalar de Lisboa Norte (CHLN) nos anos 2016 a
2018, recrutados de forma consecutiva;
• Controlos: Familiares (por exemplo, cônjuges), emparelhados para idade,
com história similar de exposição à radiação ultra-violeta;
• Idade ≥ 18 anos.
Serão critérios de exclusão os seguintes:
• História de demência ou alteração cognitiva, diagnóstico clínico de DP ou
síndrome parkinsónico atípico;
• Metastização cerebral conhecida
• Contra-indicação para realização de RM em equipamento 3.0 Tesla
(nomeadamente com dispositivos implantados ativados mecanicamente,
magneticamente ou eletronicamente, cujo funcionamento pode ser alterado
por técnicas de imagem RM, corpos estranhos ferromagnéticos ou dispositivos
implantados incompatíveis com o scanner);
• Ansiedade ou claustrofobia, que não permitam a realização de RM;
• Gravidez - conforme reportado pelo próprio participante ou por teste de urina
positivo para gravidez realizado nos 5 dias anteriores à RM.
2) Recolha de dados epidemiológicos
Um questionário epidemiológico detalhado avaliará a exposição prévia de cada
participante a fatores de risco de DP conhecidos (27) - possíveis fatores
confundentes.
3) Avaliação dermatológica
Um dermatologista realizará uma avaliação completa da pele de todos os indivíduos
para excluir a presença de melanoma em indivíduos controlo e a história pessoal e
familiar de melanoma será registada. Além disso, será realizada avaliação por
espectrofotometria, bem como biópsia do braço (zona não foto-exposta) para
determinar a concentração de melanina.
Commented [DFPMP1]: Leonor: será que temos de incluir aqui a forma como será feita essa determinação?
Commented [DFPMP2]: Ver com dermatologia se se inclui
7
4) Avaliação Neurológica
Todos os sujeitos serão avaliados por um investigador especializado na avaliação de
doentes com doenças do movimento, que aplicará escalas standard de avaliação da
DP, i.e., o score da Movement Disorders Society - Unified Parkinson’s Disease Rating
Scale (MDS-UPDRS) (28).
Adicionalmente, serão também incluídos testes neurocognitivos, o Montreal Cognitive
Assessment (MOCA)(29), e a avaliação da escala de depressão de Beck (30).
5) Estudo RM crânio-encefálica
As imagens de RM serão adquiridas com um protocolo dedicado num equipamento
3.0T, incluindo uma sequência T1 específica sensível à NM na SN (área, intensidade
do sinal). Outras sequências morfológicas serão incluídas para excluir alterações
cerebrais que possam interferir com a análise. Se qualquer aspecto patológico for
encontrado, os indivíduos serão informados e/ ou referenciados aos seus médicos
assistentes. Todas as análises dos estudos de RM serão realizadas por um
neurorradiologista, cego para os dados clínicos e demográficos do examinado.
6) Criação de base de dados de RM e dados epidemiológicos
Será criada uma base de dados para estudos subsequentes, observando as leis
relativas ao anonimato e à privacidade dos dados, incluindo:
o Informação epidemiológica detalhada sobre fatores de risco de DP;
o Registo de avaliações clínicas, de acordo com avaliações standard de DP e
testes de função cognitiva;
o Repositório de imagens de RM.
7) Análise dos dados
O outcome primário será a área e intensidade do sinal da NM na SN (outcome
contínuo) e os preditores serão os grupos melanoma/ controlo (preditor dicotómico),
que serão correlacionados com um teste-t. Adicionalmente, será realizada regressão
múltipla ajustando para outros fatores de risco de DP/ fatores confundentes. Com base nos resultados prévios de Reimão et al., Mov Disord 2015 (15), admitimos
que uma diferença de 10% (2,5mm2) na área média e largura do hipersinal T1 na SN
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entre casos e controlos é de relevância fisiopatológica e significativa para um estudo
exploratório. Considerando a distribuição normal dos dados e o desvio padrão
encontrado em controlos saudáveis em estudos anteriores, a inclusão de 65 doentes
de melanoma (casos) e 65 indivíduos controlo, ajustados para sexo e idade, permitirá
rejeitar a hipótese nula de que a diferença é zero com probabilidade (potência) 0.8. A
probabilidade de erro Tipo I associada a este teste é de 0,05.
Finalmente, o conteúdo de melanina cutânea determinado por espectrofotometria e
biopsia de tecido será correlacionado com a área da NM na SN determinada por RM
(outcome secundário), usando um teste-t.
Calendarização
Equipa de projecto
Carla Guerreiro, MD- médica interna de Neurorradiologia no Centro Hospitalar de
Lisboa Norte, Investigador responsável
Sofia Reimão, MD, PhD – Neurorradiologista no Centro Hospitalar de Lisboa Norte,
responsável pela Clínica Universitária de Imagiologia da Faculdade de Medicina da
Universidade de Lisboa, Aquisição de imagem e orientação e supervisão do projeto
Actividade Início Conclusão
Submissão do estudo à Comissão de ética 01-10-2018 30-10-2018
Recrutamento dos participantes (primeira visita) 01-12-2018 31-05-2019
Avaliação dermatológica, avaliação neurológica e RM
(segunda visita) 01-12-2018 30-06-2019
Optimização de sequências e pós-processamento 01-11-2018 31-03-2019
Análise das imagens de RM 01-01-2019 31-07-2019
Criação de base de dados 01-01-2019 31-07-2019
Análise de dados 01-08-2019 30-09-2019
Exploração e disseminação de resultados 01-10-2019 31-12-2019
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Joaquim J. Ferreira, PhD, MD - Neurologista, responsável pelo Laboratório de
Farmacologia Clínica e Terapêutica da Faculdade de Medicina da Universidade de
Lisboa, orientação e supervisão do projeto.
João Maia Silva, MD, PhD – Dermatologista no Centro Hospitalar de Lisboa Norte,
Avaliação clínica dos participantes
Leonor Lopes, MD – Dermatologista no Campus Neurológico Senior, Avaliação clínica
dos participantes
Leonor Correia Guedes, MD, PhD – Neurologista no Centro Hospitalar de Lisboa
Norte, Avaliação clínica dos participantes
Madalena Rosário, MD - Médica interna de Neurologia no Centro Hospitalar de Lisboa
Norte, Avaliação clínica dos participantes
Rita Nunes, PhD – Engenheira Física, Instituto Superior Técnico, optimização de
sequências de imagem
Daisy Abreu, MsC- Estatista, Laboratório de Farmacologia Clínica e Terapêutica da
Faculdade de Medicina da Universidade de Lisboa, análise estatística.
Resultados previsíveis Com base nos dados epidemiológicos prévios, esperamos encontrar uma redução
significativa de NM na SN em doentes com melanoma. Antecipamos também que a
biópsia cutânea e a avaliação da melanina cutânea revelem uma menor concentração
deste pigmento, correlacionando-se com os níveis de NM na SN.
A identificação de alterações na NM da SN por RM em doentes com melanoma pode
fornecer pistas adicionais sobre a fisiopatologia da DP, nomeadamente os
mecanismos da associação entre melanoma e DP, por intermédio da α-syn.
A detecção de alterações na NM por RM em doentes pré-sintomáticos com melanoma
pode sustentar a utilização desta técnica de imagem como um biomarcador válido da
degenerescência da SN e contribuir para a identificação de candidatos para futuros
ensaios clínicos com agentes modificadores da doença.
Implicações éticas Todas as avaliações clínicas e imagiológicas serão realizados com o consentimento
informado de cada sujeito, com a aprovação do comité de ética local, e em
conformidade com a legislação nacional e as diretrizes da Declaração de Helsínquia.
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Caso sejam encontradas alterações patológicas na avaliação clínica ou imagiológica,
o participante será informado e encaminhado para o seu médico assistente.
Atualmente os dados sobre a segurança do uso de Ressonância Magnética em
mulheres grávidas, principalmente durante o 1º trimestre de gravidez, não são
conclusivos. Para proteção dos participantes, as mulheres em idade fértil só
realizarão a Ressonância Magnética após confirmado o resultado negativo do teste
de gravidez na urina, que será realizado nos 5 dias antes.
Será também efetuada uma biopsia de pele na menor área cutânea possível, em zona
não foto-exposta, observando todas as condições de assepsia necessárias; serão
fornecidas as recomendações necessárias para a melhor cicatrização da pele.
Os dados serão recolhidos por um investigador obrigado à confidencialidade médico-
doente e serão anonimizados e guardados num local seguro, com acesso restrito aos
investigadores. Também os exames de RM serão anonimizados e armazenados de
modo similar.
Orçamento detalhado
Descrição Custo
Colheita de tecido biológico (130*€20) € 2600
Overheads (submissão à CNPD, impressão de consentimentos informados, cadernos de recolhas de dados)
€ 400
Reuniões e congressos, “publication fees” € 2.000
Total € 5000
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14
Anexo 1- RM da substancia nigra, com sequência dedicada ao estudo da neuromelanina
Corte de RM axial ao nível do mesencéfalo de sujeito controlo (A) e com doença de
Parkinson (B); segmentação das áreas de neuromelanina nos mesmos sujeitos:
controlo (C) e doença de Parkinson (D), demonstrando a redução característica do
sinal da neuromelanina na porção ventro-lateral da substancia nigra na doença de
Parkinson.
Adaptado de Reimão et al., Mov Disord 2015
A
B
C D
A