1

TÜBİTAK-BİDEB

Kimya Lisans Öğrencileri (Kimyagerlik, Kimya Öğretmenliği, Kimya Mühendisliği) Araştırma Projesi Eğitimi Çalıştayı

KİMYA-1 ÇALIŞTAY 2010

KARANFİL YAĞININ ANTİ-BAKTERİYEL VE SERBEST RADİKAL TUTUCU ANTİ-OKSİDAN ÖZELLİKLERİNİN

İNCELENMESİ

Proje Ekibi

GRUP MİKROP Muhammet ZOPUN Sercan FİDAN Ali SAKARYA

PROJE DANIŞMANLARI

Prof.Dr.Ayşe Z. AROĞUZ Prof.Dr.Alipaşa AYAS Doç.Dr.Yusuf DİLGİN

KEPEZ/ÇANAKKALE

3-11TEMMUZ-2010

2

TÜBİTAK-BİDEB

Kimya Lisans Öğrencileri Kimyagerlik,kimya öğretmenliği, kimya mühendisliği Araştırma Projesi Eğitimi Çalıştayı

kimya-1 Çalıştay 2010 C GRUBU

PROJE DANIŞMANLARI

Prof. Dr. Ayşe Z. AROĞUZ Prof. Dr. Alipaşa AYAS Doç. Dr. Yusuf DİLGİN

PROJE ÜYELERİ

Muhammet ZOPUN Sercan FİDAN Ali SAKARYA

PROJE AMACI

Karanfil Yağının; Gram (+) S.A. ve Gram (-) E.C. Bakterileri Üzerindeki Etkisi ile Doğal Antioksidan Alfa-Tokoferol ve Sentetik Antioksidan BHT Maddeleri Arasındaki

Antioksidan Özelliğinin Karşılaştırılması

PROJE HEDEFLERİ

Karanfil Yağının; Gram (+) S.A. (Staphylococcus Aureus) ve Gram (-) E.C. (Escherichia

coli) Bakterileri Üzerindeki Anti-Bakteriyel Özelliğinin Pozitif Sonuç Vermesi İle Karanfil Yağının, Doğal Antioksidan Alfa-Tokoferol ve Sentetik Antioksidan BHT

Maddelerinin DPPH Radikalinden Yararlanarak Serbest Radikal Tutucu Özelliklerinin Karşılaştırılması

3

1.GİRİŞ Karanfil yağında bulunan etken maddeler; fenoller (eugenol ve asetil-eugenol), seskiterpenler (a ve b karyofillenler), az miktarda esterler, ketonlar ve alkollerdir.

Şekil:1 Şekil:2 Karanfil yağının içindeki Eugenol’ un çizgisel formülü (Şekil:1) ve 3D görünümü (Şekil:2) [1] 1.1.Eugenolun Özellikleri: IUPAC İsmi: 4-allil-2-metoksiifenol, 2-metoksi-4-(2-profenil) fenol, 1-allil-3-metoksi-4-hidroksibenzen-4-allilkatekol-2-metileter CAS Numarası: 97-53-0 Molekül Formülü:C10H12O2 Molar Kütle: 164,20 g/mol Yoğunluk: 1,06 g/cm3 Erime Noktası: -9oC Kaynama Noktası: 256oC Alevlenme Noktası: 104oC[2] 1.2.Kullanım Alanı: Antiseptik (bakterilerin üremesini engelleyen) antifungal (mantarlara karşı), antiviral (virüsün tesirini önleyen) ve lokal anesteik etkileri bilinmektedir. Diş ağrılarında ağrı kesici olarak kullanılmaktadır. [3] Cilt bakımı antiseptik (mikroorganizmanın çoğalmasını engelleyen) özelliğinden dolayı akne tedavisinde ve yara iyi edici olarak, antiviral (virüsün etkisini önleyen) özelliğinden dolayı uçuk tedavisinde kullanılmaktadır. Kompres soğuk kompres; alın, şakak ve enseye tatbik edilerek baş ağrısı ve şişliklerde kullanılmaktadır. Sıcak kompres; romatizma ve kas ağrılarında kullanılmaktadır. Karanfil yağının tedavi amaçlı tek başına değil de yarımcı birkaç bitkisel öz ile kullanımı, karanfil yağının aktivitesini arttırmaktadır. [4] Vücuda çok fazla alındığında ishal, bulantı, bilinç kaybı, baş dönmesi, yüksek veya düşük tansiyon etkisi yaptığı görülmüştür. [5] Tüm dünya ülkelerinde olduğu gibi, Türkiye'de de tıbbı açıdan önemli olan bitkiler, yüzyıllardan beri halk arasında hastalıkların tedavisi amacıyla kullanılmaktadır. Dünya sağlık teşkilatı (WHO)' nın 91 ülkenin farmokopelerine ve tıbbi bitkileri üzerine yapılmış olan bazı yayınlarına dayanarak hazırladığı bir araştırmaya göre, tedavi amacıyla kullanılan tıbbi bitkilerin toplam miktarı 20.000 civarındadır. [6] Bitkilerin organizmaları öldürücü ve insan sağlığı için önemli olan özellikleri 1926 yılından bu yana laboratuarlarda araştırılmaya başlanmıştır.

4

1.3.Karanfil Yağının Anti-Mikrobiyel Özelliği: Günümüzde tıbbi bitkilerin ve bu bitkilere ait uçucu yağların saf ve özellikle ana etken maddelerinin elde edilip değerlendirilmesi hem bilimsel hem de ekonomik yönden oldukça önemlidir. Elde edilen sonuçlar, bu bitkilerin uçucu yağlarının anti-mikrobiyel aktivitelerinin olduğunu göstermektedir. Uçucu yağ ve bileşenlerinin farmakolojik özellikleri de incelenerek tıp, kozmetik ve endüstriyel alanlarda kullanılabilme imkânlarının yararlı olabileceği belirtilmektedir. [7] Uçucu yağlar eski çağlardan günümüze kadar tedavide kullanılan ilaçlar arasında yer almaktadırlar. Halk tıbbında kullanılma amaçları esas alınarak bu ilaçlar üzerinde yapılan farmakolojik araştırmalar sonucunda bazı biyolojik etkileri bilimsel olarak da açıklanmıştır. Uçucu yağların antibakteriyel ve antifungal özelliklerinden başka antiviral aktivitelerde ilgi çekmiş ayrıca rapor edilmiştir. [7] Fitonsidler, (bitkilerin sentezlediği ve mikroorganizmaları öldüren veya gelişmelerini engelleyen maddeler) bitki dokularının zedelenmeleri veya herhangi bir enfeksiyon halinde, hücrelerde lokalize olan inaktif haldeki ana bileşiklerden enzimatik olarak meydana gelmektedir. [8] Çalışmalar çeşitli bitki yağlarının antimikrobiyal etkilerinin farklı olduğunu göstermektedir. Anti-dirençlilik aktivitesinin 4 ana mekanizmasının şu şekilde olduğunu açıklamışlardır: a) Bitkiler mikropları öldürmek için ilaçlarla sinerjik olarak aktive gösterebilir. b) Bitkiler antibiyotikleri degrade eden bakteriyel enzimleri inhibe edebilir. c)Bitkiler antibiyotikleri uzaklaştıran dirençli bakteriyel suşların ‘akıtma pompaları’ nın hareketini inhibe edebilirler. d) Mikrobiyel adhesyona engel olmadır ki buda sinerjistik veya katkısal hareketin bir örneği olarak isimlendirilir. 1.4.Çalışılan Bakteriler ve Özellikleri: 1.4.1.Staphylococcus Aureus: Micrococcaceae familyası üyesi olan Staphylococcus türleri Gram pozitif, 0,5 -1,5 μm çapında kok şeklinde, spor oluşturmayan, hareketsiz, katalaz pozitif, fakültatif anaerob bakterilerdir. Bu cins içinde 28 tür ve 32 alt tür bulunmaktadır. Grubun en önemli üyesi koagulaz pozitif ve termostabil nukleaz (termonukleaz) pozitif bir bakteri olan S. aureus 'dur. S. aureus başta ısıl işlem olmak üzere mikroorganizmaların indirgenmesine yönelik tüm uygulamalara karşı yüksek bir duyarlık göstermesine rağmen, insanlarda hastalığa neden olan ve yüksek derecede ısı stabilitesi gösteren protein yapısında 5 tip toksin üretir. [9] S. aureus 'un neden olduğu intoksikasyon tipi gıda zehirlenmeleri dünya çapında en yaygın olarak görülen gastroenteritislerden birisidir. Gıda kaynaklı mikrobiyolojik hastalıklar içinde stafilokokal zehirlenmeleri payının ABD 'de %14, Macaristan 'da %40 ve Japonya 'da %20-25 olduğu tahmin edilmektedir. Zehirlenme gıda ile birlikte önceden salgılanmış bir ya da daha fazla toksinin tüketilmesi ile meydana gelir. Staphylococcus cinsi içinde insanlarda gastroenteritise neden olan enterotoksin üretme potansiyelinde olan başka türler varsa da hastalık hemen tümüyle S. aureus tarafından oluşturulur. Stafilokokal enterotoksinler pirogenik toksin (pyrogenic toxin ; PT) olarak adlandırılan geniş bir gruba girerler. Streptococcus pyogenes de aynı gruba ait olmak üzere stafilokokal enterotoksin benzeri bir toksin oluşturur. PT grubu toksinler, en önemli özellikleri süperantijen olmak üzere pek çok biyolojik ve biyokimyasal özelliği paylaşırlar. [10]

5

S. aureus 'un kontamine gıdada 1,0 μg 'dan daha az oluşturduğu toksin miktarı stafilokokal intoksikasyon semptomlarının görülmesine neden olur. Zehirlenmeye neden olan toksin miktarı tartışma konusu olup toksin tipi minimal doz üzerinde etkilidir. Bu toksin düzeyine S. aureus sayısı 100.000 kob/g-ml 'den fazla olduğunda ulaşılır. Bir diğer deyiş ile S. aureus sayısı 5x105 kob/g-ml olan gıdalar kesinlikle risklidir. Bununla beraber gıdadaki düşük S. aureus sayısı gıdanın kesinlikle güvenli olduğunu göstermez. [10]

E.Coli,

1.4.2.Escherichia Coli:

Eubacteria alemi, Proteobacteria şubesi, Gamma Proteobacteria sınıfı, Enterobacteriales takımı, Enterobacteriaceae ailesi, Escherichia cinsi üyesidir. Genelde E.Coli kısaltması ile veya koli basili olarak bilinen Escherichia coli (okunuşu Eşerişiya koli), memeli hayvanların kalın bağırsağında yaşayan faydalı bakteri türlerinden biridir. Normalde bağırsakta yaşadığı için, E. coli ' nin çevresel sularda varlığı dışkı kirlenmesinin bir belirtisidir. E. coli, pediyatrist ve bakteriyolog olan Theodor Escherich tarafından bebek dışkılarında keşfedilmiştir ve adını ondan alır; coli, "kalın bağırsaktan" demektir. E.Coli, genel olarak bakteri biyolojisinin anlaşılması amacıyla üzerinde sıkça çalışılmış bir model organizma olmuştur. Canlılar arasında hakkında en fazla şey bilinen organizma olduğu söylenebilir. İnsanın bir günde dışkı yoluyla vücudundan geçen E. coli bakteri sayısı 100 milyar ila 10 trilyon arasındadır. Dışkıyı oluşturan bakteriler başlıca anerobik bakterilerdir, seçmeli anerobik E. coli hücrelerinin sayısı diğer bakteri türlerinin binde biri dolayındadır. Başka hayvanlarda etkisiz olan bazı E. coli tipleri insana bulaştıklarında hastalık yapabilirler. Bunların en ünlüsü sayılan O157:H7 adlı serotip kanlı ishale ve ölüme yol açabilir. [11] E. coli, normal bağırsak florasına aittir, biyolojik sınıflandırmada da bağırsaklarda yaşayan bakterilerden oluşan enterik bakteriler ailesinde yer alır. Bakteri çubuk şeklinde olup, boyutları 1-2 µm uzunluğunda ve 0.1-0.5 µm çapındadır. [11] E. coli Gram-negatif bir bakteri olduğundan endospor oluşturmaz, pastörizasyon veya kaynatma ile ölür. Memeli hayvanların bağırsaklarında büyümeye adapte olmuş olduğu için en iyi vücut sıcaklığında çoğalır. Bağırsak florasının normal bir üyesi olan E. coli ile konak organizma arasında uyumlu bir ilişki olduğundan bakteri normalde hastalık yapmaz. Ancak, ortama geçmesi halinde, ki bu aynı organizmada başka bir organ olabilir (idrar yolu enfeksiyonu ile mesaneye geçmek gibi) veya başka bir konak organizmanın bağırsağı olabilir, E. coli bir hastalık etmeni olabilir. Bazı E. coli tipleri içinde bulundukları hayvan için zararsız olmalarına rağmen insana geçtiklerinde hastalık yapabilirler. Bu hastalıklar arasında başlıca ishalli hastalıklar olmakla beraber idrar yolu enfeksiyonları, menenjit, peritonit, mastit, septisemi ve gram-negatif pnömoni de sayılabilir. E. coli 'nin, tavuk, dana ve başka hayvanlarda da hastalık yapabildiği gösterilmiştir. [11] E. coli içinde hastalık yapan pek çok tipi vardır. Bunlar hasta ettikleri dokular ve hastalık mekanizmalarına bağlı olarak aşağıdaki "patotip" olarak gruplandırılırlar. İshalli hastalıklara neden olan E. coli tipleri aşağıdaki gruplara ayrılırlar:

• Enterotoksijen E. coli (ETEC) tipleri, enterotoksin üreterek hastalık yapar. Çeşitli toksinler vardır, bazıları bağırsak mukozasına zarar veren sitotoksik enterotoksinlerdir, bazıları bağırsak hücrelerinin su ve elektrolit salgılamalarına neden olan sıtotonik enterotoksinlerdir. [11] • Enteroinvazif E. coli (EIEC) tipleri, doku hücrelerinin içine girip çoğalırlar. Bunun yol açtığı enflamasyon tepkisi doku hasarını artırır.

6

• Enteropatojenik E. coli (EPEC) tipleri dokuya sıkıca bağlandıktan sonra bir enflamasyon reaksiyonu oluştururlar. Toksin salgılayarak değil, hücre içi sinyalizasyona etki ettikleri için ishale yol açtıkları düşünülmektedir. [12] • Enterohemorajik E. coli (EHEC) Bu grupta olanlar Enteropatojenik özellikler taşımaya ilaveten Şiga toksinleri salgılar. Bu gruba ait olanların en ünlüsü E. coli O157:H7'nin yol açtığı hastalık hemorajik kolit olarak adlandırılır. İshal az sulu, bol kanlı ve mukuslu olur. [13] • EnteroAggregatif E. coli (EAEC), bağırsak epiteline bağlanıp tuğla gibi dizilmiş bakteriler şeklinde görünür. Bu gruba has bakterilerin salgıladığı toksinler mukozaya zarar verip kronik ishale yol açarlar. [14] • Diffusely Adherent E. coli (DAEC), bir yaştan küçük çocuklarda ishale yol açar. Özelleşmiş fimbiralar sayesinde seyrek bir şekilde epitele bağlanırlar ve hücre içi sinyal mekanizmasını etkinleştiriler. Bu grup hakkında az şey bilinmektedir.

1.5. Disk Difizyon Metodu: Mikroorganizma kültürlerinin hazırlanması ve disk difüzyon testi bakteri Nutrient Broth (Difco)’a aşılanarak 37±0.1°C’de, maya suşlarıda Sabouraud Dextrose Broth (Difco)’a aşılanarak 25±0.1°C’de 24 saat süreyle inkübe edilir. Sterilize edilmiş ve 45-50°C’ye kadar soğutulmuş Müeller-Hinton Agar (MHA, Oxoid) ve Sabouraud Dextrose Agar (SDA) belirtildiği şekilde hazırlanan bakteri (106 adet/ml) ve maya (105 adet/ml) veya bakteri (108 adet/ml) ve maya (107 adet/ml) (Nostro ve ark., 2000) suşlarının buyyonlarda ki kültürleri ile %1 (0.01 ml) oranında aşılanarak tüp çalkalayıcıda çalkalandıktan sonra 9.0 cm çapındaki steril petri kutularına steril pipetler ile 15 ml dağıtılır. Besiyerinin homojen bir şekilde dağılması sağlanır. Katılaşan agar üzerine bitki yağları emdirilmiş diskler hafifçe bastırılarak aralarında 2 cm kalacak şekilde yerleştirilir. Bu şekilde hazırlanan petri kutuları 4°C’de 2 saat bekletildikten sonra bakteri aşılanan plaklar 37±0.1°C’de 24 saat, maya aşılanan plaklar 25±0.1°C’de 48 saat inkübe edilir. Süre sonunda besiyeri üzerinde oluşan inhibisyon zonları mm olarak değerlendirilir. Çalışmalar 3 paralel olarak yürütülür. Standart antibiyotik diskleri karşılaştırma yapmak amacıyla kontrol diskleri olarak kullanılır. [15] 1.5.1.Kirby-Bauer Test: Antibiyotik emdirilmiş filtre kağıdından diskler inhibisyon çapları ölçülür. 1966’da Kirby, Bauer, Sherris ve Tuck filtre kağıdı diskler kullanmıştır. Disk difüzyon testinden elde edilen kalitatif sonuçlar MIC testlerinden elde edilen kalitatif sonuçlarla uyumluluk gösterir.

Primer kültürden inokulum hazırlamaya 3-5 izole koloniyi öze ile sıvı besiyerine aktarılır. 3-5 saat 37 o C de inkübe edilir. Pamuklu silgici suspansiyona daldırılır, silgici tüpün kenarlarına bastırarak fazlalığı uzaklaştır, pamuklu silgici petrinin tüm yüzeyine düzgünce

1.5.2.Prosedür (Modifiye Kirby-Bauer Metodu: National Committee for Clinical Laboratory Standards. NCCLS): Sıvı besi ortamında 108 CFU/ml bakteri inokulumu hazırlanır (5 m l). Petriden 3-5 bağımsız koloni öze ile alınır. Bulanıklık McFarland No. 0.5 standard ına ayarlanır. Pamuklu silgiç kullanılarak petrideki Mueller-Hinton agar yüzeyine ekim yapılır. 5-10 dakika agar yüzeyinin kuruması beklenir. Kimyasal emdirilmiş diskler inokule edilmiş agar yüzeyine yerleştirilir. Petriler ters çevrilerek 35 oC de, (18-24 saat) inkübe edilir. İnhibisyon çapları (mm) ölçülür.

7

sürülür. (petriyi çevirerek) Petriyi kapatarak birkaç dakika kurumaya bırakılır. Cımbız vasıtasıyla kimyasal emdirilmiş diskleri agar yüzeyine yerleştirilir. (9 cm çaplı petriye en fazla 7 disk) 30 dakika içinde petrileri 35 oC lik inkübatöre ters çevirerek yerleştirilir. Gecelik inkübasyondan sonra oluşan çapları (MICdeğerleri) ölçülür ve standart antibiyotiklerinkiyle kıyaslanır.

Antibiyotik Örnek Örnek-Antibiyotik Şekil:3 [16] Şekil:4 [16] Difüzyon aşağıdaki faktörlere bağlıdır: 1. Konsantrasyon 2. Molekül ağırlığı 3. Suda çözünürlük 4. pH ve iyonlaşma 5. Agara bağlanma

Bu faktörler çap genişliğine doğrudan etkilidir. Etkin madde besi ortamına ne kadar çok difüz ederse o kadar bakteri üzerinde etkilidir. Bu yüzden çap genişliği artacaktır. Buda o maddenin anti-bakteriyel etkisinin varlığından söz edilebilir.

Antioksidan’ veya ‘yükseltgeme önleyici’, yağların otoksidasyonunu yavaşlatan

maddedir. Canlılarda, kimyasal süreçler (prosesler), özellikle

1.6.Antioksidan ve Özellikleri:

oksitlenme, serbest radikallerin

oluşmasına neden olur. Yüksek derecede reaktif olan serbest radikaller farklı moleküller ile

kolayca reaksiyona girebilir ve böylece hücrelere, canlıya zarar verebilir.

Antioksidanlar serbest radikallerle reaksiyona girerek (onlarla bağ kurarak) hücrelere

zarar vermelerini önler. Bu özellikleriyle hücrelerin anomalileşme, ve sonuç olarak tümör

oluşturma risklerini azalttıkları gibi, hücre yıkımını da azalttıkları için, daha sağlıklı ve

yaşlılık etkilerinin minimum olduğu bir yaşam yaşama şansını yükseltir.

Sentetik antioksidanların gıdalardaki kullanımı 1940'lı yıllarda BHT ve Gallik Asit Esterlerinin oksidasyonu önlediklerinin anlaşılmasıyla başlamıştır. Demir ve bakır gibi transisyon metallerinin zararlı etkileri sitrik asit(CA), etilendiamintetraasitikasit (EDTA) veya onların türevlerine metal deaktivatör veya şelat ajanı olarak etki ettikleri ondan sonra bulunmuştur.

8

1.6.1.Antioksidanların Lipid Oksidayonunu Önleme Mekanizması: Antioksidanlar, lipid oksidasyonunu engellemekte veya geciktirmektedir. Böylece

hem gıdaların kalitesi korunmakta hem de raf ömrü uzamaktadır (Kıralan ve ark. 2004). Oksidayonu önlemek veya ortadan kaldırmak amacıyla gıdalara antioksidanlar eklenmekte ve bu amaçla yıllardır antioksidan olarak Bütillenmiş Hidroksi Toluen (BHT), Bütillenmiş Hidroksi Anilin (BHA) ve Tri Bütil Hidroksi Kinon (TBHQ) gibi sentetik antioksidanlar kullanılmaktadır. (Lindsey ve ark., 2001). Ayrıca antioksidan özellikleri oldu_u bilinen fenolik bileşiklerin (dual veya sentetik) de lipid substratlarında, lipid oksidasyonunu önlediği bildirilmektedir. (Nenadis ve ark. 2003).

E vitamini içinde alfa, beta, gama ve delta tokoferolleri bulunur. Bunların içinden özellikle

1.6.2.Alfa-Tokoferol (E Vitamini) :

α-tokoferol önemli bir antioksidandır. Özellikle buğday, mısır, darı, pirinç gibi tahıllarda çok bulunur. Bunun dışında ayçiçek yağı, mısırözü yağı, pamukyağı gibi yağlarda, ceviz, badem ve yerfıstığı gibi kuru yemişlerde ve yeşil sebzelerde bulunur. E vitamini aynı zamanda pişirmeye ve sıcağa dayanıklıdır, böylece pişirilme esnasında tahrip olmazlar. E vitamini dışında farklı maddelerde bulunan tokoferoller ise rahatça tahrip olabilir. Fakat, yağda kızartma ve tahılların öğütülmesi esnasında E vitaminleri de tahrip olur, ve çoğu bozunur. Bu yüzden E vitamini ihtiva eden ürünleri yağda kızartmadan pişirmek, ve özellikle beyazlatılmadan geçmemiş tahıl ürünlerini (kepekli ürünler gibi) tüketmek daha akıllıca ve sağlıklı olur.

1.6.3.DPPH Serbest Kök Bağlama Metodu: DPPH serbest kök bağlama metodu, lipid oksidasyonunu önleyen antioksidanlar için

genel olarak kabul edilmiş bir mekanizmadır. Diğer metotlarla karşılaştırıldığında; DPPH serbest kök bağlama metodu, antioksidan aktivitelerin kısmi olarak kısa zamanda belirlenmesini sağlamaktadır. Antioksidanların DPPH serbest kökünü bağlama etkilerinin, bunların hidrojen (H) iyonu verme yeteneklerinden kaynaklandığı düşünülmektedir (Chen ve Ho, 1997; Wang ve ark. 1998).

DPPH serbest kök bağlama metodunda, örneklerin H iyonu verme kapasiteleri, stabil bir serbest kök DPPH kullanılarak araştırılmaktadır. H iyonu verme yatkınlığı olan bir bileşimin varlığında DPPH kökü indirgenir ve stabil serbest kök formu oluşur (El-Nehir ve Karakaya, 2003).

Başlangıç DPPH. konsantrasyonunu % 50 azaltmak için gereken örnek konsantrasyonu (EC50), antioksidan aktiviteyi hesaplamakta sıklıkla kullanılan bir yöntemdir. Düşük EC50 değeri yüksek antioksidan kapasiteyi gösterir. Diğer bir parametre ise anti-radikal etkinlik (AE=1/EC50) veya anti-radikal güçtür (ARP). Anti-radikal etkinliğin yüksek olması antioksidan aktivitenin yüksek olması anlamına gelmektedir (El-Nehir ve Karakaya, 2003).

Fenolik bileşiklerin antioksidan etkileri; lipid köklerini kararlı bileşikler haline dönüştürerek zincir tepkimesini kırmak olup; birincil antioksidan olarak görev yapmaktadırlar. (Altan, 1989). Fenolik bileşiklerden ayrılan hidrojenler, kararsız

9

serbest (R) kökü ile birleşerek inaktif ürün oluşturmaktadır. Fakat bu köklerdeki elektronlar molekül içerisinde yerdeğiştirdiğinde kararlı serbest hibrit kökleri olarak kalmaktadır. (Nergiz ve Ünal, 1989).

2.YÖNTEM VE METODLAR 2.1.Karanfil Yağının Anti-Bakteriyel Özelliğinin Disk Difüzyon Özelliği ile Tayini:

• Petri Kabı (2 Çift)

2.1.1.Kullanılan Araç ve Gereçler:

• Mueller Hintan Agar Besi Ortamı (100 ml) • Mueller Hinton Broth Besi Ortamı (20 ml) • Gentamisin Emdirilmiş Standart Antibiyotik Diskleri • DMSO (20 ml) • Deney Tüpü (4 tane) • Öze (1 tane) • Pamuklu Silgiç • Cetvel • Steril Eldiven (2 tane) • Mikro Pipet ve Uçları • S.A. ve E.C. Bakterileri • Karanfil Yağı

2.1.2.Deneyin Yapılışı: Deneye başlamadan 2 saat önceden koloni ortamında bulunan bakteriler büyütülmek üzere kültür ortamından öze yardımıyla alınarak besin bulunan bir çözeltinin içine alınır. 2 saat otoklavda büyümesi için beklenir. Bakteriler büyüdükten sonra pamuklu silgiç yardımı ile besin çözeltisindeki bakterileri alarak petri kaplarının içindeki agar besi ortamlarına iyice yaydırarak homojen dağılmasını sağlanır. Bu işlemler E.coli ve S.A. bakterileri için ayrı ayrı yapılır. Sonra 4 tane disk petri kabının kapağına eşit uzaklıklarda bırakılır ve sırasıyla karanfil yağından 10 mikro litre, 5 mikro litre ve DMSO çözeltisi içinde 500mg ve 2000 mg olarak disklerin üzerine damlatılır. Diskler besi ortamına cımbız yardımıyla konulduktan sonra standart gentamisinli disk petri kabının tam ortasına konur. Bu işlemler her iki bakteri için ayrı ayrı ve titizlikle yapılır. Sonra bakterilerin çoğalması için otoklavda 37o C’ de 20-24 saat bekletilir. Bu süre sonunda otoklavdan alınan içinde bakteri bulunan petri kapları incelemeye alınır. Bu inceleme disklerin etrafında bakteri kolonileri oluşup oluşmaması ile alakalıdır. Maddenin anti-biyotik özelliğinin olması demek diskler etrafında bakterilerin ölmesi demektir. Bu bakterilerin gelişmediği dairenin çapı MIC değeri olarak adlandırılır. Bu değerin olması, yani bakterilerin üremediği (bakterisiz) bölgenin kullanılan disklerin çapından büyük olduğunu gösterir. Bu sonuç gentamisin antibiyotiğinin MIC değeri ile karşılaştırılıp karanfil yağının antibakteriyel özelliği hakkında yorum yapılır. 2.2.Karanfil Yağının Serbest Radikal Tutucu Antioksidan Özelliğinin, Doğal Antioksidan Alfa-Tokoferol ve Sentetik Antioksidan BHT ile DPPH Kullanarak Karşılaştırılması:

10

• Tüplük

2.2.1.Kullanılan Araç ve Gereçler:

• Deney Tüpü (21 tane) • Metanol (400 ml) • Alfa-tokoferol (1 g) • BHT (1 g) • DPPH (0,0023 g) • UV-Vissible Spektrometresi • Beher (100 ml) • Pipet (10 ml) • Karanfil Yağı

2.2.2.Deneyin Yapılışı:

100 ml’lik 3 behere 50 ml metanol ve sırasıyla 1g karanfil yağı, 1 g alfa-tokoferol ve 1 g BHT eklenerek karıştırılır. Oluşan çözeltilerden sırasıyla 0,125, 0,25, 0,5, 1, 2, 4, 8 ml alınarak ayrı ayrı deney tüplerine konur. Ayrı bir yerde hazırlanmış 0.0023g DPPH 100 mL metanol de çözülür. Bu DPPH çözeltisinden farklı derişimler de ki numunelere 3mL DPPH çözeltisinden eklenir ve 15 dk beklenir. Son işlem olarak UV cihazında sabit 515 nm dalga boyunda ölçüm yapılır. Bu sonuçlardan elde edilen Abs-derişim grafiklerinden IC50 değerleri bulunarak %50 inhibisyon değerleri grafiğe geçirilir. Böylelikle 3 maddenin serbest radikal tutucu antioksidan değerleri kendi aralarında yorumlanır. 3.SONUÇLAR VE YORUMLAR

3.1.Karanfil Yağının Anti-bakteriyel Özelliğinin İncelenmesi:

E.C. BAKTERİSİ (MIC-mm)

S.A. BAKTERİSİ (MIC-mm)

GENTAMİSİN 21 20

KARANFİL YAĞI (5.10 -3 mL)

9 11

KARANFİL YAĞI (10.10-3mL)

13 14

KARANFİL YAĞI (500mg/DMSO)

----- ------

KARANFİL YAĞI (2000mg/DMSO)

9 10

Tablo1: Deney sonuçlarının bakteri çeşitlerine göre değerlendirilme tablosu.

11

ÖNCE

Şekil:5

Şekil:5 Numunelerimizi eklemeden önceki görüntü

Numuneleri teorik kısımda belirtilen ekleme işlemleri yapılmıştır. 24 saatlik otoklavda

bekleme süresi bittiğinde MIC değerleri elde edilmiştir. SONRA

Şekil:6

12

Şekil:7

Şekil:6 ve 7 da görüldüğü gibi deney sonrası karanfil yağının gentamisin(ortadaki) referansındaki davranışı.

Sonuç olarak karanfil yağının anti-bakteriyel özelliği var diyebiliriz. Fakat DMSO

içinde ki karanfil yağının anti-bakteriyel özelliğini kaybettiği ya da aktivitesini yitirdiğini görmekteyiz (üst taraftaki numuneler).

3.2.Karanfil Yağının Serbest Radikal Tutucu Antioksidan Özelliğinin, Doğal Antioksidan Alfa-Tokoferol ve Sentetik Antioksidan BHT ile DPPH Kullanarak Karşılaştırılması: Bu deneyin sonucu olarak UV-Vissible spektrometrede okunan değerler abs-derişim grafiği çizilerek IC 50 değerini bulmak için ; % İnhibisyon = Ao - ( A – Ab )x100/Ao

denklemi yardımıyla bütün derişimlerin % inhibisyon katsayıları bulunarak karanfil yağı, alfa-tokoferol ve BHT nin % inhibisyonları bulundu. Burada;

A: Kör (Metanol) Abs Ao: DPPH Abs Ab: Çözelti Abs Sonuç olarak bütün maddelerin % 50 inhibisyon grafikleri çizildi.

13

14

Bu % 50 inhibisyon grafiğinden karanfil yağının serbest radikal tutucu antioksidan özelliği, doğal antioksidan alfa-tokoferol ve sentetik antioksidan BHT ile karşılaştırıldığında DPPH ile tepkimeye girmeden kalan % 50 lik kısmı fazla olduğundan diğer iki maddeden daha az serbest radikal tutucu antioksidan özelliği gösterdiği görülmektedir. Ama bu sonuç onun antioksidan olmadığını göstermemekte aksine az da olsa bu özelliği barındırdığını göstermektedir. 4.KAYNAKLAR [1]- tr.wikipedia.org/wiki/eugenol 10/07/2010 [2]- Jadhav BK, Khandelwal KR, Ketkar AR, Pisal SS. (Şubat 2004). "Formülasyonu ve Pharm Ind değerlendirme Dev İlaç. Hastalıklar" periodontal mucoadhesive tablet içeren eugenol için tedavi. 30 (2): 195-203. DOI : 10.1081/DDC-120028715 . PMID 15089054 . [3]- http://tr.wikipedi.org/wiki/karanfil_(baharat) 10/07/2010 [4]- http://www.viscoti.com/tr/urun.php?id&1637&ecs 10/07/2010 [5]- eugenol Petrol Overdose , New York Times Sağlık Rehberi [6]- Kalaycıoglu, A., Öner, C., Bazı Bitki ekstraklarının antimutajenik etkilerinin Amest-Salmonella test Sistemi ile Arastırılması, Tr. Botany, 18, 117-122, 1994. [7]- Ebru Çelik, Gökçen Yuvalı Çelik, Bitki Uçucu Yağlarının Antimikrobiyal Özellikleri, Orlab On-Line Mikrobiyoloji Dergisi Yıl: 2007 Cilt: 05 Sayı: 2 Sayfa: 1-6 [8]- A.I., Antimikrobiell Wirksame substanzen in Kulturpflanzen, Angew, Chem., 70, 544-552, 1958 [9]- Sevil TOROĞLU, Menderes ÇENET, Tedavi Amaçlı Kullanılan Bazı Bitkilerin Kullanım Alanları ve Antimikrobiyal Aktivitelerinin Belirlenmesi İçin Kullanılan Metodlar, KSÜ. Fen ve Mühendislik Dergisi, 9(2), 2006

15

[10]- Gıda Mikrobiyolojisi ve Uygulamaları, 2000. Genişletilmiş 2. Baskı; Ankara Üniversitesi Ziraat Fakültesi Gıda Mühendisliği Bölümü yayını. Sim Matbaası, Ankara 522 s 14. Bölüm [11]- http://tr.wikipedia.org/wiki/Escherichia_coli 10/07/2010 [12]- Trabulsi et al. (2002) Typical and Atypical Enteropathogenic Escherichia coli [13]- Enterohaemorrhagic Escherichia coli (EHEC) [14]- Nataro et al.(1998), Enteroaggregative Escherichia coli [15]- Sevil TOROĞLU, Menderes ÇENET, Tedavi Amaçlı Kullanılan Bazı Bitkilerin Kullanım Alanları ve Antimikrobiyal Aktivitelerinin Belirlenmesi İçin Kullanılan Metodlar, KSÜ. Fen ve Mühendislik Dergisi, 9(2), 2006 [16]- On Sekiz Mart Üniversitesi-Biyokimya laboratuarı 08/07/2010 5.KATKIDA BULUNANLAR: Danışman hocalarımız; Prof.Dr.Ayşe Z AROĞUZ---Prof.Dr.Alipaşa AYAS---Doç.Dr.Yusuf DİLGİN’e Ayıca katkılarından dolayı; Uzm.Dr.Gülen TÜRKER, Gülden PINAR’ a Ferah CÖMERT’ e Ahmet ERDEM’ e Esra BOZKURT’ a Çok Teşekkür Ederiz…

16

6.ÖZGEÇMİŞLER

Ali SAKARYA 13/02/1989 tarihinde Konya/Akşehir’de doğdu. Hayatının ilk üç yılını Gebze’de geçirdi. Babasının işinden dolayı Bursa/İnegöl’de ikamet etmeye başladı. İlk ve orta eğitimini Alanyurt 75. Yıl İ.Ö.O.’ da gördü. 2003-2004 eğitim-öğretim döneminde İnegöl Lisesi’ ne kayıt oldu. 2006 yılında Yunus Emre Lisesi’nden mezun oldu. Aynı yıl ÖSS’yi kazanarak Dokuz Eylül Üniversitesi Fen-Edebiyat Fakültesini Kimya Bölümünü kazandı ve İzmir/Buca’ da ikamet etmeye başladı. Şimdi aynı bölümde 4. sınıfında eğitimini sürdürmektedir.

e-mail: alisakarya.deu@gmail.com Sercan FİDAN 01/10/1989 yılında Ünye/Ordu’da doğdu. İlköğretimini Düz Çiftlik İ.Ö.O.’da,

ortaöğretimini Tekkiraz İlk ve Ortaöğretim Okulunda tamamladı. 2002-2006 eğitim-öğretim yılını Ünye Lisesi’nde tamamladı. 2008-2009 yılları arasında Erciyes Üniversitesi Fen-Edebiyat Fakültesini Kimya Bölümünü kazandı ve öğrenimini bu üniversitede devam etmektedir. Dört çocuklu ailenin, üçüncü çocuğudur.

e-mail: sercan_52_18@hotmail.com Muhammet ZOPUN 07/11/1989 yılında Şişli/İstanbul’da doğdu. İlk ve orta öğretimini Anafartalar İ:Ö:O’da

tamamladı. 2003/2004 yılında Beşiktaş Lisesinde öğrenime başladı.2006 da mezun oldu.2007 yılı ÖSS sınavında NİĞDE Üniversitesini kazandı. Şu anda 4.sınıf öğrencisi olarak eğitimini sürdürmektedir.3 çocuklu bir ailenin en küçük üyesidir. Kendinden büyük abisi ve ablası vardır.

“e-mail: t_zopun@hotmail.com

17