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Progetto Regione Emilia-Romagna

Studio e modellazione degli aspetti enzimatici legati alla stagionatura del formaggio Parmigiano-Reggiano

Azione 3: Aspetti enzimatici legati alla stagionatura del Parmigiano-Reggiano

Fase 1: Determinazione delle caratteristiche microbiologiche e chimiche dei campioni scelti

EVOLUZIONE DELLA FRAZIONE AMMINOACIDICA E EVOLUZIONE DELLA FRAZIONE AMMINOACIDICA E OLIGOPEPTIDICANEL FORMAGGIO PARMIGIANOOLIGOPEPTIDICANEL FORMAGGIO PARMIGIANO--REGGIANO REGGIANO

NEI PRIMI MESI DI STAGIONATURANEI PRIMI MESI DI STAGIONATURA

Dipartimento di Chimica Organica ed IndustrialeFacolt di Agraria

Universit di Parma

Rosangela MarchelliArnaldo Dossena

Stefano SforzaGianni GalavernaValeria Cavatorta

Fausto Stefani

LA PROTEOLISI NEL PARMIGIANOLA PROTEOLISI NEL PARMIGIANO--REGGIANOREGGIANOEnzimi responsabili del processo proteolitico e loro origine

CASEINA

Chimosina

PlasminaAmmino acidi

Di- tripeptidiOligopeptidi

FORMAGGIO

LISI

Proteasi intracellulari

Sistemi di trasporto

Proteasi associate alla parete cellulare

Endoproteasi

Amminoproteasi

Tripeptidasi

Dipeptidasi

Lactobacillus

LatteLatte

CaglioCaglio

Proteasi Proteasi associate associate alla parete alla parete cellularecellulare

SieroinnestoSieroinnesto

Il gruppo di ricerca si propone:A. Lanalisi quantitativa del contenuto amminoacidico dei campioni

B. Lanalisi della frazione peptidica a basso peso molecolare (

ANALISI DEGLI AMMINOACIDIANALISI DEGLI AMMINOACIDI

omogeneizzazione

derivatizzazione

Filtrazione su carta

Centrifugazione (4C)

Deproteneizzazione (7,5 ml TFA) 20 min

Estrazione fase lipidica

Filtrazione (0,45 m)

Neutralizzazione con NaOH 1 N

Purificazione medianteScambio ionico

Essiccazione

Neutralizzazione con NaOH 1 N

Essiccazione e ridissoluzione in

1 ml di H2O bidistillata

5g formaggio +500l D-L Nor-Leucina+50 ml H2O bidistillata

Analisi HPLC-FLD

Essiccazione

mV

0.00

20.00

40.00

60.00

80.00

100.00

120.00

140.00

Minutes12.00 14.00 16.00 18.00 20.00 22.00 24.00 26.00 28.00 30.00 32.00 34.00 36.00 38.00 40.00 42.00 44.00

15.090

16.640 17

.584

18.402

18.814 19

.580

23.634

24.246

25.721

28.331

33.666

34.980

35.663

37.842

39.008

39.836

40.498

41.242

41.798Asp

Ser Glu His

Thr

Arg

Ala Pro

Tyr

ValGly Met

Lys Ile Leu

N-Leu

Phe

AMMINOACIDI TOTALIAMMINOACIDI TOTALI

Non emergono differenze significative nella quantit totale di amminoacidi tra parte esterna e parte centrale della forma fino al 2 mese.Una certa disomogeneit compare dal 3 mese per poi accentuarsi al 6, con prevalenza di amminoacidi nella parte esterna.

01000

20003000

400050006000

70008000

900010000

0 50 100 150 200 250 300giorni di stagionatura

a.a.

tota

li (m

g/10

0g s

.s.) esterno forma

centro forma

Distribuzione percentuale degli amminoacidi a 1 mese di stagionaDistribuzione percentuale degli amminoacidi a 1 mese di stagionaturatura

Asp3%

Ser6%

Glu15%

Gly2%

His6%

Arg7%

Thr3%Ala

5%Pro9%

Tyr3%

Val6%

Met2%

Lys16%

Ile4%

Leu9%

Phe4%

Asp3% Ser6%

Glu18%

Gly2%

His5%

Arg7%

Thr3%Ala

5%Pro10%

Tyr3%

Val6%

Met2%

Lys16%

Ile3%

Leu8%

Phe3%

CENTRO FORMAESTERNO FORMA

Nessuna differenza significativa nella distribuzione percentuale tra le due zone

Distribuzione percentuale degli amminoacidi a 6 mese di stagionaDistribuzione percentuale degli amminoacidi a 6 mese di stagionaturatura

CENTRO FORMA

Asp3% Ser

8%

Glu19%

Gly2%

His5%

Arg3%

Thr5%

Ala2%

Pro10%

Tyr1%

Val7%

Met2%

Lys14%

Ile6%

Leu9%

Phe4%

Asp3% Ser7%

Glu20%

Gly2%

His5%

Arg3%

Thr4%Ala

2%Pro10%

Tyr1%

Val7%

Met2%

Lys15%

Ile5%

Leu10%

Phe4%

ESTERNO FORMA

Nessuna differenza significativa nella distribuzione percentuale tra le due zone

Distribuzione percentuale degli amminoacidi a diversi tempi di Distribuzione percentuale degli amminoacidi a diversi tempi di stagionaturastagionatura

Asp3%

Ser6%

Glu15%

Gly2%

His6%

Arg7%

Thr3%Ala

5%Pro9%

Tyr3%

Val6%

Met2%

Lys16%

Ile4%

Leu9%

Phe4%

1 mese di stagionatura

Asp3% Ser

8%

Glu19%

Gly2%

His5%

Arg3%

Thr5%

Ala2%

Pro10%

Tyr1%

Val7%

Met2%

Lys14%

Ile6%

Leu9%

Phe4%

6 mesi di stagionatura

Dimnuisce la percentuale di arginina, alanina e tirosinaAumenta la percentuale di acido glutammico, serina, isoleucina

0

200

400

600

800

1000

1200

1400

1600

0 50 100 150 200 250 300giorni di stagionatura

mg/

100

g s.

s.

ArgTyrGlu

I dati indicano un cambiamento nella produzione di amminoacidi apartire dal 2-4 mese di stagionaturaQuesto cambiamento comporta un arresto nella produzione di Arg eTyr (o una loro degradazione) ed un incremento nella produzione diGlu

ANALISI DEI PEPTIDIANALISI DEI PEPTIDI

Ultrafiltrazione

Estrazione10 g di formaggio + 2,5 ml di Phe-Phe 1 mM +

45 ml di HCl 0,1 N (deproteinizzazione)

Filtrazione su carta

Estrazione della frazione lipidica

Filtrazione a 0,45 m

Prelievo di un'aliquota di 3 ml di estratto

Evaporazione totale del solvente

Recupero del campione con 900 l di soluzione acquosa di ac. Formico 0,1 %

Filtrazione a 10000 Da

3 lavaggi di recupero

Essiccazione completa del filtrato sotto flusso di azoto

Filtrato

Filtrato

ANALISI HPLC/MS DEI PEPTIDIANALISI HPLC/MS DEI PEPTIDISeparazione analitica Rivelazione

Time5.00 10.00 15.00 20.00 25.00 30.00 35.00 40.00 45.00 50.00 55.00 60.00 65.00 70.00 75.00

%

0

10015.04

6.34

5.304.42

3.22

6.65

6.89

10.81

15.28

15.68

15.84

27.42

16.40

24.46

22.95

42.99

27.9037.64

32.77

30.77

49.78

47.94

50.9062.00

57.04 65.51

74.3767.75

TICTIC

Phe-Phe

Interfaccia ESI

Zona di collisione in sorgente

HPLC a fase inversa

Colonna C18

Eluente a gradiente H2O-CH3CN acidificati (ac. formico 0,1 %)

Spettrometro di massa a singolo quadrupolo con

interfaccia ESI

IDENTIFICAZIONE DEI PEPTIDIIDENTIFICAZIONE DEI PEPTIDI

Time5.00 10.00 15.00 20.00 25.00 30.00 35.00 40.00 45.00 50.00 55.00 60.00 65.00 70.00 75.00

%

0

10015.04

6.34

5.304.42

3.22

6.65

6.89

10.81

15.28

15.68

15.84

27.42

16.40

24.46

22.95

42.99

27.9037.64

32.77

30.77

49.78

47.94

50.9062.00

57.04 65.51

74.3767.75

Elaborazione dei dati: semiquantificazione

m/z300 400 500 600 700 800 900 1000 1100 1200 1300 1400

%

0

100706.4

642.3

588.9

542.2

697.1

784.7

719.4

882.7

811.1

1008.7

888.8 945.0 1171.61133.5

mass5900 6000 6100 6200 6300 6400 6500 6600 6700 6800 6900 7000 7100

%

0

1007054.0

m/z100 200 300 400 500 600 700 800 900 1000 1100 1200 1300 1400 1500 1600 1700 1800

%

0

100706.4

642.3

588.9

100.1

543.7323.1162.9527.3

784.7

882.7

799.01008.6

898.7

945.01026.9 1176.51030.8 1259.4 1317.7

TICTICSpettro di massaSpettro di massa

Spettro di massa Spettro di massa ricostruitoricostruito

Picchi caratteristiciPicchi caratteristici

SEMIQUANTIFICAZIONE DEI PEPTIDISEMIQUANTIFICAZIONE DEI PEPTIDI

Time5.00 10.00 15.00 20.00 25.00 30.00 35.00 40.00 45.00 50.00 55.00 60.00 65.00 70.00 75.00 80.00 85.00 90.00

%

0

10054.71

XICXICArea del piccoArea del picco

Time5.00 10.00 15.00 20.00 25.00 30.00 35.00 40.00 45.00 50.00 55.00 60.00 65.00 70.00 75.00 80.00 85.00 90.00

%

0

10054,55

56471152

Calcolo del rapporto tra l'area generata dal peptide e l'area dello standard interno

Correzione del dato ottenuto in base al contenuto di umidit

Peptide

Frammentazione

IDENTIFICAZIONE DELLA SEQUENZA ESATTA DEI PEPTIDI IDENTIFICAZIONE DELLA SEQUENZA ESATTA DEI PEPTIDI TRAMITE CONFRONTO CON LE SEQUENZE CASEINICHE E TRAMITE CONFRONTO CON LE SEQUENZE CASEINICHE E

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