produzione di proteine in cellule animali - cellule di insetto in coltura (sistema di espressione:...

PRODUZIONE DI PROTEINE IN CELLULE ANIMALI

- Cellule di insetto in coltura (sistema di espressione: baculovirus)

- Insetti vivi (sistema di espressione: virus patogeni specifici)

- Cellule di mammifero in coltura

- Animali vivi come bioreattori (pharming)

INGEGNERIA GENETICA NEGLI ANIMALI

Transgenesi: tecnologia del trasferimento genico per introdurre sequenze diDNA nel genoma di cellule animali (o vegetali)

- Creazione di linee cellulari transgeniche- Creazione di animali transgenici (contengono il gene clonato in tutte le loro cellule)

Scopi:- Produzione di proteine ricombinanti a scopo farmacologico (anche da animali vivi: pharming)- Creazione di modelli animali per malattie umane - Ingegnerizzazione di cellule umane per la terapia genica in vivo o ex vivo

METODI DI TRASFERIMENTO GENICO IN CELLULE DI MAMMIFERO

1) Trasferimento genico diretto: - trasfezione mediata da liposomi - trasfezione mediata da recettori- trasfezione DNA libero con microiniezione nel nucleo

2) Trasferimento tramite vettori - plasmidici- virali (trasduzione)

3) Tipi di Inserzione:- ectopica- mirata

4) Obiettivi:- Produzione di proteine e farmaci - Inserzione geni in cellule specifiche per creazione animali transgenici- Terapia genica somatica nell’uomo

Trasfezione (per endocitosi) mediata da liposomi anionici o cationici

DNA trasportato nell’interno DNA trasportato all’esterno

Trasferimento genico diretto

Analogo sintetico del doppio strato fosfolipidico di membrana

Trasfezione (per endocitosi) mediata da recettori


Esempio:utilizzo recettore TfR

Trasfezione DNA libero con microiniezione


Inserzione di più copie di DNA lineare

Trasferimento genico tramite vettori virali

Virus a DNA o ad RNA

ObiettivoIntrodurre e pilotare l’espressione di transgeni in cellule in coltura

Espressione-Transitoria per transgeni non integrati nel genoma ospite, elevata espressione ma necessario trattamento ripetuto

- Stabile ma ridotta per transgeni integrati

Svantaggi- Possibile mutagenesi inserzionale (per quelli che si integrano in maniera casuale nel genoma)- Inserzione di geni (o molecole di DNA) di dimensioni limitate- Tecniche con bassa efficienza e costi elevati

Sistema vettoriale Ospite e localizzazione

Considerazioni

SV40 Vari mammiferi può o meno integrarsi

Adenovirus

(virus raffreddore)

Vari mammiferi, di solito episomico

Inserto fino a 8 kb, elevato livello espressione

Virus adeno-associati Vari mammiferi, si integra siti specifici cromosoma 19

Inserto fino a 4,5 kb, necessita di adenovirus per packaging

Papillomavirus

(cancro del collo uterino)

Vari mammiferi, integrazione stabile

Inserzione DNA di buone dimensioni

Elevato livello espressione

Retrovirus Ampia gamma, si integra come cDNA

Dimensioni fino a 8,5 kb


Genoma 5,2 kbPromotore costitutivo forteEliminazione di alcuni geni virali per inserire DNA esogenoAdatto a molti tipi cellulariAlta efficienza espressione transienteLimitazioni inserto per permettere packaging

Siti di clonaggio


• Virus non integrati: espressione transiente

• Virus integrati: espressione stabile, possibile mutagenesi inserzionale (per quelli che si integrano in maniera casuale nel genoma)

• Inserzione di geni (o molecole di DNA) di dimensioni limitate

• Tecniche con bassa efficienza e costi elevati

Svantaggi


PRODUZIONE DI FARMACI RICOMBINANTI

Produzione proteine umane in grandi quantità sostituisce la purificazione da:- organi o tessuti animali di proteine animali a volte poco efficaci o con effetti allergici o contaminanti;- organi e tessuti umani (sangue o organi di cadaveri); es. purificazione ormoni della crescita da ipofisi e rischio di malattia Creutzfeld-Jacob

- Produzione in batteri

- Produzioni in eucarioti microbici

- Produzioni in cellule animali vantaggi: modificazioni post-traduzionali delle proteine autentiche svantaggi: colture costose (supporto solido per la crescita, densità minime, uso di vettori virali e possibili conseguenze nella co-purificazione)

- Produzioni in animali e piante transgenici = pharming (pharmacological e farming) vantaggi: modificazioni post-traduzionali delle proteine autentiche

PRODUZIONE DI FARMACI RICOMBINANTI IN CELLULE PROCARIOTICHE, EUCARIOTICHE O

PHARMING

PRODOTTO MALATTIA

Insulina Diabete

Somatostatina Disordini della crescita, acromegalia, nanismo

Somatotrofina Disordini della crescita, acromegalia, nanismo

Fattore VIII Emofilia A

Interferone (vari) Leucemia e altri tumori

Fattore di crescita epidermide

Ulcere

Fattore di crescita fibroblasti

Ulcere

Eritropoietina Anemia

Attivatore tissutale plasminogeno

Infarto

Proteina di fusione: pochi aa della -galattosidasi di E. coli seguiti dalla metionina

PRODUZIONE DI ORMONI (FARMACI) RICOMBINANTI IN CELLULE PROCARIOTICHE : INSULINA

Formazione del legame disolfuro inefficiente!Cambiata la sintesi (vedi diapo successiva)

Molecola piccolanon glicosilata, pontidisolfuro

PRODUZIONE DI ORMONI (FARMACI) RICOMBINANTI IN CELLULE PROCARIOTICHE : INSULINA

Dopo ripiegamento spontaneoTagli proteolitici eliminanoil leader e il segmento C

PRODUZIONE DI ORMONI (FARMACI) RICOMBINANTI IN CELLULE PROCARIOTICHE : SOMATOSTATINA

Molto piccola: solo 14 aa = 42 bp

aa della -galattosidasidi E. coli seguiti dalla metionina

PRODUZIONE DI ORMONI (FARMACI) RICOMBINANTI IN CELLULE PROCARIOTICHE : SOMATOTROFINA

Leader sintetico: codoni 1-24 sostituiti (stessi aa) per corretta traduzione (propensione del codice) in E. coli

Proteina grande: 191 aaEstrazione di mRNA ipofisario,produzione cDNA,Sito di taglio per HaeIII inserimento leader sintetico,clonaggio, trasformazione,produzione proteina

PRODUZIONE DI FARMACI RICOMBINANTI IN CELLULE DI MAMMIFERO: IL FATTORE VIII

Produzione in E. coli impossibile26 esoni e 25 introni2351 aaProteina dimerica: subunità A e C con17 legami disolfuro e molti siti glicosilati

Necessari 17 legami disolfuro e glicosilazione: tentativi di produzione in E. coli ma proteina non attiva!

PRODUZIONE DI FARMACI RICOMBINANTI IN CELLULE DI MAMMIFERO: IL FATTORE VIII

I 2 cDNA per subunità A e subunità C clonati in 2 vettori di espressione plasmidici separati.Promotore Ag: ibrido sequenza -actina di pollo e -globina di coniglioPlasmidi introdotti in linea cellulare di hamsterProduzione efficiente e proteina attivaFVIII prodotto anche tramite pharming (secreta come proteina del latte nel maiale)

Sistema Specie ProdottoLatte Maiale Fattore VIII

Topo Attivatore plasminogeno tissutale umano

Ormone della crescita umana

Fibrinogeno umano

Coniglio Eritropoietina umana

Pecora 1-antitripisina umana

Fattore IX

Capra Attivatore plasminogeno tissutale umano

Siero (sangue) Coniglio 1-antitripisina umana

Urine Topo Ormone della crescita umana

PROTEINE PRODOTTE IN FLUIDI BIOLOGICI DI ANIMALI USATI COME BIOREATTORI

CREAZIONE DI ANIMALI TRANSGENICI

1) Trasferimento genico tramite microiniezione nel pronucleo maschile di una cellula appena fecondata. Se l’inserimento genico riesce, tutto l’animale che ne deriva è trangenico (comprese cellule germinali)

2) Trasferimento nucleare di cellula somatica con transgene in oocita fecondato privo di nucleo e reimpianto in madre surrogata. Tutto l’animale che ne deriva è trangenico

3) Trasferimento genico in cellule embrionali staminali (ES) e reimpianto in blastocisti di madre surrogataL’animale che ne deriva è chimerico (produrrà transgenici solo se le sue cellule germinali hanno il transgene)

A monte del gene da esprimere sempre inserito un promotore, a volte con specificità tissutali

CLONAGGIO NELLE CELLULE DI MAMMIFERO CON MICROINIEZIONE NEL NUCLEO

Trasferimento genico mediante microiniezione nel nucleo (pronucleo maschile)

Microiniezione di plasmidi batterici con DNA gene da inserire

Microiniezione di copie di DNA lineare (privo di vettore)

Inserimento nel DNA cromosomico di copie multiple in tandem

Utilizzo: permettono la produzione di animali transgenici quali modello di malattie

Svantaggi:Scarsa efficienza di integrazione Se integrati possono a loro volta dare mutagenesi inserzionale

Stimolazione dell’ovulazione in una femmina

Appena dopo l’accoppiamento microiniezione di DNA con il transgene (circa 200 copie) iniettato all’interno del pronucleo maschile (fatto su 20-30 ovuli fecondati)

Gli ovuli microiniettati vengono impiantati nell’utero di una madre adottiva resa pseudogravida da maschio

vasectomizzato. Dopo 3 settimane: progenie e analisi.

L’animale è transgenico perché il transgene è presente in tutte le cellule

Trasferimento genico tramite microiniezione nel pronucleo maschile

Trasferimento genico tramite microiniezione nel pronucleo maschile

Accoppiate con maschi vasectomizzati

Oocita fecondato

Trasferimento genico tramite microiniezione nel pronucleomaschile

- Ha una densità cellulare di 1000 volte superiore ad un fermentatore- Produce fino a 10g/l di proteina transgenica- Una pecora produce 250-280 litri ogni ciclo di lattazione- E’ più economico dei comuni fermentatori- Produce corrette modificazioni post-traduzionali- Facile la purificazione (nel latte ci sono poche proteine)

LA GHIANDOLA MAMMARIA COME BIOREATTORE

Clonaggio a montedi un promotore espressonella ghiandola mammaria(caseina, beta-lattoglobulina)

PROTEINE PRODOTTE IN FLUIDI BIOLOGICI DI ANIMALI USATI COME BIOREATTORI

Produzione di Fattore VIII umano nel latte del maiale.Il cDNA umano completo a valle del promotore del gene della proteinaacida del siero del latte di maiale.Sintesi di fattore VIII nel tessuto mammario del maiale e secrezione dellaproteina nel latte

Problematiche:- Alta inefficienza dei metodi di trasferimento nucleare o microiniezione nei pronuclei (in genere non più del 5% degli oociti iniettati dà progenie transgenica.

- Clonazione animale: alta frequenza di malattie congenite negli animali- Invecchiamento prematuro degli animali

- Considerazioni etiche del pharming soprattutto nelle piante (OGM).

Tecnologia del trasferimento nucleare

Riprogrammazione delnucleo che ripercorreràl’intero sviluppo

Clonazione animale:creazione di Dolly

Tecnologia del trasferimento nucleare

Dolly, primo esperimento riuscito di clonazione animale (1997)

Problematiche della clonazione animale:- Alta inefficienza dei metodi di trasferimento nucleare- Alta frequenza di malattie congenite negli animali- Invecchiamento prematuro degli animali


Trasferimento genico in cellule embrionali staminali (ES) e reimpianto in blastocisti

Le cellule staminali embrionali derivano dalla massa di cellule interne della blastocisti, 3,5 - 4,5 giorni dopo l’accoppiamento.Possono essere mantenute in coltura con fattori che impediscono il differenziamento: totipotenti

Cellule staminali pluripotenti isolate anche da feto e adulto (numero e capacità differenziative limitati)

NO è una CHIMERA!!!

Zigote Mutazione genetica due popolazioni cellulari Mosaico

Zigote 1(blastocisti) due popolazioni cellulari ChimeraZigote 2 (cellule ES)


Solo alcuni topi produrranno gameti con il transgene che daranno topi transgenici


Meno del 5% della prole è transgenica

Efficienza del trasferimento genico

Problematiche:- Alta inefficienza dei metodi di trasferimento nucleare o microiniezione nei pronuclei.

- Clonazione animale: alta frequenza di malattie congenite negli animali- Invecchiamento prematuro degli animali


produzione di proteine in cellule animali - cellule di insetto in coltura (sistema di espressione:...

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