Minicurso:

PRODUÇÃO HISTOLÓGICA E

ATUALIZAÇÕES EM MICROSCOPIA

Ministrantes/Discentes: Danyelle Silva Amaral

Karolyne Cordeiro de Oliveira

Raíne Piva Amaral

Tutora do grupo PET-Biologia: Profa. Dra. Cibele Marli Cação Paiva Gouvêa

Alfenas-MG

2018

MINISTÉRIO DA EDUCAÇÃO

Universidade Federal de Alfenas. Unifal-MG

Rua Gabriel Monteiro da Silva, 700. Alfenas/MG.

CEP 37130-000

Fone: (35) 3299-1000. Fax: (35) 3299-1063

SUMÁRIO

1 INTRODUÇÃO .................................................................................... 4

1.1 Ciências Morfológicas ........................................................................ 4

1.2 Histologia ............................................................................................ 4

1.3 Tecido ................................................................................................. 4

1.3.1 Tecido epitelial ............................................................................. 5

1.3.2 Tecido conjuntivo ......................................................................... 5

1.3.3 Tecido muscular ........................................................................... 6

1.3.4 Tecido neural ............................................................................... 6

1.4 Importância dos estudos histológicos ................................................. 7

2 OBJETIVOS ........................................................................................ 7

3 TÉCNICAS HISTOLÓGICAS .............................................................. 7

3.1 Coleta de material .............................................................................. 7

3.2 Fixação ............................................................................................... 9

3.3 Processamento do material .............................................................. 10

3.4 Inclusão e montagem de blocos ....................................................... 12

3.5 Microtomia ........................................................................................ 12

3.6 Coloração dos tecidos em lâminas histológicas ............................... 13

4 MICROSCOPIA ...................................................................................... 14

4.1 Métodos corretos de manuseio de microscópios.............................. 14

4.1.1 Limpeza ..................................................................................... 15

4.1.2 Acondicionamento para transporte ............................................ 16

4.2 Tipos de microscópios ...................................................................... 16

4.2.1 Microscópio de luz ..................................................................... 17

4.2.1.1 Pilares teóricos da microscopia óptica: aumento, resolução e

contraste ........................................................................................................ 19

4.2.1.2 Objetivas ................................................................................. 20

4.2.1.3 Condensador .......................................................................... 21

4.2.1.4 Iluminação de Kohler .............................................................. 21

4.2.2 Microscópio eletrônico ............................................................... 22

4.2.2.1 Microscópio eletrônico de varredura ....................................... 22

4.2.2.2 Microscópio eletrônico de transmissão ................................... 23

4.2.2.3 Microscopia de campo iônico .................................................. 24

5 PRÁTICA ................................................................................................ 24

REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ........................................................... 25

ANEXOS – Protocolos de Técnicas Histológicas ....................................... 26

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1 INTRODUÇÃO

1.1 Ciências Morfológicas

As Ciências Morfológicas integram áreas do conhecimento fundamentais

ao entendimento da estrutura e funcionamento dos organismos, como a

Embriologia, que estuda o desenvolvimento embrionário e fetal do indivíduo,

desde a fertilização até o nascimento; a Anatomia, que estuda aspectos como

forma, dimensão, constituição e localização dos diferentes órgãos e sistemas; a

Citologia e Histologia, que abordam a intimidade microscópica e ultramicroscópica

dos organismos, possibilitando o conhecimento de sua organização molecular,

organelas, células e tecidos, bem como de suas interações morfofuncionais.

Na área morfológica, a informação visual é de suma importância: o

conhecimento foi construído com a observação de células isoladas ou em cortes

de tecidos ou órgãos ao microscópio de luz e ao microscópio eletrônico.

1.2 Histologia

A Histologia, ou biologia tecidual, é definida como sendo a ciência que

estuda dos tecidos, de sua estrutura, seu material biológico e das maneiras como

os seus componentes se inter-relacionam, tanto estrutural como funcionalmente.

O termo histologia foi utilizado pela primeira vez pelo fisiologista e

anatomista alemão, Karl Mayer, em 1819. Contudo, o termo tecido já havia sido

introduzido em 1801 pelo anatomista francês Marie François Xavier Bichat, e foi

utilizado por Mayer para descrever de forma macroscópica as diferentes texturas

do corpo animal. O estudo dos tecidos que compõem os órgãos antes do conceito

de Mayer era uma subdivisão da anatomia denominada anatomia geral.

1.3 Tecido

Do ponto de vista biológico, podemos definir tecido como um conjunto de

células especializadas, sejam elas iguais ou diferentes entre si, separadas ou não

por líquidos extracelulares, e que realizam funções em organismos multicelulares.

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Segundo Junqueira, os tecidos fundamentais são quatro: tecido epitelial,

tecido conjuntivo, tecido muscular e tecido neural.

Sendo que cada um dos tecidos fundamentais é formado por combinações

específicas de células e matriz extracelular, que permitem o reconhecimento de

subtipos de tecidos através de estudos histológicos.

1.3.1 Tecido epitelial

O tecido epitelial é composto pelas células epiteliais e pela matriz

extracelular, que consiste na lâmina basal. As células epiteliais são justapostas,

poliédricas (várias faces), com muito citoplasma, citoesqueleto desenvolvido e

polaridade. Elas são justapostas devido à presença de junções celulares e de

pouca matriz extracelular.

O revestimento é uma das funções do epitélio. Ele cobre a superfície do

corpo, protegendo-o. Reveste os tratos digestório, respiratório e urogenital, as

cavidades corporais e os vasos sanguíneos e linfáticos. Outra função atribuída ao

tecido epitelial é a absorção, realizada tanto no sistema digestório quanto no

excretor. Há ainda tipos especiais de epitélios que realizam função sensorial e

germinativa, como os órgãos sensoriais e o epitélio dos testículos,

respectivamente.

1.3.2 Tecido conjuntivo

O tecido conjuntivo caracteriza-se pela grande variedade de células e pela

abundância de matriz extracelular.

O tecido conjuntivo foi assim denominado porque une tecidos, servindo

para conexão, sustentação e preenchimento. A composição da sua matriz celular

torna possível a absorção contra impactos, resistência à tração e uma certa

elasticidade. Pode ser especializado no armazenamento de gordura ou

responsável pela defesa do organismo.

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1.3.3 Tecido muscular

O tecido muscular possui células alongadas e ricas em filamentos

contráteis.

As células musculares são alongadas, por isso são também chamadas

fibras musculares. Elas são ricas nos filamentos de actina e de miosina,

responsáveis pela sua contração.

A contração do tecido muscular promove o movimento de estruturas

ligadas a ele, como os ossos, e, consequentemente, do corpo. Permite ainda o

movimento, pelo organismo, de substâncias e líquidos, como o alimento, o

sangue e a linfa.

1.3.4 Tecido neural

O tecido neural apresenta abundância e variedade de células, mas é pobre

em matriz extracelular.

O tecido neural encontra-se distribuído pelo organismo, mas está

interligado, resultando no sistema nervoso. Forma órgãos como o encéfalo e a

medula espinal, que compõem o sistema nervoso central (SNC).

O tecido neural localizado além do sistema nervoso central é denominado

sistema nervoso periférico (SNP) e é constituído por aglomerados de neurônios,

os gânglios nervosos, e por feixes de prolongamentos dos neurônios, os nervos.

O tecido neural recebe informações do meio ambiente através dos sentidos

e do meio interno, como temperatura, estiramento e níveis de substâncias.

Processa essas informações e elabora uma resposta que pode resultar em

ações, como a contração muscular e a secreção de glândulas, em sensações,

como dor e prazer, ou em informações cognitivas, como o pensamento, o

aprendizado e a criatividade. Ele é ainda capaz de armazenar essas informações

para uso posterior: é a memória.

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1.4 Importância dos estudos histológicos

Existem diversas aplicações dos conhecimentos adquiridos na Histologia,

como por exemplo:

• Educação: Cortes histológicos são usados regularmente em aulas práticas para

auxiliar os alunos a aprenderem sobre as microestruturas dos tecidos biológicos.

• Diagnóstico: Amostras de tecidos obtidas de um paciente podem ser estudadas

em detalhes tanto no ramo da medicina quanto da veterinária para auxiliar em

diagnósticos.

• Investigações forenses: histologia forense, imunoistoquímica e citologia podem

ajudar a compreender as possíveis causas de uma morte.

• Arqueologia: O estudo de células e tecidos advindos de sítios arqueológicos

podem conter informações sobre a história. O estado de preservação do material

biológico se encontra é crítico e na maioria das vezes é suficiente para realizar

estudos histológicos de ossadas e arcadas dentárias.

• Cultura tecidual: A Engenharia Genética, em conjunto com as novas técnicas de

culturas de tecidos, permite a criação de culturas para testes em laboratório de

medicamentos e outros compostos.

2 OBJETIVOS

• Apresentar os principais métodos de produções histológicas e tipos de

coloração;

• Apresentar as novas técnicas empregadas no ramo da microscopia.

3 TÉCNICAS HISTOLÓGICAS

3.1 Coleta de material

A coleta do material consiste na remoção de qualquer amostra de tecido de

alguns organismos pré-determinados. Tal técnica pode ser realizada de diferentes

formas, sendo estas com os organismos ainda vivos (vivissecção), após a morte

(post mortem ou necrópsia) e durante cirurgia (biópsia).

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O material coletado para estudo tecnológico deve ser obtido com rapidez,

visando a integridade celular do tecido no intervalo entre a coleta e a fixação;

objetividade, para que não ocorre a morte tecidual, pois alguns tecidos possuem

diferentes tempos de sobrevida; e cuidados com o manuseio, para não causar

nenhum dano físico ao tecido.

Quando realizada para diagnóstico, a coleta deve ser analisada por um

patologista, o qual verificará macroscopicamente a qualidade da amostra,

incluindo cor, tamanho, e aparência do órgão avaliado. Também, regras

importantes devem ser respeitadas para a manutenção da qualidade da amostra.

Todo material coletado deve ser registrado em um livro de protocolo. Esse

material que é registrado por meio de números, será organizado e devidamente

encaminhado para as demais etapas de técnicas histológicas.

Os materiais coletados podem ser encaminhados para avaliação

diagnóstica de enfermidades ou destinados a pesquisas. Quando coletada de

humanos, é necessário a identificação da amostra com dados do indivíduo e,

caso o indivíduo seja paciente do hospital, deverão ser registrados seus dados

hospitalares, que auxiliarão o histopatologista no diagnóstico.

Quando as amostras precedem de experimentos com animais, devem ser

protocoladas em caderno de registro após a eutanásia. Nas anotações devem

conter as identificações dos animais, tais como a data da eutanásia, os órgãos

coletados, o tipo de procedimento realizado, observações e título do trabalho. É

importante salientar que também deve ser anotado o protocolo do comitê de ética,

pois todos os trabalhos realizados com experimentação animal devem ser

aprovados pelo comitê de ética da instituição em que estão sendo exercidos. Em

animais experimentais nativos, o projeto deve ser submetido ao Instituto Brasileiro

do Meio Ambiente e dos Recursos Naturais Renováveis (Ibama), órgão

responsável por autorizar tal projeto.

Salienta-se, nessas técnicas, a importância da biossegurança, pois todo

material é potencialmente infectante. Portanto, deve-se manusear o material com

cuidado, durante e após a coleta, por meio do uso de Equipamentos de Proteção

Individual (EPI’s), tais como jaleco, luvas, óculos de proteção e máscaras.

Também, o descarte do material deve ser destinado para o lixo correto. Jamais

descarta-se material biológico em lixo comum.

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3.2 Fixação

Logo após a remoção de algum órgão ou tecido de um organismo, o

material inicia-se o processo de autólise, pois não há o suprimento necessário de

oxigênio e nutrientes responsáveis pela fisiologia dos tecidos. Dessa forma, o

dióxido de carbono começa a acumular-se nos tecidos, favorecendo o processo

autolítico em suas células, por meio das enzimas lisossomais presentes no

citoplasma.

Tal processo pode ser retardado se os órgãos passarem pelo processo de

fixação, pois para analisar o tecido em microscópio, o mesmo deve estar intacto.

A fixação interrompe o metabolismo das células, por isso é considerada

umas das etapas fundamentais da histologia. No momento que o metabolismo é

interrompido, as estruturas e os componentes bioquímicos ficam estabilizados, o

que favorece a preservação e conservação dos elementos teciduais, além de

possibilitar a penetração de outras substâncias que sucedem a fixação.

Existem muitos fixadores e protocolos de fixação presentes na literatura,

cada qual com sua especificidade. Porém, nenhum atinge o modelo considerado

ideal para o procedimento. Contudo, é imprescindível analisar qual o método que

melhor se adequa ao tipo de tecido estudado.

De modo básico, existem dois tipos de fixação, a física e a química.

Geralmente, a fixação química é realizada por meio do uso de substâncias

químicas que propiciam reações capazes de impedir a degradação tecidual.

O tipo de fixador a ser utilizado depende do tipo de tecido analisado e do

procedimento realizado. Portanto, a escolha do fixador depende desses principais

fatores. Dessa forma, o profissional apto deve conhecer os variados tipos de

fixadores e ter em mente a compatibilidade do fixador com os outros métodos de

coloração, com o intuito de adequar o tipo de fixador com as mais variadas

propriedades dos diversos tipos de tecidos.

A classificação dos fixadores foi descrita por Leong (1996), o qual divide os

fixadores nas seguintes classes:

Fixadores aldeídos: formaldeído, glutaraldeído e paraformaldeído comercial.

Agentes oxidantes: tetróxido de ósmio, dicromato de potássio, permanganato de

potássio e ácido crômico.

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Agentes desnaturantes ou coagulantes de proteínas: metanol, etanol, acetona e

ácido acético.

Mecanismo desconhecido: cloreto de mercúrio, ácido pícrico e sais de zinco.

Combinação de reagentes: tetróxido de ósmio e glutaraldeído, tetróxido de ósmio

e iodeto de zinco, glutaraldeído e carbodiamida e formaldeído com glutaraldeído.

Fixação a seco: carbowax 6000 (20% de polivinil – álcool ou 20% de polietileno

glicol) ou fixação no vapor.

Micro-ondas: fixação pelas ondas eletromagnéticas com ou sem a utilização de

agentes fixadores.

Dentre estes, os mais utilizados são da classe dos aldeídos, mais

comumente formaldeído, o glutaraldeído, e principalmente o paraformaldeído, que

é o próprio formaldeído na sua forma polimerizada. É importante salientar que os

fixadores devem ser preparados com solução tampão de acordo com pH do

material coletado, afim de neutralizar o pH do fixador, pois, o formaldeído, por

exemplo, ao ser exposto a luz forma ácido fórmico que pode precipitar formando

pontos marrons no tecido, o que tem a possibilidade de danificar ou dificultar as

posteriores colorações. Para uma boa fixação, é necessário utilizar um volume de

fixador vinte vezes maior do que o volume dos órgãos coletados.

O formaldeído deve ser devidamente manuseado e descartado em

recipiente correto, com o uso de luvas, máscaras e na capela exaustão ou em

ambiente aberto, pois é extremamente tóxico quando ingerido, inalado ou em

contato com a pele. Em altas concentrações, pode causar bronquite, laringite ou

pneumonia. Também é classificado como teratogênico e carcinogênico.

Após fixado, o material passa pelo processo de clivagem afim de diminuir

seu tamanho em relação ao que foi coletado. O menor tamanho facilita a

penetração dos fixadores e das demais soluções a serem empregadas.

3.3 Processamento do material

Os fragmentos devem, após a fixação, serem submetidos a infiltração com

substâncias que possibilitam maior rigidez aos tecidos e órgãos retirados,

facilitando os cortes para as análises em microscópios. Geralmente, usa-se

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parafina ou resinas de plástico para essa finalidade. Parafina é uma das

substâncias mais utilizadas para microscopia de luz enquanto que resinas são

usadas para tal e para microscopia eletrônica.

O processamento tem como finalidade difundir os reagentes no interior nos

tecidos e retirar o líquido dos mesmos e possui três fases: desidratação,

clareamento e impregnação.

A desidratação é processo pelo qual retira-se todo o líquido presente no

órgão por meio da infiltração em diferentes concentrações de álcool etílico, que se

inicia no álcool 70% em água e encerra-se no álcool absoluto ou 100%. Para que

o processo seja feito de forma adequada, o volume de álcool deve ser vinte vezes

maior que o volume do tecido. E como a água é mais densa que o álcool,

acumula-se no fundo do frasco, no mesmo lugar onde se encontra a amostra,

posteriormente à sua retirado do tecido.

Para que ocorra a impregnação da parafina nos tecidos, é necessário,

antes, retirar o álcool, pois a parafina não se mistura bem com tal substância.

Para isso, usa-se o xilol, que é um intermediário entre o álcool e a parafina. A

medida que o xilol substitui o álcool nos tecidos, estes vão clareando, por esse

motivo essa etapa é denominada clarificação ou diafanização.

Para a inclusão tecidual, é necessário que a parafina esteja aquecia entre

56ºC-60°C, pois ela só é líquida nessas temperaturas e sólida na temperatura

ambiente.

Existem outros meios alternativo de inclusão, como por exemplo resinas

hidrofílicas e hidrofóbicas, gelatinas, polietilenoglicol (carbowax), entre outros e

cada um destes segue um protocolo específico e dependem da análise

objetivada.

Todo material utilizado no processamento é inflamável, por isso é

indispensável o uso dos EPI’s e, principalmente o xilol, deve ser manuseado em

capelas de exaustão devido a sua alta toxicidade. Além disso, devem ser

devidamente descartados de acordo com a política de descarte de substâncias

químicas.

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3.4 Inclusão e montagem de blocos

É o processo pelo qual os fragmentos de órgãos são colocados, após o

processamento, em parafina líquida com auxílio de pinças. Deve evitar a

formação de bolhas de ar, por isso as amostras são colocadas ainda aquecidas.

E, após o resfriamento, o bloco está pronto para a microtomia.

O modo como os fragmentos são incluídos são de grande relevância, já

que isso interfere no corte e no tipo de análise a ser realizada. Órgãos tubulares,

como a traqueia, precisam ser incluídos na orientação transversal, os músculos

vão depender da orientação de suas fibras e a pele deve apresentar todas as

suas estruturas básicas, como epiderme e a derme. Esses são alguns exemplos

da orientação das amostras para a inclusão, mas cada amostra possui sua

especificidade e, também, vai depender do estudo realizado.

3.5 Microtomia

Ao serem retirados da estufa com parafina, os fragmentos de tecidos

contidos nesta se solidificam e, então, são levados para o micrótomo, nome dado

ao aparelho responsável por fazer os cortes microscópios, os quais variam de 1 a

10 μm de espessura e são realizados por meio do uso de navalhas afiadas. Esses

cortes possibilitam a análise microscópica, por isso é imprescindível que esses

segmentos sejam feitos com cautela a fim de manter a uniformidade do corte.

Existem diversos tipos de micrótomo no mercado e cada um é utilizado de

acordo com a especificidade do corte e do material em que os tecidos foram

incluídos.

Antes de realizar os cortes, é necessário preparar as lâminas com

substâncias que vão adesivar os cortes para que estes não se desprendam nas

fases subsequentes.

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3.6 Coloração dos tecidos em lâminas histológicas

Para visualizar os tecidos em microscópios de luz é indispensável o uso de

corantes, pois, na maioria das vezes, os constituintes celulares e extracelulares

do tecido são transparentes após a microtomia e a coloração otimiza a

visualização dessas estruturas. Para tal finalidade, existem diversos métodos de

coloração de tecidos.

Antes de iniciar o processo de coloração dos cortes, há a necessidade de

remover a parafina na qual o tecido foi incluído, no processo chamado de

desparafinização. Para isso, o corte, já aderido na lâmina, é banhado no xilol a fim

de dissolver a parafina. Além disso, a maioria dos corantes são solúveis em água,

por isso é fundamental remover o xilol do tecido e substituí-lo por água, no

processo chamado de hidratação. Para tal finalidade, são utilizadas variadas

concentrações de etanol, geralmente do mais concentrado (absoluto ou 100%)

para o menos concentrado (álcool 70%).

No geral, os corantes são compostos orgânicos que possuem anéis

aromáticos e ionizáveis. Entretanto, na maioria das vezes eles são incolores e

necessitam do acréscimo de uma substância química que lhe possibilitará a

formação de cores, denominada cromóforo. A junção dos compostos aromáticos

com os cromóforos forma os cromógenos. Para que ocorra a ligação seletiva do

corante com os tecidos, é preciso que o os cromógenos liguem-se aos

auxocromo, que é responsável por determinar se o corante é ácido ou básico.

Grande parte dos corantes se comportam como substâncias ácidas ou

básicas que formam sais por meio de ligações eletrostáticas com radicais

ionizados presentes nos componentes teciduais. Desta forma, são considerados

basófilos os componentes teciduais que são corados com corantes básicos e, em

contrapartida, considerados acidófilos aqueles que se coram com os corantes

ácidos.

Dessa forma, recomenda-se, de início, usar uma coloração que propicie

uma visão geral do tecido com um todo, permitindo a identificação dos elementos

tissulares, o que permite a avaliação histológica. A coloração mais utilizada para

tal finalidade é baseada nos corantes hematoxilina (H) e eosina (E). Nesta, os

ácidos nucleicos coram-se pela hematoxilina, destacando-se em roxo enquanto o

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citoplasma e os espaços intercelulares são corados pela eosina, corando-se em

rosa.

Nem sempre as estruturas teciduais coram-se da mesma cor do corante.

Quando isso ocorre, dá-se o nome de metacromasia. Em contrapartida, quando

os tecidos são visualizados na mesma cor, ou em tom muito semelhante ao do

corante utilizado, denomina-se como ortocromasia.

Outra técnica utilizada para a coloração de tecidos é a imunocitoquímica, a

qual engloba um conjunto procedimentos que utilizam de alguns marcadores, os

quais possuem a aptidão de se ligarem aos anticorpos, sem perder a sua

capacidade de se ligarem com o antígeno.

4 MICROSCOPIA

4.1 Métodos corretos de manuseio de microscópios

Nunca desloque o microscópio e movimente-o o mínimo possível;

Não manusear o equipamento com as mãos sujas ou molhadas;

Comece a focalizar sua lâmina sempre pela objetiva de menor aumento,

usando o macrométrico para obter o foco grosseiro e o micrométrico para o

ajuste fino do foco;

Nunca forçar o microscópio ou suas partes. Todas as conexões devem

funcionar suavemente;

As lentes da objetiva nunca devem tocar a lâmina. Portanto, nunca focalizar

levantando a platina com o parafuso macrométrico e olhando pela ocular ao

mesmo tempo;

Quando mudar a lâmina, antes de tirá-la, volte sempre para a objetiva de

menor aumento;

Nunca use a objetiva de imersão (100x) sem o óleo de imersão;

Após usar a objetiva de imersão, limpe-a;

Quando o material biológico estiver corado, use o condensador alto e o

diafragma aberto. Com o material não corado (espécimes a fresco ou vivos),

use o condensador baixo ou o diafragma fechado;

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Retire a lâmina do microscópio após o uso. Descarte as mesmas em

recipiente apropriado, a ser indicado pela professora;

Manter a platina sempre limpa e seca;

Quando o microscópio não estiver em uso, deverá ser desligado e guardado

coberto;

Habitue-se não deixar a fonte de luz acesa quando não estiver utilizando o

microscópio.

4.1.1 Limpeza

A limpeza da parte óptica deve ser criteriosa, uma vez que dela depende o

perfeito funcionamento do microscópio. Cuidados especiais devem ser tomados

com lentes, filtros e espelhos.

O material necessário à limpeza das partes citadas é composto de:

• Algodão;

• Solução de limpeza (50% éter sulfúrico PA, 50% clorofórmio PA);

• Cotonete caseiro ou palito isento de ferpas, com ponta envolvido com algodão;

• Borrifador;

• Panos limpos, de um tecido macio que não solte fiapos (por exemplo, morim);

• Lupa de bolso, com aumento de 2,5X.

Antes de se iniciar a limpeza da parte óptica do microscópio, os seguintes

cuidados devem ser tomados:

• Observar se as lentes possuem fungos;

• Observar se a camada de filme fino antirreflexiva, não está deteriorada. Isto

pode ser observado através da diferença de coloração entre o vidro e o filme.

Está deterioração pode ser causada por fungos, por soluções de limpeza

inadequadas ou por agressão mecânica, como o uso de palha de aço, papel

impróprio, objetos pontiagudos, entre outros. Após estas observações, inicia-

se a limpeza de baixo para cima, ou seja, limpam-se os vidros e espelhos da

base, da lâmpada, até chegar-se ao topo, nas oculares.

Para a limpeza de fungos utiliza-se água oxigenada a 10 volumes. O

procedimento para aplicação é o seguinte:

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• Segura-se o cotonete sem tocá-lo, para evitar depositar gordura das mãos no

algodão. Segura-se a lente, pela lateral, limpando as duas superfícies. Inicia-

se a aplicação pelo centro, fazendo-se um movimento em espiral. O mesmo

procedimento é utilizado na limpeza de espelhos. Para a limpeza das lentes

com manchas de gorduras ou outras que não fungos, executa-se o mesmo

procedimento anterior, porém com a solução de limpeza. Os filtros e lentes de

plástico ou acrílico não podem ser limpos com a solução de clorofórmio e éter

sulfúrico, pois isto danificaria a sua superfície tornando-os opacos. Utiliza-se

para isto álcool etílico.

A limpeza das partes mecânicas, mesmo as mais básicas, não faz parte do

escopo deste documento, pois apesar de simples, requer um treinamento prévio,

de forma a evitar acidentes que possam causar graves danos ao microscópio.

Durante o trabalho de limpeza as peças desmontadas devem ser deixadas

sobre os panos citados e cobertas para que não haja depósito de poeira.

4.1.2 Acondicionamento para transporte

Quando for necessário transportar um microscópio, devem-se tomar

cuidados especiais na embalagem, para garantir que não sejam causados danos

ao equipamento durante a viagem. As oculares e objetivas devem ser embaladas

individualmente se possível em plástico bolha e protegidas dentro da caixa por

isopor ou bolas de jornal. O tubo binocular também deve ser desconectado da

estativa, para se evitar que o soquete de engate seja quebrado. Quaisquer outras

peças desmontáveis, em nível de usuário, devem merecer a mesma atenção. A

caixa da embalagem deverá ser, preferencialmente, de madeira reforçada.

4.2 Tipos de microscópios

No estudo dos materiais três tipos de microscopia são utilizados em grande

extensão: microscopia óptica (MO), microscopia eletrônica de varredura (MEV) e

microscopia eletrônica de transmissão (MET). Em menor extensão, mas em uma

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faixa exclusiva de alto aumento e excelente resolução, encontra aplicação a

microscopia de campo iônico (MCI).

4.2.1 Microscópio de luz

Os microscópios de luz podem ser: verticais; invertidos; mono, bi ou

trinoculares.

Os tipos de microscopia de luz são: campo claro; campo escuro;contraste

de fase (sem coloração); contrate interferencial; polarização; fluorescência e

confocal a laser.

A luz, que atravessa as lentes condensadoras, é uniformemente espalhada

sob a lâmina e atravessa o objeto observado, incidindo na lente objetiva. Estando

o objeto colocado anteriormente ao ponto focal da lente objetiva, forma-se-á, no

plano focal da lente ocular, uma imagem real (que pode ser projetada em um

anteparo), maior e invertida. A luz ao atravessar a ocular, formará uma imagem

virtual, maior e direta com relação à imagem formada pela objetiva. Deste modo,

a imagem final do objeto, proporcionada pelo microscópio, será virtual, maior e

invertida em relação ao mesmo. O observador ao examinar o material verá uma

imagem real e invertida, pois a luz ao atravessar o cistalino do olho formará uma

imagem real e invertida com relação à imagem formada pela ocular. O cérebro

inverte esta imagem. O aumento final da imagem é resultado do produto do

aumento proporcionado pelas lentes oculares e objetivas.

O microscópio fotônico é sempre constituído pela parte mecânica (estativa)

e pelo sistema ótico (FIGURA 1).

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Figura 1 - Anatomia do microscópio ótico comum composto.

1) Base: ou pé; serve de apoio físico para as demais partes;abriga a lâmpada,

os dispositivos de estabilização e o diafragma de campo; botão liga/desliga e

ajuste da intensidade da iluminação.

2) Iluminador: ou fonte; situado na parte posterior da base da estativa; o feixe

luminoso emitido pela lâmpada é conduzido através de um sistema de lentes

até o espelho, situado abaixo do diafragma de campo luminoso, que o

conduz para o condensador, passando pela lâmina, objetiva e ocular.

3) Macro e micromético: parafusos que permitem os ajustes mecânicos, grosso

e fino, respectivamente, da altura da platina; têm função de focalizar a

amostra no ponto focal da objetiva.

4) Braço: abriga a trilha denteada da platina e dá suporte aos parafusos macro

e micrométrico.

5) Condensador: sistema de lentes que coleta luz que vem do diafragma de

campo e forma um cone de luz com intensidade uniforme focalizado na

amostra; limita o feixe para evitar a dispersão de luz oriunda de elementos

da coluna do microscópio, de modo a impedir a deterioração da qualidade da

imagem.

6) Platina: ou mesa; plataforma localizada entre condensador e objetiva, onde a

amostra é colocada.

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7) Charriot: dispositivo associado à platina que permite o deslocamento da

amostra nos eixos “X” e “Y” do plano horizontal.

8) Objetivas: são os principais responsáveis pelo aumento, pela resolução e

pela qualidade da imagem; coletam a luz difratada pelo espécime e formam

uma imagem ampliada do objeto nas oculares ou próximo a elas.

9) Tubo: ou canhão; onde são fixados o revólver das objetivas, o suporte das

oculares e a saída para câmera fotográfica.

10) Suporte das oculares.

11) Oculares: componentes ópticos que dão aumento adicional à imagem

produzida pela objetiva, focalizam a imagem no olho do observador e

determinam o tamanho do campo de visão; ajuste de dioptria e interpupilar

12) Diafragma-íris do condensador: diafragma de abertura; é crítico na formação

da imagem.

O sistema ótico do microscópio permite ampliar a imagem com definição

suficiente para se visualizar o objeto de interesse.

4.2.1.1 Pilares teóricos da microscopia óptica: aumento, resolução e

contraste

Aumento: dado pelo conjunto: objetiva ( principal componente ); tubo

(caminho da objetiva até as oculares); ocular (aumento adicional)

Aumento = aumento obj x aumento ocl x 1,2 (no microscópio binocular)

Contraste: que pode ser positivo (a amostra é mais escura do que o plano

de fundo) e negativo (a amostra é mais clara do que o plano de fundo).

Resolução: capacidade de se distinguir dois pontos próximos como

estruturas separadas. A capacidade de resolução do olho desarmado é de 0,2

mm (200 µm) e distância focal de 25 cm. A resolução da lente depende do ângulo

de abertura (NA; abertura numérica) e do comprimento de onda; quanto maior a

valor de NA maior a resolução. O limite teórico para a NA no ar é 1 (180o), mas na

realidade obtem-se 0,95 (140o); as objetivas a óleo podem alcançar NA de 1,4.

Quanto menor a distância focal, maior o aumento; o campo de visão é

inversamente proporcional ao aumento (FIGURA 2).

20

R = λ / 2NA

Figura 2 - Esquema de lentes objetivas, relacionando: aumento, abertura numérica, distância focal

e resolução.

4.2.1.2 Objetivas

Componente óptico mais próximo do objeto (amostra) e são as lentes mais

importantes para o aumento da imagem, sendo as mais comuns: 4, 10, 20, 40 e

100 x (imersão).

Para que seja conseguido o aumento, algumas objetivas precisam de um

meio de refração diferente do ar, que pode ser o óleo mineral (mais comum,

preto), glicerol (laranja), água (branco) ou meio especial (vermelho).

Outros fatores que diferenciam as objetivas são as aberrações.

Basicamente, existem dois tipos de aberrações: as cromáricas e as esféricas. As

aberrações cromáticas ocorrem em função da maior refração de ondas com

comprimento de onda menor, em relação as outras de comprimento de onda

maior, causando franjas coloridas na imagem. As aberrações cromáticas podem

ser corrigidas por lentes acromáricas, semi-apocromáticas e apocromáticas.

Além das aberrações cromáticas, as lentes também apresentam

aberrações esféricas. Essas anomalias ocorrem porque os raios que percorrem

as regiões periféricas de determinadas lentes tendem a focar antes dos raios que

21

percorrem regiões mais centrais das lentes. Dessa forma um ponto focado na

imagem vai aparecer cercado por uma nuvem ou um halo claro, formado pelos

raios periféricos. Em função da forma convexa das lentes, a margem e a parte

central da imagem nunca estão em foco ao mesmo tempo (curvatura de campo) e

as lente plano corrigem esta aberração.

4.2.1.3 Condensador

O condensador e seu diafragma íris são extremamente importantes na

produção de imagem de qualidade, interferindo na formação da imagem, seu

contraste e resolução. Isto ocorre, pois, o diafragma do condensador determina o

ângulo que será formado pelo cone de iluminação (quanto maior o NA, maior o

cone). Na realidade a resolução de uma imagem depende da NA do condensador

mais a NA da objetiva. Por outro lado, a abertura do diafragma íris implica em

diminuição do contraste. Assim, para observação em geral a NA do condensador

deve ser de 80% da NA da objetiva e para materiais com pouco contraste deve-se

ajustar o NA do condensador para 1/4 do NA da objetiva. O condensador mais

comumente utilizado é o Abbe (homenagem ao seu inventor Ernst Karl Abbe).

Hoje existem condensadores acromáticos, aplanáticos, aplanático-acromático e

com NA 1,4, os quais trabalham com óleo de imersão entre a lente e a lâmina.

4.2.1.4 Iluminação de Kohler

Ajuste da iluminação da amostra de modo a produzir a melhor qualidade de

imagem com brilho uniforme e sem excessos. para isso a iluminação deve estar

alinhada.

Focalização - a amostra com a objetiva de 10x;

Fechar diafragma de campo;

Fechar o diafragma íris do condensador, até que uma imagem geomética seja

observada (bordas do diafragma de campo);

Focalizar as bordas do diafragma abaixando ou elevando o condensador, até

que as bordas fiquem nítidas;

22

Abrir o diafragma íris do condensador até a NA desejada;

Abrir o diafragma de campo até iluminar todo o campo de visão.

4.2.2 Microscópio eletrônico

A miscroscopia eletrônica existe de dois tipos, a de transmissão e a de

varredura.

4.2.2.1 Microscópio eletrônico de varredura

Um microscópio eletrônico de varredura (MEV) utiliza um feixe de elétrons

no lugar de fótons utilizados em um microscópio óptico convencional, o que

permite solucionar o problema de resolução relacionado com a fonte de luz

branca.

O MEV é um aparelho que pode fornecer rapidamente informações sobre a

morfologia e identificação de elementos químicos de uma amostra sólida. Sua

utilização é comum em biologia, odontologia, farmácia, engenharia, química,

metalurgia, física, medicina e geologia. O MEV é um dos mais versáteis

instrumentos disponíveis para a observação e análise de características

microestruturais de objetos sólidos. A principal razão de sua utilidade é a alta

resolução que pode ser obtida quando as amostras são observadas; valores da

ordem de 2 a 5 nanômetros são geralmente apresentados por instrumentos

comerciais, enquanto instrumentos de pesquisa avançada são capazes de

alcançar uma resolução melhor que 1 nm.

Outra característica importante do MEV é a aparência tridimensional da

imagem das amostras, resultado direto da grande profundidade de campo.

Permite, também, o exame em pequenos aumentos e com grande profundidade

de foco, o que é extremamente útil, pois a imagem eletrônica complementa a

informação dada pela imagem óptica.

23

4.2.2.2 Microscópio eletrônico de transmissão

A microscopia eletrônica de transmissão permite a análise de defeitos e

fases internas dos materiais, como discordâncias, defeitos de empilhamento e

pequenas partículas de segunda fase.

Um microscópio eletrônico de transmissão consiste de um feixe de elétrons

e um conjunto de lentes eletromagnéticas, que controlam o feixe, encerrados em

uma coluna evacuada com uma pressão cerca de 10-5 mm Hg. A figura 2 mostra

a seção esquemática vertical de um aparelho que utiliza 100 kV como diferença

de potencial máxima de aceleração do feixe. Um microscópio moderno de

transmissão possui cinco ou seis lentes magnéticas, além de várias bobinas

eletromagnéticas de deflexão e aberturas localizadas ao longo do caminho do

feixe eletrônico. Entre estes componentes, destacam-se os três seguintes pela

sua importância com respeito aos fenômenos de difração eletrônica: lente

objetiva, abertura objetiva e abertura seletiva de difração. A função das lentes

projetoras é apenas a produção de um feixe paralelo e de suficiente intensidade

incidente na superfície da amostra.

Os elétrons saem da amostra pela superfície inferior com uma distribuição

de intensidade e direção controladas principalmente pelas leis de difração

impostas pelo arranjo cristalino dos átomos na amostra.

Em seguida, a lente objetiva entra em ação, formando a primeira imagem

desta distribuição angular dos feixes eletrônicos difratados. Após este processo

importantíssimo da lente objetiva, as lentes restantes servem apenas para

aumentar a imagem ou diagrama de difração para futura observação na tela ou na

chapa fotográfica. Na figura 3 é mostrada uma fotografia de um MET de 200 kV.

Deve-se finalmente destacar que embora existam em operação alguns

aparelhos cuja tensão de aceleração é de 1000 kV, a maioria dos equipamentos

utilizados no estudo de materiais (metálicos, cerâmicos e poliméricos) dispõe de

tensão de aceleração de até 200 kV. Os MET utilizados em biologia (materiais

orgânicos naturais) em geral operam na faixa de 60 a 80 kV.

24

4.2.2.3 Microscopia de campo iônico

A microscopia de campo iônico, por apresentar excelente resolução,

permite estudos difíceis de serem realizados com as outras técnicas, tais como

observação de defeitos puntiformes, aglomerados de átomos de soluto ("cluster")

e análise da estrutura de contornos e de interfaces.

5 Prática

Breve exposição de cada fase da confecção do material para estudo

histológico;

Montagem de lâmina e coloração de esfregaço bucal.

Iluminação de Kohler ou ajustes da iluminação

Observação da lâmina

25

REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

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EDIPUCRS, 2007.

BRASIL. Ministério da Saúde: Biossegurança em laboratórios biomédicos e de

microbiologia. Brasília: MS, 2006.

______. Ministério da Saúde: Classificação de risco dos agentes biológicos.

Brasília: MS, 2010.

GARTNER, L.P. et al. Tratado de histologia em cores. 3. ed. Rio de Janeiro:

Guanabara Koogan, 2007.

HARRIS, H. F. On the rapid conversion of haematoxylin into haematein in staining

reactions. J. Appl. Microsc., v. 3, p. 777-780, 1900.

JUNQUEIRA, L.C.U.; CARNEIRO, J. Histologia básica. 11. ed. Rio de Janeiro:

Guanabara Koogan, 2008. 524p.

LEUNG, A.Y. Encyclopedia of common natural ingredients: used in food,

drugs, and cosmetics. 2. ed. Canadá: John Wiley e Sons, 1996. p. 68- 110.

MACEDO, A. et al. Cuidados básicos com microscópios ópticos. CT/3,

CNPDIA, Nº 3, 1996, p.1-7.

ORGANIZAÇÃO MUNDIAL DA SAÚDE: Manual de segurança biológica em

laboratório. 3. ed. Genebra: OMS, 2004.

PADILHA, A. F. Microscopia eletrônica de transmissão. PMI-2201.

SILVA, A. A. A.; ANDRADE-NETO, A.V. Cálculo da taxa de ionização por campo

de um átomo próximo a uma superfície metálica: aplicação ao microscópio iônico

de campo. Rev. Bras. Ensino Fís., v. 34, n. 1, p. 1-5, 2012.

STEVENS, A.; LOWE, J. Histologia. São Paulo: Manole, 1995.

TIMM, L. L. Técnicas rotineiras de preparação e análise de lâminas histológicas.

Caderno La Salle XI. v. 2, p. 231-9, 2005.

UNIVERSITY OF LEEDS. What is histology. Leeds, 2003. Disponível em:

<https://histology.leeds.ac.uk/what-is-histology/index.ph>. Acesso em: 11 set.

2018.

26

ANEXOS – PROTOCOLOS DE TÉCNICAS HISTOLÓGICAS

- fixar o material em paraformaldeído 4% tamponado (tampão fosfato 0,1 M, pH

7,0, contendo 0,9% de NaCl), por 24 h (não deixar mais tempo que isto).

- transferir para o álcool 70% (pode ser armazenado na geladeira por várias

semanas).

- desidratar o material em série crescente de álcool (já está no álcool 70%): 80,

90, 95 e 2 x de 100, por 1 h cada. Pode ficar overnight no último álcool 100.

- transferir para o xilol/álcool (1:1), xilol I e xilo II, por 1 h cada

- infiltração em parafina: xilol/parafina (1:1), parafina I, parafina II, por 1 hora, a

56o C (não deixar mais, pois pode danificar o material)

- incluir em parafina (transferir para parafina nova e retirar da estufa)

- o volume de líquido e parafina é um pouco acima da peça.

- realizar a microtomia

Coloração com HE

- desparafinizar: xilol I e xilol II, 10 min cada

- Hidratar o material da lâmina, em série crescente de álcool: 100, 95, 80 e 70%, 5

mim.

- lavar 3 x em água destilada

- hematoxilina, 5 min

- lavar em água de torneira e deixar 10 min em água de torneira.

- eosina, 10 min

- lavar rapidamente em água de torneira

- hidratar o material (colocar o álcool no suporte agitar, tirar e colocar outro):

álcool 95 – 5x; álcool 100-1 – 5x; álcool 100-2 – 5x; álcool 100-3 – 5x

- xilol I, xilol II, por 10 min cada

-montar com enthelan: retirar a lâmina do xilol e rapidamente pingar enthelan,

molhar a lamínula no xilol e colocar sobre a lâmina, bater vagarosamente com a

pinça para remover as bolhas e limpar o excesso de enthelan, (com muuuuito

27

cuidado), com auxílio de algodão enrolado em um palito de unha, molhado em

xilol.

Imunocitoquímica

- Desparafinizar e reidratar as seções d

em lâminas, antes da coloração.

- Tratar as seções com peróxido de hidrogênio (H2O2) 0,3% (v/v), em metanol, por

20 minutos, para bloquear peroxidases endógenas e equilibrar em tampão fosfato

salina (PBS) 0,01 M em pH 7,2 por 30 minutos.

- Incubar os cortes em PBS, contendo Tween 20 a 0,1% (PBST) ec 1% (p/v) de

albumina de soro bovino (BSA) por 30 minutos para bloqueio de ligação não-

específica (PBST/BSA)

- Incubar com o primeiro anticorpo diluído em PBST/BSA por 1 h (usar a diluição

indicada pelo fabricante).

- Lavar com PBST/BSA (5x).

- Incubar com o segundo anticorpo diluído em PBS/BSA por 1 h.

- Lavar as lâminas com PBST/BSA para remoção de AC não ligados

- Pré-incubar as seções com Tris-HCl 0,1 M, pH 7,6 antes da reação com

diaminobenzidina (DAB).

- Revelar com DAB a 0,05% em Tris-HCl 0,1 M pH 7,6 contendo peróxido de

hidrogênio 0,03 % (v/v), por 10 min.

- A seguir desidratar os cortes realizar a montagem definitiva das lâminas.