produÇÃo de amilase por amostra de - unicap.br · figura 6- fluxograma simplificado da produção...

UNIVERSIDADE CATÓLICA DE PERNAMBUCO PRÓ-REITORIA ACADÊMICA

COORDENAÇÃO GERAL DE PÓS-GRADUAÇÃO MESTRADO EM DESENVOLVIMENTO DE PROCESSOS AMBIENTAIS

Tainã Crisia de Souza Fonseca

PRODUÇÃO DE AMILASE POR AMOSTRA DE

Aspergillus tamarii UCP 1261 ATRAVÉS DE

FERMENTAÇÃO SUBMERSA UTILIZANDO

RESÍDUOS AGROINDUSTRIAIS

Recife

2017


PRODUÇÃO DE AMILASE POR AMOSTRA DE Aspergillus

tamarii UCP 1261 ATRAVÉS DE FERMENTAÇÃO

SUBMERSA UTILIZANDO RESÍDUOS AGROINDUSTRIAIS

Orientador: Prof.Dr.Carlos Alberto Alves da Silva

Co-orientadora: Profa Dra.Galba Maria de Campos Takaki

Recife

2017

Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação

em Desenvolvimento em Processos Ambientais

Universidade Católica de Pernambuco como pré-requisito

para obtenção do título de Mestre em Desenvolvimento

de Processos Ambientais.

Área de Concentração: Desenvolvimento em Processos

Ambientais

Linha de Pesquisa: Biotecnologia e Meio Ambiente

FONSECA, T.C.de S.

PRODUÇÃO DE AMILASE POR AMOSTRA DE Aspergillus tamarii UCP 1261

ATRAVÉS DE FERMENTAÇÃO SUBMERSA UTILIZANDO RESÍDUOS

AGROINDUSTRIAIS

2017, p.65.

Dissertação (Mestrado) - Universidade Católica de Pernambuco. Pró-reitoria Acadêmica. Curso de Mestrado em Desenvolvimento de Processos Ambientais, 2017, 65p.

1. Fungo filamentoso 2. formulação meios alternativos; 3.planejamento fatorial

4.Atividade Amilolítica.

Programa de Pós-Graduação em Desenvolvimento de Processos Ambientais.

PRODUÇÃO DE AMILASE POR AMOSTRA DE Aspergillus tamarii

UCP 1261 ATRAVÉS DE FERMENTAÇÃO SUBMERSA UTILIZANDO

RESÍDUOS AGROINDUSTRIAIS


Examinadores:

____________________________________

Prof.Dr.Carlos Alberto Alves da Silva (Orientador) Universidade Católica de Pernambuco – UNICAP

____________________________________ Profa.Dra Kaoru Okada (Membro Interno)

Universidade Católica de Pernambuco – UNICAP

_______________________________________ Profa.Dra.Luciana de Oliveira Franco (Membro Externo)

Universidade Federal Rural de Pernambuco – UFRPE

i

AGRADECIMENTOS

A DEUS primeiramente, por mais essa conquista diante de tantas dificuldades ele sempre me

deu forças para continuar a jornada.

Ao meu filho, Jorge Henrique, que mesmo com suas limitações físicas, sempre esteve ao meu

lado da sua maneira e pacientemente entendeu as minhas horas de ausência. Ele é o meu

incentivador maior, sua batalha e força de viver, não me deixou desistir em momento algum.

A minha mãe, Sonia Maria, sempre se fez presente e nunca me desamparou.

A minha família e namorado (meu amor), Junior Menezes, que sempre estiveram prontos a me

ajudar e trazer palavras de incentivo.

Aos meus amigos que entenderam os momentos que estive ausente, até mesmo quando

precisaram de mim.

Ao meu orientador, Professor Dr. Carlos Alberto Alves da Silva, que sem seu incentivo e

companheirismo não teria conseguido terminar minha pesquisa. Serei eternamente grata pela

oportunidade que tive em passar esses anos, sendo sua orientanda, foram anos de

aprendizado inigualável e que jamais esquecerei.

A minha co-orientadora, Galba Takaki, que tenho um carinho especial, tendo-a como minha

segunda mãe.

A Rosileide Fontenele e Marcos Luna, que me auxiliaram em vários momentos com seu vasto

conhecimento e muita paciência.

Aos meus queridos amigos (Miller, Paloma e Felipe), nunca esquecerei dos nossos momentos

no laboratório

Ao técnico em laboratório, Sr Severino Humberto de Almeida, que sem ele, nada funcionaria.

A todas as pessoas que contribuíram com todas as técnicas laboratoriais.

A CAPES pelo apoio financeiro, contribuindo para o desenvolvimento do conhecimento.

ii

SUMÁRIO

AGRADECIMENTOS .............................................................................................................. i

LISTA DE FIGURAS ............................................................................................................. iv

LISTA DE TABELAS .............................................................................................................. v

RESUMO ............................................................................................................................. vii

ABSTRACT..............................................................................................................................vii

CAPÍTULO I .......................................................................................................................... 8

1.Introdução..............................................................................................................................9

2.OBJETIVOS..........................................................................................................................11

2.1 Objetivo Geral....................................................................................................................11

2.2 Objetivos Específos...........................................................................................................11

3.REVISÃO DA LITERATURA.................................................................................................12

3.1 Enzimas..............................................................................................................................12

3.1.1 Aplicações das enzimas..................................................................................................14

3.2 Enzimas de origem fúngicas..............................................................................................15

3.3 Amilases.............................................................................................................................16

3.4 Gênero Aspergillus.............................................................................................................19

3.5 Processos fermentativos....................................................................................................21

3.6 Resíduos agroindustriais....................................................................................................23

3.6.1 Macaxeira (Manihot esculenta).......................................................................................24

3.6.2 Batata inglesa (Solanum tuberosum L.)..........................................................................26

4. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS.....................................................................................28

CAPÍTULO II.............................................................................................................................39

RESUMO..................................................................................................................................40

ABSTRACT...............................................................................................................................40

iii

INTRODUÇÃO..........................................................................................................................40

MATERIAL E MÉTODOS..........................................................................................................42

Micro-organismos......................................................................................................................42

Obtenção e preparo dos resíduos.............................................................................................42

Substratos.................................................................................................................................42

Preparo das farinhas: casca da macaxeira e casca de batata ingles.......................................42

Identificação morfológica da espécie Aspergillus....................................................................43

Seleção das amostras de Aspergillus spp em meio sólido.......................................................43

Produção de amilase por Fermentação submersa...................................................................44

Preparação do inóculo..............................................................................................................44

Meio controle............................................................................................................................44

Meios alternativos....................................................................................................................44

Detecção da tividade enzimática..............................................................................................45

Cálculo da atividade enzimática e atividade amilolítica...........................................................45

RESULTADOS E DISCUSSAO...............................................................................................45

Identificação morfológica da amostra......................................................................................45

Scrennig enzimático de amostras de Aspergillus spp. produtoras de amilase......................47

Seleção do meio controle para produção de amilase em cultivo submerso...........................48

Produção de amilase por Aspergillus tamarii em meio alternativo.........................................49

Influência da farinha da casca de macaxeira, farinha da caca do ph ....................................50

CONCLUSÕES.......................................................................................................................52

REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS.......................................................................................52

CAPÍTULO III..........................................................................................................................55

CONCLUSÕES GERAIS........................................................................................................56

ANEXOS……………………………………………………………………………………………...57

iv

LISTA DE FIGURAS

CAPÍTULO I

Figura 1 - Curva de conversão de substrato em produto catalisado na presença e na ausência de enzima. E= enzima. ............................................................................................................. 18

Figura 3- Imagem microscópica de Aspergillus fumigatus ........................................................ 19

Figura 4- Morfologia representativa da espécie do gênero Aspergillus ..................................... 20

Figura 5- Aspergillus tamarii ..................................................................................................... 20

Figura 6- Fluxograma simplificado da produção de enzimas microbianas utilizando o processo de fermentação submersa ........................................................................................................ 22

Figura 7-Tubérculo macaxeira .................................................................................................. 25

Figura 8- Tubérculo Batata Inglesa .......................................................................................... 26

CAPÍTULO II

Figura 1- Amostra de Aspergillus tamarii....................................................................................46

Figura 2- Aspergillus tamarii.......................................................................................................46

Figura 3- Diagrama de pareto do planejamento fatorial 23.........................................................50

Figura 4- Diagrama de pareto do planejamento fatorial 22.........................................................51

v

LISTA DE TABELAS

CAPÍTULO I

Tabela 1- Classificação das enzimas em função das reações catalisadas, segundo a União Internacional de Bioquímica e Biologia Molecular (IUBMB) ...................................................... 13

Tabela 2- Componentes presentes nas batatas (g/100g) na matéria integral ........................... 27

CAPÍTULO II

Tabela 1- Planejamento fatorial-matriz codificada 2 3 utilização de resíduos............................44

Tabela 2- Seleção de amostra de Aspergillus spp produtora de amilase em meio sólido avaliado pela formação de halo (mm) durante 72 horas de cultivo.............................................48

Tabela3-Detecção da atividade amilolítica(UA)..........................................................................49

Tabela 4- Produção de amilase por Aspergillus tamarii..............................................................49

Tabela 5- Produção de amilase por Aspergillus tamrii avaliada após 48h..................................51

vi

RESUMO

A produção de enzimas microbianas envolve processos fermentativos que são aprimorados

constantemente para produção de metabólitos secundários de interesse industrial e/ou

ambiental. As amilases E.C. 3.2.1.1. são enzimas que estão envolvidas em diversos processos

tecnológicos. A utilização de resíduos agroindustriais tem surgido com uma alternativa viável

na formulação de meios alternativos para produção biotecnológica de baixo custo, foram

utilizados para identificação, amostras de Aspergillus spp. isolados de solos da Caatinga

nordestina com potencial produção de amilase em meio sólido. Após a seleção e identificação

do micro-organismo produtores de amilase, novos ensaios envolvendo a produção da enzima

através de fermentação submersa foram realizados com diferentes meios de produção. Em

seguida, novos ensaios foram realizados utilizando um planejamento fatorial completo 23

contendo resíduos agroindustriais como cascas de tubérculos (macaxeira e batata inglesa)

muito consumidos na região Nordeste. Os experimentos foram conduzidos durante 96 horas,

150 rpm e 37ºC. Os resultados obtidos demonstram que a amostra de Aspergillus tamarii UCP

1261 apresentou maior formação de halo característico (68 mm) 37ºC, pH 6 e 72 h. Os ensaios

envolvendo a seleção de meios como Czapeck dox apresentou valores de atividade amilolítica

de 4 UA/mL após 48h de incubação. No planejamento fatorial 23 a máxima produção da enzima

ocorreu na condição 4 apresentando pH 6 e valor da atividade amilolítica de 3 UA/mL.

Posterirormente, foi realizado um planejamento fatorial 22, utilizando os resíduos de forma

individual, observando-se uma máxima atividade amilolítica de 9,0 UA/mL, em 48h de cultivo

com o substrato casca de macaxeira e pH 6. Os resultados obtidos neste trabalho descrevem o

potencial biotecnológico de fungos filamentosos isolados do bioma Caatinga na indução do

amido presente em cascas de tubérculos (macaxeira e batata inglesa) em produção de

amilase, evidenciando a formulação de um meio alternativo e promissor na produção de

amilase.

Palavras-Chave: produção enzimas; formulação meios alternativos; planejamento fatorial

vii

ABSTRACT

The production of microbial enzymes involves fermentative processes that are constantly

improved for the production of secondary metabolites of industrial and / or environmental

interest. Amylases E.C. 3.2.1.1. are enzymes that are involved in several technological

processes. The use of agro-industrial waste has emerged as a viable solution in the formulation

of alternative media for low-cost biotechnological production were performed to better identify

samples of Aspergillus spp. isolated from soils of the northeastern Caatinga with potential

production of amylase on solid medium. After selection and identification of microorganism

producing amylase, new assays involving enzyme production by submerged fermentation were

carried out with different media of production. Then, new tests were performed using a 23 full

factorial design containing agroindustrial residues such as tuber (cassava and potato) peels,

widely consumed in the Northeast region. The experiments were conducted for 96 hours, 150

rpm and 37°C. The results obtained show that Aspergillus tamarii UCP 1261 presented higher

formation (68 mm) of characteristic halo at 37ºC, pH 6 and 72 h. Assays involving the selection

of media such as Czapek dox showed values of amylolytic activity of 4 AU/mL after 48h of

incubation. In 23 factorial design the maximum enzyme production occurred in condition 4

presenting pH 6 and amylolytic activity value of 3 AU/mL. A 22 factorial design was carried out,

using the individual residues, with a maximum amylolytic activity of 9,0 AU/mL in 48 hours of

culture with the substrate cassava peel and pH 6. The results obtained in this work describe the

biotechnological potential of filamentous fungi isolated from the Caatinga biome for the

production of amylase with the induction of starch present in tuber peels (cassava and potato),

evidencing the formulation of an alternative and promising medium in the production of

amylase.

Key Words: production enzymes; formulation of alternative media; factorial planning

8

CAPÍTULO I

Fonseca, T. C. S. Produção de amilase por amostras de Aspergillus tamarii...

9

1. INTRODUÇÃO

A intensificação das ações humanas, do consumo, produção e exploração de

matérias primas, associado ao acelerado crescimento populacional e desenvolvimento

da atividade industrial, têm ocasionado grandes impactos ambientais, principalmente

em solos e recursos hídricos, devido a geração de resíduos contendo poluentes

orgânicos e inorgânicos. A preocupação referente à contaminação do meio ambiente

tem se tornado um dos principais focos de interesse público mundial, pois tem

prejudicado a qualidade das águas, dos solos e a saúde humana (REBOUÇAS,

FERNANDES et al.2011; OLIVEIRA,2016).

Uma alternativa para diminuir os danos causados ao meio ambiente é a

utilização de subprodutos como substratos para a produção de enzimas,

principalmente em países que geram grandes quantidades destes materiais, como

ocorre no Brasil, por sua extensa atividade agroindustrial (GUPTA et al.,2003;

MARTINS et al., 2012). Tem sido cada vez mais estimulado o desenvolvimento de

pesquisas que visem além do tratamento, o reaproveitamento dos resíduos produzidos

pelas atividades agroindustriais. As questões ambientais, em especial, têm suscitado

reflexões e preocupações, uma vez que os resíduos gerados apresentam elevado

potencial para causar danos ambientais muitas vezes irreversíveis, se não forem

devidamente tratados ou destinados. Nesse sentido, com o intuito de solucionar ou

minimizar essa questão, o aproveitamento de resíduos tem emergido como alternativa

interessante e ambientalmente sustentável (NUNES et al., 2009; KRAEMER, 2015;

MALAFAIA et al.,2016).

A ampla diversidade quanto às características das enzimas potencializa sua

aplicação em diferentes processos na indústria, assim, frente à demanda por novas

hidrolases com prospecção de aplicabilidade no setor, há um estímulo natural pela

exploração da biodiversidade microbiana, com o isolamento e seleção de novas cepas

produtoras de enzimas (BARATTO et al., 2012).

A busca recorrente por enzimas de origem fúngicas produzidas através de

cultivo a partir de resíduos agroindustriais têm se tornado uma excelente aplicabilidade

nos setores industrial e ambiental. Fungos filamentosos são muito promissores para a

produção de muitos produtos de interesse biotecnológico e industrial, devido à grande

variedade de atividades catalíticas, fácil adaptação, possibilidade da produção

enzimática através de processos fermentativos em grande escala, a expressão de

enzimas extracelulares, a produção de enzimas auxiliares, e a simplicidade dos


10

requerimentos nutricionais, o que permite o cultivo com resíduos agroindustriais como

fonte de carbono para seu crescimento (BON, FERRARA, CORVO, 2008; LOPES,

2011).

Existem diversas produções enzimáticas descritas na literatura através de

processos biotecnológicos com a utilização de fungos filamentosos do gênero

Aspergillus, em meios contendo resíduos da agroindústria: proteases em farelo de

trigo, amilases em casca de mandioca (CRUZ et al., 2011), xilanases em bagaço de

cana-de-açucar e casca de soja (MOREIRA, 2013; CUNHA, 2016), β-galactosidase

em casca de soja (MARTARELLO, 2016).

A utilização das amilases em diversas áreas da indústria faz com que micro-

organismos sejam cada vez mais estudados e suas enzimas caracterizadas,

disponibilizando uma gama de conhecimento. Dessa maneira, o estudo da capacidade

amilolítica desses micro-organismos representa um importante avanço no

conhecimento das possibilidades de aplicação de seu potencial para produção de

enzimas de interesse industrial, como as amilases (BASTOS et al.,2015).

Este trabalho foi investigar o potencial de produção de amilase, através de

estudos evolvendo amostras de fungos do gênero Aspergillus isolados de solo da

Caatinga de Pernambuco visando avaliar o potencial enzimático para produção da

enzima amilase e a elaboração de meios de cultivo alternativos que contenham

resíduos agroindustriais (cascas de macaxeira e batata inglesa) muito consumidos na

região nordeste do Brasil.


11

2.OBJETIVOS

2.1 Objetivo Geral

Produção de amilase por de Aspergillus spp isolado de solo da Caatinga do Estado de

Pernambuco, através de fermentação submersa utilizando resíduos agroindustriais

para formulação de meios alternativos.

2.2 Objetivos Específicos

Realizar em meio sólido a seleção de produtores de amilase em amostras de

Aspergillus ssp. em diferentes valores de temperaturas e pH;

Identificacao do micro-organismo selecionado, através da detecção em meio

solido;

Selecionar o meio de maior produção de amilase através de fermentação

submersa em meio convencional;

Investigar o uso dos substratos (cascas de macaxeira e batata inglesa) em

associação, a partir do meio de produção de amilase selecionado;

Investigar a utilização de diferentes substratos agroindustriais, utilizando como

resíduo as cascas dos tubérculos de macaxeira (Manihot esculenta) e

batata inglesa (Solanum tuberosum L.)

Utilizar planejamento um fatorial 23 para selecionar o ensaio com maior

produção daeamilase

Analisar através de um planejamento fatorial 22, a influência dos substratos

isolados (cascas de macaxeira e batata inglesa) na produção de amilase em

meio alternativo proveniente.


12

3. REVISÃO DA LITERATURA

3.1 Enzimas

A ciência que estuda as enzimas é denominada de enzimologia. O termo

enzima foi introduzido pela primeira vez por volta de 1878 por Willian Kühne (do grego

en = dentro zyme = levedura) para designar as substâncias contidas nos extratos de

levedura usados em fermentação. Em 1897, Eduard Buchner descobriu que os

extratos de levedo podiam fermentar o açúcar até álcool, o que lhe renderia o prêmio

Nobel de Química em 1907. Porém, um dos grandes momentos da enzimologia

aconteceu em 1926, quando James Summer isolou e cristalizou a urease e

demonstrou sua origem protéica. Em 1930, Northrop e Stanley realizaram estudos

mais detalhados de cristalografia de três enzimas digestivas, a pepsina, a tripsina e a

quimotripsina, o que os levou ao recebimento de um Prêmio Nobel da Química mais

tarde, em 1946. (MONTEIRO, SILVA, 2009; NETO 2016).

Enzimas são substâncias naturais envolvidas em todos os processos

bioquímicos, que dentre outras funções, são capazes de decompor moléculas

complexas em unidades menores, como carboidratos em açúcares (SOARES et al.,

2010). Podem se definir como proteínas especializadas que possuem eficiência

catalítica significativa, pois apresentam alto grau de especificidade por seus

substratos, acelerando assim as reações químicas. As enzimas são catalisadores que

aumentam a velocidade de uma reação sem alterar o equilíbrio da mesma, além de

diminuir a energia de ativação. Estas também aceleram a transformação do substrato

em produto e fazem a reação alcançar o equilíbrio mais rapidamente (GIRALDO,

2011).

Esse grupo de substâncias desempenha papel fundamental na conversão da

luz ou da energia das ligações químicas em ATP na transformação de nutrientes

contendo carbono e metabolitos utilizados pelas células, na replicação e expressão da

informação genética e na detecção e transdução de sinais químicos externos à célula.

O pH, a temperatura, a concentração de substrato e a presença de inibidores são os

principais alteradores da ação enzimática (ROCHA et al.,2015).

São classificadas em grupos, em função do tipo de reação que catalisam

(Tabela 1), sendo: oxidorredutases (catalisam reações de óxidoreduções),

transferases (catalisam reações de transferência de grupos de uma molécula a outra),

hidrolases (catalisam reações de hidrólise), liases (catalisam reações de quebra de


13

ligações), isomerases (catalisam reações de mudança intramolecular, onde um

substrato transforma-se em um produto isômero) e ligases (catalisam a ligação

covalente de moléculas, com simultânea quebra de uma ligação de alta energia) como

determinado pela International Union of Biochemistry (JESUS, 2014).

Tabela 1- Classificação das enzimas em função das reações catalisadas, segundo a União

Internacional de Bioquímica e Biologia Molecular (IUBMB)

Classe Subclasse Reação catalisada

Oxirredutase Transferase Hidrolase Liase Isomerase Ligase

Desidrogenase, Oxidase, Peroxidase, Hidrogenase Metiltransferase, Transaminase Carboidrase, Esterase, Lipase, Fosfatase, Protease Descaboxilase, Cetoacidólise, Hidratase Racemase, Mutase, Isomerase Sintetase

Oxidação-redução e remoção ou adição de átomos de hidrogênio Transferência de grupo tais como: aldeídos, cetonas etc. Hidrólise e formação de glicosídeos, anidridos, ésteres, amidas, peptídeos e outras funções e ligações C-N. Adição, usualmente de HX, a duplas ligações como: C=C;C=N e C=O, e também os processos reversos Transferência de grupos na mesma molécula para formar isômeros Formação ou clivagem de ligações C-S, C-N e estéres de fosfato

Fonte: NELSON, COX (2011)

A caracterização de uma enzima é fundamental para a sua aplicação

biotecnológica. No entanto, o custo elevado dos processos é um dos principais fatores

que influencia na economia de produção, separação, recuperação e purificação de

uma enzima. Essa redução no custo, pode ser alcançada pela otimização dos

processos de produção. São avaliados diversas variáveis inerentes e não somente à

enzima (caracterização, estabilidade e purificação), mas também o processo

fermentativo (o micro-organismo, pH, umidade, temperatura, tempo de cultivo,

composição do substrato e da solução nutritiva, além de taxa de aeração do meio

fermentativo e tipo de biorreator) (SHAH, MADAMWAR, 2005; SANTOS et al., 2013;

PEREIRA, 2016).

O aumento da preocupação com questões ambientais, qualidade do produto e

redução de custos, alavancou o interesse por enzimas em diferentes aplicações. A

tecnologia enzimática é uma alternativa para substituir processos químicos por


14

biocatalisados, por possuir menor impacto ambiental e apresentar ferramentas

promissoras para síntese de compostos de alto valor agregado (HASAN, SHAH,

HAMEED, 2006; PRECZESKI, 2016).

3.1.1 Aplicações das enzimas

Produtos biotecnológicos eram produzidos há muito tempo, por meio da

utilização de enzimas em técnicas artesanais, desconhecendo os mecanismos

envolvidos nos processos de fabricação, seja ela para produção de alimentos (queijo,

cerveja, vinho e vinagre) ou mercadorias como couro, índigo e linho. Somente a partir

do século XVII, iniciaram-se os estudos da biotecnologia esclarecendo os fenômenos

que ocorriam nas produções e possibilitando o avanço da ciência e aplicabilidade das

enzimas em processos industriais (KIRK, BORCHERT, FUGLSANG, 2002; VITOLO,

PESSOA, 2015).

Após os antibióticos, enzimas são os produtos microbianos mais explorados na

indústria biotecnológica. As aplicações das enzimas ocorrem em diversos setores

industrias. Na panificação, laticínios, fabricação de cerveja e vinicultura, por séculos, e

sua aplicação mantém o pão macio e fresco por mais tempo. Além disso, as enzimas

são usadas para reduzir a concentração de álcool e calorias na cerveja. Em enologia,

o teor de enxofre pode ser reduzido, e a clareza da cor do vinho pode ser mantida,

sabores e a capacidade de filtração podem ser melhorados. Na fabricação de ração

animal, as enzimas são usadas principalmente para aumentar a disponibilidade de

nutrientes essenciais (LEE et al., 2013; SPOHNER et al., 2015).

Economicamente o uso de enzimas na indústria de alimentos foi estimado em

US$ 4 bilhões em 2015. O Brasil encontra-se com uma estimativa de US$ 240

milhões, o que corresponde a aproximadamente 6% do mercado global. Segundo a

Associação Brasileira das Indústrias da Alimentação (ABIA), a indústria de produtos

alimentícios e bebidas teve um faturamento de R$ 562 bilhões em 2015, o que

corresponde ao 9,5% do Produto Interno Bruto (PIB) do Brasil (ABIA, 2016).

A utilização de enzimas nas indústrias é indispensável, pois através dela ocorre

o melhoramento da qualidade de um produto ou torna mais fácil a obtenção do

mesmo. Essa capacidade se deve ao fato de que as enzimas atuam sobre as

substâncias que compõem um determinado produto, sendo que, para cada substância,

existem enzimas específicas que a degradam (LIMA et al., 2001; BARATTO et al.,

2012).


15

3.2 Enzimas de origem fúngicas

A introdução de enzimas como catalisadores em processos industriais, a

exemplo das microbianas, mostra-se vantajoso, pois são específicas, naturais e

geralmente não apresentam toxicidade, características desejáveis tanto pela indústria

quanto para a integridade ambiental (ESPOSITO, AZEVEDO, 2004; COSTA,

ZANELLA, 2012).

Os fungos apresentam considerável influência cultural, devido a extensa

interação com plantas, animais, bactérias e outros organismos, estes micro-

organismos desempenham diversas funções como decompositores, mutualistas e

parasitas (MCLAUGHLIN et al., 2009; EBERSBERGER et al., 2012).

O reino Fungi consiste em um grupo de organismos eucarióticos que inclui

micro-organismos como leveduras e fungos filamentosos. Divide-se nos Filos

Chytridiomycota, Zygomycota, Ascomycota, Basidiomycota e Deuteromycota (LEITE,

2010). Mais de 70.000 espécies de fungos já foram descritas, mas estima-se que

existam pelo menos 1,5 milhões de espécies no mundo, ou seja, apenas 5% são

conhecidos (GALVAGNO, FORCHIASSIN, 2010; SURYANARAYANAN et al., 2009;

PEREIRA,2016).

Através da capacidade de secretarem enzimas extracelulares e pela sua

particular forma de crescimento, os fungos filamentosos se adaptam ao

aproveitamento de uma ampla gama de substratos e constituem um grupo muito

grande e heterogêneo encontrado em qualquer nicho ecológico. Estes micro-

organismos são responsáveis pela produção de importantes ácidos orgânicos, pela

produção de fármacos, pelo controle biológico de insetos-pragas da agricultura, pelo

controle de inúmeras moléstias que atacam plantas cultivadas, pela produção de

etanol e pela produção de enzimas de interesse industrial e de elevado valor

econômico, destacando-se as celulases, lacases, xilanases, pectinases e amilases

(ESPOSITO, AZEVEDO, 2010, CUNHA, 2016).

Os fungos compõem um dos maiores recursos genéticos disponíveis, ao

crescerem sobre substratos naturais, os fungos secretam variadas enzimas que

convertem os constituintes poliméricos a moléculas mais simples. Muitas dessas

enzimas apresentam importantes aplicações comerciais como as amilases, que

possuem aplicações nas indústrias de tecidos, de combustíveis, de produtos químicos

e farmacêuticos entre outras (SILVA, 2014).


16

Segundo ROVEDA, HEMKEMEIER, MARIA (2010), fungos filamentosos são

considerados bons produtores de enzimas microbianas. Dentre eles, os do gênero

Aspergillus são os mais estudados para a produção de enzimas. Este gênero

apresenta uma grande diversidade de espécies com características vantajosas, como

o fácil crescimento em meios sólidos e a produção de enzimas extracelulares (VRIES,

VISSER, 2001; GOTTSCHALK, OLIVEIRA, BON, 2010; GOTTSCHALK et al.,2013).

Os fungos são as fontes mais importantes para a produção de amilases, que

são utilizadas para a degradação do amido em várias aplicações, tais como a

panificação, fabricação de cerveja, e adoçante, entre outros (GUPTA et al., 2003; KIM,

MAEDA, MORITA, 2006; GONÇALVES, 2016). O gênero Aspergillus, incluindo

espécies tais como A. oryzae, A. nidulans, A. kawachii e A. niger, é a fonte mais

comum para a produção de amilase (TORRADO et al., 2013). A maioria das indústrias

produtoras de α-amilase fúngica são produzidas por Aspergillus spp

(SIVARAMAKRISHNAN et al., 2006, GONÇALVES, 2016).

A aplicação destes micro-organismos como fontes produtoras de enzimas e de

muitos outros metabólitos de interesse pelo aproveitamento de resíduos oriundos de

fontes renováveis da agroindústria tem sido investigada em quase todo o cmundo

(MUKHERJEE; DAS; SEN, 2006; NITSCHKE; PASTORE, 2006;MANEERAT;

PHETRONG, 2007; GASPARIN et al., 2012; ANDRADE, 2016).

3.3 Amilases

Dentre as enzimas industriais mais utilizadas, as amilases estão entre as mais

importantes, apresentando grande importância biotecnológica, representando 25% do

mercado mundial de enzimas (BORGIO, 2011; KUMAR, SAHAI, BISARIA, 2012;

GONÇALVES, 2016).

As amilases pertencem ao grupo das hidrolases, são definidas quimicamente

como E.C. 3.2.1.1. e aplicadas em diversos processos industriais (têxtil, bebidas

destiladas, cervejarias, panificação, cereais, alimentação infantil, liquefação e

sacarificação do amido, ração animal, indústria química e farmacêutica, dentre outras)

(BIAZUS et al., 2009;CORREA, 2015).


17

Esse grupo de enzimas amilolíticas são um conjunto que catalisam a hidrólise

ou síntese das ligações glicosídicas em moléculas de amido. São divididas em

endoamilases, exoamilases, enzimas desramificadoras e transferases. Atuam nas

ligações α-(1,4) e/ou (α-1,6) dos polímeros amiláceos gerando mono, di e

trissacarídeos, oligossacarídeos e α-dextrinas limite (carboidratos ramificados de baixo

peso molecular) de acordo com sua especificidade (MURALIKRISHNA, NIRMALA,

2005; BUENO, 2016).

Existem amilases que além de serem termoestáveis, são estáveis em pH

alcalinos e outras são estáveis em pH ácidos. Tanto as amilases alcalinas quanto as

amilases acidófilas, possuem muitas aplicabilidades industriais. Amilases que mostram

atividade ótima em pH ácido, são usadas principalmente em xarope de glicose e

panificação indústriais, as que demostram atividades em pH alcalino têm encontrado

aplicações em formulações de sabões em pó (ASOODEH, CHAMANIC, LAGZIANA,

2010).

A produção de amilases por fermentação submersa (FS) e fermentação em

estado sólido (FSS) foi exaustivamente investigada e é afetada por uma variedade de

fatores físico-químicos que incluem: a composição do meio de crescimento, pH médio,

concentração de fosfato, a idade do inóculo, temperatura, aeração, fonte de carbono e

fontes de nitrogênio (VIHINEN, MÄNTSÄLÄ, 1990; GUPTA et al., 2003; NWAGU,

OKOLO, 2011). As fontes de nitrogênio comumente utilizadas incluem farinha de soja,

extrato de levedura, peptona e extrato de carne (NWAGU, OKOLO, 2011).

Os reagentes que participam das reações catalisadas pelas enzimas são

denominados de substratos. Efetivamente, quando se compara a conversão de um

substrato em produto catalisado por enzima e outro por um catalisador químico,

observa-se uma rápida conversão com o uso das enzimas. Além disso, as enzimas

não alteram o equilíbrio químico das reações e podem acelerar reações reversíveis em

ambos os sentidos (GAMA, AIRES, CABRAL, 2003) (Figura 2).


18

Figura 1 - Curva de conversão de substrato em produto catalisado na presença e na ausência de enzima. E= enzima.

Fonte: FERREIRA et al.,2009

Entre os vários parâmetros que estimulam a produção de amilases, as

condições de crescimento microbiano e os substratos de carbono usados no meio de

cultivo têm recebido atenção especial. Fontes de carbono como dextrina, frutose,

glicose, lactose, maltose, amido solúvel, além de outras, encarecem sua produção. No

meio de cultivo, esses substratos podem ser substituídos por subprodutos agrícolas, o

que torna o processo de produção dessas enzimas mais econômico. Com esse

objetivo, farinhas e farelos de diferentes grãos e tubérculos como arroz, cevada, milho,

trigo, mandioca e batata têm sido usadas no meio de cultura para aumentar a

produtividade de amilases de fungos e bactérias (OLIVERA et al, 2007).

Mesmo as amilases apresentando diversas fontes de produção a maior

quantidade é encontrada no mercado proveniente de micro-organismos, como

bactérias, leveduras e fungos filamentosos. Dentro da indústria alimentícia, a aplicação

de amilases para gerar diferentes produtos é um processo que tem se diversificado e

apresenta rendimentos econômicos consideravelmente altos (SOARES et al., 2010).

Destacam-se na produção de amilase os micro-organismos dos gêneros

Rhizopus, Aspergillus, Bacillus, Micobacterium, entre outros, (SIVARAMAKRISHNAN

et al., 2006; ALVA et al., 2007; TORRADO et al., 2013; ROOHI, 2014; GONÇALVES,

2016).


19

3.4 Gênero Aspergillus

O gênero Aspergillus foi descrito pela primeira vez, em 1729, pelo sacerdote

florentino e micologista Pietro Antonio Micheli. Ele deu-lhe este nome por considerar

sua estrutura semelhante a um hissope, estrutura utilizada pela igreja católica para

aspergir água benta. Este gênero pertence à família Tricomaceae, ordem Eurotiales, à

classe Ascomycetes, que pertence a Divisão Ascomycota, Reino Fungi (KIRK et al.,

2008; LIRA, 2014; LIU, 2016).

Aspergillus spp (figura 3), pertencem ao reino Fungi, filo Ascomycota, ordem

dos Eurotiales, família Trichocomaceae e gênero Aspergillus. Este gênero pode ser

encontrado amplamente na natureza, principalmente em solos, associado com a

deterioração de materiais vegetais e alimentos e principalmente em regiões tropicais e

subtropicais (LIMA, 2012)

Existem cerca de 200 espécies isoladas do solo, de plantas em decomposição

e do ar. As espécies mais conhecidas são a Aspergillus flavus, A. niger, A. oryzae, A.

nidulans, A. fumigatus, A. clavatus, A. glaucus, A. ustus e o A. versicolor. Eles podem

tanto ser patogênicos ao ser humano como exemplo o A. flavus, que é produtor de

aflatoxinas, como podem possuir o status de GRAS (Generally Regarded as Safe) que

são amplamente usados nas indústrias como exemplo o A. nidulans, A. oryzae e o A.

niger (MONCLARO, 2014).

Figura 2- Imagem microscópica de Aspergillus fumigatus

Fonte: BARTON, 2013

Apresentam em sua morfologia (Figura 4) colônias com uma ampla

variação na coloração, então principal característica macroscópica utilizada para


20

classificação, podendo descrever colônias com colorações em tons verde, amarelo,

cinza, marrons, preto e branco (VARGA,2004; REIS, 2015).

Figura 3- Morfologia representativa da espécie do gênero Aspergillus

Fonte: LIRA, 2014

Economicamente diversos isolados do gênero Aspergillus são utilizados na

produção de diversos produtos industriais (VARGA,2004; REIS, 2015). Possuem uma

vasta utilização na indústria de produção de fármacos, alimentos e bebidas, produção

de ácidos orgânicos e diversas enzimas (SAMSON, VARGA, 2011; HORN et al.,

2013).

Figura 4- Aspergillus tamarii

Fonte: ANTOLIN, 2017


21

3.5 Processos fermentativos

A fermentação é um processo natural que ocorre em determinados compostos

ou elementos a partir da ação de diferentes agentes e que pode ser simplificado como

um processo de oxidação incompleto. São realizadas por uma série de micro-

organismos de diferentes gêneros. Dependendo do tipo de produto obtido, o processo

fermentativo é diferente, exigindo uma maior ou menor quantidade de micro-

organismo, quantidade de açúcares e do tempo de duração do processo (VISIOLI et

al., 2015; TEIXEIRA, SIQUEIRA, BATISTA, 2017).

Existem dois tipos básicos de fermentação que são utilizados para a produção

de enzimas: a fermentação submersa (FS) e a fermentação em estado sólido (FES)

(FERNANDES, 2007; ORLANDELLI, 2012; ANDRADE, 2016). A FES baseia-se no

crescimento dos micro-organismos em substratos sólidos na ausência (ou quase) de

água livre, sendo um processo microbiano que geralmente ocorre na superfície dos

materiais sólidos que tem capacidade de absorver água, podendo ou não conter

nutrientes solúveis. A fermentação submersa (FS) é um processo que disponibiliza os

nutrientes para o microrganismo em meio líquido. Nutrientes como peptonas, açúcares

e substâncias complexas (vitaminas e íons) são dissolvidos em água ou mesmo

soluções tampões. Essas fermentações devem ser mantidas em agitação constante

para ideal aeração e disponibilidade de nutrientes (FARINAS et al., 2011; OLIVEIRA et

al; 2012; ORLANDELLI et al., 2012).

As culturas submersas têm sido tradicionalmente utilizadas para a produção

industrial de enzimas devido à facilidade de controle de diferentes parâmetros, tais

como pH, temperatura, aeração e umidade. Sistemas FES se mostram promissores na

produção de enzimas fúngicas devido ao crescimento microbiano ocorrer em

condições mais próximas ao habitat natural desses micro-organismos (SOUZA,

MAGALHÃES, 2010). Tanto o processo de FES quanto o de FS apresentam

características importantes, as quais devem ser levadas em conta no momento da

escolha, sendo necessário avaliar as vantagens e desvantagens em cada processo

fermentativo, considerando o tipo de produto desejado e, principalmente, o grupo de

micro-organismos a ser utilizado (GONÇALVEZ, 2016).

A FS é a técnica majoritariamente utilizada nos países ocidentais para a

produção de enzimas devido à facilidade de crescimento dos microrganismos em

condições controladas de pH e temperatura, além de tornar fácil a recuperação das

enzimas extracelulares (FEITOSA, 2009; ORLANDELLI, 2012). Os processos


22

microbianos de produção de enzimas ocorrem em cultivo submerso quando as células

produtoras se desenvolvem em meio de cultivo líquido. Nos cultivos microbianos, a

adição de resíduos industriais, por ser de origem complexa, pode modificar a fisiologia

do micro-organismo, isto é, o comportamento do micro-organismo. Em função disso, o

cultivo em meio líquido pode apresentar turvação, crescimento de películas ou em

depóditos, dentro outros (PELCZAR et al.,1996; REGINATTO, 2016).

Na FES, o micro-organismo cresce em substratos sólidos umedecidos ou

suportes inertes, na ausência (ou quase) de água livre, e na FS, os substratos são

dissolvidos em meio líquido. Neste caso, o microrganismo pode crescer entre os

fragmentos do substrato (dentro da matriz do substrato) ou sobre a superfície do

substrato, consumindo o substrato e secretando metabólitos, dentre os quais as

enzimas (MITCHELL et al., 2006; RAHARDJO, TRAMPER, RINZEMA,2005). O

material sólido é insolúvel e age como suporte físico e como fonte de nutrientes. O

material sólido poderá ser um substrato sólido natural, como resíduos da agricultura,

ou um suporte inerte, como poliuretano ou resinas poliméricas (PANDEY, 2003;

FERNANDES, 2007; REGINATTO, 2016).

Os fungos filamentosos são muito utilizados uma vez que produzem enzimas

em grande quantidade e variedade e possuem facilidade em crescer ao natural em

substratos sólidos, tendo uma excelente capacidade de fermentação (PEREIRA,

2014). Em geral suas colônias apresentam um rápido e abundante crescimento, com

densa distribuição sobre o meio de crescimento (LIMA, 2012) Figura 6.

Figura 5- Fluxograma simplificado da produção de enzimas microbianas utilizando o processo de fermentação submersa

Fonte: ORLANDELLI et al; 2012.


23

3.6 Resíduos agroindustriais

O tradicional processo industrial, além do produto de interesse, gera múltiplas

saídas de outros materiais em forma de resíduos e emissões não incorporadas no

produto final que, geralmente, são aceitas como efeito normal no processo de

fabricação. Porém, nos últimos anos têm se intensificado o aproveitamento de

resíduos, especialmente os agroindustriais tais como, polpa e folhas de café, resíduos

de frutas, bagaço de mandioca, farelo de soja, bagaço de cana de açúcar, polpa de

beterraba, etc. Vários processos biotecnológicos foram desenvolvidos para utilizar

esses materiais na produção de álcool, enzimas, ácidos orgânicos, aminoácidos,

gerando produtos de grande valor econômico. A procura de enzimas industriais, em

particular de origem microbiana é cada vez maior, devido à suas aplicações em uma

ampla variedade de processos (PENHA, et al., 2016; CORREA, 2017)

Os resíduos agroindustriais são constituídos principalmente por

macromoléculas como substâncias húmicas, lignina, celulose, hemicelulose, proteínas

e pectina. Essas macromoléculas apresentam grupos funcionais tais como tiol (-SH),

sulfato (-OSO3H), carbonila (-C=O), carboxil (-COOH), amina (-NH2), amida (-

CONH2), hidroxil (-OH) fosfato (-OPO3H2) entre outros (DEMIRBAS, 2009; SUD,

MAHAJAN, KAUR, 2008, OLIVEIRA, 2016).

A valorização e a minimização de resíduos têm como princípio básico, o

conhecimento das características químicas dos mesmos, sustentando aplicações que

venham a convertê-los em matérias primas para novos produtos. Dentro dos conceitos

das tecnologias limpas, a composição dos resíduos representa importante informação

para determinar as aplicações para novos produtos e processos (PEREIRA, 2016).

O Brasil está entre os países com maior produção agrícola no mundo, sendo

também responsável pela produção de grandes quantidades de resíduos que podem

causar vários problemas ambientais. Assim, o interesse por formas de utilização

sustentável e agregação de valor aos resíduos agroindustriais tem crescido e o

desenvolvimento de bioprocessos para utilização desses materiais ganha destaque

(SOCCOL; VANDENBERGHE, 2003; FONSECA-MALDONADO et al., 2014; MARCO,

2014;).

Os resíduos resultantes do processamento agroindustrial de fontes vegetais

podem representar significativa fonte poluidora, pois sem uma aplicação viável muitas

vezes são descartados diretamente no meio ambiente (VIEIRA et al., 2009).


24

Entretanto, alguns estudos têm demonstrado aplicações sustentáveis para esses

subprodutos, sendo empregados na produção de fertilizantes orgânicos, ração animal,

produção de etanol, enzimas, óleos essenciais e aditivos (FERRARI, COLUSSI,

AYUB, 2004; KOBORI, JORGE, 2005; ALEXANDRINO, et al., 2007; RODRIGUES et

al., 2009; TUTTOBENE et al., 2009; LIU et al., 2010; ARBOS, STEVANI,

CASTANHA,2015).

Os substratos mais comuns e destacados pelo descarte em quantidades

significativas são: casca de cereais, palha e farelo de arroz, palha e farelo de trigo, de

soja, bagaço de cana-de-açúcar, folha de mandioca, bagaço de laranja, resíduos de

algodão, palha de bananeira, dentre outros (FILHO, FRANCO, 2015). Estes resíduos

podem servir como substratos para o cultivo de fungos filamentosos e produção de

suas enzimas (CASTRO, PEREIRA, 2010; SHARMAA, ARORAB, 2015).

A importância desses substratos está no fato do mesmo conter muitas

substâncias de alto valor e, empregando uma tecnologia adequada, pode ser

convertido em produtos comerciais ou matérias-primas para processos secundários

como, a produção de enzimas (LAUFENBERG, KUNZ, NYTROEM, 2003; FRANÇA et

al.,2015).

3.6.1 Macaxeira (Manihot esculenta)

A Manihot esculenta, conhecida como mandioca, macaxeira, aipim ou tapioca

no Brasil, como cassava em países que falam inglês, como yuca na América Latina

(espanhol) e como manioc em países africanos, é uma planta perene, arbustiva,

pertencente à família das Euforbiáceas (Figura 7). A parte mais importante da planta é

a raiz. Rica em amido, utilizada na alimentação humana e animal ou como matéria

prima para diversas indústrias. Originária da América do Sul, provavelmente do Brasil,

a mandioca já era cultivada pelos índios, por ocasião da descoberta do país

(EMBRAPA, 2013; FILHO; BAHIA, 2013; VIEIRA, 2013; PEREIRA, 2016; FAO, 2017).

As raízes tuberosas (órgão de interesse econômico) possuem tamanho e

formato variados, podendo ser cilíndricas, cônicas e globosas. O número de raízes é

variável, ocorrendo de 5 a 20 raízes por planta a depender da cultivar. A colheita da


25

mandioca pode ocorrer entre 8 e 18 meses após o plantio e as raízes são destinadas

para o consumo in natura ou industrial (SILVA et al., 2012; MATOS,2016).

A macaxeira é fornecedora de energia a partir do amido acumulado em suas

raízes de reserva, tubérculo cuja casca é descartada, após a sua utilização,

considerada umas das fontes mais ricas em calorias e carboidratos, sendo cultivada e

consumida por milhões de pessoas em países tropicais (CARVALHO, ABREU,2009;

FUHRMANN,2016).

Figura 6-Tubérculo macaxeira

Fonte: BRASIL ESCOLA, 2017

A casca de mandioca desidratada apresenta 58,1% de amido, 3,4% de

proteína bruta e 28,6 % de fibra. Estes resíduos são ricos em amido e apresentam

fibras de boa qualidade, podendo conter aplicações biotecnológicas (VILHALVA et

al.,2012).

Na economia brasileira, a mandioca vem ganhando destaque como fonte

alternativa de produção de bioprodutos devido à facilidade de cultivo e ao baixo custo

de produção. Considerando o alto conteúdo de amido na mandioca, a possibilidade de

se atingir produtividades altas na produção da enzima amilase (LOTTERMANN, 2012).


26

3.6.2 Batata inglesa (Solanum tuberosum L.)

A batata (Solanum tuberosum), nativa da Cordilheira dos Andes, pertence à

família da Solanaceae, uma grande família de plantas que contém mais de 3.000

espécies (VISSER et al., 2009; MUCHALAK,2016). É uma das culturas mais populares

na alimentação mundial e vêm sendo cultivada em diversos países. O Brasil é um dos

poucos países onde se planta batata o ano todo, e segundo dados do IBGE (2016), No

Brasil, a área cultivada no ano de 2016 foi de 125 mil hectares e a produção foi de

aproximadamente 3,6 milhões de toneladas o que corresponde a aproximadamente

1% da produção mundial. Há dois mercados a que se destinam a batata brasileira. O

primeiro, que representa a maior parte, é o comércio do tubérculo na forma in natura.

O segundo mercado, se refere à batata destinada à indústria, seja para a produção de

“chips” ou de batata para fritura (SILVA, 2016).

Os tubérculos de batata inglesa são caules modificados com folhas e gemas

axilares muito reduzidas, internódios curtos e expansão radial, tendo nos grãos de

amido seu componente principal, os quais são sintetizados dentro de plastídeos

especializados, denominados de amiloplastos (PETERSON, BARKER, HOWARTH,

1985).

Figura 7- Tubérculo Batata Inglesa

Fonte: ABBA, 2017

Apresentam em sua composição aproximadamente, por 76 % de água, 20 %

de carboidratos, 2 % de proteínas e uma quantidade irrisória de lipídeos

Aproximadamente 80 % do peso dos carboidratos da batata é de amido, com uma

proporção de 75 %–79 % de amilopectina e 21 %-25 % de amilose. A batata é


27

também uma razoável fonte de vitamina C (OLIVEIRA, REIS, PEREIRA, 2004;

FERNANDES, 2014).

Tabela 2- Componentes presentes nas batatas (g/100g) na matéria integral

Componentes Media % Variação %

Umidade 77,5 63,2 - 86,9

Sólidos Totais 22,5 13,1 – 36,8

Carboidratos Totais 19,4 13,3 – 30,5

Proteínas 2,0 0,7 – 4,6

Cinzas 1,0 0,44 – 1,9

Fibras 0,6 0,17 – 3,48

Lipídeos 0,1 0,02 – 1,0

Fonte: SMITH (1977)


28

4 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

ABBA. Associação Brasileira de Batata. Disponível em: www.abba.org.br. Acesso em: 15 de Fevereiro de 2017.

ABIA. Associação Brasileira das Indústrias da Alimentação.Disponível em:www.abia.org.br. Acesso em: 19 de Maio de 2016.

ALEXANDRINO A.M. et al. Aproveitamento do resíduo de laranja para a produção de enzimas lignocelulolíticas por Pleurotus ostreatus (Jack:Fr). Ciência e Tecnologia de Alimentos, v, 27, p.364-368,2007.

ALVA, S. et al. Production and characterization of fungal amylase enzyme isolated from Aspergillus sp. JGI 12 in solid state culture. African Journal of Biotechnology, v. 6, n.5, p. 576-581, 2007.

ANDRADE, M.S. Produção de lipase por Yarrowia lipolytica e formulação de bioproduto para aplicação em tratamento do efluente lácteo. 2016.Tese (Doutorado em Engenharia Química). Universidade Estadual de Campinas, São Paulo.

ANDREA, O. Processamento da mandioca para uso culinário. Disponível em:www.cpt.com.br.Acesso em:15 de Fevereiro de 2017.

ANTOLIN, M. A. Aspergillus. Disponível em: www.socalemi.Acesso em: 15 de Fevereiro de 2017.

ARBOS, K. A.; STEVANI, P. C.; CASTANHA, R. Atividade antimicrobiana, antioxidante e teor de compostos fenólicos em casca e amêndoa de frutos de manga. Ceres, v. 60, n. 2, 2015.

ASOODEH, A.; CHAMANIC, J.; LAGZIANA, M. A novel thermostable, acidophilic α-amylase from a new thermophilic “Bacillus sp. Ferdowsicous” isolated from Ferdows hot mineral spring in Iran: Purification and biochemical characterization. International Journal of Biological Macromolecules, v.46, p. 289- 297, 2010.

BARATTO, C. M. et al. Seleção de microrganismos produtores de enzimas hidrolíticas

isolados da região do meio oeste de Santa Catarina, Brasil. Evidência-Ciência e

Biotecnologia, v. 11, n. 2, p. 15-28, 2012.

BARTON, R. C. Laboratory diagnosis of invasive aspergillosis: from diagnosis to

prediction of outcome. Scientifica, v. 2013, 2013.

BASTOS, C. M.S., et al. Efeito das condições de cultivo na produção de amilase por

duas linhagens de leveduras. Revista Brasileira de Biociências, v.13, n. 3,2015.

BIAZUS, J. P. M. et al. Production and characterization of amylases from Zea mays malt. Brazilian Archives of Biology and Technology, v. 52, n. 4, p. 991 – 1000, 2009.

https://www.google.com.br/url?sa=t&rct=j&q=&esrc=s&source=web&cd=&cad=rja&uact=8&ved=0ahUKEwiGiKf5297RAhXIF5AKHYQkBuUQFggcMAA&url=http%3A%2F%2Fwww.abia.org.br%2F&usg=AFQjCNFNAOS6tGb_earE5CRWVNkQ0O4NWw&sig2=k9bpewZvP6-2RPvtV5J_CA


29

BON, E. P. S.; FERRARA, M. A.; CORVO, M. L. Enzimas em biotecnologia. Rio de

Janeiro: Interciência, 2008.

BORGIO, J. F. Immobilization of microbial (wild and mutant strains) amylase on coconut fiber and alginate matrix for enhanced activity. American Journal of Biochemistry and Molecular Biology, v. 1, n. 03, p. 255-264, 2011.

BUENO, M. M. Avaliação de enzimas microbianas para tratamento e adequação de farinhas de trigo em substituição ao uso de oxidantes químicos: efeitos sobre as propriedades reológicas de dois perfis de farinha. 2016,63f. Dissertação (Mestrado em Ciência e Tecnologia de Alimentos). Universidade Federal do Rio Grande do Sul, Porto Alegre, 2016.

CARVALHO, A. V.; ABREU, L. F. Processo agroindustrial: elaboração de chips de macaxeira. Embrapa Amazônia Oriental, 2009.

CASTRO, A.M.; PEREIRA JR. Produção, propriedades e aplicação de celulases na hidrólise de resíduos agroindustriais. Química Nova, v. 33, n. 1, p. 181-188, 2010.

CORREA, Fabiane Fernanda de Barros. Desenvolvimento de um bioprocesso utilizando-se resíduos para produção de amilases por Rhizopus oligosporus e etanol por Saccharomyces cerevisiae. 2015,79f. Dissertação (Mestrado em ciências Biológicas). Universidade Estadual Paulista, Rio Claro,2015.

CORRÊA, C. L.. Estudo do transcritoma global do fungo Aspergillus terreus quando cultivado em resíduos agroindustriais. 2017,155f. Tese (Doutorado em Biologia Molecular). Universidade de Brasília, Brasília,2017.

COSTA, J. A. A.; ZANELLA, G. N. Identificação de fungos filamentosos em derivados de milho comercializados em Primavera do Leste–MT. Rev. Bras. Farm, v. 93, n. 1, p. 109-113, 2012.

CUNHA, J. R. B.et al. Cultivation of Penicillium spp. in soy bean crop residues for production of cellulase, protease and amylase. Revista Ceres, v. 63, n. 5, p. 597-604, 2016.

CUNHA, L.L. Purificação e caracterização bioquímica e biofísica de uma xilanase de aspergillus foetidus. 2016,69f. Dissertação (Mestrado em Ciências Farmacêuticas). Universidade de Brasília,Brasília.

da CRUZ, E. A. et al. Produção de Alfa-Amilase por Aspergillus niger em Resíduo de Cascas de Mandioca. Journal of Health Sciences, v. 13, n. 4, 2015.

DERMIBAS A. Biorefineries: Current activities and future developments. Energy Conversion and management, v. 50, n. 11, p. 2782-2801, 2009.

EBERSBERGER, I. et al. A consistent phylogenetic backbone for the fungi. Molecular Biology and Evolution, v. 29, n. 5, p. 1319–34, 2012.

EMBRAPA – Empresa brasileira de pesquisa agropecuária. Mandioca. Disponível em: www.embrapa.br/.Acesso em 16 de Set. de 2016.


30

ESPOSITO, E. ; AZEVEDO, J.L. de. Fungos: uma introdução à biologia, bioquímica e biotecnologia. Caxias do Sul: Educs, v. 11, 2004.

ESPOSITO, E.; AZEVEDO, J. L. Fungos: uma introdução à biologia, bioquímica e biotecnologia.Caxias do Sul , RS: 2010.

FARINAS, C. S. et al. Evaluation of operational parameters on the precipitation of endoglucanase and xylanase produced by solid state fermentation of Aspergillus niger. Brazilian Journal Chemical Engineering. v. 28, n. 1, p. 17-26, 2011.

FAO. Disponível em: http://www.fao.org/ag/agp/agpc/gcds/index. Acesso em 11 de Jan de 2017.

FEITOSA, I. C. Produção de enzimas lipolíticas utilizando bactéria isolada de solo com histórico de contato com petróleo em fermentação submersa.2009,106f. Dissertação (Mestrado em Engenharia de Processos) Universidade Tiradentes, Aracaju, 2009.

FERNANDES, A. F. et al. Efeito da substituição parcial da farinha de trigo por farinha de casca de batata (Solanum Tuberosum Lineu). Ciência e Tecnologia de Alimentos, Campinas, v. 28, p. 56-65, 2008.

FERNANDES, A.F. Utilização da farinha de casca de batata inglesa (Solanum tuberosum L.) na elaboração de pão integral. 2014,144f. Dissertação (Mestrado em Ciência dos Alimentos). Universidade Federal de Lavras,Minas Gerais,2014.

FERRARI R.A., COLUSSI F, AYUB R.A. Caracterização de subprodutos da industrialização do maracujá-aproveitamento das sementes. Revista Brasileira de Fruticultura, v.26, p.101-102,2004.

FERREIRA, A.P.et al. Aplicações industriais da biotecnologia enzimática. Revista Processos Químicos. v,3,n.5,p.9-23,2009.

FILHO, G. de A. F.; BAHIA, J. J.S. Mandioca. Disponível em: Acesso em: 16 de Dez. de 2016.

FILHO, W.B.N.; FRANCO, C.R. Avaliação do Potencial dos Resíduos Produzidos Através do Processamento Agroindustrial no Brasil. Revista Reviews in Microbiology, v. 41:1, p.52-60, 2015.

FONSECA-MALDONADO, R. et al. Biochemical properties of glycosylation and characterization of a histidine acid phosphatase (phytase) expressed in Pichia pastoris. Protein expression and purification, v. 99, p. 43-49, 2014.

FRANÇA, R.L.S. et al. Avaliação do potencial de produção de enzimas celulolíticas por

fermentação semi-sólida por meio de planejamento experimental. Blucher Chemical

Engineering Proceedings, v. 1, n. 2, p. 1890-1896, 2015.

FUHRMANN, E. Caracteres morfo-agronômicos e bioquímicos de clones elite de mandioca de mesa com raízes de polpas amarelada e rosada. 2016,111f. Dissertação (Mestrado em Agronomia). Universidade de Brasília,Brasília,2015.

http://www.fao.org/ag/agp/agpc/gcds/index.%20Acesso%20em%2011


31

GALVAGNO, M.A.; FORCHIASSIN, F. Fisiologia dos fungos: nutrição e metabolismo. In: E. ESPOSITO; J.L. AZEVEDO (Eds.); Fungos: uma introdução à biologia, bioquímica e biotecnologia, v.2, p.125–173, 2010.

GAMA, M., AIRES, B. M. R., CABRAL, J.; Engenharia Enzimática, Lidel: Portugal, 2003.

GASPARIN, F. G. M.et al . Produção de lipase e biossurfactante por isolado de efluente de laticínio. Communication / Comunicação Biochemistry and Biotechnology Reports, v. 1, n. 1, p. 28–31, 2012.

GIRALDO, M. A. Purificação e caracterização bioquímica da invertase extracelular produzida pelo fungo filamentoso Aspergillus terreus.2011,126f. Dissertação (Mestrado em Biotecnologia).Universidade Estadual paulista,Araraquara,2011.

GONÇALVES, L.G. Produção de amilases de Rhizopus microsporus var. oligosporus e hidrólise enzimática do bagaço de mandioca visando a produção de etanol por Saccharomyces cerevisiae. 2016, 68f. Dissertação (Mestrado em Ciências Biológicas). Universidade estadual Paulista,Rio Claro,2016.

GOTTSCHALK, L.M.F et al,. Comparação da produção das enzimas xilanase e feruloil esterase em fermentação em estado sólido e submersa pela cepa mutante Aspergillus niger 3T5B8. In: Embrapa Agroindústria de Alimentos-Artigo em anais de congresso,2013.

GOTTSCHALK, L.M.F.; OLIVEIRA, R.A.; BON, E.P.S. Cellulases, xylanases, β- glucosidase and ferulic acid esterase produced by Trichoderma and Aspergillus act synergistically in the hydrolysis of sugarcane bagasse. Biochem. Eng. J., v. 51, p. 72-78, 2010.

GUPTA, R et al. Microbial α-amylases: Biotechnological perspective. Process Biochemistry, v. 38, p. 1599-1616, 2003.

GUPTA, R. et al. Microbial α-amylases: a biotechnological perspective. Process biochemistry, v. 38, n. 11, p. 1599-1616, 2003.

HASAN, F.; SHAH, A. A.; HAMEED, A. Industrial applications of microbial lipases. Enzyme and Microbial Technology, v. 39, p. 235-251, 2006.

HORN, B. W.et al,. Sexual reproduction in Aspergillus tubingensis from section Nigri. Mycologia, v. 105, n. 5, p. 1153–63, 2013.

IBGE– INSTITUTO BRASILEIRO DE GEOGRAFIA E ESTATÍSTICA – IBGE. Levantamento sistemático da produção agrícola. 2015. Disponível em: www.ibge.gov.br/.Acesso 21 de junho de 2016.

JESUS, J. G. R. Seleção e identificação de cepas bacterianas produtoras de amilases isoladas da microbiota associada a resíduos agrícolas de cacau e dendê. 2014,86f. Dissertação (Mestrado em Biotecnologia),Universidade Federal da Bahia, Salvador, 2014.


32

KIM, H.; MAEDA, T.; MORITA, N. Effect of a-fungal amylase on the dough properties and bread quality of wheat flour substituted with polished flours, Food Research International. 39, p. 117-126, 2006.

KIRK, O.; BORCHERT, T.V.; FUGLSANG, C.C. Industrial enzyme applications.Current Opinion in Biotechnology, v. 13, n.4, p. 345–351, 2002.

KLICH, M.A. Identification of Common Aspergillus species. Amsterdam: Centraalbureau voor Schimmelautures, 2002.

KOBORI C.N. ; Jorge N. Caracterização dos óleos de algumas sementes de frutas como aproveitamento de resíduos industriais. Ciência e Agrotecnologia, v,29, p.1008-1014,2005.

KRAEMER, M. E. P. A questão ambiental e os resíduos industriais. Disponível em: http://www.amda.org.br/imgs/up/Artigo_25.pdf. Acesso em: 20 de dez de 2015.

KUMAR, V.; SAHAI, V.; BISARIA, V. S. Production of amylase and chlamydospores by Piriformospora indica, a root endophytic fungus. Biocatalysis and Agricultural Biotechnology, v. 1, p. 124-128, 2012.

LAUFENBERG, G.; KUNZ, B.; NYSTROEM, M. Transformation of vegetable waste into

value added products: (a) the upgrading concept; (b) practical implementations.

Bioresource Technology, v.87,n. 2,p.167-198, 2003.

LEE, Y.S. et al. β-cyclodextrin production by the cyclodextrin glucanotransferase from

Paenibacillus illinoisensis ZY-08: cloning, purification, and properties. World J

Microbiol Biotechnol, v.29, p.865–873, 2013.

LEITE, C.L. Taxonomia de fungos. In: E. ESPOSITO; J.L. AZEVEDO (Eds.); Fungos:

uma introdução à biologia, bioquímica e biotecnologia, v.2, p.47–91, 2010.

LIMA, M. B. Avaliação do efeito da adição de fontes nitrogenadas e de sais minerais na fermentação em estado sólido para produção de fitase por Aspergillus. 2012,80f. Dissertação (Mestrado em Engenharia de Alimentos), Universidade Estadual de Campinas, Campinas, 2012.

LIMA, U. A. et al. Biotecnologia Industrial: Processos Fermentativos e Enzimáticos, Ed.

Edgard Blücher, v. 3, p.593, 2001.

LIRA, D.D. de. Caracterização de Aspergillus sp. Quanto a capacidade de degradação de óleo diesel. 2014,60f. Dissertação (Mestrado em Biologia de Fungos). Universidade Federal de Pernambuco,2014.

LIU K.et al.High concentration ethanol production from corncob residues by fed-batch strategy. Bioresource Technology, v, 101, p.4952-4958,2010.


33

LIU, T.P. S.L. et al. Produção, purificação, caracterização e aplicação de tanase de Aspergillus melleus URM 5827 produzida por fermentação em estado sólido utilizando sementes de achachairú.Universidade Dederal Rural de Pernambuco,Recife, 2016.

LOPES, C. Produção e Análise de Metabólitos Secundários de Fungos

Filamentosos. 2011,130f. Dissertação (Mestrado em Biologia celular e molecular).

Universidade Federal do Rio Grande do Sul, Porto Alegre.

LOTTERMANN, M. T. Purificação e caracterização estrutural de uma α-amilase de

Cryptococcus flavus expressa em Saccharomyces cerevisiae. 2012,71f.

Dissertação (Mestrado em Biologia Molecular) . Universidade de Brasília, Brasília,

2012.

MALAFAIA, G. et al. Teor de nutrientes em folhas de milho fertilizado com vermicomposto de lodo de curtume e irrigado com água residuária doméstica. Ambiente & Água-An Interdisciplinary Journal of Applied Science, v. 11, n. 4, p. 799-809, 2016.

MALDONADO, G. H.;LÓPEZ, P. O.; BILIADERIS, C. G. Amylolytic enzymes and products derived from starch: a review. Critical Reviews in Food Science & Nutrition, v. 35, n. 5, p. 373-403, 1995.

MANEERAT, S.; PHETRONG, K. Isolation of biosurfactant-producing marine bacteria and characteristics of selected biosurfactant. Songklanakarin J. Sci. Technol., v. 29, n. 3, p. 781-791. January 2007.

MARTARELLO, R. Purificação de uma beta-galactosidase produzida por Aspergillus

foetidus através de técnicas cromatográficas. 2016. Dissertação (Mestrado em

Ciências da Saúde). Universidade de Brasília, Brasília.

MARTINS, S.E. et al. Production and characterization of polygalacturonase from thermophilic Thermoascus aurantiacus on submerged fermentation. Annals of microbiology, v. 62, n. 3, p. 1199-1205, 2012.

MATOS, F. S. et al. produtividade de cultivares de mandioca sob déficit hídrico. Agri-environmental sciences, v. 2, n. 1, p. 15-24, 2016.

MCLAUGHLIN, D. J. et al. The search for the fungal tree of life. Trends in microbiology.v. 17, n. 11, p. 488–97, 2009.

MITCHELL, D.A. et al.. The bioreactor Step of SSF: A Complex Interaction of Phenomena, p.13-32, 2006.

MONCLARO, A. V. Caracterização de múltiplas formas de xilanases produzidas por Aspergillus oryzae quando crescido em resíduos têxteis. 2014,110f. Dissertação (Mestrado em Biologia Molecular), Universidade de Brasília, Brasília, 2014.


34

MONTEIRO, Valdirene N.; SILVA, R. N. Aplicações industriais da biotecnologia enzimática. Revista Processos Químicos, v. 3, n. 5, p. 9-23, 2009.

MOREIRA, F.G.et al .Produção de amilases por Aspergillus tamarii.Production of amylases by Aspergillus tamarii. Revista de Microbiologia, v.3, p.157-162,1999.

MOREIRA, L.R.D.S. Xilanases produzidas por Aspergillus terreus: caracterização, degradação de biomassa lignocelulósica e efeito de compostos fenólicos. 2013. Tese (Doutorado em Biologia Celular). Universidade de Brasília, Brasília.

MUCHALAK, S. M. et al. utilização de bioestimulante nas características agronômicas de diferentes cultivares de batata irrigada. Nucleus, v. 13, n. 2, p. 253-262, 2016.

MUKHERJEE, S.; DAS, P.; SEN, R. Towards commercial production of microbial surfactants. Trends in Biotechnology, v. 24, n. 11, p. 509–515, 2006.

MURALIKRISHNA, G.; NIRMALA, M. Cereal α-amylases—an overview. Carbohydrate Polymers, v. 60, n. 2, p. 163-173, May 2005.

NELSON, D. L.; COX, M.M. Lehninger: Princípios de Bioquímica. 5 Ed, ArtMed. ISBN 853632418X, 2011.

NETO, S.D.L.Complexos enzimáticos em rações para frangos de corte. 2016,74f. Dissertação (Mestrado em zootecnia).Universidade de Goiás,Goiânia,2016.

NITSCHKE, M.; PASTORE, G. M. Production and properties of a surfactant obtained from Bacillus subtilis grown on cassava wastewater. Bioresource Technology, v. 97, n. 2, p. 336–341, 2006

NUNES, P. M. P. et al. A importância do aproveitamento dos resíduos industriais da semente de Citrus. Visão Acadêmica, v. 10, n. 1, p. 97-110, 2009.

NWAGU, T. N.; OKOLO, B. N. Extracellular amylase production of a thermotolerant Fusarium sp: isolated from Eastern Nigerian soil. Brazilian Archives of Biology and Technology, v. 54, n. 4, p. 649-658, 2011.

OLIVEIRA, D.M.; REIS, K.C. dos; PEREIRA, J. Composição centesimal da farinha de batata produzida a partir de secagem solar e secagem em estufa. In: Congresso Brasileiro de Ciência e Tecnologia de Alimentos: estratégia pade Cira o desenvolvimento, 19., 2004, Recife. Anais… Recife, 2004.

de OLIVEIRA, A.N. et al. Produção de amilase por rizóbios, usando farinha de pupunha como substrato. Ciênc. Tecnol. Aliment, v. 27, n. 1, p. 61-66, 2007.

OLIVEIRA, D. C. A. et al. Comparação entre três bioprocessos para a produção de enzimas proteolíticas utilizando resíduos agroindustriais. Revista Brasileira de Tecnologia Agroindustrial. v. 6, n.2, p.822-831, 2012.

OLIVEIRA, F. M. Resíduos agroindustriais como adsorventes para remoção de

azul de metileno em meio aquoso. 2016.163f.Dissertação (Mestrado em Química).

Universidade Federal de Goiás, Catalão,2016.


35

ORLANDELLI, R. C. et al. Enzimas de interesse industrial: produção por fungos e

aplicações. Sabios: Revista Saúde e Biologia. v. 7, n. 3, p.97-109, 2012.

PANDEY, A. et al. Enzyme Technology. 1ª ed. New Delhi: Asiatech Publishers, Inc,p.

p,760, 2005.

PANDEY, A. Solid-state fermentation. Biochem. Eng. J., v. 13, p. 81-84, 2003.

PELCZAR J.R.et al. Microbiologia: conceitos e aplicações, v. 2, 1996.

PENHA, E. M. et al. Agro-industrial residues utilization of palm oil for lipase production by Aspergillus niger. Ciência Rural, v. 46, n. 4, p. 755-761, 2016.

PEREIRA, C. B. Avaliação da produção de enzimas celulolíticas e hemicelulolíticas por

fungos isolados do cerrado, costa marinha brasileira e da Antártica, utilizando casca

de soja como substrato. 2016,116f. Dissertação (Mestrado em Ciências

Farmacêuticas), Universidade de Brasília, Brasília, 2016.

PEREIRA, J. L. Produção de enzimas amilolíticas por Aspergillus orysae através de fermentação no estado sólido. Trabalho de Conclusão de Curso em Farmácia, Universidade de Brasília, Brasília, 56 p., 2014.

PEREIRA, J. M.. Características funcionais, antimicrobianas e aplicação das águas sobrenadantes da fermentação do amido de mandioca. 2016,173f. Tese (Doutorado em Ciência dos Alimentos). Universidade Federal de Santa Catarina, Florianópolis,2016.

PETERSON, L. R.; BARKER, G. W.; HOWARTH, M. J. Development and structure of tubers. In: LI, P. H. Potato Physiology. Academic Press, p.123-152, 1985.

PRECZESKI, K. P. et al. Avaliação da imobilização das enzimas lipase, inulinase e

peroxidase não comerciais em diferentes suportes inorgânicos. Anais da JIC-

JORNADA DE Iniciação Científica e Tecnológica, v. 6, n. 1, 2016.

PY-DANIEL, K. R. Atividades amilolíticas identificadas em bibliotecas metagenômicas da microbiota do solo do Cerrado. 2010. 101f. Mestrado em Biologia Molecular. Departamento de Biologia Celular, Universidade de Brasília, Brasília.

RAHARDJO, Y.S.P.; TRAMPER, J.; RINZEMA, A. Modeling conversion and transport phenomena in solid-state fermentation: A review and perspectives. Biotechnol, 2005.

REBOUÇAS, A. C.; FERNANDES, A. N. Remoção dos hormônios estradiol e

etinilestradiol de soluções aquosas empregando turfa decomposta como material

adsorvente. Química Nova, v. 34, n. 9, p. 1526-1533, 2011.


36

REGINATTO, C. Produção e caracterização parcial de pectinases de Aspergillus niger LB-02-SF obtidas em processo submerso. 2016.90f. Dissertartação (Mestrado em Biotecnologia). Universidade de Caxias Do Sul,Caxias do Sul, 2016.

REIS, R.L. S. et al. Avaliação do Potencial Biotecnológico de Aspergillus Parasiticus ucp 1281 no Biotratamento de Efluentes da Indústria de Laticínios e Produção de Lipídeos. e-xacta, v. 8, n. 1, p. 31-42, 2015.

ROCHA I.S. et al,.Estudo Prospectivo Relativo a Depósitos de Patentes Relacionadas às Enzimas Peptidases .Cadernos de Prospecção, v.8, n.1, p.123-132,2015.

RODRIGUES C.et al.A new alternative to produce gibberellic acid by solid state fermentation. Brazilian Archives of Biology and Technolology,v.52,p.181-188,2009.

ROOHI, M. K. Bio-statistical approach for optimization of cold-active α-amylase production by novel psychrotolerant M. foliorum GA2 in solid state fermentation. Biocatalysis and Agricultural Biotechnology, v.3, p. 175-181, 2014.

ROVEDA M., HEMKEMEIER M., MARIA C. Avaliação da produção de lipases por diferentes cepas de microrganismos isolados em efluentes de laticínios por fermentação submersa. Ciência e Tecnologia de Alimentos, v.30, n.1, p.126-131,2010.

SAMSON, R. A; VARGA, J. What is a species in Aspergillus. Medical mycology, v. 47,n, p. S13–20, 2009.

SANTOS, T.C. et al. AspergIllus niger como produtor de enzimas celuloliticas a partir farelo de cacau (Theobroma cacao). Arquivos do Instituto Biológico, v. 80, n.1, p. 65-71, 2013.

SHAH, A R.; MADAMWAR, D. Xylanase production by a newly isolated Aspergillus foetidus strain and its characterization. Process Biochemistry, v. 40, n. 5, p. 1763-1771, 2005.

SHARMA, R.K.; ARORA, D. S.. Fungal degradation of lignocellulosic residues: An aspect of improved nutritive quality. Critical reviews in microbiology, v. 41, n. 1, p. 52-60, 2015.

Silva, D.V.et al. Seletividade de herbicidas pós-emergentes na cultura da mandioca. Planta Daninha,v. 30,n.4,p. 835-841,2012.

SILVA, I. W. Índices de tomada de decisão para Chrysodeixis includens e monitoramento para o manejo de pragas em Solanum tuberosum. 2016,58f. Dissertação (Mestrado em Agronomia). Universidade Federal de Viçosa, Campus Rio Paranaíba, Minas Gerais , 2016.

SILVA, T. J. Crescimento apical e síntese de carboidrases em fungos filamentosos: uma análise bioquímica e morfológica, 2014.

SIVARAMAKRISHNAN, S. et al. α-Amylase from microbial sources – an overview on

recent developments. Food Technology Biotechnology, v. 44, p. 173-184, 2006.


37

SMITH, O. Potatoes: production, storing, processing. Westport, Connecticut: The Avi, p.77-121,1977.

SOARES, I. A.et al. Identificação do potencial amilolítico de linhagens mutantes do fungo filamentoso Aspergillus nidulans. Ciência e Tecnologia de Alimentos, v. 30, n. 3, p. 700-705, 2010.

SOCCOL, C.R. et al. Glucoamylase. In: Enzyme Technology. New Delhi: Asiatec Publishers Inc., p. 221- 230, 2005.

SOUZA, P. M.; MAGALHÃES, P. O. Application of microbial amylase in industry – a review. Brazilian Journal of Microbiology, v.41, n.4, p. 850-861, 2010.

SPOHNER, S.C. et al.Expression of enzymes for the usage in food and feed industry with Pichia pastoris. Journal of Biotechnology, v. 202, p. 118–134, 2015.

SUD, D.; MAHAJAN, G.; KAUR, M. P. Agricultural waste material as potencial adsorbents for sequestering heavy metal from aqueous solutions- A review. Bioresource Technology, v. 99, p. 6017-6027, 2008.

SURYANARAYANAN, T.S. et al. Fungal endophytes and bioprospecting. Fungal

Biology Reviews, v.23, n.1, p 9-19, 2009.

TEIXEIRA, T. S.; SIQUEIRA, F. G.; BATISTA, R. D. Enzimas microbianas de

desconstrução da parede celular: Novas Abordagens. Revista Eletrônica de Energia, v. 6, n. 1, 2017.

TORRADO, A. et al. Amylase production by Aspergillus oryzae in a solid-state

bioreactor with fedbatchoperation using mussel processing waste waters as feeding

medium. Journal of Chemical Technology and Biotechnology, v. 88, p. 226-236,

2013.

TUTTOBENE R. et al. Industrial orange waste as organic fertilizer in durum wheat. Agronomy for Sustainable Development, v.29,p.557-563,2009.

VARGA, J.et al. Molecular diversity of agriculturally importante Aspergillus species.In: Molecular Diversity and PCR-detection of Toxigenic Fusarium Species and Ochratoxigeniz Fungi.Springer Nerherlands,p.627-640,2004.

VIEIRA, P.A.F. Caracterização química do resíduo do processamento agroindustrial da manga (Mangifera indica L.) var. Ubá. Alimentos e Nutrição, v,20,p.617- 623,2009.

VIEIRA, L.J.et al . Development of interspecific hybrids of Manihot esculenta and paternity analysis with molecular markers. Journal of Agricultural Science,,v.151,n.6,p. 849-861,2013.

VIHINEN, M. MÄNTSÄLÄ, P. Conserved residues of liquefying α-amylases are concentrated in the vicinity of active site. Biochemical and biophysical research communications, v. 166, n. 1, p. 61-65, 1990.


38

VILHALVA, D.A. A. et al. Secagem convencional de casca de mandioca proveniente de resíduos de indústria de amido. Pesquisa Agropecuária Tropical, v. 42, n. 3, p. 331-339, 2012.

VISIOLI, L. J. et al. Desenvolvimento de uma metodologia rápida e de baixo custo para

quantificação de acetona-butanol-etanol em processos fermentativos Industriais. Blucher Chemical Engineering Proceedings, v. 1, n. 2, p. 2670-2677, 2015.

VISSER, R. G. F.et al. Sequencing the potato genome: Outline and first results to come from the elucidation of the sequence of the world's third most important food crop. American Journal of Potato Research, v. 86, p. 417-429, 2009.

VITOLO, M.; PESSOA, A. Biotecnologia farmacêutica: aspectos sobre aplicação industrial. 1ed. São Paulo-SP: Blucher, 2015.

VRIES, R.P.; VISSER, J. Aspergillus Enzymes Involved in Degradation of Plant Cell Wall Polysaccharides. Microbiol.Mol. Biol. Rev., v. 65, p. 497-522, 2001.


39

CAPÍTULO II

Potencial biotecnológico de Aspergillus tamarii UCP 1261 na produção de amilase

utilizando meios alternativos contendo resíduos agroindustriais

Artigo submetido à revista Acta Scientiarium Technology


40

Potencial biotecnológico de Aspergillus tamarii UCP 1261 na produção de amilase

utilizando meios alternativos contendo resíduos agroindustriais

Resumo

As amilases são enzimas envolvidas em diversos processos tecnológicos. A utilização

de resíduos agroindustriais surge com alternativa viável na produção de enzimas

industriais. Foram realizados estudos de seleção e identificação de amostras de

Aspergillus spp isoladas de solo da Caatinga nordestina com potencial produção de

amilase em meio sólido. Após a seleção e identificação do micro-organismo, novos

ensaios envolvendo a produção da enzima através de fermentação submersa com

diferentes meios de produção foram realizados. A utilização de um planejamento

fatorial completo serviu para elaboração de meios alternativos contendo resíduos

(cascas de macaxeira e batata inglesa) ricos em amido. Os experimentos foram

conduzidos durante 96 horas,150rpm à 37ºC. Os resultados obtidos demonstram que a

amostra de Aspergillus tamarii obteve a formação do maior halo característico (68mm)

37ºC, pH 6. 72 h. Nos ensaios envolvendo a seleção de meios, o meio Czapeck

apresentou valores de atividade amilolítica de 4 UA/mL após 48h de crescimento. No

planejamento fatorial 23, a máxima produção da enzima ocorreu na condição 4

apresentando valor da atividade amilolítica de 3 UA/mL. Os dados obtidos concluem

que o Aspergillus tamarii possui habilidade de converter o amido dos resíduos em

amilase, demostrando dessa forma ser promissor para produção da enzima.

Palavras-Chave: fungo filamentoso, formulação meios alternativo, planejamento

fatorial, atividade amilolítica

Biotechnological potential of Aspergillus tamarii UCP 1261 in the production of

amylase using alternative means containing agroindustrial residues

Abstract

Amylases are enzymes involved in various technological processes. The use of

agroindustrial wastes appears with a viable alternative in the production of industrial

enzymes. In this study, the selection and identification of Aspergillus spp isolates from

Caatinga Northeastern soil with potential amylase production in solid medium were


41

carried out. After the selection and identification of the microorganism, new tests

involving the production of the enzyme through submerged fermentation with different

production media were performed. The use of full factorial design helped to prepare

alternative production media containing residues rich in starch (cassava and potato

peels). The experiments were conducted for 96 hours, 150 rpm at 37ºC. The results

obtained demonstrate that the isolate of Aspergillus tamarii showed the formation of the

largest characteristic halo (68 mm) at 37ºC, pH 6 and 72 h. In the assays involving

selection of the media, the Czapeck medium showed amylolytic activity values of 4

AU/mL after 48 h of growth. In 23 factorial design, the maximum enzyme production

occurred in condition 4, presenting amylolytic activity value of 3 AU/mL. The data

obtained conclude that Aspergillus tamarii has the ability to convert the starch from the

residues to amylase, thus proving to be promising for the production of the enzyme.

Keywords: filamentous fungus, formulation of alternative media, factorial design,

amylolytic activity

INTRODUÇÃO

O crescente aumento das pesquisas na área da enzimologia estimula a descoberta

de novos micro-organismos produtores de enzimas que apresentem alta produtividade,

especificidade e estabilidade das enzimas. As enzimas são usadas, em grande escala, na

indústria de tecidos (celulases), detergentes (proteases e lipases), de alimentos e bebidas

(amilases, pectinases, proteases e celulases), de couro (proteases e lipases) ) (Pasha,

Anuradha & Rao, 2013; Soares et al ., 2013; Griebeler et al.,2015)e na dieta de

ruminantes para o aumento da digestibilidade (Griebeler et al.,2015).

Um grande número de enzimas, muitas das quais utilizadas na biotecnologia são

produzidas por fungos do gênero Aspergillus. Os fungos filamentosos são bons

produtores de enzimas industriais e são de grande importância na biotecnologia atual

(Loguercio-Leite et al., 2006; Benassi et al., 2014).

Dentre as enzimas de interesse biotecnológico, as amilases (EC 3.2.1.1) possuem

potencial de hidrolisar o amido e pode ser obtida a partir de fontes de origem vegetal,

animal ou microbiana. As de origem microbiana são particularmente importantes por

sua utilização em diversos processos industriais (Costa, Abreu-lima & Carreiro, 2014.

As amilases representam 25% do mercado de enzimas e encontram aplicações em todos


42

os processos industriais que necessitam da hidrólise parcial ou completa do amido

(Costa, Abreu-lima & Carreiro, 2014; Saxena et al., 2007).

Na produção das enzimas, compostos de valor podem ser retirados ou

sintetizados a partir de diferentes resíduos da indústria. Há uma tendência crescente em

converter resíduos industriais e agroindustriais em produtos de valor, os quais podem

resultar em reduções potenciais do volume de resíduos, além dos custos de eliminação

das frações remanescentes (da Cruz et al., 2015).

Este estudo teve como objetivo isolar e selecionar amostras de Aspergillus spp

potencialmente produtoras de amilase através da bioconversão da farinha das cascas de

macaxeira e batata inglesa na busca de formulação de novo meio de cultivo contendo

esses resíduos.

MATERIAL E MÉTODOS

Micro-organismos

Foram utilizadas quatro amostras de Aspergillus spp (Aspergillus UCP 1261,

Aspergillus UCP 1392, Aspergillus flavus UCP 1383, Aspergillus niger UCP 1382)

isoladas de solo da Caatinga do Nordeste de Pernambuco, depositadas no Banco de

Culturas do Núcleo de Pesquisas em Ciências Ambientais (NPCIAMB), da

Universidade Católica de Pernambuco.

Obtenção e preparo dos resíduos

Substratos

Os substratos utilizados par produção da amilase foram resíduos agroindustriais

derivados de tubérculos ricos em amido: cascas de macaxeira e cascas de batata inglesa,

provenientes do comercio local.

Preparo das farinhas: casca de macaxeira e casca de batata

A casca de macaxeira (Manihot esculenta) e a casca de batata inglesa (Solanum

tuberosum) foram lavadas com água destilada e secas em estufa à 40ºC durante 72

horas. Em seguida, as cascas foram trituradas e tamizadas (mesh nº32).


43

Identificação morfológica da espécie Aspergillus (KLICK, 2002)

A amostra foi identificada conforme o manual de identificação de Aspergillus descrito

por KLICK (2002) e SAMSOM et al.(2004). O isolado foi inoculado nos seguintes meio

de cultivo: Agar Czapek autolisado de levedura (CYA),(Czapek concentrado 10mL,

sacarose 30g, extrato de levedura 5g, K 2 HPO 4, 1g, Agar 20g e água destilada

1000ml) e Extrato de Malte Àgar (MEA) (extrato de malte 20g, peptona 1g, glicose

20g, Agar 20g e água destilada 1000mL). Os meios foram ajustados ao pH 6 e

autoclavados a 121°C por 15 minutos. As inoculações foram feitas a partir de

suspensão espórica numa solução de Agar semi-sólido contendo 0,2% e 0,05% de

Tween 80, utilizando uma micropipeta para inoculação em três pontos equidistantes e

incubadas por sete dias nas temperaturas 25°C e 37°C.

Após 7 dias, os diâmetros das colônias foram medidos e foram observados as

características macroscópicas: textura da colônia, grau de esporulação, cor de conídios,

textura e cor do micélio, a presença de cores de pigmentos e exsudato.Para as

observações microscópicas, foi removido o micélio das zonas onde as colônias

adjacentes estão mais próximas, a partir da área da colônia em que os conídios estavam

começando a se desenvolver. As lâminas foram montadas com ácido lático (85%) e

gotas de etanol a 70% para dispersar os conídios e para impedir bolhas de ar quando

montados em ácido lático. Após o preparo de lâminas, foram observadas estruturas

microscópicas, como comprimento, largura e textura dos conidióforos, forma da cabeça

conidial, diâmetro da vesícula, comprimento das métulas (se presente) e fiálides,

diâmetro, forma e textura dos conídios e ascósporos (se presentes), forma e cor do

cleistotécio/escleródios (se presentes).

Seleção das amostras de Aspergillus spp em meio sólido

Para escolha da amostra de Aspergillus spp produtoras de amilase, foram realizados

testes para determinação da atividade amilásica em meio sólido de acordo com a

metodologia de HANKIN, ANAGNOSTAKIS (1979) adicionando 2% amido solúvel ao

meio. O meio de cultura foi distribuído em placas de Petri, e após a solidificação foi

realizado furos no centro das placas e inoculados 100 μL da suspensão de esporos

fúngicos. As placas foram incubadas em diferentes temperaturas (28ᵒ;37

ᵒ e 45

ᵒ) e pH

(6;7,8) durante 96 hrs. Após o período de detecção enzimática, foram reveladas com

uma solução de iodo a 0,1N, durante 5 minutos. A formação de um halo transparente


44

em torno das colônias crescidas evidenciou a presença de amilase. Todos os ensaios

foram realizados em triplicata.

Produção de amilase por Fermentação submersa

Preparação do inóculo

Esporos jovens de cepas de Aspergillus spp foram transferidas para frascos de

Erlenmayers contendo água estéril até a obtenção de 107esporos/mL. Em seguida, 10%

da suspensão foi inoculadas no meio controle e meio residual.

Meio controle

A produção de amilase foi testada em quatro diferentes meios convencionais para

detecção de amilase de acordo com Adams (1990), Czapck (Wiseman, 1975), Khanna

(1995) e Sr (Rizzatti et al.,2001), Os cultivos foram realizados em frascos de

Erlenmeyers de 250 mL de capacidade contendo 100 mL dos respectivos meios. O meio

que induziu a maior produção de amilase foi selecionado e substituído o substrato

(amido solúvel) pelo amido residual proveniente dos resíduos (cascas da macaxeira e

batata inglesa).

Meios alternativos

A produção foi realizada em frascos de Erlenmeyers de 250 mL de capacidade contendo

100mL do meio contendo diferentes concentrações da farinha da casa de macaxeira e

farinha da casca de batata em diferentes pH de acordo com um planejamento fatorial de

23 (Tabela 1). O cultivo foi realizado em 150 rpm, 37° C durante 96 horas e os dados

obtidos foram analisados pelo programa Statistica versão 10 da Stat Soft. Os ensaios

foram realizados em triplicata.

Tabela 1- Planejamento fatorial-matriz codificada 2 3 utilização de resíduos

Variáveis

Níveis

-1 0 1

pH 5,0 6,0 7,0

Casca de macaxeira (%) 0,5 1,5 2,5

Casca de batata (%) 0,5 1,5 2,5


45

Detecção da atividade enzimática

A atividade amilolítica foi realizada de acordo com a metodologia da ANVISA (2012).

Este método é baseado na quantificação dos açúcares redutores liberados pela reação de

hidrólise do amido catalisada por amilases.

Cálculos das atividades enzimática e amilolítica

O cálculo da concentração da curva analítica e atividade amilolítica para amilase foram

realizados a partir do liquido metabólico seguindo o protocolo da ANVISA (2012). Os

valores para determinação da concentração da curva analítica foram expressos em

mmol/mL (Eq. 1A), enquanto para atividade amilolítica em UA.mL-1

.min. -1

(Eq. 1B).

E.

q 1A

Onde:

C=Concentração em Mmol ml-1

(ABSAM)=Valor da leitura da amostra em nm

(ABSBR)=Valor da leitura do branco da amostra

b=Coeficiente linear

a=Coeficiente angular

Atividade Amilolítica [UA.Ml-1

.min. -1

] = Eq.1B

Onde:

C=Concentração de açucares redutores na amostra (Mmol)

RESULTADOS E DISCUSSAO

Identificação morfológica da amostra

De acordo com identificação clássica, com base nas características macroscópicas e

microscópicas, o isolado que apresentou melhores resultados, pertence a espécie

Aspergillus tamarii Kita. As colônias crescidas em MEA, apresentou micélio branco,

reverso incolor, conidióforo de comprimentos irregulares que garantem uma textura

grosseira; conídios apresentaram coloração marrom-amarelado com o envelhecimento

(Figura 1-A). Em CYE, apresentaram diâmetro de 70 mm a 25° C e 37°C apresentando

micélio branco, reverso incolor a amarelo acinzentado; colônia flocosa a plana conídios

de cor marrom oliva com o envelhecimento da colônia (Figura 1-B).


46

Figura 1- Amostra de Aspergillus tamarii. Colônias crescidas em MEA 25°C (A);

Colônias crescidas em CYA 25°(B)

Nas observações microscópicas foram observadas cabeças do tipo radial a colunar,

conidióforos de superfície rugosa e incolor, vesículas globosas a piriforme entre 20 a 45

µm de largura; predominantemente bisseriado (presença de métulas e fiálides), como

mostra na figura 2-A, raramente foram encotradas seriação monosseriada (apenas

fiálides), métulas/fiálides a maioria das vezes cobrindo toda a superfície da vesícula,

métulas alcançando de 4 a 8μm e fiálides entre 4 a 6 µm de comprimento. Conídios

globosos, grosseiramente rugosos com paredes espessas, como mostra na figura 2 -B

apresentando rugosos entre 5μm a 8μm de diâmetro, raramente 13 μm de diâmetro.

Figura 2- Aspergillus tamarii. (A) Cabeça conidial (400x); (B) conídios (1000x)

Os dados informados correspondem à literatura descrita por KLICK (2002), que

descreve ser uma espécie originalmente isolada do molho tamari e também considerado

um fungo comum do solo, especialmente em solos tropicais. A região da caatinga é um


47

dos biomas mais ameaçados do Brasil, em que grande parte de sua área tem sido

desertificada, devido principalmente as condições climáticas extremas. Apesar das

adversidades do clima na região, como radiação solar, baixo teor de chuvas etc., muitas

espécies fúngicas são isoladas do solo da região semi-árida. CAVALCANTI, MAIA

(1994), isolaram fungos celulolíticos de solo no semi-árido da caatinga, COSTA et al.,

(2006), estudaram Hiphomycetes de solo contaminado por minérios em região semi-

árida do Nordeste, SANTIAGO, SOUZA-MOTTA (2006), que isolaram Mucorales de

solo da caatinga. Várias espécies do gênero Aspergillus e entre outros gêneros foram

isolados da região Xingó, no Nordeste por De QUEIROZ et al.(2006), entre elas 28

cepas de A. tamarii foram encontradas nos três municípios alagoanos estudados.

Screnning enzimático de amostras de Aspergillus spp. produtoras de amilase em

meio sólido

A Tabela 2 demonstra os resultados da avaliação de diferentes espécies de Aspergillus

na produção de amilase. De acordo com os dados, o Aspergillus tamarii (UCP 1261),

apresentou maior potencial em produzir, extracelularmente, a amilase após 72 horas de

incubação em pH 6 á temperatura de 37ºC resultando na formação de halo característico

com diâmetro de 68 mm.

Resultados considerados inferiores foram obtidos por SOUZA, OLIVEIRA,

ANDRADE (2008)

após testarem o potencial de amostras de Basidiomycetes na

produção da amilase, o que resultou na formação do halo característico com dimensões

entre 6,20 a 22,30mm após crescimento a 28ºC. Por outro lado, ALVES et al (2002)

realizaram o estudo da produção de amilase com Mucor spp. e observaram resultados

similares aos obtidos neste estudo demonstrando a formação do halo característico com

dimensões entre 46-85mm após 72 h. GOTO et al.(1998) descreveram que uma ótima

produção de amilase por fungos do gênero Aspergillus é viabilizada após cultivo em

meio de cultura com pH em torno de 6.0.


48

Tabela 2- Seleção de amostra de Aspergillus spp produtora de amilase em meio sólido

avaliado pela formação de halo (mm) durante 72 horas de cultivo

* (-) Não formação do halo característico

Seleção do meio controle para produção de amilase em cultivo submerso por

Aspergillus tamarii

Os fungos podem apresentar diferentes comportamentos metabólicos após mudanças na

composição do meio de cultivo. Portanto, as soluções de sais são componentes

fundamentais que influenciam no crescimento dos micro-organismos e na produção de

metabólitos de interesse industrial (Lopes et al., 2016). Nesse sentido, os resultados

obtidos neste estudo demonstraram que a indução da produção amilolítica pela cepa de

Aspergillus tamarii foi fortemente influenciada pela solução de sais que constitui o

meio Czapeck em pH 6.0 no período de 96 h. No entanto, após 48 h ocorreu a máxima

produção enzimática no meio denominado 2, obtendo atividade amilolítica de 4 UA/mL

com um pH final de 7,1 (Tabela 3). Esses resultados estão de acordo com os obtidos por

MONGA et al.(2011) que afirmaram que amostras de Aspergillus spp são capazes de

crescer e produzir amilase em meio Czapek com valores de atividade amilásica na faixa

de 1,9 - 4.4 U/mL.

Fungos

pH

Temperaturas (ºC)

28 37 45

Aspergillus tamarii

UCP 1261

6

7

8

43

41

40

68

65

37

53

35

51

Aspergillus UCP

1372

6

7

8

44

42

46

42

31

43

51

51

40

Aspergillus flavus

UCP 1383

6

7

8

-

-

-

-

-

-

-

-

-

Aspergillus niger

UCP 1382

6

7

8

-

35

29

-

30

-

-

29

-


49

Tabela 3- Detecção da atividade amilolítica (UA) em diferentes meios de produção de

amilase por Aspergillus tamarii

Meios

24h

Atividade

amilolítica

(UA/mL)

48h

Atividade

amilolítica

(UA/mL)

72h

Atividade

amilolítica

(UA/mL)

96h

Atividade

amilolítica

(UA/mL)

pH

final

1

2

3

4

0,1

2,0

0,8

0,7

0,8

4 0,7

1,5

0,8

3,5

0,8

0,7

0,7

2,5

0,7

0,6

8,0

7,1

7,0

8,0

Produção de amilase por Aspergillus tamarii em meio alternativo contendo

farinhas de macaxeira e de batata

A Tabela 4 descreve os resultados obtidos na produção de amilase por Aspergillus

tamarii crescido a 37ºC durante 72 h, através de um planejamento fatorial de 23. De

acordo com os resultados, a condição 4 do planejamento em meio constituído por 2,5%

de farinhas da casca de macaxeira e da casca de batata em maiores concentrações, pH

7,0, obteve-se a máxima atividade amilolítica de 3,00 UA/mL de todas as condições

testadas. Resultados inferiores para produção de amilase foram obtidos por FARZANA

et al.(2016), após cultivo de diferentes espécies de Aspergillus spp crescido a 37ºC em

pH 6, em meio contendo casca de batata como fonte de carbono, obtendo atividade

enzimática da amilase de 0,046 UA/mL.

Tabela 4- Produção de amilase por Aspergillus tamarii avaliada após 72 h de cultivo

através de planejamento fatorial de 23

Condições

Casca de macaxeira

(%)

Casca de batata

(%)

pH inicial

Atividade

Amilolítica

(UA/mL)

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

11

12

0,5

0,5

2,5

2,5

0,5

0,5

2,5

2,5

1,5

1,5

1,5

1,5

0,5

0,5

0,5

2,5

2,5

2,5

2,5

2,5

1,5

1,5

1,5

1,5

5,0

7,0

5,0

7,0

5,0

6,0

5,0

7,0

6,0

6,0

6,0

6,0

0,00

0,00

0,00

3,00

0,40

0,00

0,30

0,54

0.09

0,10

0,12

0,10


50

Influencia da farinha da casca de macaxeira, farinha da casca de batata e do pH

na produção de amilase

A Figura 3 demonstra o Diagrama de Pareto para análise da influência das variáveis

independentes casca da farinha de macaxeira, farinha da casca de batata, e do pH, assim

como suas associações, sobre a variável reposta produção de amilase por Aspergillus

tamarii.

De acordo com os dados, todas as variáveis estudadas, assim como suas associações,

foram significativas do ponto de vista estatístico, com valores acima de p, com nível de

confiança de 95%. No entanto, a associação do pH com a farinha de macaxeira foi a que

mais influenciou na indução da produção da amilase.

Figura 3- Diagrama de Pareto do planejamento fatorial 23 para análise dos fatores

substratos e pH sobre a variável resposta atividade amilolítica em 72h de cultivo

A partir dos resultados obtidos e representados pelo diagrama de Paretto (figura 3), foi

realizado um novo planejamento de 22 variando as concentrações da farinha da casca de

macaxeira e o pH (tabela 5) com a finalidade de obter a máxima produção de amilase.

De acordo com os resultados obtidos, a melhor atividade amilolítica ocorreu na

condição 2 do planejamento em meio constituído por 0,5% de farinha da macaxeira e

pH 7,0 (9,0 UA/mL).


51

Tabela 5- Produção de amilase por Aspergillus tamarii avaliada após 48 h de cultivo de

acordo com planejamento fatorial de 22

Condições

Casca de macaxeira

(%)

pH

Atividade

Amilolítica

(UA/mL)

1

2

3

4

5

6

7

8

0,5

0,5

2,5

2,5

1,5

1,5

1,5

1,5

5,0

7,0

5,0

7,0

6,0

6,0

6,0

6,0

0,5

9,0

7,5

1,0

7,0

7,2

7,5

7,0

A figura 4 demostra o Diagrama de Pareto para os efeitos produzidos sobre a atividade

da amilase a partir das concentrações da farinha da casca de macaxeira e o pH

utilizadas, diagnosticando que todas as variáveis independentes foram significativas

estatisticamente. No entanto, a variável que provocou efeito positivo favorecendo a

máxima produção da amilase foi a concentração da farinha da casca da macaxeira.

Figura 4- Diagrama de Pareto do planejamento fatorial 22para análise dos fatores

substratos e pH sobre a variável resposta atividade amilolítica em 48h de cultivo.


52

CONCLUSÕES

O fungo Aspergillus tamarii (UCP 1261) demonstrou ser um fungo promissor para

produção da enzima amilase nos meios testados. Adicionalmente, a produção da amilase

foi favorecida pela elaboração dos meios alternativos, que o Aspergillus tamarii

converteu o amido presente das cascas de macaxeira e batata inglesa, o resíduo da

farinha da casca de macaxeira apresentou maior destaque por obter a máxima pruducao

da enzima amilase. Os resultados realizados neste trabalho, atendem aos requisitos

essenciais da sustentabilidade pelo uso destes resíduos que são descartados no meio

ambiente sem nenhum tratamento, podendo gerar produtos ambientalmente poluentes.

REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

Adams, P.R.(1990) Mycelial amylase activities os thermophilic species os

Rhizomucor,Humicola and Papulaspora. Mycopatologia,112(1),35-37.

Alves M.H., Campos-Takaki G.M., Porto A.L.F., & Milanez A.I.(2002). Screening of

Mucor spp. for the production of amylase, lipase, polygalacturonase and

protease. Brazilian Journal of Microbiology,33(4), 325-330.

ANVISA (2012). Agência nacional de vigilância sanitária, 224,64-72.

Benassi V.M., Pasin T.M., Facchini F.D.A., & Jorge JÁ (2014). A novel glucoamylase

activated by manganese and calcium produced in submerged fermentation by

Aspergillus phoenicis. Journal of basic microbiology, 54(5)333-339.

Cavalcanti M.A., & Maia L.C. (1994). Cellulolytic fungi isolated from an alluvial soil

in a semi-arid area of the northeast of Brazil. Rev. Microbiol,25(4)251-4.

Costa I.P., Cavalcanti M.A.Q., Fernandes M.J.S., & Lima D.M.(2006). Hyphomycetes

from soil of an area affected by copper mining activities in the State of Bahia,

Brazil. Brazilian Journal of Microbiology,37(3)290-295.

Costa S.T.C, Abreu-lima T.L., & Carreiro S.C.(2014). Atividade amilolítica de

leveduras isoladas de batata-doce (Ipomoea batatas (L.) Lam). Revista

Biociências,17(2),15-24.

da Cruz E.A., Melo M.C., Santana N.B., Franco M., de Santana R.S.M., Santos L.S. &

Gonçalves Z.S.(2015).Produção de Alfa-Amilase por Aspergillus niger em Resíduo de

Cascas de Mandioca. Journal of Health Sciences,13(4),245-249.


53

de Queiroz Cavalcanti M.A., de Oliveira L.G., Fernandes M.J., & Lima D M (2006).

Fungos filamentosos isolados do solo em municípios na região Xingó, Brasil. Acta bot.

Bras, 20(4),831-837.

Farzana Y., Abdullah M., Sethi A.A., Saleem H., Narmeen A., Ansari A., & Qader

S.(2016). A.Solid state fermentation: a cost effective approach for production of starch

liquefying fungal amylase using agro industrial wastes. Science

international,28(3),2703-2706.

Goto C.E., Barbosa E.P., Liberato L.D.C., Ferreira G.R., Lopes A.V., & Peralta

R.M.(1998). Production of amylases by Aspergillus fumigatus. Revista de

Microbiologia, 29(2),99-103.

Griebeler N.E., de Bortoli V., Astolfi A.L., Daronch N.A., & Cristina A.(2015). Seleção

de fungos filamentosos produtores de amilases, proteases, celulases e pectinases. Rev.

Acad. Ciênc. Anim, 13, 13-22.

Hankin L., & Anagnostaki S.L.(1979). The Use of Solid Media for detection of

Enzymes Production by Fungi.Mycologia, 67,597 – 607.

Khanna P., Sundari S.S., & Kumar N.J.(1995). Production, isolation and partial

purification of xylanase from Aspergillus sp.World J.Microbiol.Biotecnol, 11(2),242-

243.

Klich M.A.(2002). Identification of Common Aspergillus species. Amsterdam:

Centraalbureau voor Schimmelautures.

Loguercio-Leite C., Groposo C., Dreschler-Santos E.R., Godinho P.D.S., & Abrão R.L.

(2006). A particularidade de ser um fungo–I. Constituintes

celulares. Biotemas,19(2),17-27.

Lopes, P.H.S. et al. (2016).ENBEQ-Enconto Brasileiro sobre o ensino de Engenharia

química, Caracterização da produção amilolítica pelo fungo Pinicillium sp.L1.

Monga M., Goyal M., Kalra K.L., & Soni G.(2011) .Production and stabilization of

amylases from Aspergillus niger. Mycosphere, 2(2),129-134.

Pasha K.M., Anuradha P., & Rao D.S.(2013). Screening of a pectinolytic fungal strain;

Aspergillus foetidus MTCC 10367 for the production of multiple enzymes of industrial

importance. International Journal of Pharma and Bio Sciences, 4,1205-1209.

Rizzatti A.C.S., Jorge J.A., Terenzi H.F., Rechia C.G.V., & Polizeli M.L.M.(2001).

Purification and properties of a thermostable extracellular β-D-xylosidade produced by

thermotolerant Aspergillus phoenicis.J.Ind.Microbiol.Biothecnol, 26(3), 156-160.


54

Samson R.A., & Hoekstra E.S. (2004). Frisvad JC Introduction to food-and airborne

fungi (No. Ed. 7). Centraalbureau voor Schimmelcultures (CBS).

Santiago A., & Souza-motta C.M.(2006).Mucorales isolados do solo de mineração de

cobre e produção de amilase e inulinase. Acta Botanica Brasilica,20(3),641-647.

Saxena R.K., Dutt K., Agarwal L., & Nayyar P.(2007) . A highly thermostable and

alkaline amylase from a Bacillus sp. PN5. Bioresource Technology,98(2),260-265.

Soares I.A., Flores A.C., Zanettin L., Pin H.K.. Mendonça M.M., Barcelos R.P., &

Baroni S.(2010).Identification of the amylolytic potential of mutant strains of the

filamentous fungi Aspergillus nidulans. Food Science and Technology,30(3),700-705.

Souza H.Q., Oliveira L.A., & Andrade J.S.(2008). Seleção de Basidiomycetes da

Amazônia para produção de enzimas de interesse biotecnológico. Ciênc. Tecnol.

Alim,28,116-124.

Wiseman A. (1975) Handbook of Enzyme Biotechnology.

CAPÍTULO III

FONSECA,T.C.S. Produção de amilase por amostra de Aspergillus tamarii...

56

CONCLUSÕES GERAIS

Diante dos resultados obtidos, foi possível concluir que:

Aspergillus tamarii (UCP 2161) apresentou o melhor resultado para nas condições de

pH entre 6,0, 72h e temperatura 37ºC;

Nos ensaios referentes à seleção dos meios de produção de amilase em fermentação

submersa, o meio que apresentou os melhores resultados foi o meio 2 (Czapck),

apresentando uma AE (atividade enzimática) = 4 UA /mL.

O Meio 2 como controle apresentaram, os melhores resultados no ensaio denominado

4, uma AE= 3 UA/ML, com 72 horas de crescimento;

A farinha de cascas de macaxeira e batata inglesa foram eficientes para a obtenção da

enzima amilase através de fermentação submersa;

Os melhores resultados da atividade amilasica, foi obtida através do resíduo farinha da

casca de macaxeira;

A produção da amilase foi favorecida pela eficiência da bioconversão do Aspergillus

tamarii nos nutrientes presentes das cascas de macaxeira e batata inglesa.


57

ANEXOS


58

INSTRUÇÕES PARA SUBMISSÃO DE ARTIGOS:REVISTA ACTA SCIENTIARUM.

TECHNOLOGY

1. Acta Scientiarum. Technology, ISSN 1807-8664 (on-line), é publicada trimestralmente pela

Universidade Estadual de Maringá.

2. Vimos informar que, a partir de 2018, o periódico publicará artigos originais nas áreas de:

Biotecnologia; Bioenergia (enfoque tecnológico); Ciências Exatas e da Terra; Engenharias; Ciência,

Tecnologia e Engenharia de Alimentos e suas subáreas, conforme classificação das Áreas do

Conhecimento (CAPES, CNPq), com vistas à melhor avaliação e visibilidade.

3. Os autores se obrigam a declarar a cessão de direitos autorais e que seu manuscrito é um trabalho

original, e que não está sendo submetido, em parte ou no seu todo, à análise para publicação em outro

meio de divulgação científica sob pena de exclusão. Esta declaração encontra-se disponível no

endereço: http://periodicos.uem.br/ojs/index.php/ActaSciTechnol/about/submissions.

4. Os dados, ideias, opiniões e conceitos emitidos nos artigos, bem como a exatidão das referências, são

de inteira responsabilidade do(s) autor(es). A eventual citação de produtos e marcas comerciais não

significa recomendação de seu uso por parte do comitê editorial da revista.

5. Os relatos deverão basear-se nas técnicas mais avançadas e apropriadas à pesquisa. Quando

apropriado, deverá ser atestado que a pesquisa foi aprovada pelo Comitê de Ética e Biossegurança da

instituição.

6. Os artigos submetidos deverão ser em inglês. Os autores devem providenciar uma versão com

qualidade.

7. Os artigos serão avaliados por, no mínimo, três consultores da área de conhecimento da pesquisa, de

instituições de ensino e/ou pesquisa nacionais e estrangeiras, de comprovada produção científica. Após

as devidas correções e possíveis sugestões, o artigo será aceito se tiver dois pareceres favoráveis e

rejeitado quando dois pareceres forem desfavoráveis.

8. Os artigos deverão ser submetidos pela internet, acessando o Portal ACTA, no

endereço http://www.uem.br/acta.

9. O conflito de interesses pode ser de natureza pessoal, comercial, política, acadêmica ou financeira.

Conflitos de interesses podem ocorrer quando autores, revisores ou editores possuem interesses que

podem influenciar na elaboração ou avaliação de manuscritos. Ao submeter o manuscrito, os autores

são responsáveis por reconhecer e revelar conflitos financeiros ou de outra natureza que possam ter


59

influenciado o trabalho. Os autores devem identificar no manuscrito todo o apoio financeiro obtido para a

execução do trabalho e outras conexões pessoais referentes à realização do mesmo. O revisor deve

informar aos editores quaisquer conflitos de interesse que poderiam influenciar a análise do manuscrito,

e deve declarar-se não qualificado para revisá-lo.

10. A revisão de português (Resumo) e a revisão de língua estrangeira serão de responsabilidade e

custeados pelos autores dos artigos já aceitos para publicação, mediante comprovação emitida pelos

revisores credenciados.

11. Estão listadas abaixo a formatação e outras convenções que deverão ser seguidas:

a) No processo de submissão, deverão ser inseridos os nomes completos dos autores (no máximo seis),

seus endereços institucionais e o e-mail do autor indicado para correspondência.

b) Os artigos deverão ser subdivididos com os seguintes subtítulos: Resumo, Palavras-

chave, Abstract, Keywords, Introdução, Material e métodos, Resultados e discussão, Considerações

finais, Agradecimentos (opcional) e Referências. Esses itens deverão ser em caixa alta e em negrito e

não deverão ser numerados. Observa-se que, em caráter excepcional, pela característica da área da

Matemática, os artigos poderão conter no seu corpus os itens Introdução, Conclusão e Referências.

c) O título, com no máximo vinte palavras, em português e inglês, deverá ser preciso. Também deverá

ser fornecido um título resumido com, no máximo, seis palavras.

d) O resumo, não excedendo 200 palavras, deverá conter informações sucintas sobre o objetivo da

pesquisa, os materiais experimentais, os métodos empregados, os resultados e a conclusão. Até seis

palavras-chave que não estejam citadas no título deverão ser acrescentadas ao final tanto do resumo

como do abstract.

e) Os artigos não deverão exceder 15 páginas digitadas, incluindo figuras, tabelas e referências

bibliográficas. Deverão ser escritos em espaço 1,5 linhas e ter suas páginas numeradas no topo à direita

e todas as linhas numeradas no lado esquerdo. O trabalho deverá ser editado no MS-Word, ou

compatível, utilizando Times New Roman fonte 12.

f) O trabalho deverá ser formatado em A4 e as margens inferior, superior, direita e esquerda deverão ser

de2,5 cm.

g) O arquivo contendo o trabalho que deverá ser anexado (transferido), durante a submissão, não

poderá ultrapassar o tamanho de 2 MB, nem poderá conter qualquer tipo de identificação de autoria,

inclusive na opção propriedades do Word.

h) Tabelas, figuras e gráficos deverão ser inseridos no texto, logo depois de citados.


60

i) As figuras e as tabelas deverão ter preferencialmente7,65 cm de largura e não deverão ultrapassar16

cm.

j) As figuras digitalizadas deverão ter 300 dpi de resolução e preferencialmente gravadas no formato jpg

ou png. Ilustrações em cores serão aceitas para publicação.

k) Deverá ser adotado o Sistema Internacional (SI) de medidas.

l) As equações deverão ser editadas, utilizando software Math Type ou inserida como figura jpg ou png.

m) As variáveis deverão ser identificadas após a equação.

n) Artigos de revisão poderão ser publicados, mediante convite do Conselho Editorial ou Editor-Chefe da

Eduem.

o) Artigos científicos redigidos em língua inglesa terão prioridade na pauta de publicação da revista,

desde que respeitado o limite de 20% em cada fascículo.

p) A revista recomenda que oitenta por cento (80%) das referências sejam de artigos listados na base ISI

Web of Knowledge ou Scopus com menos de 10 anos. Recomenda-se dar preferência às citações de

artigos internacionais. Não serão aceitas nas referências citações de dissertações, teses, monografias,

anais, resumos, resumos expandidos, jornais, magazines e boletins técnicos. Recomenda-se evitar

documentos eletrônicos.

q) As citações deverão seguir os exemplos abaixo, que se baseiam na norma da American Psychological

Association (APA). Para citação no texto, usar o sobrenome e ano: Et (2001) ou (Et, 2001); para dois

autores: Costa e Mansur (2008) ou (Costa & Mansur, 2008); para três a cinco autores (1.ª citação):

Martín, Montes e Galán (2008) ou (Martín, Montes & Galán, 2008) e, nas citações subsequentes, Martín

et al. (2008) ou (Martín et al., 2008); para seis ou mais autores, citar apenas o primeiro seguido de et al.:

Parra et al. (2008) ou (Parra et al., 2008).

MODELOS DE REFERÊNCIAS

Deverão ser organizadas em ordem alfabética, alinhamento justificado, conforme os exemplos seguintes,

que se baseiam na norma da American Psychological Association (APA). Listar todos os autores do

trabalho. Os títulos dos periódicos deverão ser completos e não abreviados, sem o local de publicação.

ARTIGOS

Um autor


61

Sarma, B. (2015). Some sequence spaces of fuzzy numbers defined by Orlicz function. Acta Scientiarum.

Technology, 37(1), 85-87. doi: 10.4025/actascitechnol.v37i1.16966

Dois autores

Costa, E. S., Jr., & Mansur, H. S. (2008). Preparação e caracterização de blendas de quitosana/poli

(álcool vinílico) reticuladas quimicamente com glutaraldeído para aplicação em engenharia de

tecido. Química Nova, 31(6), 1460-1466.

Até sete autores (devem-se indicar todos os autores separados por vírgula, exceto o último que deve

ser separado por vírgula seguido de &)

Parra, J. E. G., Radüna, N. J., Veiverberg, C. A., Lazzari, R., Bergamin, G. T., Pedron, F. A., & Sutili, F.

J. (2008). Alimentação de fêmeas de jundiá com fontes lipídicas e sua relação com o desenvolvimento

embrionário e larval. Ciência Rural, 38(7), 2011-2017.

Oito ou mais autores (devem-se indicar os seis primeiros, inserir reticencias e acrescentar o último

autor)

Levantesi, C., La Mantia, R., Masciopinto, C., Bocklmann, U., Ayuso-Gabella, M. N., Salgot, M., ...

Grohmann, E. (2010). Quantification of pathogenic microorganisms and microbial indicators in three

wastewater reclamation and managed aquifer recharge facilities in Europe. Science of the Total

Environment, 408(1), 4923-4930.

LIVROS

Cowie, J. M. G. (2001). Polymers: chemistry and physics of modern materials. Cheltenham, UK:

Chapman and Hall.

El-Rewini, H., & Abd-EL-Barr, M. (2005). Advanced computer architecture and parallel processing.

Hoboken, NJ: John Wiley and Sons.

Schmal, M. (2005). Engenharia das reações químicas e catálise. In P. A. Melo Jr. (Ed.), Fronteiras da

Engenharia Química I (p. 21-50). Rio de Janeiro, RJ: E-papers.

produÇÃo de amilase por amostra de - unicap.br · figura 6- fluxograma simplificado da produção...

Documents