ENZIMASENZIMAS

Dr. Giuliano Bernal DossettoDr. Giuliano Bernal DossettoDepartamento de Ciencias BiomédicasDepartamento de Ciencias Biomédicas

Facultad de MedicinaFacultad de MedicinaUniversidad Católica del NorteUniversidad Católica del Norte

IntroducciónIntroducción

Son catalizadores de las reacciones químicas presentes Son catalizadores de las reacciones químicas presentes en los sistemas biológicos.en los sistemas biológicos.

Presentan alta especificidad.Presentan alta especificidad.

Disminuyen la energía de activación dentro de una Disminuyen la energía de activación dentro de una reacción permitiendo la formación de producto.reacción permitiendo la formación de producto.

Las enzimas son de naturaleza proteíca, a excepción Las enzimas son de naturaleza proteíca, a excepción de un grupo de RNAs catalíticos (de un grupo de RNAs catalíticos (RibozimasRibozimas). ).

La actividad catalítica de las enzimas, depende de la La actividad catalítica de las enzimas, depende de la integridad de su conformación nativa, cuyos pesos integridad de su conformación nativa, cuyos pesos moleculares fluctúan entre los 12 kDa a 1.000 kDa.moleculares fluctúan entre los 12 kDa a 1.000 kDa.

Enzimas y MedicinaEnzimas y Medicina

EnzimaEnzima AlteraciónAlteración PatologíaPatología

LactasaLactasa Inhibición de su Inhibición de su síntesis síntesis

Intolerancia a la lactosaIntolerancia a la lactosa

Glucosa 6P-Glucosa 6P-DeshidrogenasaDeshidrogenasa

Diversas mutacionesDiversas mutaciones Favismo (Destrucción Favismo (Destrucción eritrocitaria)eritrocitaria)

ALT, GPTALT, GPT Aumento en los niveles Aumento en los niveles plasmáticosplasmáticos

Indicio de ataque cardíaco Indicio de ataque cardíaco o falla hepáticao falla hepática

TirosinasaTirosinasa Deficiencia en la Deficiencia en la síntesis de Melanina a síntesis de Melanina a

partir de tirosinapartir de tirosina

AlbinismoAlbinismo

Fenilalanina Fenilalanina hidroxilasahidroxilasa

Conversión de Conversión de fenilalanina a tirosinafenilalanina a tirosina

FenilcetonuriaFenilcetonuria

1897: Eduard Buchner demuestra que el extracto de levadura 1897: Eduard Buchner demuestra que el extracto de levadura puede fermentar azúcar a alcoholpuede fermentar azúcar a alcohol

1926: James Sumner aisló y cristalizó la enzima ureasa 1926: James Sumner aisló y cristalizó la enzima ureasa encontrando que era una proteína. Postula que todas las encontrando que era una proteína. Postula que todas las enzimas son proteínas.enzimas son proteínas.

1930: J.B.S Haldane sugiere en su tratado “Enzimas” que 1930: J.B.S Haldane sugiere en su tratado “Enzimas” que interacciones débiles entre la enzima y el sustrato podrían interacciones débiles entre la enzima y el sustrato podrían ser usadas para distorsionar a éste último e inducir la ser usadas para distorsionar a éste último e inducir la catálisis.catálisis.

ClasificaciónClasificación

Enzimas simplesEnzimas simples: Son aquellas que para su función : Son aquellas que para su función catalítica no necesitan catalítica no necesitan cofactorcofactor o o coenzimacoenzima..

Enzimas conjugadasEnzimas conjugadas: Enzimas que necesitan para : Enzimas que necesitan para su catálisis una su catálisis una coenzimacoenzima o o cofactorcofactor. .

Una enzima junto a su coenzima y/o cofactor se Una enzima junto a su coenzima y/o cofactor se designa como designa como holoenzimaholoenzima. La región proteíca de tal . La región proteíca de tal enzima se denomina enzima se denomina apoenzima apoenzima o o apoproteínaapoproteína. . Cuando la coenzima o ión metálico se unen Cuando la coenzima o ión metálico se unen covalentemente a la enzima, constituye un covalentemente a la enzima, constituye un grupo grupo prostéticoprostético..

IsoenzimaIsoenzima: Distinta estructura, misma función: Distinta estructura, misma función

Clasificación enzimáticaClasificación enzimática Para evitar ambiguedades la clasificación enzimática se Para evitar ambiguedades la clasificación enzimática se

basa en un código de 4 dígitos para agrupar a todas las basa en un código de 4 dígitos para agrupar a todas las enzimas.enzimas.

ATP + GlucosaATP + Glucosa ADP + Glucosa 6-PADP + Glucosa 6-P

ATP-Glucosa fosfotransferasa (2.7.1.1.)ATP-Glucosa fosfotransferasa (2.7.1.1.)

(2) Clase: Transferasa(2) Clase: Transferasa

(7) Subclase: Fosfotransferasa(7) Subclase: Fosfotransferasa

(1) Fosfotransferasa con un grupo hidroxilo como (1) Fosfotransferasa con un grupo hidroxilo como aceptoraceptor

(1) D-glucosa como aceptor del grupo fosforilo(1) D-glucosa como aceptor del grupo fosforilo

Sitio ActivoSitio Activo

Existen reacciones químicas Existen reacciones químicas intracelulares que se presentan intracelulares que se presentan en condiciones desfavorables. en condiciones desfavorables. Sin embargo las enzimas Sin embargo las enzimas solucionan el problema al solucionan el problema al proporcionar un ambiente, donde proporcionar un ambiente, donde una reacción determinada es una reacción determinada es energéticamente más favorable. energéticamente más favorable.

Binding of a substrate to an Binding of a substrate to an enzyme at the active site.enzyme at the active site.

Velocidad y equilibrio de una Velocidad y equilibrio de una reacción enzimáticareacción enzimática

E + S ES EP E + P

La función de un catalizador es aumentar la velocidad de reacción.

Los catalizadores NO modifican los equilibrios de reacción.

Cualquier reacción tal como S P, puede describirse por un diagrama de reacción coordinada.

Definiciones termodinámicas de Definiciones termodinámicas de equilibrio y velocidad de reacciónequilibrio y velocidad de reacción

Equilibrio de reacción se relaciona con Equilibrio de reacción se relaciona con ΔΔGº´ Gº´

Velocidad de reacción se relaciona con Velocidad de reacción se relaciona con ΔΔGG‡‡

Termodinámicamente la relación entre Termodinámicamente la relación entre ΔΔGº´ y Gº´ y KKeq eq puede ser descrita por la expresión:puede ser descrita por la expresión:

ΔΔGº´ = -RT ln Gº´ = -RT ln KKeqeq (R= 1,987 cal/mol (R= 1,987 cal/mol

ºK)ºK)

Definiciones termodinámicas de equilibrio y Definiciones termodinámicas de equilibrio y velocidad de reacciónvelocidad de reacción

La velocidad de una reacción es determinada La velocidad de una reacción es determinada por la concentración de los reactantes, y por una por la concentración de los reactantes, y por una constante de velocidad (constante de velocidad (kk).).

V = V = kk[S][S] Reacción de 1º órdenReacción de 1º órden

V = V = kk[S[S11][S][S22]] Reacción de 2º órdenReacción de 2º órden

La concentración de la enzima [E] es La concentración de la enzima [E] es despreciable en una reacción catlizada.despreciable en una reacción catlizada.

Pocos principios explican el poder catalítico y Pocos principios explican el poder catalítico y la especificidad de las enzimasla especificidad de las enzimas

Durante una reacción catalizada ocurren muchas Durante una reacción catalizada ocurren muchas reacciones químicasreacciones químicas entre grupos funcionales de entre grupos funcionales de S S y y EE. . Los grupos funcionales catalíticos podrían formar enlaces Los grupos funcionales catalíticos podrían formar enlaces covalentes transientescovalentes transientes o se podrían transferir algunos o se podrían transferir algunos grupos desde el S hasta E. Estas reacciones grupos desde el S hasta E. Estas reacciones disminuirían disminuirían la energía de activación de la enzima.la energía de activación de la enzima.

Gran parte del poder catalítico de las enzimas deriva de Gran parte del poder catalítico de las enzimas deriva de la energía libre liberada en la formación de múltiples la energía libre liberada en la formación de múltiples enlaces débilesenlaces débiles e e interacciones no covalentesinteracciones no covalentes entre la entre la enzima y su sustrato.enzima y su sustrato.

Pocos principios explican el poder catalítico y Pocos principios explican el poder catalítico y la especificidad de las enzimasla especificidad de las enzimas

La interacción entre E y S (Complejo [ES]) es mediada La interacción entre E y S (Complejo [ES]) es mediada por las mismas fuerzas que estabilizan la estructura de por las mismas fuerzas que estabilizan la estructura de la proteína.la proteína.

La formación de cada interacción débil en el complejo La formación de cada interacción débil en el complejo [ES] es acompañada por una pequeña [ES] es acompañada por una pequeña liberaciónliberación de de energía libreenergía libre..

El sitio activo de las enzimas El sitio activo de las enzimas nono es complementario al es complementario al sustrato per se, sino que al estado de transición en el sustrato per se, sino que al estado de transición en el cual el sustrato se convierte en producto en el curso de cual el sustrato se convierte en producto en el curso de una reacción enzimática.una reacción enzimática.

E: E: Dihidrofolato reductasaDihidrofolato reductasa

S1: S1: TetrahidrofolatoTetrahidrofolato

S2: S2: NADP+NADP+

Cinética EnzimáticaCinética Enzimática

V0= Vmax(S)

Km+(S)

Teoría de Michaelis-MentenTeoría de Michaelis-Menten

Desarrollada en 1913 explica la acción y cinética de las enzimas. Supone que E se combina con S para formar el complejo E-S, el cual se escinde para formar E + P.

La ecuación de Michaelis-Menten es la ecuación de velocidad para las reacciones catalizadas por enzimas frente a un sustrato.

Cuando la velocidad inicial es exactamente igual a la mitad de la velocidad máxima, se deduce que la concentración de sustrato es igual a la constante Km.

Concentración de sustratoConcentración de sustrato

La concentración de sustrato cambia con el La concentración de sustrato cambia con el curso de la reacción, por lo tanto es complejo curso de la reacción, por lo tanto es complejo estudiar su efecto.estudiar su efecto.

Para evitar esto se mide la velocidad inicial Para evitar esto se mide la velocidad inicial (V(V00)), , la cual se obtiene cuando el tiempo es lo la cual se obtiene cuando el tiempo es lo suficientemente corto una vez que ha suficientemente corto una vez que ha comenzado la reacción. En este tiempo se comenzado la reacción. En este tiempo se considera considera [S] constante[S] constante..

Cuando [S] no es capaz de modificar la Cuando [S] no es capaz de modificar la velocidad se dice que se alcanzó velocidad se dice que se alcanzó VVmaxmax..

Características de Km y Vmax.Características de Km y Vmax.

KKmm no tiene un valor fijo, sino que varia con la no tiene un valor fijo, sino que varia con la estructura del sustrato, con el pH y la temperatura.estructura del sustrato, con el pH y la temperatura.

Para las enzimas que poseen más de un sustrato, Para las enzimas que poseen más de un sustrato, cada uno de estos exhibe una Kcada uno de estos exhibe una Kmm característica. característica.

En condiciones intracelulares, las enzimas no se En condiciones intracelulares, las enzimas no se hallan saturadas por los sustratos.hallan saturadas por los sustratos.

La velocidad máxima (VLa velocidad máxima (Vmaxmax) varía ampliamente de ) varía ampliamente de una enzima a otra, dependiendo del sustrato, del pH y una enzima a otra, dependiendo del sustrato, del pH y la temperatura. la temperatura.

Representación de Lineweaver-Burk.Representación de Lineweaver-Burk.

Es una transformación algebraica de la ecuación de Es una transformación algebraica de la ecuación de velocidad de Michaelis-Menten. velocidad de Michaelis-Menten.

La más utilizada es la que considera los La más utilizada es la que considera los recíprocos recíprocos de ambos miembros de la ecuación de velocidad.de ambos miembros de la ecuación de velocidad.

Esta representación de Esta representación de doble recíprocodoble recíproco, permite , permite una determinación más una determinación más exacta del valor de Vexacta del valor de Vmaxmax de las de las obtenidas de los gráficos de velocidad de Michaelis-obtenidas de los gráficos de velocidad de Michaelis-Menten. Menten.

Además proporciona información acerca de la Además proporciona información acerca de la inhibición enzimática. inhibición enzimática.

Catálisis de dos o mas sustratosCatálisis de dos o mas sustratos

Ternary complexTernary complex

Ping Pong mechanismPing Pong mechanism

Efecto del pH sobre actividad Efecto del pH sobre actividad enzimáticaenzimática

Efecto de la T° sobre actividad enzimáticaEfecto de la T° sobre actividad enzimática

Mecanismos de reacción ilustran los principios: Quimiotripsina

EjerciciosEjercicios

The muscle enzyme lactate dehydrogenase The muscle enzyme lactate dehydrogenase catalyzes the reaction:catalyzes the reaction:

Piruvate + NADH + HPiruvate + NADH + H++ Lactate + NADLactate + NAD++

Solution of NADH, but not NADSolution of NADH, but not NAD++ absorb light at absorb light at 340nm. Explain how these properties of NADH can 340nm. Explain how these properties of NADH can be used to design a quantitative assay for lactate be used to design a quantitative assay for lactate dehydrogenase.dehydrogenase.

Human blood serum contains a class of enzymes known Human blood serum contains a class of enzymes known as acid phosphatases, which hydrolyze biological as acid phosphatases, which hydrolyze biological phosphate esters under slightly acidic conditions (pH phosphate esters under slightly acidic conditions (pH 5.0). Acid phosphatases are produced by erythrocytes, 5.0). Acid phosphatases are produced by erythrocytes, the liver, kidney, spleen, and prostate gland. The the liver, kidney, spleen, and prostate gland. The enzyme from prostate gland is clinically important enzyme from prostate gland is clinically important because its increased activity in the blood is frequently because its increased activity in the blood is frequently an indication of prostate cancer. The phosphatase from an indication of prostate cancer. The phosphatase from the prostate gland is strongly inhibited by tartrate ion, but the prostate gland is strongly inhibited by tartrate ion, but acid phosphatases from other tissues are not. How can acid phosphatases from other tissues are not. How can this information be used to develop a specific procedure this information be used to develop a specific procedure for measuring the activity of the acid phosphatase of the for measuring the activity of the acid phosphatase of the prostate gland in the human blood serum?prostate gland in the human blood serum?

Estimation of VEstimation of Vmaxmax and K and Kmm by inspection by inspection

[S] (M)[S] (M) VV00 ( (μμM/min)M/min)

2.5 x 102.5 x 10-6-6 2828

4.0 x 104.0 x 10-6-6 4040

1 x 101 x 10-5-5 7070

2 x 102 x 10-5-5 9595

4 x 104 x 10-5-5 112112

1 x 101 x 10-4-4 128128

2 x 102 x 10-3-3 139139

1 x 101 x 10-2-2 140140