Procesamiento de las muestras1. Orinas (debe llegar al laboratorio en contenedor estéril y ha de conservarse a 4ºC en menos de 24 horas)

[a] Agar sangre, chocolate o Cled/Cystine-Lactose-Electrolyte-Deficient (medios general y especifico para orinas) => se siembra en 3 direcciones/ cubrir totalmente la superficie (cuantitativa en Cled o AS - para contar colonias; realizar antibiograma); crecerán todo tipo de germenes: cocos Gram+, bacilos Gram-, levaduras; en Cled/AS no crecen cocos Gram- (Neisseria, Moraxella, Chlamydia); en AS se comprueba las características hemolíticas o no de las bacterias e.j. Stafilococcus aureus (B hemolítico) y en Cled, las característica lactosa (+) => amarillas o lactosa (-) sin cambio de color => azul verdosas.

[b] Agar Mac Conkey (selectivo para bacilos Gram-) => se siembra por agotamiento en cuadrantes (puede ponerse un disco de Colistina en el inoculo para ayudar a la identificación de E.coli (sensible a colistina - común en orinas); crecen bacilos Gram- => Enterobacterias y también Pseudomonas; observaremos las características de lactosa (+) => colonias rojas y lactosa (-) sin cambio de color => rosa.

[c] Agar Citrato de Simmons (solo en algunos protocolos); se siembra en la lengüeta del tubo preparado en pico de flauta; las colonias consumidoras de citrato (+) => vira a azul y las que no, permanece verde; se usa para la diferenciación de Enterobacterias (para diferenciar entre coliformes y coliformesfecales. Los coliformes fecales no fueron capaces de utilizar el citrato como fuente de carbono ni a las sales de amonio como fuente de nitrógeno. Los coliformes no fecales como Enterobacter aerogenes o Salmonella enteritidis podían utilizar el citrato en este medio dando una reacción alcalina) en base a su capacidad de utilizar el citrato (mediante citrato permeasa)

Los gérmenes mas frecuentes que podemos encontrar (en orina se identifican especies):- E. coli (el mas frecuente) => bacilo Gram-, móvil, sensible a Colistina, lactosa (+), indol (+)- Streptococcus faecalis => coco Gram+, catalasa (-), oxidasa (-).- Proteus spp (todas) => bacilo móvil Gram-, resistente a Colistina, lactosa (-), oxidasa (-), Triptófano Desaminasa/TDA (+), ureasa (+) tardío.

- Stafilococcus aureus => coco Gram+, catalasa (+), coagulasa (+), B hemolítico, oxidasa(-).- Candidas spp (todas) => morfología de levaduras (parece como hematíes)- Klebsiella spp => bacilo Gram-, inmóvil, sensible a Colistina, ureasa (+), colonias mucosas, lactosa (+), tardío.- Pseudomonas spp => bacilo Gram-, móvil, sensible a Colistina, lactosa (-), oxidasa (+)

2. Coprocultivos (contenedor especifico para coprocultivo "Cary y Blair" / bote de orina; conservada a 4ºC, procurar procesarla en <24H; se siembran por agotamiento en cuadrantes).

[a] Hecktoen o SS => medios selectivos y diferenciales donde crecerán el genero Salmonella y Shigella; en Hecktoen las Salmonellas spp => colonias lactosas (-), verdosas y pueden ser SH2 /sulfihidrogeno/ acido sulfidrico (+) con fondo negro, son bacilos móviles, sensible a Colistina; las Shigellas spp => lactosas (-) , SH2 (-), bacilos inmóviles en fresco y sensibles a Colistina; las colonias lactosas (+) en este medio serán amarillas;en SS las Salmonellas y Shigella serán el del medio (caramelo) y también con el fondo negro (Salmonellas SH+ y lactosa- ); colonias lactosa (+) => rojizas; las colonias lactosas+ no son patógenas (coliformes fecales) y no se investigan.

[b] Agar Yersinia CIN => para buscar colonias de Yersinia spp (rosa clarito - Yersinia pestis, Yersinia enterocolitica y Yersinia pseudotuberculosis.) que aparece como lactosa (+), sensible a Colistina y bacilos Gram- e móviles, fermentador de manitol. La inhibición selectiva de organismos gram negativos y gram positivos se obtiene mediante cristal violeta (inhibidor de Gram+), desoxicolato sódico (inhibidor de Gam+) y los agentes antimicrobianos: cefsulodina, Irgasan (Triclosan) y novobiocina (inhibidor de S.epidermidis).

[c] Agar Campylosel => crecerá Campylobacter spp (bacilos Gram- con flagelos) como colonias pequeñas translucidas, sensibles a Nalidixico (especies C. coli y C.jejuni) resistente a

Nalidixico el C. fetus, en fresco aparecen en coma/en S, ureasa (+) oxidasa (+) catalasa (+); al hacer la prueba del hipurato C.jejuni seran (+) y C.coli (-); P. hipurato => un procedimiento cualitativo para determinar la capacidad de las bacterias de hidrolizar enzimáticamente (hipuricasa) el hipurato sódico que da lugar a acido benzoico y glicina un compuesto de color morado.

[d] Caldo Selenito => caldo enriquecido para los géneros Salmonella y Shigella. el selenito de sodio inhibe la flora Gram+ y la mayoría de la flora entérica excepto Salmonella spp.

[e] Agar McConkey (solo en algunos protocolos) => los coliformes aparecerán como colonias rojas por ser lactosas (+); no es necesario???

[f] Agar TCBS /tiosulfato citrato bilis sacarosa (detectar Vibrio cholerae) => aparecen colonias de color amarillo sacarosa (+), oxidasa (+) y son bacilos Gram- pleomórficos; el extracto de levadura y la peptona proporcionan el nitrógeno y las vitaminas. El citrato sódico, el tiosulfato sódico, la bilis de buey y un pH alcalino fuerte inhiben los organismos Gram+ y suprimir los coliformes (inhibidor para la mayoría de las entero-bacterias), favoreciendo el crecimiento de Vibrio cholerae porque este organismo es sensible a los entornos ácidos. La alta concentración de sodio favorece el crecimiento de Vibrio cholerae que es halotolerante (tolera el medio salado) y de otras especies de Vibrio, cuya mayoría es halofílica. La sacarosa (+) es un carbohidrato fermentable, y el cloruro sódico estimula el crecimiento. El tiosulfato sódico es una fuente de azufre y actúa

con el citrato férrico como indicador para detectar la producción de ácido sulfhídrico/SH2. El azul de bromotimol y el azul de timol son indicadores de pH. En Mc, Vibrio Cholerae es lactosa (-).

3. Exudados vaginal y uretral (la muestra llegara en uno o varios escobillones; se siembra por agotamiento en cuadrantes).

[a] Agar Sangre (medio general) => buscamos Streptococcus B hemoliticos del grupo B (S.agalactiae), que aparecerán como colonias pequeñas translucidas con un halo de B hemólisis alrededor de la colonia; son cocos Gram+, catalasa y oxidasa (-), anaerobio facultativo, prueba de látex (+).

[b] Agar chocolate => buscamos Haemophilus spp como colonias muy pequeñas grisáceas que crecen bien por ser gérmenes exigentes en su crecimiento que requieren factor X y/o V (proceden de la degradación de la Hb); también podemos colocar discos de factor X y/o V y mirar el satelitismo; al fresco como coco-bacilos inmóviles, Gram-; oxidasa y catalasa variable.

[c] Agar Thayer Martin o New York => buscamos N.gonorrhoeae o N.meningitis que aparecerán como colonias de color gris; son diplococos Gram-, catalasa (+), oxidasa (+) que fermentan la glucosa pero no el resto de los azucares.

[d] Agar Gardnerella => buscamos Gardnerella vaginalis, como colonias B-hemolíticas y al fresco como bacilo pequeño, Gram variable, anaerobio facultativo, oxidasa (-) y catalasa (-). La presencia de sangre humana favorece el crecimiento de las especies estudiadas, ya que producen ß-hemólisis alrededor de las colonias. La ß-hemólisis en agar con sangre humana es altamente indicativa de presencia de G.vaginalis. Los antibióticos incluidos en el medio inhiben la mayoría de los contaminantes Gram- y de las levaduras.

[e] Vagicult o Roiron (medio liquido) => crecen levaduras (Candidas spp) y Trichomonas (protozoo unicelular flagelado).

[f] Agar Sabouraud (se puede incluir para detectar Candidas spp)

[g] Medio de detección de Micoplasmas y Chlamydias

4. Semen - la muestra llegara en contenedor estéril/ bote de orina; se siembra por agotamiento en cuadrante en medios: Cled, McConkey , Agar Sangre, Agar chocolate, Thayer Martin o New York, Roiron, y cultivo de Clamydias, buscando en cada caso los mismos gérmenes que en el caso del exudado vaginal.

5. Esputo - la muestra ha de llegar en contenedor esteril y conservarse menos de 24H a 4ºC; antes de sembrar se observa por el microscopio si la muestra es valida/ no esta contaminada por saliva; se siembra por agotamiento en cuadrantes; solo se

siembra cuando en el Gram, el cociente leucocitos/ celulas epiteliales sea > 2,5 (recuento en fresco/al microscopio); si es < a 1,5 es dudoso. Cuando sean muestras de UCI o provenientes de neumonías se siembran siempre.

[a] Agar Sangre => buscamos colonias de Streptococcus pneumoniae o Branhamella catharralis; S.pneumoniae >> colonias verdosas (alfa hemólisis) y al fresco como coco Gram+, catalasa (-), sensible a la Optoquina; Branhamella catarralis >> colonias blanco-grisáceas y al fresco como cocos Gram-, oxidasa (+), catalasa (+) que no utiliza ningún azucar (no es fermentadora), pero reduce los nitratos a nitritos/ nitratasa+ (lo que le diferencia del genero Neisseria que ademas es fermentadora de glucosa y maltosa).

[b] Agar chocolate => buscamos Haemophilus spp como colonias puntiformes translucidas, que al fresco como coco-bacilos, Gram-, catalasa y oxidasa variable; agar chocolate polyvitex (contiene factor V/ NAD y factor X /hemina procedente de la degradación de Hb)

[c] Agar McConkey => donde creceran Enterobacterias y otros bacilos Gram-.

[d] Medio de Lowestein-Jensen (o Coletsos) => para rescatar Mycobacterium tuberculosis, bacilos acido alcohol resistente (Zhiel Neelsen+) de crecimiento muy lento; los niveles bajos de la penicilina y el ácido nalidíxico también están presentes en el medio de LJ para inhibir el crecimiento de lo Gram+ y Gram-, con el fin de limitar el crecimiento de especies de micobacterias solamente. Presencia de verde malaquita en el medio inhibe las floras mayoría acompañante; que se desinfecta y se solidifica mediante un proceso de espesamiento; el Glicerol mejora el crecimiento de Mycobacterium tuberculosis.

[e] Medio Legionella => muestras de UCI; la Legionella pneumophila es bacilo Gram- (en realidad, se tiñe muy mal, aerobio exigente, movil; en general, no fermenta ni oxida los azucares, sino que utiliza los aminoacidos; es hipurato+ => un procedimiento cualitativo para determinar la capacidad de las bacterias de hidrolizar enzimáticamente (hipuricasa) el hipurato sódico; necesita L-cisteina para crecer y también iones férricos Fe. La inhibición del crecimiento de las bacterias Gram+, la mayoría de las bacterias Gram-, levaduras y mohos, a través de una combinación optimizada de 3 antibióticos. Las colonias que crecen en medio Agar Legionella y no crecen en medio AS deben considerarse, con alta probabilidad, colonias de Legionella.

6. Cepillado bronquial (la muestra vendrá en el cepillo y se conservara a 4ºC < de 24H); se siembra en los mismos medios que en el caso anterior (esputo) añadiendo ademas: agar sangre anaerobios (ASA) o medio AKV (agar sangre kanamicina-vancomicina), selectivo para bacilos Gram- anaerobios y Bacteroides (bacilo Gram-, anaerobio estricto).

7. Exudado faringeo y oral (la muestra viene en torunda, se sembrara por agotamiento en cuadrante).[a] Agar sangre => crecera todo tipo de gérmenes (medio general enriquecido)[b] Agar chocolate => crecera todo tipo de gérmenes[c] Agar Mac Conkey => creceran las Enterobacterias y otros bacilos Gram- poco exigentes.[d] Agar CNA /agar sangre (de cordero) colistina nalidixico, medio selectivo para Gram+/ inhibe los Gram- => para deteccion de Streptococcus B-hemoliticos, Enterococcus y Staphylococcus??[e] Agar Sabouraud (solo en orales) => deteccion de Candidas spp.

8. Exudados varios - abscesos heridas ... (se sembrara por agotamiento en cuadrantes. La muestra ha de llegar en tubo estéril y se conservara a 4ºC menos de 24H.[a] Agar sangre => crecerá todo tipo de gérmenes[b] Agar chocolate => idem[c] Agar Mac Conkey => crecerán las Entero-bacterias y otros bacilos Gram (-) poco exigentes.[d] Agar CNA /agar sangre (de cordero) colistina nalidixico, medio selectivo para Gram+/ inhibidor Gram- => crecerán bien los Steptococcus B-hemolíticos.[e] Agar ANA (agar sangre anaerobios/ASA, aunque también puede utilizarse agar AKV, agar sangre kanamicina y vancomicina) => medios selectivos para bacilos Gram- anaerobios (estrictos) y Bacteroides.[f] Caldo Tioglicolato => crecen bien todo tipo de bacterias aerobias o anaerobias; permite el desarrollo de una amplia

variedad de microorganismos, incluidos los nutricional-mente exigentes. Además, se observa que las bacterias estrictamente aerobias, crecen en la parte superior, mientras que las anaerobias facultativas o anaerobias estrictas crecen en las profundidades del medio.

RELACION DE LAS BACTERIAS CON EL OXIGENO EN TIOGLICOLATO En base a la relación de las bacterias con el oxígeno, estas se pueden clasificar en : 1. Aerobio estricto: Un organismo el cual requiere utilizar el oxígeno como aceptador terminal de electrones , puede tolerar un nivel del oxígeno equivalente o mayor de una atmósfera de aire (oxígeno del 21%), y tiene un tipo terminantemente respiratorio de metabolismo (Mycobacterium tuberculosis, Bacillus). 2. Anaerobio o Aerobio facultativo: Un organismo que puede crecer bien en ausencia del oxígeno y en la presencia de un nivel de oxígeno equivalente a una atmósfera del aire (oxígeno de 21%) => Enterobacterias, Vibrio spp, Haemophilus spp.. 3. Microaerofílico (anaerobio aerotolerante): Un organismo que es capaz de un crecimiento oxígeno-dependiente, pero no puede crecer en la presencia de un nivel del oxígeno equivalente a una atmósfera de aire (oxígeno de <21%) => Campylobacter fetus, Pseudomonas y Neisseria. 4. Anaerobio estricto: Un organismo que es incapaz de crecimiento oxígeno-dependiente y no puede crecer en la presencia de una concentración de oxígeno equivalente a una atmósfera de aire (oxígeno de 21% - nada de O2). (Clostridium botulinum).

5. Anaerobios aero-tolerantes: Pueden crecer con o sin oxígeno pero su metabolismo es siempre fermentativo (Lactobacillus)

9. Liquido cefalorraquídeo - se siembra por agotamiento en cuadrante del sedimento del tubo centrifugado a 1500 rpm a 3000 rpm durante 20 minutos, si en el tubo hay mas de 1 ml de muestra. Sino, vortear el tubo. La muestra se ha de procesar de inmediato y si no es posible, conservarse a 37ºC.[a] Agar sangre => buscamos Neisseria meningitidis, como

pequeñas colonias no hemolíticas y al fresco se ve como diplococos, Gram-, oxidasa (+), catalasa (+), fermentador de glucosa y maltosa (la fermentación de este azucar le diferencia del gonococo; también puede crecer Streptococcus pneumoniae (neumococo) que aparecen como colonias verdosas (Alfa hemolisis) y al fresco como cocos Gram+, catalasa (-), sensible a la optoquina.[b] Agar chocolate => ídem y ademas pueden crecer Haemophilus spp como colonias puntiformes translucidas, que al fresco aparecerá, como coco-bacilos, Gram-, catalasa y oxidasa variable.[c] Agar Thayer-Martin => medio selectivo para Neisserias, crecerán bien los meningococos /N.meningitidis.[d] Medio tioglicolato (caldo) => medios para anaerobios y aerobios.(f) Ademas se hará una extensión para Gram.

10. Otros líquidos estériles (sinovial, pleural, pericardio...) - se siembran por agotamiento; la muestra ha de llegar en tubo estéril y su conservación no se ha de demorar mas de 24H a 4ºC.

[a] Agar sangre => crecerán casi todo tipo de microorganismos, con características hemolíticas de algunos de ellos.[b] Agar chocolate => crecerán casi todo tipo de gérmenes, sobre todo exigentes.[c] Agar McConkey => crecerán Enterobacterias y otros bacilos Gram- poco exigentes.[d] Agar CNA => agar columbia colistina nalidixico (sangre de cordero), selectivo para Gram (+)[e] Agar ASA => agar sangre anaerobios selectivo para bacilos Gram- anaerobios y Bacteroides.

11. Cateteres y sondas - se siembra mediante la técnica de Maki (rodamiento del cateter)[a] Agar chocolate => crecerán casi todo tipo de gérmenes, y podrán crecer bien algunos exigentes como el Haemophillus.[b] Agar sangre => crecerán bien casi todo tipo de gérmenes y podrá verse sus características hemolíticas si las tuvieran.[c] Caldo tioglicolato => si se observa crecimiento se hará un pase por Agar chocolate.[d] También puede ponerse en una placa de agar MacConkey.

12. Hemocultivos - la muestra se introduce en el vial de hemocultivos, conservando a 37ºC en el Bactec (detecta CO2) hasta su identificación.

Tema 6 - Medios de Cultivo en bacteriología clínica (Clasificación y Preparación)

Medios de cultivo - compuesto por distintos nutrientes requeridos para cultivar gérmenes como las bacterias, hongos y parásitos según sus necesidades nutricionales de cada uno; en función de sus requerimientos, existen grandes diferencias entre los medios de cultivo que nos sirven para diferenciar cada tipo de microorganismo que podrá crecer en unos medios de cultivo y no en otros.

Función de medios cultivo:- separar y aislar distintas especies microbiales presentes en una muestra.- paso previo para el estudio de identificación de un microorganismo problema.- conocer el metabolismo en función del nutriente o sustrato que utiliza (lactosa) o metabolito que produce (indol).- estudios macroscópicos => visualizar las características de las colonias en medios sólidos.- realizar antibiogramas determinando la sensibilidad (mayor/menor) de la bacteria problema a distintos antibióticos.- pruebas de CMI (concentración minima inhibitoria)- conservar las especies microbiales o muestras.

Requerimientos energéticos y no energéticos de los medios de cultivo - fuente de energia (fuente de carbono y de nitrogeno) y fuente no energética (azufre, fósforo, iones metálicos, factores de crecimiento, f. de arranque y inhibidores) necesarios para el desarrollo (crecimiento) de cultivos microbiales; fuente de carbono => acido acetico, alcohol, citrato sódico, azucares (mono o disacáridos incluso almidón => glucosa, lactosa, maltosa), CO2 (bacterias fotosintetizantes y quimiolitotrofas); conocer el tipo de azucar utilizado => útil para su identificación bioquímica y clasificación taxonómica; fuente de nitrógeno (menos energética) => proteínas completas (gelatina - determinar actividad proteolítica/gelatinasa; extractos de carne y sales de amonio), péptidos/polipeptidos (peptonas - extractos de levadura, caseína - trípsica de caseína/triptófano => formación de indol) o aminoácidos y otros => nitratos, nitrogeno organico, amoniaco, sales de amonio, aminoacidos; conocer la fuente nitrogenada => util para clasificación taxonómica; fuente de azufre => sulfatos, tiosulfatos, aminoacidos (metionina, cisteina, tiamina); fuente de fosforo => fosfatos; iones metalico => hierro, potasio, sodio, magnesio y en concentraciones mas bajas => cinc,

manganeso, cobre, cobalto, etc;

Otros requerimientos no energéticos:Factores de crecimiento => componentes que muchas bacterias no son capaces de fabricar por si solas para su crecimiento (aminoácidos => cisteina; factor X y factor V procedente de la degradación Hb; vitaminas, bases puricas y pirimidicas); factores de arranque => sustancias que permite a la bacteria salir de su fase de latencia y comenzar su fase de crecimiento exponencial (fuentes de energía => glucosa; iones metálicos que estimula el crecimiento); factores inhibidores => componentes que bloquar el proceso metabólicos de algun microbio; muy útiles para la identificación y tipificación bioquímica de las bacterias(azida sodica => impide Gram-; antibióticos => inhibidores y destructores; colorantes la eosina azul de metileno utilizado por medio Levine; cristal violeta en medio Mac-Conkey => impide Gram+).

Condiciones que ha de cumplir un medio de cultivo:1. Una composición de nutrientes adecuada (requerimientos energéticos y no energéticos)2. Condiciones físico-químicas apropiadas:- Temperatura optima/ideal (según la especie microbiana => psicrófilas <20ºC; mesófilas 18-45ºC; termófilas > 45ºC; las bacterias patógenas del hombre 35-37ºC; fuera de estas no crecen o crecen mucho mas despacio;) e.j.: Yersinia 22ºC, Campylobacter 45ºC (los dos son gastrointestinales)- Grado de humedad (cantidad de agua que necesita para crecer)- pH adecuado es en general cercano a la neutralidad +/- 7(estabilizante de pH => buffers o tampones que facilitan el crecimiento); pH acido => Tiobacilos (cerca a 0); pH alcalino => bacilos ureasa positivo/ Proteus (en torno a 8) y Vibrio cholerae (pH 9)- Presión osmótica en general isotónia (300 miliosmoles)- Presencia o ausencia de oxigeno; la mayoría de las bacterias aerobias y anaerobias son facultativos que se desarollan bien con y sin O2; existen pocos anaerobios estrictos; bacterias microaerofílica => produce mas CO2.

Principales tipos de medios de cultivo- según su proporción de agua / su consistencia (sólidos, líquidos, caldo)- según su uso / su utilización (para aislamiento, crecimiento en general /recuento, identificacion, mantenimiento de cepas, para antibiogramas)- según su origen del que proceden (naturales, sintéticos y semi-

sintéticos, complejos)- según su presentación (deshidratados o liofilizados, sólidos en placa petri, sólidos en tubo, líquidos en tubo, semi-sólidos en tubo, doble fase en frasco o tubo).

Medios de cultivo según su proporción en agua:- Medios sólidos > 15% de agar; para aislamiento, identificación, elaboración de antibiogramas) =>1881 Koch utiliza la gelatina (inconveniente => se funde a 24oC y existen bacterias gelatinasa positiva que destruiran tal medio); posteriormente Hesse su alumno usa el agar (medio inerte).- Medios líquidos/caldos => contiene agua, fuente de carbono, sales minerales y algunos lleva factores de crecimiento, vitaminas, peptonas y aminoácidos.- Medios semisolidos => agar semi-sólidos (<5% de agar)

Medios de cultivo según su uso o utilización:- Medios para aislamiento => {a} medios enriquecidos (componentes basicos + caseina soja, triptofano para microorganismo exigente; e.j. agar sangre/chocolate {b} medios selectivos (componentes basicos + componentes que impiden el crecimiento de algún tipo bacteriano para seleccionar) e.j. medio Rothe (para aislar Streptococcus faecalis /Gram+) contiene azida sódica que impide Gram-; la mayoria de medios selectivos son también medios diferenciales {c} medios diferenciales (= medios selectivos + sustancias resalta las caracteristicas microbiales de algunas; e.j. medio Levine (contiene eosina y azul de metileno que inhibe Gram+ y algunas Gram-, facilita a las enterobacterias y lactosa (para las fermentadoras)- Medios para crecimiento en general => liquida o solida sirve para el crecimiento de la mayor parte de las bacterias (componentes basicos + sales y agua) ; e.j. el caldo comun (contiene extracto de carne, peptona, glucosa, cloruro sodico y agua); el caldo Tioglicolato.- Medios de identificación (= medios diferenciales) => sirve para clasificar taxonómica-mente el microoganismo; e.j. agua peptonada = indol positivo; caldo Stuart urea-indol = ureasa; glucosa = fermentación de glucosa (sacarolitico = sacarosa positivo).- Medios de mantenimiento de cepas => mantener las cepas vivas durante periodos de tiempo relativamente largos a temperaturas bajas para impedir su crecimiento; e.j. leche descremada congelada- Medios para antibiogramas; e.j. Proctor (antibiogramas fungicas), Mueller Hinton (a.b.bacterianas), Wilkins-Chapman (a.b. bacteriana anaerobicas).

Medios de cultivo según su origen

- Medios naturales => poco utilizados, se preparan artesanalmente, constituidos por ciertos tejidos, liquidos organicos (leche, huevo, patata, suero sanguineo)- Medios semi-sintéticos => parte de su composicion son extractos naturales (levadura, malta, patata, sagre, leche) + constituyentes sintéticos- Medios sintéticos => estructuras sintéticas mas o menos puras y químicamente definidas disueltas en agua destilada (los mas utilizados en bacteriologia y en general); contiene: fuente de carbono o azucar, fuente de nitrógeno inorgánica como iones NO-3, NH+4 o orgánica como peptona, aminoácidos, aminas, etc., compuestos minerales como oligoelementos, factores de crecimiento (vitaminas, aminoacidos, bases puricas o pirimidínicas).- Medios complejos => son los primeros que se utilizaron en bacteriología; en actualidad se uss mas en parasitología y virología; se preparan de forma compleja (tejidos animales/carne de musculo, higado, corazon, yema de huevo, azucares, pepetonas, vegetales, etc.

Medios de cultivo segun su presentacion- Medios deshidratados o liofilizados- Medios ya preparados- Medios solidos en placa Petri- Medios solidos en tubo- Medios liquidos en tubo- Medios semisolidos en tubo- Medios de doble fase en frasco

Principales medios utilizados en microbiología1. Agua peptonada (peptona en medio acuoso con pH 7 a 37ºC 24-48 horas) => determinación de la producción de indol debido a su alto contenido en triptófano; tras la adición de 5/6 gotas de reactivo Kovacs en hidróxido potásico (KOH 40%) => anillo rojo en la superficie indicara indol positivo.

2. Medio Chapman (selectivo y diferencial) => aislamiento de

Staphylococcus (halófilos) S.aureus (coagulasa+); Comp: alto contenido de cloruro sódico 75 gr (agar manitol salado); 15 gr de D-manitol (diferencial => azucar utilizado por algunos estafilococos), 25 gr de rojo fenol (indicador positivo de pH a 37ºC 24-48 horas => amarillo dorado); es orientativa, se debe completar la prueba con pruebas bioquímicas (coagulasa/latex); S.epidermidis no fermentan el manitol, por tanto el color sigue rojizo o purpureo.

3. Agar de Thayer y Martin (Agar New York City) => no permite el crecimiento de muchos microorganismos, pero si permite aislar gonococos y meningococos (Neisseria); Comp: agar chocolate/ sangre calentado + formula polyvitex (vitaminas y aminoácidos) + VCAT (vancomicina => inhibe los Gram+, colistina => inhibe los coliformes /Gram-, anfotericina => antifúngico, trimetropinsulfametroxazol => antibiótico de amplio espectro).

4. Agar chocolate Polyvitex => medio general enriquecidos donde crecen la mayoría de bacteria y Haemophyllus); Comp: agar chocolate + formula polyvitex (vitaminas y aminoácidos) incluyendo factores X (hemina) y V (NAD/ nicotinamida adenina dinucleótido) proporcionados por la hemoglobina y PolyViteX.

5. Medio base Christensen (líquidos y sólidos) => para la

prueba de la ureasa; ureasa+ de rojo => rosa; gérmenes con ureasa+ => Proteus y Helicobacter pilory

6. Medio citrato de Simmons (agar solido) => prueba de citrato (como fuente de energía) para la investigación de bacilos Gram- (la diferenciación entre coliformes y coliformes fecales. Los coliformes fecales (E.coli) no fueron capaces de utilizar el citrato como fuente de carbono ni a las sales de amonio como fuente de nitrógeno. Los coliformes no fecales como Enterobacter aerogenes o Salmonella enteritidis podían utilizar el citrato en este medio dando una reacción alcalina); Comp: citrato sódico, azul de bromotimol (indicador pH, de que el citrato esta consumido /se alcalina; verde => azul); gérmenes con citrato permeasa => Klebsiella pneumoniae, Salmonella, Enterobacter aerogenes.

7. Medio Clark y Lubs (caldo/ liquido) => para diferenciar entero-bacterias mediante prueba de Voges-Proskauer (producción de acetoína/ acetil metil carbinol => por reducción a 2,3 butanodiol o por oxidación a diacetilo); y prueba de Rojo de Metilo (acidificación del medio con pH <4,5 y cambio de color a rojo); gérmenes con VP+ => Klebsiella pneumoniae y Enterobacter aerogenes; gérmenes con RM+ => Proteus, E.coli y Salmonella.

8. Medio Cled/Cystine-Lactose-Electrolyte-Deficient (solido) => recuento e identificación de gérmenes en las vías urinarias; Comp: lactosa en alta cantidad, azul de bromotimol (indicador del consume lactosa verde => amarillo); las colonias mas frecuente => E.coli (amarilla L+), Proteus (azul L-), Klebsiella (amarilla azulada y muy mucosa (L+), Pseudomonas aeruginosa (verde L-), Streptococcus faecalis (amarilla L+), Staphylococcus aereus (amarilla L+).

9. Agar sangre (se comercializa con nombre TSA => tripticasa, soja, agar) => investigación de microorganismos hemolíticos (consume hematíes); es un medio general enriquecida; Comp: sangre de cordero (agar columbia) o caballo o ternero => estériles y desfibrinadas; alfa hemólisis/ neumococo (parcial) => halo verdoso/difuso alrededor de la colonia; beta hemólisis/ Streptococcus B-hemolítico y Staphylococcus aureus que causan anginas (total) => halo transparente; gamma hemólisis/ Pseudomona causa gastro intestinales (no hemolizar) => sin halo.

10. Medio eosina azul de metileno /EMB (Medio Levine) => selectivo y diferencial, para aislamiento de entero-bacterias Gram- (E.coli, Enterobacter, Salmonella, Shigella, Proteus, Klebsiella) Comp: alto contenido de lactosa (indicador fermentadora), eosina azul de metileno (indicador de pH y inhibidor los Gram+ y las floras de Gram- fastidiosas).

11. Medio de agar Hektoen (diferencial y selectivo) => aislamiento de entero-bacterias patógenas Gram-; Comp: sales biliares (inhibe Gram+), lactosa (indicador de L+ => amarillo/naranja) sacarosa, peptona, tiosulfato sódico y citrato férrico amoniacal (indicador de la producción SH2/H2S => puntos negro), azul de bromotimol, fuschsina ácida (indicadores de pH); en condición normal es verde => fermentacion de lactosa/acidificación => vira a amarillo/naranja (características de fermentadora L+ Escherichia, Serratia, Klebsiella, Citrobacter, Enterobacter y Vibrio cholerae); cuando se consume lactosa + peptona (se acidifican primero, y después se basifican) => verde; cuando se consume azufre/ disulfurasas+ => precipita el hierro y la colonia se vuelve negro (característica de Salmonella y Proteus vulgaris).

12. Medio Kliger o KIA (Kliger Iron Agar) => medio solido en tubo (color caramelo); muy semejante y mas utilizado es TSI (triple sugar, iron) + 10 gr de sacarosa; muy utilizado para la identificación de entero-bacterias, pruebas de la lactosa, glucosa, gas y SH2; Comp: lactosa (indicador de L+), peptonas, glucosa, citrato férrico amoniacal y tiosulfato sódico (componentes para producir SH2), rojo fenol (indicador de pH); los gérmenes productor de SH2+ => Proteus, Salmonella y Citrobacter; los productores del gas CO2+ => Salmonella y Citrobacter y E.coli.

13. Medio MacConckey (color rosa) => aislamiento e identificación de entero-bacterias Gram-/ poco exigentes; Comp: sales biliares (inhibidor Gram+), lactosa (indicador L+), cloruro sodico, rojo neutro, cristal violeta (inhibidor los cocos de Gram+); L+ (consumidor de lactosa) => rojo (E.coli y Enterobacter aerogenes), L- (no fermentador)=> Salmonella, Shigella y Pseudomonas; Gram- exigentes => Neisseria, Haemophyllus.

14. Medio Mueller Hinton (general) => para la realizacion de antibiograma por el método de Bauer-Kirby

15. Medio Ornitina Movilidad/ MIO (preparado en tubo/ semisolido) => identificación de la movilidad bacteriana (entero-bacterias), capacidad para descarboxilar la ornitina (orinitina descarboxilasa /está dada por un color púrpura/ alcalinidad del medio y la producción de indol (al añadir reactivo de Kovacs); La movilidad se demuestra por un enturbiamiento del medio o por crecimiento que difunde mas allá de la línea de inoculación; el germen que da resultado positivo de los 3 pruebas => E.coli.

16. Medio caldo F-Selenito (selectivo) => medio enriquecido con fosfato para el aislamiento de Salmonella; Comp: selenito sódico (inhibidor de flora Gram+ y Gram- excepto Salmonella); después también se hace cultivo con agar SS.

17. Medio agar S-S (color caramelo) => aislamiento de las bacterias patógenas importantes Salmonella y Shigella; Comp:

lactosa (indicador fermentadora de L), tiosulfato sódico y citrato de hierro (indicador de SH2), sales biliares y verde brillante (inhibidor bacillos Gram+), rojo neutro (indicador de pH); L+ (coliformes - E.Coli y Klebsiella) => rojas o rosadas; L- y SH2- => incoloras (típico de Shigella); L- y SH2+ con la precipitación de hierro => negro (típico de Salmonella).

18. Medio Agar XLD (agar xilosa-lisina-desoxicolato) => se utiliza para el aislamiento y diferenciación de bacilos entéricos Gram-, especialmente del género Salmonella y especialmente Shigella (entero-bacterias patógenas); Comp.: xilosa (la fermentan los entéricos menos Shigella), sacarosa y lactosa, desoxicolato de sodico (inhibe Gram+); se puede utilizar para la identificación de lactasa+, lisina descarboxilasa+ => Salmonella que alcaliniza el medio y SH2+ (tiosulfato sódico + citrato de hierro amoniacal).

19. Medio caldo Columbia => caldos para hemocultivos.

20. Medio Castañeda (caldo y solido) => búsqueda de gérmenes Brucella, Vibrios y Pasteurella en sangre (hemocultivos).

21. Medio de Lowenstein-Jensen (selectivo) => cultivo de Mycobacterium tuberculosis y otras micobacterias; Comp: fécula de patata, verde malaquita => inhibidor de la mayoría de gérmenes; la prueba se confirma con tinción de acido alcohol resistencia (Con la tinción de Ziehl-Neelsen las micobacterias se observan como bacilos de color rojo); micobacterias patógenas crecen muy lenta (+ 7 días); los niveles bajos de la penicilina y el ácido nalidíxico también están presentes en el medio de LJ para inhibir el crecimiento de Gram+ y Gram-, con el fin de limitar el crecimiento => único de micobacterias.

22. Medio Sabouraud => para el aislamiento e identificación de hongos micelares y levaduriformes.

23. Medio Sabouraud gentamicina tetrazolium => para el aislamiento e identificación de Candida (levaduriformes); La gentamicina inhibe el crecimiento de la mayoría de las bacterias Gram- y Gram+.

24. Medio Schaedler con vitamina K3 (caldo o agar solido) => para cultivo de anaerobios (estrictos y facultativos); La presencia de factores de crecimiento como el extracto de levadura, la hemina y la vitamina K3 y la adición de sangre de cordero permite el crecimiento incluso de las especies más exigentes.El agente reductor (L-cistina) y la elevada concentración de dextrosa en el medio favorecen el crecimientode especies anaerobias p.ej. Lactobacillus, Streptococcus, Clostridios y Bacteroides.

25. Medio CPS cromogénico (agar/ solido) => es un medio de aislamiento y de identificación destinado a las muestras urinarias; permite realizar (1) el recuento microbiano (método de inoculación estandarizado); (2) identificación de: Escherichia coli, Enterococcus del grupo D, KES (Klebsiella, Enterobacter, Serratia), Proteeae (Proteus, Providencia, Morganella); la concentración elevada de agar evita el crecimiento invasivo de Proteus; el medio se inocua directamente a partir de la orina,

respetando técnicas adecuadas de toma de muestras y su transporte; permite la identificacion directa de:a. E.coli => coloración espontanea (rosa a burdeos) de las colonias productores de B-glucuronidasa (B-GUR) y coloración azul revelada por el reactivo indol cuando la cepa genera triptofanasa.b. Enterococcus y KES => coloración espontanea azul-verde de las cepas que producen B-glucosidasa (B-GLU).c. Proteeae => coloración marrón revelada por el reactivo TDA cuando la cepa genera triptófano desaminasa (sin reactivo es incoloro).Modo operativo - dejar atemperar las placas a temperatura ambiente; inocular la muestra con el asa calibrada de 10ul => sumergir el asa en la orina, mantenerlo verticalmente; descargar el asa al realizar una estría sobre un radio de la placa; realizar estrías perpendiculares muy apretadas sobre toda la superficie de la placa; incubar en la estufa con la tapa hacia abajo a 37ºC en aerobiosis; se examinan los cultivos después de 24 horas de incubación.Lectura e interpretación:Recuento - estimar la concentración bacteriana comparando la densidad de las colonias presentes sobre la mitad superior de la placa con la del esquema; <1000 (negativo), entre 1000 - 100.000 (dudoso), mas de 100.000 (positivo)Identificación - observar las colonias(1) Colonias de color rosa a burdeos o translucidas con centro rosa a burdeos => presunción de E.coli; confirmar mediante una detección de indol (depositar una colonia sobre un disco de papel previamente embebido de una gota de reactivo R1 del envase ID Indol TDA) => indol+ da una coloración azul (E.coli); la ausencia de color azul (indol-) se debe proceder a la pruebas de API.(2) Colonias de color azul-verdoso y observación de cocos Gram+ mediante examen directo => Enterococcus; si no cumple esta condición, se debe proceder a las pruebas de API.(3) Colonias de color azul-verdoso y observación de bacilos Gram- mediante examen directo => grupo KES; la identificación se debe proseguir mediante pruebas bioquímicas (ureasa+ => Klebsiella; ornitina descarboxilasa+ => Enterobacter; gelatinasa+ => Serratia).(4) Colonias incoloras a marrón-anaranjado => efectuar TDA (depositar sobre algunas colonias idénticas, una gota de reactivo R2 del envase ID Indol TDA), observar la coloración después de unos 30 segundos => TDA+ da una coloración marrón +/- oscuro; efectuar indol => indol+ da color azul (Proteus, Providencia o Morganella); ausencia de coloración azul es indol- (Proteus mirabilis); TDA- da una coloración amarilla y la identificación se debe proceder a las pruebas de API.

Medio: Agua de peptona (Prueba de indol)

pH: 7,2

Esterilización: 121 oC, 20'

Distribución: Tubos de hemolisis, 2 ml

Reactivo de Kovacs (prueba de indol)

p-dimetilamino benzaldehído 5g

Alcohol amílico 75 ml

HCl concentrado 25 ml

Medio base (agua de peptona) Prueba de fermentación de azúcares

Peptona 10 g

NaCl 5 g

Púrpura de bromocresol solución alcohólica

al 1% 2,5 ml

Agua destilada 1000 ml

Carbohidrato: Lactosa 2 g

pH: 7,2

Esterilización: 112 oC, 30'

Distribución: Tubos de hemolisis con campanita Durham, 2 ml

Medio Hugh-Leifson (prueba de O/F)

Medio base 10,4 g

Peptona 2 g

NaCl 5 g

K2HPO4 0,3 g

Azul de bromotimol 0,03 g

Agar 3 g

Glucosa 10 g

Agua destilada 1000 ml

pH: 7,4

Esterilización: 112 oC, 30'

Distribución: Tubos de hemolisis, 2 ml

Medio de Clark-Lubs (rojo de metilo)

Peptona 7 g

K2HPO4 5 g

Glucosa 5 g

Agua destilada 1000 ml

pH: 7,5

Esterilización: 112 oC, 30'

Distribución: Tubos de hemolisis, 2 ml

Reactivo: Rojo de metilo

Rojo de metilo 0,2 g

Alcohol etílico 200 ml

Agua destilada 300 ml

alfa-naftol al 5% en etanol (Voges-Proskauer)

KOH al 40% en agua

Medio de Koser (citratos) Medio de Simmons (citratos)

Na2NH4PO4 1,5 g H2NH4PO4 1 g

KH2PO4 1 g K2HPO4 1 g

MgSO4 0,2 g NaCl 5 g

Citrato sódico 3 g Citrato sódico 2 g

Agua destilada 1000 ml Azul de bromotimol 0,08 g

Agar 15 g

Agua destilada 1000 ml

pH: 7,2

Esterilización: 121 oC, 20'

Distribución: tubos de hemolisis, 2 ml

Medio de cultivo (reducción de nitratos y nitritos):

Peptona 10 g

NaCl 5 g

KNO3 1 g

Agua destilada 1000 ml

pH: 7,2

Esterilización: 121 oC, 20'

Distribución: Tubos de hemolisis con campanita Durham, 2 ml

Reactivos para la detección d nitritosde nitritos

Solución de ácido sulfanílico al 0,8% en ácido acético 5 N

Solución de alfa-naftilamina al 0,5% en ácido acético 5 N

Granalla de zinc

Medio de Kligler

Peptona 20 g

Lactosa 10 g

Glucosa 1 g

NaCl 5 g

Citrato férrico amónico 0,5 g

Tiosulfato sódico 0,5 g

Rojo fenol 0,025 g

Agar 17 g

pH: 7,4

Esterilización: 112 oC, 30'

Distribución: Tubos de ensayo, 4 ml. Inclinar en pico de flauta.

Cultivo en medio de KliglerFundamento Permite un diagnóstico rápido orientativo del tipo de

enterobacteria aislado. Las enterobacterias mas patógenas no suelen fermentar (producir ácidos de) la lactosa. Se detecta la producción de ácidos (acompañada o no del desprendimiento de gases) de glucosa o lactosa y producción de SH2.

Materiales y reactivos

Medio de Kligler

Método 1- Inocular los tubos con hilo de platino: primero por picadura y a continuación una siembra en estría en la superficie inclinada. Incubar a 37 oC durante 24 horas

Resultados

(amarillo=acidez; rosa= alcalinidad; negro = SH2; fractura o desplazamiento del medio = gases)

1- Producción de ácidos de la glucosa (no de la lactosa) En la superficie del medio las enterobacterias respiran consumiendo la glucosa: Cuando la agotan (solo tiene 0.1%) consumen los péptidos y se alcaliniza el medio (lsuperficie rosa). En el fondo las enterobacterias fermentan la glucosa produciendo ácidos (fondo amarillo).

2- Producción de ácidos de la lactosa (y de la glucosa): En la superficie del medio las enterobacterias respiran utilizando la glucosa y luego la lactosa. En el fondo producen una elevada cantidad de ácidos y difunden hasta la superficie (todo el medio amarillo).3-Producción de SH2 (color negro): la bacteria ha realizado una respiración anaerobia utilizando el tiosulfato como aceptor de electrones; el tiosulfato se convierte en SH2 que con el Fe3+ origina S3Fe2 (color negro)

La imagen muestra (de izquierda a derecha):

1-cultivo lactosa -, SH2 +

2-cultivo lactosa +

3-cultivo lactosa –

4- cultivo lactosa -

Producción de ácidos de :

Lactosa Glucosa

Todo el cultivo amarillo (b)

+ +

Amarillo en el fondo y rosa en el pico de

flauta©

- +

Todo el cultivo rojo o rosa (d)

- -

Precipitado negro (a) Producción de SH2

Fractura o desplazamiento del

medio (b y c)

Producción de gases