Procedimientos invasivos para el diagn óstico de las anomalías

cromos ómicas fetales

Antoni Borrell

Hospital Clínic de Barcelona

Perspectivas de futuro del diagnóstico prenatal de las

anomalías cromosómicas fetales

Procedimientos invasivos para el diagn óstico de las anomalías

cromos ómicas fetales:

PASADO

Tasa procedimientos invasivos(REDCBarcelona 1992-2009)

16

2119 19

2527 28

3034 34

31 31

41

33 33

2826

22

56

69

64

57

63

58

70

65

70

60 59 58

71

57

51 52 53

38

8

1310 9

1618

1618

2123

1921

26

20 2016

12 12

0

10

20

30

40

50

60

70

80

92 93 94 95 96 97 98 99 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9

totalEdat 35+Edat<35

Cribra do secuencialcon interpretación independente

• ~ 8% edad materna avanzada• ~ 5% TN aumentada• ~10% screening bioquímico positivo• ~ 6% angustia• ~ 1% marcadores ecografía 20 semanas

• 30% procedimientos invasivos• 85% detección T21

Evolución AC y BC HCB

10

104

188264

316

409

501441 442 430

369 344312 318

359400

509

418491

426388 381372

411 385

1981 86

154

383

542

837 814

9581033

965921

720

815736 724

657620

531 530 560621

731661

606528

483 492 488

267

154

0

200

400

600

800

1000

80 82 84 86 88 90 92 94 96 98 0 2 4 6 8 10.

Procedimientos invasivos para el diagn óstico de las anomalías

cromos ómicas fetales:

PRESENTE

Amniocentesis

Obtención de líquido amniótico por punción transabdominal

Biopsia Corial

Obtención de vellosidades coriales por vía transcervical/transabdominal

Indicaciones

Indicación AC BC

Alto riesgo aneuploidia

- edad materna avanzada

- cribado bioquímico 2o trimestre

- cribado combinado 1r trimestre

- anomalía parental

- anomalía previa

- anomalía fetal 2t 1t

Estudios moleculares/bioquímicos

Infección fetal/amniótica

Edad gestacional

AC

< 14 s. nunca14 s. excepcionalmente15 s. si membranas coaptadas

≥ 16 s. idonea

BC

< 10 s. nunca10-14 s. TC≥ 11 s. TA

Riesgo elevado RPM y malposiciónextremidades

Nicolaides. Lancet, 1994

Asociado a defectos de reducción de extremidades e hipoplasia oromandibular

Dolk. Lancet, 1992

• Grupo y RhD

• Serologías víricas– VIH– VHB– VHC si factores de riesgo

Preprocedimiento

Evaluar riesgo-beneficioVIH: CV, HAART

VHB: HBeAg,DNA

VHC: DNA

AC mejor BC?

Lopez & Coll, Fetal Diagn Ther 2010

Técnica procedimiento : AC

– Técnica ambulatoria

– Control ecográfico:• previo a punción

• punción ecoguiada• aspiración ecoguiadaRomero et al. Obstet Gynecol 1995

– Aguja 22-20G

- Punción transplacentaria• si es el acceso más fàcil al pool de LA

VentajasAmnio -Vacutainer

• Aspiración más sencilla– no se necesita un segundo operador o

dejar la sonda ecográfica– colocación de vacutainers por auxiliar

• Menor manipulación• Mejor transporte

Borrell et al.,Prenat Diagn 2008

Técnica procedimiento BC

• Procedimiento ambulatorio

• Control ecográfico continuo

• TC– Pinza– Cánula

• TA− aguja 18-20 G− doble aguja− cánula 18G +pinza

Dolor-Anestesia subcutánea AC:

no diferencias RCOG 2010

-AC en zona más baja, más dolor

-Scores de dolor Csaba,0641 BC-TA35 AC26 BC-TC

-BC: TA más dolorosa en obesas

TC más dolorosa en nulíparasWax,09

• Gammaglobulina anti-D si RhD negativo

• VHB: IG específica (600UI) en:- HBeAg o DNA positivo- AC transplacentaria o en tercer trimestre

• Reposo 24 h.

• Dolor abdominal: AC, BC-TA

• Sangrado vaginal: BC-TC

• Riesgo de amniorrexis

• Riesgo de pérdida fetal

Postprocedimiento

AC: riesgo de pérdida fetal

Estudio Randomizado Tabor,1986

en 4606 mujeres bajo riesgo: 1% exceso (1.7% vs 0.7%)

Cochrane Review Alfirevic & Mujezinovik, 2003

5 estudios con grupo control: 0,6% exceso de pérdida

Centros con experiencia

0,13% exceso de pérdida (CI 0,07-0,20).Odibo,2007

Amniocentesis de tercer trimestretercer trimestretercer trimestretercer trimestre (Hodor, 2007’

no aumenta riesgo de RPM, DPPNI, exitus fetal, cesarea urgente

BC: Riesgo de perdida fetal

No estudios randomizados: BC vs Control

MetaanálisisAlfirevic, 2007

Cohorte Danesa: > 60000 gestantes. AC 1.4% - BC-1.9% (Tabor,2009)

Grupo control: No exceso riesgo BC. No diferencias TC vs TA (Odibo, 2008)

Randomización (US) TC (2.5%) vs. TA (2.3%) (Jackson, 1992)

AC BC

antes 14 d.

0.6 0.7

total 1.9 2.0

Pèrdida < 24 s. (Caughey,06’

AC•Comparación ginecológo-perinatólogo (Blessed,01)

0.3% vs 0.03% en 30 dias post-AC

• Comparación con la experiencia anual (Stone,04)

0.3% vs 0.03% en 30 dias post-AC segun </> 50 AC anuales

Pérdida fetal: Experiencia operador

BC40% más de riesgo de perdida fetal (OR 1,4)

según <1000 />1500 proc ( periodo de estudio 11 años)(Tabor, 2009)

Pérdida fetal Estudio randomizado HCB

• 301 BC vs. 335 AC

• Pérdida fetal espontanea hasta 1 s. post-parto :– BC 2.3% (7/301)– AC 2.4% (8/335)– by intention to treat: 2.3% vs. 2.3%– by actual treatment: 2.3% vs. 2.4%

• Pérdida fetal 2 s. post-procedimiento:– BC 1.7% (5/301)– AC 0.9% (3/335)

Borrell, 1999

RIESGO AMNIOCENTESIS: ¿0.06%?

1% vs. 0.94% hasta 24 s.

RIESGO ABORTO:

- edad materna- peso- etnicidad- pérdidas previas- diabetes mellitus- inducción ovulación- PAPP-A bajo- DV reverso- TN aumentada

No resultado en AC y BC

• RIESGO DE NO OBTENER MUESTRA (< 1%)• AC: 2 punciones blancas• BC-TC: Estenosis cervical • BC-TA: No acceso al corion

• RIESGO DE NO OBTENER UN CARIOTIPO (<1%)• AC: 0.5% fallo cultivo• BC directo: no hay cultivo

Fiabilidad de AC y BC

• FALSOS POSITIVOSAC: Pseudo/mosaicos (0.9%)BC: Resultado no conclusivo: mosaico/ anomalíaconfinada placenta (2%)

• FALSOS NEGATIVOSAC: Contaminación materna (<1%)BC directo: 0.4% pero 9/10 anomalías ecográficas

(van denBerg,06)BC directo+cultivo 0.08%

¿QF-PCR en todas las amnios ?

No es necesario, sólo sirve per avanzar el resultado

¿QF-PCR substituyendo el cariotipo ?

Quizas sí, en casos de edad materna avanzada y screening de 2 trimestre

En gemelos : ¿AC o BC?

• RIESGO DE CONFUSION DE MUESTRAS EN DC DA- AC: NO (no fluoresceina)- BC: 1% en 2 placentas adyacentes

• RIESGO DE PERDIDA FETAL

- AC: 2%2%2%2% Yukobowich,01 en 476 gemelares- BC: 1%

• PRECOCIDAD RESULTADO riesgo interrupción selectiva 1 gemelo DC:

• 5% < 16 s.• 10% 16-20 s.• 15% > 20 s.

¿Una o dos entradas ?

• DICORIALES: SI

• MONOCORIALES DIAMNIOTICOS: NO, a no ser que exista una anomalíadiscordante

• MONOCORIALES MONOAMNIOTICOS NO es posible

Conclusiones1) La edad materna no debería considerarse indicación de

procedimiento invasivo2) Los estudios genéticos y cromosómicos precisan de la

extracción de material fetal mediante un procedimiento invasivo

3) Los procedimientos invasivos comportan un cierto riesgo de pérdida fetal Indicación clara

4) La AC se realiza a partir de la semana 15, idealmente en la semana 16

5) La BC es una técnica que se realiza precozmente Ventajas

6) En manos expertas, la biopsia corial y la amniocentesis tienen similar tasa de complicaciones.

7) Un programa de cribado precoz debe disponer de un método diagnóstico precoz

Procedimientos invasivos para el diagn óstico de las anomalías

cromos ómicas fetales:

FUTURO

Dos escenarios de futuro

1. Abandono: Diagnóstico prenatal no invasivo

2. Universalización: Estudio genómico masivo

Cell-free fetal DNA (cffDNA) en circulación materna

• Descubrimiento del DNA fetal libre (cffDNA) abrió nuevas perspectivas

• 1947: hallazgo DNA extracelular

• 1977: aumento DNA libre en pacientes cancer

• 1997: secuencias del cromosoma Y en sangrede gestantes portadoras de fetos masculinos(Lo,97)

Caracteristícas cffDNA/RNA

• Cuantificación cffDNA en plasma:– 3% en segundo trimestre– 6% en tercer trimestre– 10% estimaciones más recientes en T21

• Persistencia cffDNA: eliminación en 2h post-parto en 7/8 gestants y en todas en 2 d. (Lo,99). Vida media 16 min.

• Presencia RNA específico de la placenta (ZFY) en plasma materno (Poo,00).

Diagnóstico Prenatal no invasivo

Al haber mucho más DNA librematerno que fetal, sólo es factible identificar las secuencias de origen paterno ausentes en la madre:

1) determinación sexo: cromosoma Y

2) RhD en gestantes RhD negativas3) mutaciones paternas

DPNI aneuploidías

1) Selección ácidos nucleicosespecíficos fetales:

- mRNA: “RNA-SNP allelic ratio”- DNA metilado: “epigenetic allelic ratio”

2) Dosificación cromosómica relativa- Massively Parallel Sequencing (MPS)

RNA Allelic Ratio

• Localización selectiva ácidos nucleicosfetales:– DNA: gen maspin (c18) imprintado en madre

y no metilado en placenta– RNA: transcrits PLAC4 (c21): cffRNA de un

gen que sólo se expresa en la placenta

• Dosificación cromosómica– “Allelic ratio”: analisis de unos locus

heterozigotos de SNPs (diferencia únicooligonucleotido entre genomas paterno y materno) localizados en el gen estudiado.

Normal

Fetus(heterozygote)

Down

syndrome

Fetus(heterozygote)

1. Transcribed SNP

locus on 21st

chromosome

2. RNA expressed

in placenta

3. Circulating

placental RNA in

maternal plasma

transcription release into circulation

G

A

A

G

G

4. Measure

G/A ratio

1:1

2:1

Testing strategy for Down syndromeheterozygous on one SNP (Lo YMD et al., 2007)

Normal

Fetus(heterozygote)

Down

syndrome

Fetus(heterozygote)

1. Transcribed SNP

locus on 21st

chromosome

2. RNA expressed

in placenta

3. Circulating

placental RNA in

maternal plasma

transcription release into circulation

G

A

A

G

4. Measure

G/A ratio

1:1

1:2

Testing strategy for Down syndromeheterozygous on one SNP – 1:2 (Lo YMD et al., 2007)

A

Normal

Fetus(homozygous)

Down

syndrome

Fetus(homozygous)

1. Transcribed SNP

locus on 21st

chromosome

2. RNA expressed

in placenta

3. Circulating

placental RNA in

maternal plasma

transcription release into circulation

A

A

4. Measure

G/A ratio

?

?

Testing strategy for Down syndromehomozygous on one SNP (Lo YMD et al., 2007)

A

A

A

The RNA Study(RNA-based Non-invasive testing for Aneuploidy)

Jacob A. Canick & Glenn E. Palomaki

Co- Principal InvestigatorsWomen & Infants Hospital

Alpert Medical School of Brown University

An independent observational study funded by Sequenom, Inc.

BROWNBROWNBROWNBROWNWomen & InfantsWomen & InfantsWomen & InfantsWomen & Infants

V4.1

• Regiones diferentementemetiladas (DMR) en el cromosoma 21

• Enriquecimiento de regioneshipermetiladas (DMR) del cromosoma 21 fetal

• Analisis discriminante muestra8 DMR útiles

The Concept

Relative amount of chromosome 21Normal Mother Normal Fetus

18 copies + 2 copies20 copies

18 copies + 3 copies21 copies

Relative amount of chromosome 21Normal Mother Down syndrome

Fetus

Need to distinguish 21 copies from 20 copies, a 5% difference.(assumes 10% of ccfDNA is fetal)

But fetal and maternal DNA are not distinguishable in MPS

Relative amount of chromosome 21

18 copies + 2 copies20 copies

18 copies + 3 copies21 copies

Relative amount of chromosome 21

Need to distinguish 21 copies from 20 copies, a 5% difference.(assumes 10% of ccfDNA is fetal)

Schematic illustration of the procedural framework for using massively parallel genomic sequencing for the nonin vasive

prenatal detection of fetal chromosomal aneuploidy.

Chiu R W K et al. PNAS 2008;105:20458

Schematic illustration (cont)

Chiu R W K et al. PNAS 2008;105:20458

%chr21 = 1 / 51 = 2%

Chiu R W K et al. PNAS 2008;105:20458

Schematic illustration (cont)

`

2.012.001.982.022.031.99------2.01 (sd=0.02)

2.11(2.11 – 2.01)

Z = ---------------- = 5.0 0.02

Percent unique reads and corresponding z-score for chromosome 21, on 28 maternal plasma samples

Chiu R W K et al. PNAS 2008;105:20458

% of all unique reads

Z-score

Black genomic representationBlue normal male

Orange normal femaleGreen T21 maleRed T21 female

Normal range

• ¿Cuando estará a punto?

• ¿Screening o diagnóstico?

• ¿Sólo para T21?

Consideraciones finales DPNI

Alteraciones DNA

• A. genómica: anomalía cromosómicanumérica

Alteraciones DNA

• A. genómica: anomalía cromosómicanumérica

• A. cromosómica: anomalía cromosómicaestructural

Síndromes microdelecionals

Alteraciones DNA

• A. genómica: anomalía cromosómicanumérica

• A. cromosómica: anomalía cromosómicaestructural

• A. génica: cambio de un par de bases

Resolución técnicas de citogenética

CGH-array10Kb-1Mb

CITOGENETICA CONVENCIONAL

~10 Mb

CITOGENETICAMOLECULAR

FISH~130 Kb

(sonda-específica)

3.000 Mb

CGH-array

CGH-array

CGH-array

CGH-array

CGH-array

¿Procedimentos invasivos?

1) ABANDONO: El DPNI de la trisomia 21 fetal está en fase de estudio y sufuturo inmediato dependerá en gran medida de los resultados de los proyectos en marcha basados en MPS.

2) UNIVERSALIZACIÓN: es una posibilidad futura, cuando un estudio exhaustivo de anomalías genéticasno comporte ni tantas dudas en suinterpretación (CNV), ni unos costos tan altos.