EDUCACIN CONTINUADA EN EL LABORATORIO CLNICO

Ed Cont Lab Cln 2004;7: 38-43 PROCALCITONINA Y MARCADORES DE INFECCIN Cristina Prat Aymerich y Jose Domnguez Bentez Servicio de Microbiologa, Hospital Universitari Germans Trias i Pujol, Badalona. INTRODUCCIN La respuesta inflamatoria consiste en la activacin del sistema de protenas de fase aguda en respuesta a un estmulo que acta sobre clulas del sistema retculo-endotelial dando lugar, bsicamente, a la liberacin de citocinas. Cuando el estmulo que desencadena la respuesta inflamatoria es un microorganismo causante de infeccin se elevan mltiples magnitudes, pero muy pocas diferencian infeccin bacteriana aguda de otros tipos de infeccin, como la vrica, as como de respuesta inflamatoria de origen no infeccioso. El diagnstico de seguridad de la sepsis bacteriana es microbiolgico, mediante el aislamiento del agente etiolgico en el hemocultivo o en cultivos de muestras del foco de la sepsis, o bien la deteccin de antgenos o anticuerpos por mtodos inmunolgicos. Algunos mtodos rpidos permitirn el diagnstico inmediato, como la tincin de Gram de muestras del foco infeccioso (por ejemplo, lquidos cefalorraqudeo, pleural o asctico), o bien la deteccin de antgenos en fluidos biolgicos, o la deteccin de anticuerpos mediante mtodos serolgicos rpidos. Sin embargo, en un gran nmero de casos los resultados no sern inmediatos, dado que no siempre es posible conseguir muestras adecuadas del foco de la sepsis y las tcnicas de aislamiento requieren un procesamiento y un tiempo de incubacin. Adems, no siempre es posible llegar a un diagnstico etiolgico; los hemocultivos negativos no excluyen la sepsis bacteriana dado que frecuentemente el paciente ha recibido antibiotico-terapia previa y determinadas infecciones (por ejemplo, las neumonas) son bacterimicas slo en un bajo porcentaje. As, ante la sospecha de sepsis bacteriana, el diagnstico se basa inicialmente en los datos clnicos (sntomas y signos generales y propios del foco de la infeccin) y en pruebas de laboratorio: recuento de leucocitos y de neutrfilos, fibringeno, velocidad de sedimentacin globular y protena C reactiva Sin embargo, hay muchas situaciones en las que esta informacin es insuficiente. Las mani-festaciones clnicas, as como las magnitudes

analticas, especialmente el recuento leucocitario, se ven modificados o ausentes en individuos inmunodeprimidos (neutropnicos, trasplantados, infectados por el virus de la inmunodeficiencia humana, cirrticos, en tratamiento con gluco-corticoides, etc.) o son de difcil interpretacin en determinados grupos de edad, como nios o ancianos, as como en aquellos enfermos que ya presentan un grado de respuesta inflamatoria basal no secundaria a infeccin (post-operados, quemados, enfermos con distress respiratorio o con procesos inflamatorios crnicos, como enfermedad inflamatoria intestinal o artritis reumatoide, etc.). REACTANTES DE FASE AGUDA Los reactantes de fase aguda son aquellos que se liberan en respuesta al inicio de una infeccin o dao tisular. Son componentes del complemento, protenas de la coagulacin y fibringeno. Su sntesis est modulada por citocinas, fundamen-talmente interleucina-1, interleucina-6, interleucina-8 y factor de necrosis tumoral-. Son magnitudes inespecficas, dado que pueden elevarse en respuesta a cualquier tipo de estmulo inflamatorio: enfermedades autoinmunes, neoplasias, situaciones de estrs tales como traumatismos, quemaduras, intervenciones quirrgicas, etc. Adems, cuando se elevan en respuesta a la infeccin, no son especficos de etiologa bacteriana con repercusin sistmica, sino que aumentan tambin en infecciones de etiologa vrica o en infecciones localizadas. En ocasiones pueden ser incluso detectables en individuos sanos. As pues, los reactantes de fase aguda ms frecuentemente medidos ante la sospecha de infeccin presentan una serie de limitaciones. La protena C reactiva en plasma es la magnitud ms utilizada. Es un marcador muy sensible de inflamacin. Su mecanismo de accin es la unin a la fosforilcolina de la membrana de las bacterias, con la funcin de opsonizacin y activacin del complemento. La protena C reactiva aumenta en la respuesta inflamatoria aguda, incluyendo infecciones vricas y bacterianas localizadas, siendo el parmetro ms til en estos casos, as como en inflamaciones crnicas, como la artritis

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reumatoide, utilizndose como marcador de actividad. Los procedimientos de determinacin son sencillos, pero la vida media de la protena C reactiva es larga, y puede mantenerse elevada incluso das despus de finalizado el proceso inflamatorio, presentando limitaciones para la monitorizacin teraputica y pronstica a corto plazo. La velocidad de sedimentacin globular es tambin un marcador utilizado con frecuencia, como una medida indirecta de las alteraciones en la concentracin del fibringeno que influyen en la agregacin eritrocitaria. Se eleva ms lentamente que la protena C reactiva y puede tardar semanas en recuperar los valores de referencia. Se utiliza como indicador de actividad en procesos inflamatorios crnicos, pero no necesariamente como consecuencia de infeccin. Puede dar lugar a resultados falsos positivos y falsos negativos cuando existe anemia, policitemia u otras alteraciones en la serie eritrocitaria. Las interleucinas -1, -6 y -8 y el factor de necrosis tumoral- son marcadores ms especficos de respuesta inflamatoria sistmica, pero pueden aumentar tambin en respuesta a estmulos inespecficos. Por ejemplo, se produce liberacin del factor de necrosis tumoral- en las lisis tumorales espontneas o en las producidas por quimioterapia, en la rabdomiolisis aguda, en lesiones del sistema nervioso central, cuadros de hipertona muscular, etc. Su vida media en plasma es muy corta (picos mximos entre 90 y 180 minutos despus de la accin del estmulo) y se producen grandes variaciones en su concentracin por una rpida down regulation. Son protenas muy poco estables in vivo por lo que los procedimientos de laboratorio para su determinacin son ms complejos. En ocasiones, las concentraciones de interleucinas son ms elevadas en otros compartimentos corporales (lquido pleural, fluido broncoalveolar, lquido cefalorraqudeo, etc) que en suero. La neopterina, recientemente descrita, es liberada por los macrfagos con la activacin de la inmunidad celular. As, la concentracin de neopterina est elevada en respuesta a infecciones por virus, protozoos y bacterias intracelulares. No se eleva en respuesta a infecciones causadas por bacterias extracelulares. As, es til, en general, en la diferenciacin de infecciones bacterianas y vricas. Es tambin un indicador de complicaciones inmunolgicas en pacientes trasplantados. Puede medirse por procedimientos de enzimoinmunoanlisis y radioinmunoanlisis.

Frente a las limitaciones de los marcadores de infeccin habituales, la procalcitonina se muestra como una magnitud sensible y especfica para el diagnstico de infeccin bacteriana sistmica. PROCALCITONINA Sntesis y funcin Desde su descripcin en 1993, mltiples estudios han demostrado la utilidad de la procalcitonina como marcador especfico de infeccin bacteriana sistmica. La procalcitonina es un pptido de 116 aminocidos, precursor de la calcitonina. Procede del gen CALC-I que da lugar, por splicing alternativo, al CGRP (calcitonin gene related peptide) en clulas del sistema nervioso central, y a la pre-pro-calcitonina en las clulas C del tejido tiroideo. As pues, la procalcitonina, procedente de la escisin de la pre-pro-calcitonina se sintetiza, en condiciones normales, en las clulas C de la glndula tiroides, para dar lugar a la calcitonina hormonalmente activa, la catacalcina y el segmento N-terminal (Figura 1). Sin embargo, en las infecciones severas es capaz de sintetizarse en tejidos extratiroideos, presumiblemente en clulas del sistema mononuclear fagoctico. En condiciones experimentales, se ha observado su sntesis bajo el estmulo de la endotoxina bacteriana, concretamente el fragmento lipo-polisacrido. En estas circunstancias, las citocinas inflamatorias como el factor de necrosis tumoral- y la interleucina-6 alteraran el triage del aparato de Golgi y daran preferencia a la sntesis de precursores de la calcitonina de alta masa molar. As, durante las infecciones severas se liberan otros precursores de la calcitonina, pero la procalcitonina es el principal. La cintica de la procalcitonina consiste en una induccin muy rpida en respuesta a un estmulo, dentro de las primeras 2-6 horas; despus de un incremento inicial, los valores dependen del balance entre su vida media en plasma (aproximadamente 25-30 horas) y la nueva produccin de procalcitonina . La funcin de la procalcitonina durante la sepsis y las infecciones severas es an objeto de estudio. Se ha planteado la hiptesis de un posible papel en el metabolismo del fsforo y del calcio, como la hormona a la que da lugar cuando se sintetiza en condiciones normales, pero parece ms probable su intervencin como mecanismo regulador en la sntesis de xido ntrico, responsable de la hipotensin durante la sepsis.

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Figura 1. Estructura de la procalcitonina. Procedimientos de medida La procalcitonina tiene una vida media en plasma de 25-30 horas y es muy estable in vivo e in vitro, permitiendo su medicin en suero o plasma mediante procedimientos sencillos. Actualmente existen dos ensayos cuantitativos: inmuno-luminomtrico e inmunofluorescente automa-tizado, y uno semicuantitativo por inmuno-cromatografa. La tcnica inmunoluminomtrica permite la cuantificacin de la procalcitonina en suero. Se trata de una reaccin enzimtica tipo sndwich, que consta de una fase slida con un anticuerpo monoclonal contra el fragmento catacalcina de la procalcitonina, donde se aade la muestra de suero y, posteriormente, anticuerpos mono-clonales contra el fragmento calcitonina marcados con un derivado de acridina (Figura 2). Se realiza una incubacin de 1 hora y, posteriormente, lavados sucesivos y lectura de la luminescencia mediante un luminmetro, que permite medir las unidades relativas de luz (RLUs) que son directamente proporcionales a la concentracin de procalcitonina de las muestras. La tcnica inmunofluorescente automatizada est basada en la tecnologa TRACE (Time-Resolved Amplified Cryptate Emission). Consiste en la transferencia no radiante de energa desde un donante (criptato) hasta un aceptante (XL 665), ambos marcadores fluorescentes. El inmuno-anlisis consta de anticuerpos policlonales contra la calcitonina conjugados con criptato, y de anticuerpos monoclonales contra la catacalcina conjugados con XL 665. Las molculas de procalcitonina presentes en la muestra se insertan entre los antic rpos formando un inmuno-

complejo. Cuando la muestra a medir es excitada, el criptato emite una seal fluorescente de vida larga a 620 nm, mientras el XL 665 emite una seal de vida corta a 665 nm. Cuando ambos componentes se encuentran unidos a un inmunocomplejo, se amplifica la seal de la fluorescencia emitida por el criptato como donante por el hecho de estar prximo al aceptante (XL 665) y ocurre tambin a 665 nm. Esta seal de vida larga emitida por el inmunocomplejo es proporcional a la concentracin de procalcitonina en la muestra. La tcnica inmunocromatogrfica usa un anticuerpo monoclonal contra la catacalcina conjugado con oro coloidal, y un anticuerpo policlonal contra la calcitonina fijado a la fase slida. Cuando la muestra de suero se aplica sobre la tira, el trazador se une a la procalcitonina, y se forma un complejo antgeno-anticuerpo marcado. Este complejo se desplaza por capilaridad, pasando a travs del rea conteniendo la banda del test, donde se une a los anticuerpos contra la calcitonina fijados y se forma un complejo sndwich. Cuando la concentracin de procalcitonina es mayor de 0,5 ng/mL, este complejo puede observarse como una banda coloreada. La intensidad de la banda es directamente proporcional a la concentracin de procalcitonina en la muestra. Los resultados se expresan en un rango de valores de < 0,5, > 0,5, > 2 y > 10 ng/mL. El trazador que no se ha unido difunde hasta la zona de la banda control, donde se fija produciendo una banda coloreada, que ser utilizada para evaluar la fiabilidad del test. Diferentes evaluaciones han mostrado una buena correlacin entre el procedimiento semicuantitativo y los cuantitativos.

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Figura 2. Fundamento del test inmunoluminomtrico. Indicaciones y limitaciones Se han descrito mltiples aplicaciones de la procalcitonina como marcador de infeccin sistmica bacteriana. Su utilidad en infecciones fngicas o parasitarias es ms controvertida. Las principales indicaciones consisten, en general, en distinguir la respuesta inflamatoria debida a la infeccin bacteriana sistmica de la vrica, la infeccin bacteriana localizada y la reaccin inflamatoria a estmulos no infecciosos. La procalcitonina resulta especialmente til en situaciones en que las manifestaciones clnicas son ms inespecficas, como es el caso de edades extremas (nios y ancianos), inmuno-deprimidos y pacientes que ya presentan una respuesta inflamatoria basal no secundaria a infeccin (post-quirrgicos, traumatismos, quemaduras, distress respiratorio, neoplasias, etc.). La determinacin de procalcitonina es, pues, especialmente til en las siguientes situaciones: 1. Diagnstico de infeccin bacteriana con

inflamacin sistmica: - infeccin bacteriana sistmica versus

localizada (por ejemplo, pielonefritis y cistitis), - infeccin bacteriana sistmica versus vrica

(por ejemplo, meningitis bacteriana y vrica), - inflamacin de origen bacteriano o no

bacteriano en pacientes con respuesta inflamatoria alterada: nios y ancianos, pacientes inmunodeprimidos (por ejemplo, infeccin y rechazo agudo en paciente

trasplantado) y pacientes crticos (por ejemplo, infeccin en paciente post-operado).

2. Control del tratamiento y seguimiento de las infecciones bacterianas: Una respuesta adecuada al tratamiento antibitico producir un rpido descenso en la concentracin de procalcitonina, teniendo en cuenta su vida media en plasma de 25-30 horas. Si la concentracin de procalcitonina se mantiene incrementada es indicativo de mal pronstico. As pues, es til en la monitorizacin de enfermos crticos.

Cabe destacar como sus principales limitaciones: Su concentracin no aumenta, o slo discretamente, cuando se trata de una infeccin confinada a un rgano o sin manifestaciones sistmicas, siendo poco til en este tipo de infecciones, en las que la protena C reactiva aportar ms informacin. Tampoco es til en la monitorizacin de infecciones vricas ni de enfermedades inflamatorias crnicas. Su concentracin disminuye en suero cuando el tratamiento es adecuado, pero esto no indica erradicacin de la infeccin, nicamente que la respuesta sptica parece estar bajo control. Interpretacin de los resultados La medicin de procalcitonina pretende aportar rapidez a la toma de decisiones diagnsticas y teraputicas, pero nunca sustituir a la impresin clnica ni a los resultados microbiolgicos. Usando los valores discriminantes del procedimiento semicuantitativo como referencia, a pesar de que es discutible si otros valores podran resultar ms adecuados, se pueden interpretar los resultados de la siguiente manera: < 0,5 ng/mL: Individuos sanos, procesos inflamatorios crnicos, infecciones vricas e infecciones bacterianas localizadas. La presencia de sepsis, sepsis severa o shock sptico son improbables. 0,5 - 2 ng/mL: Infecciones vricas e infecciones bacterianas localizadas. La presencia de sepsis severa o shock sptico son improbables, pero la sepsis es posible. 2 - 10 ng/mL: Infeccin bacteriana sistmica (sepsis) muy probable. Se aconseja iniciar tratamiento antibitico.

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> 10 ng/mL: Sepsis severa o shock sptico muy probables, existe riesgo de desarrollar fallo multiorgnico. Es necesario iniciar tratamiento especfico. CONCLUSIONES La medicin de procalcitonina en suero es una magnitud til para el diagnstico de infeccin bacteriana sistmica. Presenta mayor sensibilidad y mayor especificidad diagnsticas que otros marcadores como la protena C reactiva o la velocidad de sedimentacin globular, ya que no se eleva de forma inespecfica en respuesta a infecciones vricas, infecciones bacterianas localizadas o reacciones inflamatorias de origen no infeccioso. Por el hecho de tratarse de un marcador de infeccin y no de diagnstico, los resultados deben ser interpretados con precaucin. En general, las infecciones bacterianas severas (sepsis severa o shock sptico) suelen presentar valores > 10 ng/mL, y, en estos casos, es prcti-camente incuestionable otra etiologa de la respuesta inflamatoria que no sea la infeccin bacteriana. Resultados entre 2 y 10 ng/mL prcticamente aseguran la existencia de infeccin bacteriana y se aconseja iniciar antibioterapia despus de la obtencin de muestras para el

diagnstico microbiolgico. Los resultados entre 0,5 y 2 ng/mL deben interpretarse con gran cautela: buscar el foco de infeccin localizada o pensar en una infeccin vrica, pero no excluir la posibilidad de sepsis bacteriana. Teniendo en cuenta la cintica de la procalcitonina, una segunda determinacin a las 12-24 horas puede resultar muy til. Resultados claramente negativos, < 0,5 ng/mL, hacen altamente improbable la infeccin bacteriana, pero son posibles las infecciones vricas. Si la sospecha clnica es alta o el proceso infeccioso se encuentra en una fase muy inicial, las mediciones seriadas pueden ser de utilidad en espera de los resultados microbiolgicos. La determinacin de procalcitonina est especialmente indicada en el diagnstico de infeccin bacteriana sistmica en pacientes con respuesta inflamatoria alterada: nios, ancianos, pacientes inmunodeprimidos y pacientes crticos. Una vez diagnosticada la infeccin bacteriana sistmica, la procalcitonina puede resultar til en la monitorizacin de la respuesta al tratamiento antibitico instaurado, as como para valorar la necesidad de tratamientos adyuvantes.

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