1

PROBIOTIKÁ A NATURÁLNE LÁTKY V CHOVE HOSPODÁRSKYCH ZVIERAT

Univerzita veterinárskeho lekárstva a farmácie

Košice, 2010

2

Univerzita veterinárskeho lekárstva a farmácie

Probiotiká a naturálne látky v chove hospodárskych zvierat

MVDr. Radomíra Nemcová, PhD., MVDr. Soňa Gancarčíková, PhD., MVDr. Dagmar Mudroňová,PhD., MVDr. Jana Koščová, MVDr. Viktor Buleca

Odborný materiál pre vzdelávanie praktických veterinárnych lekárov a farmárov pripravený v rámci projektu SK0021 Biotechnologické a naturálne produkty pre zdravie ošípaných – kvalitné a bezpečné potraviny spolufinancovaného z EEA finančného mechanizmu, nórskeho finančného mechanizmu a štátneho rozpočtu Slovenskej republiky.

Košice, 2010

ISBN 978-80-8077-185-0

3

OBSAH

1. História objavu probiotík a ich význam 5

2. Definícia probiotík 6

3. Probiotiká a ich mechanizmus účinku 7

3.1. Inhibičný vplyv na patogénne mikroorganizmy 7

3.1.1. Kompetícia o receptory na črevnej sliznici 7

3.1.2. Mechanizmus adherencie u LAB 8

3.1.3. Kompetícia a živiny 9

3.1.4. Produkcia antibakteriálnych látok 9

3.2. Stimulácia imunity

3.3. Vplyv na tráviace procesy a metabolizmus

9

10

4. Bezpečnosť probiotík 11

5. Východiská a možnosti zvyšovania účinnosti probiotík 12

6. Kombinácia probiotík so synergicky pôsobiacimi zložkami prírodného pôvodu 14

6.1. Synbiotiká a potencované probiotiká 14

6.2. Probiotiká a fytokomponenty 15

6.3. Probiotiká a nešpecifické substráty 16

6.4. Probiotiká a metabolity mikroorganizmov 17

6.5. Probiotiká a polynenasýtené mastné kyseliny 18

6.6. Probiotiká a vakcíny 19

6.7. Probiotiká a stopové prvky 20

7. Nové poznatky získané pri štúdiu účinku probiotických baktérií a naturálnych

látok na moduláciu biologických bariér tráviaceho traktu zvierat

21

7.1. Vplyv aplikácie laktobacilov a fruktooligosacharidov na inhibíciu salmonel

v tráviacom trakte kurčiat

21

7.2. Vplyv zlúčenín zinku na inhibičnú aktivitu laktobacilov voči črevným patogénnym

baktériám

23

7.3. Sledovanie inhibičnej aktivity rastlinných esenciálnych olejov (EO) voči črevným

baktériám a vplyvu kombinácie laktobacilov a EO na inhibíciu salmonel

26

7.4.Sledovanie adherenčnej schopnosti laktobacilov na črevnú mukózu prasiat 29

7.5.Vplyv krátkodobej a kontinuálnej aplikácie laktobacilov na inhibíciu E. coli K88

v tráviacom trakte prasiat

29

7.6.Efekt aplikácie Lactobacillus casei a fruktooligosacharidov na počty fekálnych

baktérií, koncentráciu fekálnych organických kyselín a imunitný systém odstavčiat

30

4

7.7.Vplyv oligosacharidov na inhibičnú aktivitu laktobacilov voči patogénnym E. coli

K88

7.8. Vplyv aplikácie laktobacilov a oligosacharidov na vybrané biochemické,

mikrobiologické a produkčné parametre odstavčiat

32

35

7.9. Efekt aplikácie laktobacilov a oligosacharidov na zdravotné ukazovatele u prasiat 28

7.10. Vplyv polynenasýtených mastných kyselín (PNMK) na adherenčnú schopnosť

Lactobacillus casei a efekt kombinovanej aplikácie Lactobacillus casei a PNMK na

vybrané parametre črevného metabolizmu a imunitný systém gnotobiotických ciciakov

39

7.11. Vplyv probiotických kmeňov Lact. plantarum BIOCENOL TM LP96 a Lact.

fermentum BIOCENOL TM LF99 (probiotický syr) a ľanového semena na

mikrobiologické, biochemicko-enzymatické, morfologické a imunologické parametre

u odstavčiat

41

8. Záver

43

5

1. História objavu probiotík a ich význam

V dnešnej dobe existuje množstvo informácií o význame probiotík pre zdravie ľudí a zvierat. Súvisí to s

poznaním, že živé organizmy, sú ovplyvňované rôznymi baktériami nielen negatívne, ale aj pozitívne a dokonca

môžu zohrávať dôležitú úlohu pri normálnej funkcii slizničnej imunity. Prvá zmienka o prospešnosti probiotík je

už v perzskej verzii Starého zákona (Genesis18:8): „Abrahám vďačil svojej dlhovekosti za to, že konzumoval

kysané mlieko“. Rímsky historik Plínius (76 BC) odporúčal pitie fermentovaného mlieka pri liečbe

gastroenteritídy. Vedecký dôkaz o tom, že tzv. správne baktérie v potravinách môžu pozitívne ovplyvniť zdravie,

podal nositeľ Nobelovej ceny za medicínu za rok 1908 I. I. Mečnikov. Predpokladal, že dôvodom dlhovekosti v

niektorých populáciách je diéta, ktorá obsahuje predovšetkým veľké množstvá fermentovaného mlieka, ktoré je

konzumované či už vo forme jogurtu, kefíru alebo kumysu. Poukázal na to, že proces starnutia je spôsobený

činnosťou toxínov, ktoré produkuje patogénna črevná flóra; z toho vyplynul jasný záver, že zmenou črevnej

flóry pravidelným požívaním probiotických produktov sa v čreve počet baktérií produkujúcich toxíny redukuje,

čo následne pozitívne ovplyvňuje proces starnutia. Identifikoval mliečne baktérie, ktoré nazval bulharský bacil

a označil ich za „pôvodcu“ dlhovekosti ľudí. Prvé terapeutické pokusy využitia pozitívnych baktérií sú spojené s

vojenským chirurgom Dr. Alfrédom Nissle. V roku 1916 publikoval prácu, v ktorej popísal baktériu E. coli

(izolovanú zo stolice vojaka, ktorý nemal žiadne gastrointestinálne problémy v prostredí prebiehajúcej

salmonelovej infekcie na fronte). Tento kmeň sa zachoval a bol po objaviteľovi pomenovaný (E. coli Nissle

1917). Objavom Mečnikova a Alfréda Nissleho však dlhé roky nebola venovaná pozornosť. Súviselo to aj s

faktom, že proti najčastejším pôvodcom infekčných ochorení, boli objavené antibiotiká. Význam probiotík pri

prevencii alebo liečbe infekcií narástol až poznaním, že antibiotiká, síce zabíjajú rôzne baktérie, ale za cenu

narušenia mikrobiologickej rovnováhy na slizniciach a povrchu tela, o ktorej vieme, že je dôležitým faktorom

normálnej funkcie lokálnej imunity. Časté používanie antibiotík vo výžive a medicíne je aj spojené s

nebezpečenstvom rezistencie a rezíduí. Reziduá niektorých antibiotík môžu pri dlhodobom používaní ovplyvniť

zdravie ľudí a zvierat, ale najväčším rizikom je, že dochádza k navodeniu rezistencie voči antibiotikám, ktoré sú

nenahraditeľné v liečbe ľudí. Rozsiahlosť problému sa signifikantne zvyšuje možnosťou baktérií horizontálne

prenášať determinanty rezistencie a neustále sa zvyšujúcim používaním antibiotík, ktoré vytvorilo enormný

selektívny tlak voči rezistentným baktériám. Odhaduje sa, že počas posledných 60-tich rokov bolo uvoľnených

do biosféry niekoľko miliónov ton antibiotík. Veľmi často bola a je zaznamenávaná korelácia medzi použitím

antibiotík a vznikom antibiotickej rezistencie (Bronzwaer a kol., 2002). K prenosu génov dochádza vo veľkej

miere v in vivo podmienkach medzi baktériami gastrointestinálneho traktu (GIT) a patogénnymi baktériami,

keďže u rozmanitých bakteriálnych druhov od rozličných hostiteľov sú prítomné identické gény rezistencie.

Veľký podiel na rozšírení získanej rezistencie majú antibiotické rastové stimulátory využívané v chove zvierat,

ktoré môžu selektovať rezistentné baktérie v komenzálnej flóre zvierat a tým zvýšiť ich počty v čreve a vo

fekáliách. Tento rezervoár rezistentných génov zvyšuje možnosť transferu génov rezistencie na patogénne

baktérie u ľudí a tým riziko kontaminácie ľudí cestou potravinového reťazca. Obrovská výroba antibiotík

zaťažuje životné prostredie odpadom a nežiaducim spôsobom ovplyvňuje ekosystém. Potrebu hľadania

alternatívnej liečby proti infekčným chorobám zvýšilo aj poznanie, že farmaceutický priemysel už nie je schopný

produkovať nové účinné molekuly antibakteriálnych liečiv v takom tempe ako rezistencia narastá. V druhej

polovici 20. storočia odštartoval systematický výskum v oblasti „prospešných baktérií“, vytvárania ich konceptu,

odkrývania ich mnohorakých účinkov a interakcií s hostiteľským makroorganizmom.

6

2. Definícia probiotík

Pravdepodobne v roku 1954 Ferdinand Vergin zaviedol po prvý raz do literatúry výraz „probiotic“.

Vychádzal z gréckeho základu slov pro-pre a bios-život predpokladajúc, že substancia je prospešná pre život,

v kontraste s výrazom „antibiotikum“, kde substancia má negatívny vplyv na život. K presnejšiemu pojmu

„probiotikum“ prispeli Lilley a Stillwell (1965), ktorí probiotiká definovali ako látky vylučované

mikroorganizmami, ktoré stimulujú rast iných mikroorganizmov. Odvtedy sa definícia probiotík menila

s narastajúcimi poznatkami o mechanizme ich účinku na organizmus. V roku 1971 Sperti aplikoval tento pojem

na tkanivové exkréty, ktoré stimulujú mikrobiálny rast. Parker (1974) prvý použil pojem „probiotic“ vo význame

v akom sa používa dnes. Definoval probiotiká ako „organizmy a látky, ktoré prispievajú k črevnej mikrobiálnej

rovnováhe“. Rušivým výrazom v tejto definícii bolo slovo „látky“, ktoré dovoľovalo v širšom význame sem

zahrnúť napr. aj antibiotiká. V roku 1989 sa Fuller pokúsil zlepšiť Parkerovú definíciu probiotík s nasledovným

rozdielom. Probiotiká sú: „živé mikrobiálne doplnky stravy, ktoré pozitívne ovplyvňujú hostiteľa úpravou jeho

intestinálnej mikrobiálnej rovnováhy“. Táto zmenená definícia zdôrazňovala potrebu životaschopných probiotík,

a predpokladala pozitívny efekt pre hostiteľa, čo bolo, podľa tejto definície, zviera. V roku 1992 už Fuller

definoval probiotiká ako „biopreparáty obsahujúce živé bunky alebo metabolity stabilizovaných autochtónnych

mikroorganizmov, ktoré optimalizujú osídlenie a zloženie črevnej mikroflóry zvierat a ľudí a majú stimulačný

vplyv na tráviace procesy a imunitu makroorganizmu“. Havenaar a kol. (1992) rozšírili definíciu probiotík s

rešpektom na hostiteľa a prirodzené prostredie mikroflóry ako „živé mono alebo zmiešané kultúry

mikroorganizmov, ktoré sú aplikované zvieraťu alebo človeku a pozitívne pôsobia na hostiteľa, zlepšovaním

vlastností črevnej mikroflóry". Dhingra (1993) zase uvádza že, probiotiká sú predovšetkým regulátory

mikrobiálneho prostredia čreva, ktoré obmedzujú črevné problémy a inhibujú patogény tráviacej sústavy.

Schaafsma probiotiká v roku 1996 definuje ešte stále vo vzťahu ku gastrointestinálnemu traktu: „Perorálne

probiotiká sú živé mikroorganizmy, ktoré po požití v dostatočnom množstve sa prejavia efektom rozdielnym od

základnej výživy“. Salminen a kol. (1999) rozšírili definíciu probiotík dokonca ďalej, bez limitovania

navrhovaných zdravotných efektov vplývajúcich na autochtónnu mikroflóru. Podľa Salminena, probiotikum je

„živá mikrobiálna kultúra alebo kultivovaný mliečny produkt s pozitívnymi vplyvmi na zdravie a výživu

hostiteľa“.

Potenciál využitia probiotík sa však nehľadá len v ovplyvnení funkcií gastrointestinálneho traktu, ale aj

v iných oblastiach medicíny. Výskumy sa zameriavajú na odhalenie ďalších probiotických kmeňov, na

testovanie mechanizmu ich účinku a dôkazy o ich efektivite. V apríli 2001 v argetínskej Cordobe sformovaná

expertná komisia FAO (Food and Agriculture Organization) pri Svetovej zdravotníckej organizácii

(FAO/WHO), aby vypracovala analýzu a následne definíciu probiotík. Stanovenie definície malo význam aj pre

poľnohospodárstvo, potravinársky priemysel, verejné zdravotníctvo, medicínu a mikrobiológiu. Svoje závery

FAO/WHO publikovala v máji roku 2002 (FAO/WHO 2002). V tomto dokumente, v časti 4. „Odporúčania, sa v

bode 1. probiotiká definujú ako: „Živé mikroorganizmy, ktoré podávané v dostatočných množstvách majú

preukázateľne pozitívny vplyv na hostiteľa/príjemcu“.

7

3. Probiotiká a ich mechanizmus účinku

Probiotiká sa efektívne využívajú v potravinárskom priemysle, poľnohospodárstve a humánnej

i veterinárnej medicíne. Používajú sa vo výžive hospodárskych zvierat na konzervovanie krmív, zlepšenie

konverzie živín v krmivách a zvýšenie produkcie (Svozil a kol., 1987; Skřivanová a Macháňová, 1990;

Nousiainen a Setälä, 1993), v manipulácii funkčného vývoja tráviaceho traktu mladých zvierat (Fonty a kol.,

1983; Wallace a Newbold, 1992; Bomba a kol., 1992), a v prevencii a terapii chorôb u ľudí (Gotz a kol., 1979)

a hospodárskych zvierat (Watkins a kol., 1982; Bomba a kol., 1997). Sú súčasťou funkčných potravín pre ľudí.

Najčastejšie sa na probiotické účely používajú baktérie mliečneho kvasenia, medzi ktoré patria zástupcovia

rodov Lactobacillus, Bifidobacterium, Propionibacterium, Enterococcus, Bacillus.

Napriek mnohým získaným poznatkom nie je mechanizmus účinku probiotík v súčasnosti úplne

objasnený. Doterajšie poznatky v tejto oblasti sú zamerané na:

- inhibičný vplyv na patogénne mikroorganizmy

- stimuláciu imunity hostiteľa

- ovplyvnenie tráviacich procesov a metabolizmu

3.1. Inhibičný vplyv na patogénne mikroorganizmy

Mechanizmus inhibičného efektu probiotík voči patogénom môže byť sprostredkovaný kompetíciou o

receptory na črevnej sliznici, kompetíciou o živiny a produkciou antibakteriálnych látok.

3.1.1. Kompetícia o receptory na črevnej sliznici

Dôkazy o tom, že indigénna gastrointestinálna mikroflóra má schopnosť inhibovať kolonizáciu

patogénnych mikroorganizmov, pochádzajú zo štúdií u hydiny. Klasickým prípadom sú novovyliahnuté kurčatá

z komerčných liahní, u ktorých je vývin natívnej mikroflóry oneskorený (Hakkinen a Schneitz, 2000). Zavedenie

črevnej mikroflóry zo zdravej dospelej hydiny novovyliahnutým kurčatám zvýšilo ich rezistenciu proti infekcii,

ak boli tieto následne infikované salmonelami podanými v krmive. Táto inhibičná koncepcia je známa ako

„Nurmiho koncept“, alebo„kompetitívna exklúzia“. Lee et al., (2001) sa zmieňujú o pozitívnom vplyve

Lactobacillus reuteri, ktorý sa bežne nachádza v gastrointestinálnom trakte kurčiat a moriek. Po perorálnej

aplikácii Lactobacillus reuteri novovyliahnutým kurčatám zistili, že sa znížil počet baktérií Salmonella

typhimurium a následne sa znížila mortalita kurčiat v prvých týždňoch chovu. Podobné inhibičné účinky

dosiahnuté zavedením natívnej mikroflóry za účelom kontroly patogénov u novonarodených zvierat a u ľudí boli

nazvané ako„kolonizačná rezistencia“ (Mead, 2000; Rabsch a kol., 2000).

Adherencia baktérie na črevnú stenu je považovaná za hlavný predpoklad kolonizácie. To platí nielen

pre probiotiká, ale aj pre patogény. Kľúčovým bodom je väzba „baktéria – sliznica“. Boli popísané dva hlavné

komponenty esenciálne pre toto spojenie: glykokonjugáty na črevných enterocytoch a bakteriálne adhezíny.

Povrch GIT epitelu je pokrytý vrstvou hlienu, ktorý tvorí bariéru medzi črevným obsahom a sliznicou čreva a

chráni epitel voči chemickému, mikrobiologickému a fyzikálnemu poškodeniu (Forstner a Forstner, 1994).

Prítomnosť tohto hlienu má význam pri kolonizácii GIT baktériami a tiež je dôležitým mechanizmom

kolonizačnej rezistencie (Van Dijk a kol., 2002). Hlien je produkovaný špeciálnymi bunkami črevného epitelu -

gobletové bunky a tvorí súvislú vrstvu (100-200 µm) na jeho povrchu (Specian a Oliver, 1991). Pozostáva

z glykokonjugátov, vody, peptidov a fosfolipidov (Matsuo a kol., 1997). Tieto glykokonjugáty alebo nazývané aj

8

mucíny sú kľúčovými molekulami pri rozpoznávaní enterocytov baktériami. Štrukturálna rozmanitosť

karbohydrátov v makromolekule mucínu a rozmanité spôsoby väzby poskytujú množstvo rôznych cieľových

väzobných miest, ktoré sú rozpoznávané probiotickými ako aj patogénnymi baktériami. Receptory nachádzajúce

sa na črevnej sliznici sú hostiteľsky špecifické a sú ovplyvňované viacerými faktormi ako genetika, stupeň

zrelosti epiteliálnych buniek, úseky tráviaceho traktu, vek hostiteľa a druh prijímanej potravy. Uvedené faktory

majú za následok zmeny vo vnímavosti ku kolonizácii. V ostatných rokoch niektoré štúdie popisujú schopnosť

mikroflóry kvalitatívne a kvantitatívne modulovať expresiu glykokonjugátov hostiteľom. Táto hostiteľom

indukovaná modifikácia mucínu môže potenciálne zmeniť kolonizáciu rôznych baktérií a tiež poskytnúť

baktériám bunkové fukozylované glykokonjugáty ako zdroj energie čo môže selektívne zvýhodniť určitú

skupinu baktérií v súťaži o adherenčné miesta (Hooper a Gordon, 2001; Freitas a kol., 2002).

Niektoré kmene rodov Ruminococcus, Bifidobacterium, Clostridium a Peptostreptococcus produkujú

veľké množstvá glykozidových hydroláz schopných degradovať oligosacharidové reťazce mucínu. Toto vedie

k tvorbe alebo deštrukcii špecifických väzobných miest čo môže modifikovať potenciálnu kolonizáciu.

Štiepením oligosacharidov mucínu dochádza taktiež k produkcii jednoduchých cukrov, ktoré sa stávajú vhodným

substrátom pre iné baktérie neschopné degradovať glykokonjugáty (MacFarlane a kol., 1999).

3.1.2. Mechanizmus adherencie u LAB

Pre nepretržitú kolonizáciu čreva baktériami je nevyhnutná ich väzba na glykokonjugáty. Mechanizmus

adherencie môže byť špecifický - rozpoznávanie a špecifická väzba na glykoproteíny a glykokonjugáty

a nešpecifický - pohyblivosť baktérií, chemotaxia a nešpecifická väzba na hlien (Kelly a kol., 2005).

Na povrchu G+ baktérií sa nachádzajú rôzne štruktúry neproteínovej povahy, ktoré majú funkciu

adhezínov. Patrí sem kapsula, ktorá má lipopolysacharidový charakter alebo slizovitá vrstva pozostávajúca

z kyseliny teichovej a lipoteichovej (Sato a kol., 1982; Contrepois a kol., 1988). Hlavnou zložkou bunkovej

steny bifidobaktérií, streptokokov a stafylokokov je kyselina lipoteichová (Poxton a Arbuthnott, 1990; Kelly

a kol., 1994). U laktobacilov boli identifikované nasledovné komponenty bunkovej steny: kyslé

mukopolysacharidy pre adherenciu na epitel hrvoľa kurčiat (Fuller, 1975), zmiešané makromolekulárne

komplexy proteínov a kyseliny teichoikovej u Lactobacillus fermentum RI (Sherman a Savage, 1986)

a sekrečný proteín u Lactobacillus fermentum 737 (Conway a Kjelleberg, 1989), ktoré kolonizujú epitel žalúdka

myší, povrchový proteín u Lactobacillus fermentum 104-S nesúci adherenciu na skvamózny epitel žalúdka

ošípaných (Henriksson a kol., 1991). Sekrečný proteínový komponent, ktorý redukoval, resp. zabraňoval

adherencii E. coli K 88 na mukózu ilea prasiat bol popísaný u Lactobacillus fermentum 104-R (Blomberg a kol.,

1993). Predpokladá sa, že tento aktívny komponent buď mení K 88 receptory mukózy chemicky, takže nie sú

rozoznávané K 88 fimbriami, alebo sa naviaže na K 88 receptory a priestorovo bráni naviazaniu sa K 88 fimbrií.

U humánnych laktobacilov (Coconnier a kol., 1992) bola zistená prítomnosť dvoch komponentov zodpovedných

za adherenciu na enterocyty. Prvý faktor bol určený bunkovou stenou (polysacharid) a druhý-extracelulárny

faktor proteínovej povahy (adherence promoting factor). Tento sekrečný faktor tvoril most medzi baktériou

a eukaryotickými bunkovými receptormi a bol zodpovedný až za 90% adherenčnú schopnosť Lactobacillus

acidophilus BG2 FO4. Vyznačoval sa silnou špecifitou- zvyšoval adherenciu iného humánneho kmeňa, ale

neovplyvňoval adherenciu potravinárskych kmeňov. Mukai a kolektív (1992) a Mukai a Arihara (1994) sledovali

úlohu lektínov v mechanizme adherencie laktobacilov na enterocyty hydiny. Na základe výsledkov pokusov

9

predpokladajú, že adherencia laktobacilov môže byť sprostredkovaná lektínmi, ktoré syntetizujú buď laktobacily

alebo črevný epitel. Lektíny môžu byť viazané na špecifické karbohydráty na povrchu epitelu alebo bakteriálnej

bunky. Iné práce identifikovali prítomnosť S-vrstvy (povrchové proteíny), (Schneitz a kol., 1993; Vidgren a kol.,

1992) zodpovednej za adherenciu Lactobacillus acidophilus na črevný epitel hydiny.

V pokusoch in vivo bolo zistené, že laktobacily vytvárajú s gram-negatívnymi baktériami koagregáty na

povrchu neinfikovaného vaginálneho epitelu (Reid, 1988), pričom tento fenomén zabraňuje vzniku infekčných

ochorení urogenitálneho traktu. Podobný protektívny mechanizmus medzi laktobacilmi a enterotoxigénnymi E.

coli (ETEC) môže fungovať aj v GIT. Spencer a Chesson (1994) zistili, že prítomnosť K 88 antigénu je

aktívnym faktorom v koagregácii medzi E. coli a laktobacilmi.

3.1.3. Kompetícia a živiny

Hypotéza kompetície o živiny v črevnom lumene medzi osídlenými a invadujúcimi baktériami bola

odvodená od pozorovania, že tieto baktérie spolu súťažia o živiny. Baktérie mliečneho kvasenia, ktoré rastú na

mieste kolonizácie, môžu využívať živiny, ktoré by inak boli dostupné pre patogény (Perdigon et al., 2001;

Jonsson a Conway, 1992). Ak teda väčšiu časť dostupných živín spotrebujú probiotické mikroorganizmy, rozvoj

patogénnej mikroflóry bude v dôsledku nedostatku živín obmedzený. Pri tejto súťaži je možné prospešnú

mikroflóru podporiť rôznymi špecifickými rastovými substrátmi, ako laktóza (Pollman a kol., 1980),

inulooligosacharidy (Hidaka a kol., 1986), fruktooligosacharidy (Rowland, 1992), xylooligosacharidy (Suwa a

kol., 1987), horčík (Vandervoorde a kol., 1992) a iné.

3.1.4. Produkcia antibakteriálnych látok

Baktérie mliečneho kvasenia (LAB) produkujú antimikrobiálne látky medzi ktoré patria toxické

metabolity kyslíka, organické kyseliny a bakteriocíny (Nemcová, 1997). Pri aeróbnom raste LAB dochádza

k tvorbe peroxidu vodíka, aktívnych molekúl O2 a voľných radikálov –OH, ktoré sú nositeľmi tzv. „toxicity

kyslíka“. Tieto metabolity majú bakteriostatický alebo bakteriocídny efekt. Inhibičný efekt organických kyselín

je sprostredkovaný znížením pH a ich toxickým účinkom (Piard a Desmazeaud, 1991). Pre baktérie je toxická

nedisociovaná forma organických kyselín. Zvýšená toxicita kyseliny octovej sa pripisuje jej vyššiemu pK v

porovnaní s kyselinou mliečnou, pričom jej toxicita sa zvyšuje úmerne s poklesom pH (Daly a kol., 1972).

Adams a Hall (1988) preukázali synergický efekt kyseliny mliečnej a octovej voči salmonelám. Kyselina

mliečna znižovala pH média, čím sa zvyšovala toxicita kyseliny octovej. U LAB bola potvrdená aj produkcia

ďalších antimikrobiálnych substancií, ako sú bakteriocíny, diacetyl reuterin, kyselina pyroglutámová, kyselina

benzoová a ďalšie (Casla a kol., 1996; Lindgren a Dobrogosz, 1990).

3.2. Stimulácia imunity

Pre stimuláciu imunitného systému je dôležitá adherenčná schopnosť probiotického kmeňa. Probiotiká

môžu aktivovať lymfoidné bunky črevného lymfatického tkaniva (GALT gut-associated lymphoid tissue),

zastúpeného buď ojedinelými lymfatickými uzlíkmi difúzne rozptýlenými po celej dĺžke čreva alebo v ileu

Peyerovými plakmi (Madara, 1997). Práve v tenkom čreve sú obvykle počty baktérií relatívne nízke, avšak

perorálna aplikácia probiotických prípravkov obsahujúcich vysoké počty prospešných baktérií vedie k ich

nadbytku v tomto úseku čreva, čo pravdepodobne tiež napomáha stimulácii črevného lymfatického tkaniva

(Link-Amster a kol., 1994). Kontakt buniek GALT so živými probiotikami aktivuje nešpecifické a špecifické

10

imunitné mechanizmy v črevnom lymfatickom systéme ako aj v systémovej imunite. Imunogénnosť probiotík

závisí od stupňa kontaktu bakteriálnych buniek s epitelovými a lymfatickými bunkami črevnej sliznice.

Probiotiká pôsobia na črevné lymfoidné bunky buď ako celé mikroorganizmy, ich fragmenty alebo metabolity.

Zdá sa, že hlavnú úlohu pri stimulácii imunity intaktnými bunkami probiotík hrajú M-bunky, ktoré sú ojedinele

rozptýlené medzi epiteliálnymi bunkami črevného lymfoidného tkaniva. Predkladanie menších

makromolekulárnych antigénov lymfatickým bunkám čreva môže prebiehať transcelulárne cez epiteliálne bunky

alebo paracelulárne (Ouwehand a kol., 1999b). Pri silnej väzbe baktérií na epiteliálne bunky sa predpokladá

možnosť vyvolania imunitnej odpovede nimi produkovanými metabolitmi. Antigén prezentujúce bunky a T-

bunky potom môžu regulovať počty a aktivitu mikroflóry čreva (Strober a kol., 1998). Neadherentné kmene

baktérií môžu nepriamo tiež ovplyvňovať imunitný systém hostiteľa, a to reguláciou zloženia mikroflóry,

zmenou črevnej permeability pre antigény alebo produkciou substancií, ktoré modulujú imunitnú odpoveď voči

antigénom (Ouwehand a kol., 1999a).

Probiotiká prospešným spôsobom regulujú tak imunitnú elimináciu antigénov patogénnych

mikroorganizmov, ako aj imunologickú toleranciu na potravinové antigény. Mechanizmus tohto pôsobenia nie je

presne známy, ale sa uplatňuje na úrovni anatomických štruktúr (zabránenie adhézie patogénnych

mikroorganizmov na črevný epitel), ako aj zariadení prirodzenej a špecifickej imunity. Podstatou pôsobenia

probiotík je imunostimulačný účinok na tie imunitné mechanizmy, ktoré sa uplatňujú v obrane proti patogénnym

mikroorganizmom nachádzajúcim sa v gastrointestinálnom trakte, a naopak imunosupresívny účinok na reakcie

imunitnej precitlivenosti (hypersenzitívnosti) na potravinové antigény. Kľúčovú úlohu má pri tom udržovanie

správnej rovnováhy medzi prozápalovými a protizápalovými cytokínmi sekretovanými najmä subpopuláciami

TH1- a TH2-lymfocytov, stimulácia tvorby TGF-b, IL-10 a sekrečného IgA. Imunomodulačné mechanizmy

probiotík zahrňujú indukciu produkcie mucínu, aktiváciu makrofágov, stimuláciu IgA a neutrofilov, inhibíciu

uvoľňovania prozápalových cytokínov, stimuláciu periférnych imunoglobulínov a moduláciu povrchových

fenotypov dendritových buniek. Imunostimulačný účinok probiotík sa odráža aj vo zvýšenej rezistencii hostiteľa

na spontánne nádory následkom účinnejšieho imunitného dozoru a zníženej aktivity prokarcinogénnych

enzýmov.

Pozitívny vplyv probiotických mikroorganizmov na imunitný systém v in vivo podmienkach bol

dokázaný v mnohých experimentoch. Perdigon (2000) dokázala, že preventívna perorálna aplikácia laktobacilov

u myší bola sprevádzaná vysokými hladinami IgA a zvýšila aj fagocytárnu aktivitu makrofágov, čo zvieratá

chránilo pred infekciou Salmonella typhimurium a E. coli. Aplikácia nepatogénneho kmeňa E. coli serotyp

O83:K24:H31 u novorodencov viedla k stimulácii lokálnej imunity aj hladín IgA, ktorý u takýchto detí čiastočne

nahrádza chýbajúce imunoglobulíny z materského mlieka (Lodinová-Žádniková a kol., 2000). Po aplikácii

Lactobacillus GG bol sledovaný nárast hladín IgA špecifických antigén produkujúcich buniek a skrátenie trvania

rotavírusových hnačiek (Majamaa a kol., 1995). Perdigon, G. a kol. (1995) pozorovali po pôsobení Lb. casei, Lb.

acidophilus a jogurtu zvýšený počet plazmatických buniek produkujúcich IgA v závislosti od dávky. t

3.3. Vplyv na tráviace procesy a metabolizmus

Probiotiká ovplyvňujú tráviace procesy predovšetkým zvýšením počtov a enzýmovej aktivity pre

makroorganizmus prospešných baktérií a tým zvyšujú aj stráviteľnosť a využiteľnosť krmiva (Burgstaller a kol.,

1984). U ľudí trpiacich laktózovou maldigesciou bolo potvrdené zvýšenie aktivity β-galaktozidázy a redukcia až

11

vymiznutie príznakov ochorenia po podávaní vybraných kmeňov laktobacilov a bifidobaktérií (Vesa a kol.,

1996). Niektoré kmene laktobacilov vykazujú aj amylolytickú aktivitu (Champ a kol., 1983) a bola zistená aj ich

schopnosť štiepiť β-glukan (Jonsson a Hemmingsson, 1991). Silnú proteázovú, lipázovú a amylázovú aktivitu a

tiež schopnosť štiepiť množstvo vyšších cukrov, ktoré sú súčasťou rastlín, majú zástupcovia rodu Bacillus

(Sögaard a Suhr-Jessen, 1990). Tieto vlastnosti probiotík sú využívané hlavne na zlepšenie stráviteľnosti krmiva.

Okrem enzýmových aktivít sú laktobacily a bacily schopné znižovať produkciu škodlivých dusíkatých

zlúčenín v čreve, ktoré poškodzujú intestinálnu sliznicu (Hill a kol., 1970). Znížené množstvo dusíkatých látok,

hlavne amoniaku a amínov, a vyššia koncentrácia únikavých mastných kyselín priaznivo ovplyvňujú funkciu

črevnej steny (Nousiainen a Setälä, 1993). Optimalizácia tráviacich procesov sa potom prejaví rastovo-

stimulačným efektom a zvýšením hmotnostných prírastkov.

Probiotiká znižujú hladinu cholesterolu v krvi, ktorého vyššie množstvá sú považované za jeden

z predispozičných faktorov kardiovaskulárnych ochorení, a to inhibíciou jeho syntézy vplyvom niektorých

organických kyselín (Mann, 1977; Fernandes a kol., 1987), utilizáciou priamo z črevného obsahu alebo znížením

jeho absorpcie z tráviaceho traktu (Gilliland, 1990). De Smet a kol. (1998) sledovali vplyv podávania živej

kultúry Lactobacillus reuteri u prasiat kŕmených diétou s vysokým obsahom tuku a cholesterolu a nízkym

obsahom vlákniny na hladinu cholesterolu v plazme, pričom zaznamenali signifikantne nižšie (p<0,05) hladiny

celkového a LDL-cholesterolu oproti kontrolnej skupine. Medzi skupinami však nebol rozdiel v koncentrácii

HDL-cholesterolu. Akalin a kol. (1997) dosiahli obdobné výsledky u myší kŕmených jogurtom obohateným o

Lactobacillus acidophilus.

Bola potvrdená aj antitumorová aktivita probiotík, ktorá môže byť realizovaná buď priamo inhibíciou

nádorových buniek (Reddy a kol., 1973), supresiou baktérií produkujúcich β-glukozidázu, β-glukuronidázu a

azoreduktázu, ktoré katalyzujú konverziu prokarcinogénov na proximálne karcinogény (Goldin a Gorbach,

1977), deštrukciou karcinogénov ako sú napr. nitrozamíny (Rowland a Grasso, 1975) alebo supresiou

nitroreduktázy, ktorá sa podieľa na ich syntéze (Goldin a Gorbach, 1984). V pokusoch na potkanoch, ktorým bol

subkutánne podávaný karcinogén dimetylhydrazín, bol potvrdený antikarcinogénny účinok preventívne

podávaného Lactobacillus GG, ktorý signifikantne znížil počet a výskyt tumorov tenkého čreva a kolónu (Goldin

a kol., 1996). Bolognani a kol. (1997) dokázali v in vitro podmienkach schopnosť Lactobacillus acidophilus a

Bifidobacterium longum viazať karcinogény, avšak v in vivo pokusoch na myšiach neboli zaznamenané

výraznejšie zmeny v absorpcii a distribúcii karcinogénov v tele, ani zníženie ich genotoxickej aktivity v pečeni.

Na druhej strane však Pool-Zobel a kol. (1993) v pokusoch na potkanoch potvrdili antigenotoxické pôsobenie

laktobacilov.

4. Bezpečnosť probiotík

Dôležitým krokom pri posudzovaní bezpečnosti probiotického mikroorganizmu je jeho presná

identifikácia využívajúca súčasné možnosti molekulovo-biologických metód. Doposiaľ používané probiotické

kmene majú status „Všeobecne považované za bezpečné“ (GRAS) Väčšina z nich patrí medzi rody

Bifidobacterium a Lactobacillus. Aj napriek veľmi zriedkavým prípadom infekcií spojených s uvedenými

mikroorganizmami, ktoré sa vyskytli v humánnej praxi hlavne u imunodeficientných pacientov (Rautio a kol.,

1999; Mackay a kol., 1999; Ouwehand a Salminen, 2000) sa zdá, že konzumácia produktov obsahujúcich tieto

baktérie nepredstavuje vážne riziko. Vyššie riziko je spojené s používaním zástupcov rodov Enterococcus,

12

Streptococcus, Escherichia a Bacillus, ktoré obsahujú aj potencionálne patogénne kmene. Okrem toho

enterokoky a E. coli veľmi často obsahujú plazmidy alebo prenosu schopné genetické elementy, ktoré môžu byť

nositeľmi génov antibiotickej rezistencie (Wegener a kol., 1998). Prenosná rezistencia k vankomycínu medzi

enterokokmi je vážnym problémom v klinickej medicíne, pretože sa zvyšuje výskyt enterokokových

nozokomiálnych infekcií a hrozí nebezpečenstvo možného prenosu rezistencie na patogénne a potencionálne

patogénny.

Kritériom bezpečnosti pre využívanie probiotík v praxi má byť skutočnosť, že probiotické

mikroorganizmy by nemali zvyšovať už existujúce riziká antibiotickej rezistencie spojenej s normálnou

mikroflórou v čreve alebo v potravinách. Opatrenia zahrňujú použitie vhodných štartérových a probiotických

kultúr a vhodných substrátov pre fermentácie potravín. Prenosu baktérií rezistentných na antibiotiká zo zvierat

do fermentovaných a iných potravín sa možno vyhnúť napríklad pasterizáciou alebo tepelnou úpravou

surového mlieka alebo mäsa. Okrem toho, generovanie baktérií rezistentných na antibiotiká u potravinových

zvierat a rastlín sa musí minimalizovať uvážlivým použitím antibiotík. Pre zachovanie terapeutického

potenciálu antibiotík je potrebné zastaviť rozšírenie génov rezistencie na všetkých úrovniach. Toto zahrňuje

zákaz použitia antibiotík ako stimulátorov rastu v chove hospodárskych zvierat, ako bolo nedávno ustanovené

v Európskej únii. Pri genetickej modifikácii baktérií mliečneho kvasenia (vývoj potravinových vektorov) sa

antibiotické markery v súčasnosti nahrádzajú napríklad metabolickými markermi. Aj keď v súčasnosti sa

vyvíjajú probiotiká pre použitie v kombinácii s antibiotikami zavedením viacnásobnej rezistencie na tieto

baktérie, probiotiká vo všeobecnosti nemajú byť určené na to, aby niesli viac rezistencie, než je potrebné pre

špecifický účel. Predovšetkým sa musí zhodnotiť biologická bezpečnosť probiotických baktérií mliečneho

kvasenia pre konzumáciu ľuďmi navrhnutím kritérií a predpisov na jednej strane a normalizovaním metodík

testovania biologickej bezpečnosti pred uvedením a po zavedení na trh na druhej strane.

5. Východiská a možnosti zvyšovania účinnosti probiotík

Aj keď používanie probiotík v praxi preukazuje ich pozitívny biomedicínsky efekt často sa stretávame

s prípadmi ich neúčinnosti resp. nestálym účinkom. Rozdielna účinnosť probiotík v rôznych podmienkach môže

spočívať v probiotickom prípravku samotnom, alebo môže byť spôsobená vonkajšími podmienkami.

Najčastejšie príčiny a faktory, ktoré môžu spôsobiť variabilitu údajov o účinnosti probiotík sú nasledovné:

nezohľadnenie kritérií selekcie produkčného kmeňa, výber produkčného kmeňa bez cielenej laboratórnej

diagnostiky v podmienkach in vitro a in vivo, nízka prežívateľnosť produkčného kmeňa a jeho nestabilita,

použitie nešpecifického kmeňa vo vzťahu k hostiteľovi, nízka dávka, frekvencia a zle zvolená doba podávania

probiotika, nevhodná aplikačná forma a nezabezpečenie deklarovaného počtu živých baktérií v probiotiku,

interakcie s niektorými liekmi, vplyv stresu, genetické a druhové odlišnosti, vek a druh hostiteľa.

Súčasným celosvetovým trendom v oblasti výskumu a vývoja probiotík je snaha o stabilizovanie resp.

potencovanie účinku probiotických prípravkov. Tento cieľ je možné dosiahnuť:

1. získavaním nových poznatkov o mechanizme účinku probiotík a tým optimalizovať kritériá výberu

produkčných kmeňov

2. štúdiom možností potencovania probiotík

Výskum zameraný na štúdium vlastností probiotických kmeňov, ich vplyvu na organizmus, ale najmä

na mechanizmus ich účinku a zvýšenie ich účinnosti je nevyhnutnou podmienkou pre vývoj skutočne

13

efektívnych probiotických prípravkov. Účinné probiotikum musí vyhovovať kritériám podmieňujúcim jeho

účinok. Na základe doteraz známeho mechanizmu účinku probiotík boli definované kritériá výberu, ktoré by

mal produkčný probiotický kmeň spĺňať. Produkčný kmeň probiotika by mal byť schopný tolerovať podmienky

tráviaceho traktu, druhovo špecifický, adherovať vo vysokých počtoch na črevnú sliznicu tráviaceho traktu, mal

by mať dobré technologické vlastnosti (vysoká životaschopnosť pri spracovaní, lyofilizácii a skladovaní), mal by

rýchlo revitalizovať v tráviacom trakte a mal by vykazovať klinicky overený biomedicínsky účinok. Produkčný

kmeň musí byť bezpečný čo zahŕňa jeho presnú charakterizácia, podrobné zdokumentovanie jeho nepatogenity,

genetickej stability a zdravotnej nezávadnosti. Niektoré z vyššie uvedených kritérií pre selekciu

mikroorganizmov na probiotické účely sa dajú testovať v in vitro, ale väčšina z nich sa musí verifikovať v in

vivo podmienkach. Získané znalosti poukazujú často na skutočnosť, že niektoré vlastnosti mikroorganizmov

pozorované v laboratórnych podmienkach neboli potvrdené v pokusoch so zvieratami (Chateau a kol., 1993).

V súčasnosti sa pri štúdiu vlastností mikroorganizmov v in vitro podmienkach uplatňujú moderné molekulovo-

biologické metódy. V in vivo podmienkach sa štúdium realizuje väčšinou u konvenčných zvierat. Vynikajúci

experimentálny model pre testovanie vlastností probiotických mikroorganizmov, mechanizmu ich účinku

a všetkých faktorov ovplyvňujúcich ich účinnosť predstavujú „ germ-free“ zvieratá.

Na zlepšenie účinnosti probiotík je potrebné získať ďalšie dôležité poznatky o mechanizme ich

účinku v tráviacom trakte (Stavric and Korgenay, 1995). Pozitívny vplyv každého probiotického

mikroorganizmu na makroorganizmus môže byť sprostredkovaný jedným alebo viacerými mechanizmami

účinku, ktoré sa prejavujú v rôznej intenzite. To poukazuje na nutnosť komplexného a detailného štúdia

mechanizmu účinku každého probiotického mikroorganizmu, aby sa objasnila mono- alebo polyfaktoriálnosť

študovaného mechanizmu. Takéto presné pochopenie vzťahov medzi makroorganizmom a probiotickým

mikroorganizmom následne umožňuje zvýšiť účinnosť probiotika, a to či už zintenzívnením jedného

z mechanizmov alebo rozšírením škály mechanizmov účinku probiotického prípravku. Získanie ďalších

poznatkov o mechanizme účinku probiotík povedie k definovaniu ďalších nových kritérií výberu čo vytvorí

predpoklady pre zvýšenie ich účinnosti.

Štúdium možností potencovania probiotík sa zameriava na kombináciu viacerých kmeňov

mikroorganizmov, genetické manipulácie a kombináciu probiotík a synergicky pôsobiacich komponentov

prirodzeného pôvodu.

Kombinácia viacerých probiotických kmeňov umožňuje využiť ich synergický efekt. Vytvoriť

efektívne probiotikum založené na viacerých kmeňoch si však vyžaduje dôkladnú znalosť ich vzájomných

interakcií, ako aj účinok kombinácie samotnej, čo je podmienené náročnými štúdiami. Fuller (1989) uvádza, že

výhody probiotík založených na viacerých kmeňoch mikroorganizmov spočívajú v ich účinnosti za rôznych

podmienok a u rôznych druhov zvierat. Tieto viackmeňové prípravky môžu akumulovať rôzne charakteristiky

(zdravotné, produkčné) typické pre tieto baktérie a tak ponúkať širšie spektrum biomedicínskych účinkov. Počet

kmeňov v jednom prípravku sa môže pohybovať od jedného do osem (Fuller, 1989). Baktérie rodu Bacillus vo

viackmeňových prípravkoch môžu účinkovať ako potenciálne stimulátory rastu pre druhy Streptococcus

a Lactobacillus (Pollman a kol., 1980). Hoci Bacillus sp. neadheruje na intestinálne mikroklky, tieto baktérie

rastú v slizničnom biofilme nad črevnými papilami a upravujú hlien ako živinu pre iné probiotické baktérie

(Porubcan, 1990).

14

Ukazuje sa, že génové manipulácie sú ďalším spôsobom zvýšenia účinnosti probiotík (McCarthy a

kol., 1988). Ich implementácia však vyžaduje oveľa viac poznatkov o spôsobe účinku probiotík. Získanie

takýchto poznatkov umožní využitím techník génových manipulácií, spojiť schopnosť mikroorganizmu prežívať

v tráviacom trakte so schopnosťou produkovať metabolity, ktoré sú nositeľmi inhibičného efektu (Fuller, 1989).

Len ďalší výskum však ukáže, aká bude stabilita génovo manipulovaných probiotických mikroorganizmov, ako

aj ich schopnosť udržať sa v prirodzenom ekosystéme tráviaceho traktu. Treba tiež vylúčiť akékoľvek zdravotné

riziko.

Zdá sa, že kombinácia probiotík so synergicky pôsobiacimi zložkami prírodného pôvodu je

z praktického hľadiska najlepším spôsobom pre zlepšovanie účinnosti probiotických prípravkov. Na

potencovanie efektu probiotických prípravkov týmto spôsobom možno brať do úvahy také komponenty, ktoré

pozitívne ovplyvňujú ekosystém tráviaceho traktu a imunitu hostiteľa prostredníctvom niektorého z

mechanizmov účinku probiotika. Zlepšenie účinnosti probiotík ich kombinovaním so synergicky pôsobiacimi

zložkami sa dosiahne buď zintenzívnením niektorého mechanizmu alebo rozšírením škály mechanizmov

probiotického efektu. Uvedenou kombináciou sa získajú účinnejšie probiotické prípravky, ktoré boli označené

ako potencované probiotiká (Bomba a kol., 2002). Zdá sa, že na potencovanie účinku probiotík možno použiť

viacero vhodných komponentov, ako sú oligosacharidy, fytokomponenty, nutričné a rastové faktory, proteíny,

polynenasýtené mastné kyseliny, organické kyseliny a bakteriálne metabolity (Pollman a kol., 1980; Gálfy a

Bokori, 1990; Gibson a Roberfroid, 1995; Yadava a kol, 1995). Možno predpokladať, že zvýšenie účinnosti

probiotík ich kombináciou so synergicky pôsobiacimi komponentami nájde široké využitie v praxi.

6. Kombinácia probiotík so synergicky pôsobiacimi zložkami prírodného pôvodu

6.1. Synbiotiká a potencované probiotiká

Jedným zo spôsobov potencovania účinnosti probiotických prípravkov môže byť kombinácia probiotík

a prebiotík ako synbiotík (Salminen a kol., 1998). Podľa Roberfroida (1998) synbiotiká môžu zabezpečiť

zvýšenie prežívania probiotického kmeňa počas pasáže tráviacim traktom a jeho začlenenie medzi endogénne

baktérie a tým stimulovať rast a aktivitu tak exogénnych (probiotických) ako aj endogénnych baktérií.

K najčastejšie používaným prebiotikám patria fruktooligosacharidy, galaktooligosacharidy,

mananoligosacharidy, xylooligosacharidy, arabinoxylany, rafinóza, stachyóza, glukozylsacharóza, isomalturóza,

inulín, isomaltóza, laktosacharóza, laktulóza a laktóza (Patterson a Burkholder, 2003). Sú to produkty prevažne

prírodného charakteru, nemajú nežiadúce efekty, neakumulujú sa v živočíšnych tkanivách, sú rezistentné voči

vysokej teplote a nízkemu pH žalúdka, majú kladný vplyv na zdravie a produktivitu zvierat. Boli popísané tri

možné mechanizmy ich účinku (Spring a kol., 2000):

1. Oligosacharidy sú čiastočne alebo úplne rezistentné voči účinkom tráviacich enzýmov hostiteľa. Nie sú

absorbované alebo metabolizované v hornej časti tráviaceho traktu. Tak sú schopné dosiahnuť kolón,

kde môžu reagovať s mikrobiálnou flórou a črevnými bunkami.

2. Oligosacharidy sú využívané ako špecifické rastové substráty prospešnými baktériami. Nie sú

využívané patogénmi, resp. potenciálnymi patogénmi. Oligosacharidy indukujú enzymatický systém

prospešných baktérií, ktorý ich štiepi na organické kyseliny a plyny. Tým sa vytvárajú priaznivé

15

podmienky pre kolonizáciu tráviaceho traktu prospešnými baktériami a naopak, rast nežiadúcej

mikroflóry je potlačený.

3. Oligosacharidy reagujú s proteínovými receptormi prítomnými na povrchu mikrobiálnych buniek alebo

epiteliálnych buniek tráviaceho traktu a ovplyvňujú bakteriálnu adherenciu a imunomoduláciu.

Práce s používaním synbiotík sú síce ojedinelé, ale dosiahnuté výsledky sú pozitívne. Estrada

a kolektív (2001) pri kŕmení skoro odstavených prasiatok fruktooligosacharidmi spolu s Bifidobacterium longum

pozorovali zlepšenie využiteľnosti krmiva. Hoci sa rezistentný škrob nepovažuje za prebiotikum, Brown a kol.

(1997) pri kŕmení prasiat kukuričným škrobom s vysokým obsahom amylózy spolu s bifidobaktériami

pozorovali zvýšené vylučovanie bifidobaktérií trusom na rozdiel od tých, ktorým boli podávané bifidobaktérie

samostatne. Pravdepodobne sa bifidobaktérie naviazali na povrch škrobových granúl, ktoré slúžili ako nosič cez

GIT. Predpokladá sa, že vyššia koncentrácia substrátu v diéte priaznivo ovplyvnila kolonizáciu GIT prospešnými

mikroorganizmami (Crittenden, 1999).

Shim a kolektív (2005) v experimentoch in vivo tiež potvrdili pozitívnejší vplyv kombinácie

oligofruktózy (OF) a probiotík na zloženie črevnej mikroflóry u prasiatok. Kombinácia týchto zložiek

signifikantne znižovala celkové počty koliformných baktérií v kolóne a signifikantne zvyšovala populáciu

bifidobaktérií v ileu a v kolóne v porovnaní s kontrolou. V niektorých pokusoch so synbiotickými produktami

kombinácia bifidobaktérií a fruktooligosacharidov priniesla sľubné výsledky v znižovaní počtu aberantných

krýpt (Gallaher a kol., 1996). Kumprecht a Zobač (1998) potvrdili, že biologické prípravky obsahujúce

stabilizované živé mikroorganizmy (baktérie mliečneho kvasenia), ako aj extrakty bunečnej steny

Saccharomyces cerevisiae (mannanoligosacharidy), by mohli mať okrem pozitívneho vplyvu na zdravie aj

pozitívny účinok na rast prasiat a konverziu krmiva.

Synbiotiká možno považovať za prípravky, ktorých potencovaný ochranný a stimulačný účinok sa

prejavuje len v kolóne. Berúc do úvahy patogenézu hnačkových chorôb u mláďat je potrebné chrániť mukózu

tráviaceho traktu v celej jeho dĺžke, t.j. aj v tenkom čreve, aby bolo možné zabrániť adhézii patogénnych

mikroorganizmov. Pri rôznych poruchách žalúdočno-črevného traktu dietetického pôvodu sa objavujú

podmienky na translokáciu patogénov alebo podmienených patogénov z kolónu do prednej časti tráviaceho

traktu. Potencované probiotiká poskytujú účinnú ochranu tak pre tenké črevo, ako aj pre kolón. Potencované

probiotiká sú definované ako kombinované bioprípravky obsahujúce produkčné kmene mikroorganizmov a

synergicky pôsobiace komponenty prirodzeného pôvodu potencujúce ich probiotický efekt v tenkom i hrubom

čreve a ich priaznivý účinok na hostiteľa zintenzívnením jedného z mechanizmov alebo rozšírením škály ich

probiotického účinku. Potencované probiotiká musia vyhovovať týmto kritériám: a) musia byť efektívnejšie ako

ich jednotlivé súčasti samotné, b) ich potencovaný ochranný a stimulačný účinok sa musí prejavovať vo

všetkých častiach tráviaceho traktu. Na základe vyššie uvedených kritérií možno synbiotikum považovať za

potencované probiotikum, ak sa pridá komponent potencujúci jeho probiotický efekt v tenkom čreve. Z toho tiež

vyplýva, že potencované probiotiká budú pravdepodobne viaczložkové prípravky.

6.2. Probiotiká a fytokomponenty

Existuje množstvo vedeckých štúdií zameraných na sledovanie baktericídneho a bakteriostatického

pôsobenia rastlín a rastlinných extraktov. Fytoaditíva môžu svojou antimikrobiálnou aktivitou selektívne

ovplyvňovať črevnú mikroflóru alebo priaznivo vplývať na eubiózu v tráviacom systéme, čoho výsledkom je

16

lepšia utilizácia a absorpcia živín a/alebo stimulácia imunitného systému (Wenk, 2000). Fenolové zložky

oreganovej silice, tymol a karvakrol, sú schopné modifikovať bunkové membrány patogénov, vrátane

Escherichia coli, ale voči laktobacilom týmto spôsobom neúčinkujú (Losa a Williams, 2000). Stimulácia

produkcie kyselín kmeňom Lb. plantarum bola potvrdená aj u esenciálneho oleja z oregana a rascovej silice

(Kivanc a kol., 1991). Ani vysoký obsah fenolov po aplikácii rastlinných výťažkov neovplyvní počty

laktobacilov v tráviacom trakte zvierat (Mellor, 2000). Nakashima a Yoshikai (1980) preukázali, že fytíny

stimulovali rast baktérií produkujúcich kyselinu mliečnu v beztukovom mliečnom médiu. Nakashima (1997)

popísal, že stimulačný účinok fytínov na Lb. casei, nemožno pripísať zložkám fytínu, ale hlavne mangánu

primiešavanému do fytínových prípravkov. Vodné extrakty zelených rias a morského šalátu stimulovali

produkciu kyselín laktobacilmi.

Baktérie mliečneho kvasenia môžu zabrániť koliformnej hnačke interakciou s enterotoxínmi. Takáto

interakcia môže byť nepriama ovplyvnením populácie E. coli alebo ich metabolizmu, alebo priama

neutralizáciou samotného enterotoxínu. Rastlinné extrakty môžu mať podobnú schopnosť, ktorú možno využiť

pri potencovaní neutralizačného účinku laktobacilov proti enterotoxínu E. coli. Alkoholový výťažok koreňov

Coleus froskohlii Briq. mal výrazný inhibičný účinok proti sekrécii toxínu produkovaného E. coli. Coleonol A a

B, získaný stĺpcovou chromatografiou benzénovej frakcie alkoholového extraktu koreňov Coleus froskohlii mal

antisekrečné účinky. Coleonol A vykazoval takmer 79 % inhibíciu voči sekrécii indukovanej tepelne labilným

(LT) toxínom a 67 % inhibíciu proti sekrécii indukovanej tepelne stabilným (ST) toxínom. Coleonol B

vykazoval nižší účinok voči LT, ale mierne vyšší účinok voči ST enterotoxínom, v porovnaní so široko

používaným antidiarhoickým liekom Loperamidom, ktorý pri podobnom dávkovaní vykazoval inhibíciu 77 %

(LT) resp. 65 % (ST) (Yadava a kol. 1995).

Tieto zistenia do budúcna predstavujú možnosť kombinácie prípravkov na báze rastlinných extraktov

s vybranými laktobacilovými kmeňmi, čím sa zabezpečí inhibícia nežiaducej patogénnej mikroflóry, kým

populácie prospešných mikroorganizmov zostanú nepoškodené, dokonca ich aktivita môže byť stimulovaná

účinnými látkami rastlinných extraktov. Tým sa zabezpečí optimalizácia tráviacich procesov a prevencia

ochorení tráviaceho traktu zvierat.

6.3. Probiotiká a nešpecifické substráty

Na stimuláciu účinku probiotík je možné použiť aj mnohé nešpecifické substráty. Pollman a kol. (1980)

študovali vplyv Lactobacillus acidophilus na prasiatka kŕmené krmivom obohateným o laktózu. U zvierat, ktoré

dostávali kombináciu laktózy a laktobacilov boli zaznamenané najvyššie počty laktobacilov a najvyššie

priemerné denné prírastky v porovnaní s ostatnými skupinami.

Použitie peptidov spoločne s laktobacilmi u prasiat signifikantne znížilo mortalitu spôsobenú hnačkami,

výskyt tráviacich porúch a zlepšilo rastové parametre u zvierat. Ako sa ukázalo, kombinácia peptidov

s laktobacilmi bola účinnejšia ako ich samostatné použitie (Lyons, 1987).

Srvátka, vedľajší produkt mliečneho priemyslu, obsahuje laktózu, rozpustné proteíny, lipidy, vitamíny a

minerálne soli. Prikrmovanie moriek srvátkou zvýšilo efekt aplikácie Lactobacillus reuteri, čo sa prejavilo

zvýšením hmotnostných prírastkov a rezistencie voči salmonelám (Edens a kol., 1991). Bury a kol. (1998)

popísali použitie srvátkového koncentrátu ako nutričného doplnku pre baktérie mliečneho kvasenia. Pridanie

tohto proteínu signifikantne zvýšilo tak počty buniek, ako aj produkciu kyseliny mliečnej laktobacilmi a

17

streptokokmi. Srvátkové proteíny α-laktalbumín a β-laktoglobulín sú vynikajúcimi stimulátormi rastu

bifidobaktérií (Petschow a Taebott, 1990). Proteolytické enzýmy baktérií mliečneho kvasenia majú veľký

význam pre proces tvorby aminokyselín a vitamínov vo fermentovanej srvátke (Law a Haandrikman, 1997).

Srvátková laktóza je vo všeobecnosti lacným zdrojom cukrov pre fermentačné procesy. Viacerí autori navrhujú

použitie technológie imobilizácie buniek pri fermentácii srvátkovej laktózy pre zlepšenie produkcie kyseliny

mliečnej (Roukas a Kotzekidou, 1991; Norton a kol., 1994). Samuelov a kol. (1999) popísali fermentáciu

srvátkovej laktózy Anaerobiospirillom succiniproducens za účelom produkcie nutričných doplnkov pre zvieratá

založených na sukcináte. Sukcinát má potenciál stimulovať tvorbu propionátu v bachore a zvýšiť účinnosť

produkcie (Lyons, 1988). Podľa Romonda a kol. (1998) konzumácia bezbunkovej srvátky pri použití

selektovaného kmeňa bifidobaktérií je schopná modifikovať ekosystém ľudského čreva.

Hyun a Shin (1998) popísali využitie bovinnej krvnej plazmy získanej na bitúnkoch ako zdroja dusíka

pre kultiváciu Lactobacillus sp. Krvný proteínový hydrolyzát v médiu zvyšoval prežívanie kmeňa v procese

lyofilizácie. Podľa uvedených autorov hovädzia krv získaná pri porážke je sľubným zdrojom ekonomickej

produkcie probiotík. Krvné proteíny zostávajúce vo finálnom probiotiku môžu zohrávať ďalšiu úlohu ako

nutričné doplnky.

6.4. Probiotiká a metabolity mikroorganizmov

Väčšina baktérií produkuje rôzne biologicky aktívne metabolity. Najtypickejšími produktami

laktobacilov sú organické kyseliny, ale aj CO2, peroxid vodíka, laktoperoxidázotiokyanátový systém alebo

bakteriocíny (Nemcová, 1997).

Organické kyseliny spolu s probiotikami a špecifickými sacharidmi (bunkové steny kvasiniek) sú často

považované za náhradu antibiotických rastových stimulátorov (Jensen, 1998). Je známy pozitívny vplyv

acidifikácie krmív na gastrointestinálny ekosystém, konverziu krmiva a zdravotný stav zvierat. Prídavok

niektorých organických kyselín ako napr. kyseliny fumarovej (Gedek a kol., 1992), kyseliny mravčej a

propiónovej (Bolduan a kol., 1998) a kyseliny mliečnej (Thomlinson a Lawrence, 1981) do krmiva pre ošípané,

znížil počty koliformných baktérií, pH črevného obsahu a percento úhynu prasiatok. Fermentované krmivá

predstavujú jednu z možností použitia organických kyselín v kombinácii s probiotikami. Sú charakteristické

vysokými počtami kyselinu mliečnu produkujúcich baktérií a kvasiniek (107 – 109 cfu/ml), nízkym pH (cca 4) a

vysokou koncentráciou kyseliny mliečnej. Takéto krmivá následne redukujú počty koliformných zárodkov,

znižuje sa výskyt hnačiek u prasiat a zvyšujú sa produkčné ukazovatele (Jensen, 1988; Moran a kol., 2000).

Podobne fermentované mlieka, ktoré obsahujú baktérie mliečneho kvasenia, ich metabolické produkty a

samotné zložky pochádzajúce z mlieka, zlepšujú rovnováhu črevnej mikroflóry (Djouzi a kol., 1997). Po

podávaní fermentovaného mlieka myšiam bol potvrdený jeho vplyv na zvýšenie rezistencie voči Salmonella

typhimurium aj zvýšenie imunity (Perdigon a kol., 1991).

Bakteriocíny, proteínové zlúčeniny s antimikrobiálnym vplyvom na niektoré druhy baktérií, je možné

využívať ako prirodzenú ochranu potravín pred patogénmi a kontaminujúcimi baktériami (Klaenhammer, 1993;

Lauková a kol., 2000). Napríklad bakteriocín produkovaný kmeňom Enterococcus faecium CCM 4231 znížil

počty Listeria monocytogenes v potravinách (Lauková a kol., 1999; Lauková a kol., 2001). Aby sa dosiahla

vyššia efektivita a úplná eliminácia kontaminujúcich baktérií z potravín, je možné použiť kombináciu dvoch

synergicky pôsobiacich bakteriocínov alebo aplikovať bakteriocín s iným systémom inhibujúcim bakteriálne

18

kontaminanty, ako napr. organické kyseliny (Scanell a kol., 1997) alebo laktoperoxidázový systém (Rodriguez a

kol., 1997). Kolicíny, bakteriocíny produkované určitými kmeňmi E. coli, sú schopné špecificky inhibovať iné

kmene E. coli a príbuzných druhov, medzi nimi aj pôvodcov hnačkových ochorení (Murinda a kol., 1996). V in

vivo podmienkach bola otestovaná preventívna aj terapeutická aplikácia enterocínu A, ktorý je produktom

Enterococcus faeciun EK 13, gnotobiotickým prepeliciam. Výsledkom bolo signifikantné zníženie počtov

Salmonella düsseldorf oproti kontrole, ktorej enterocín nebol podávaný (Lauková, 2003). Z uvedených dôvodov

je možné predpokladať, že spoločné použitie probiotických organizmov s bakteriocínmi by mohlo zlepšovať ich

pozitívny účinok na hostiteľa a to či už znížením kontaminácie krmív patogénmi alebo priamo prevenciou alebo

terapiou hnačkových ochorení.

6.5. Probiotiká a polynenasýtené mastné kyseliny

Ďalšiu možnosť pre zvýšenie účinnosti probiotických baktérií predstavujú mastné kyseliny.

Polynenasýtené mastné kyseliny (PNMK) sú v poslednom období využívané na ovplyvnenie tukového

metabolizmu a imunitného systému zvierat. Bol zistený rozdielny vplyv týchto dvoch skupín na imunitný

systém. n-3 PNMK sa vyznačujú protizápalovým a antiproliferačným vplyvom na bunky imunitného systému. n-

6 PNMK cestou arachidónovej kyseliny naopak pôsobia prozápalovo a imunoregulačne. Do organizmu zvierat

sa PNMK dostávajú výlučne z potravy alebo krmiva, preto sa v súvislosti s nimi hovorí o esencialite. V literatúre

sa uvádza, že PNMK cestou krmiva alebo potravy sa dostávajú do tráviaceho traktu kde môžu ovplyvňovať GIT

mikroflóru tým, že ovplyvňujú rast baktérií (antibakteriálny efekt alebo stimulačný efekt) alebo ovplyvňujú

adherenciu baktérií (sú organickou súčasťou bunkových membrán a sú zodpovedné za ich fluiditu a fyzikálno-

chemické vlastnosti -hrúbku, vlastnosti lipoidnej fázy- a tým môžu ovplyvňovať adherenciu baktérií cestou

modifikácie zloženia lipidov v črevnej stene resp. v stene bakteriálnej bunky). Podľa Brocketta a Tannocka

(1981) relatívne množstvá kyseliny palmitovej a olejovej v diéte môžu ovplyvňovať počty laktobacilov

adherujúcich na mukózu žalúdka myší. Ringo a kol. (1998) zistili zvýšenú kolonizáciu čreva rýb baktériami

produkujúcimi kyselinu mliečnu po prídavku 7% kyseliny linolénovej v diéte, nižšie počty boli zistené po

aplikácii kyseliny linolovej a nízke alebo žiadne počty týchto baktérií po prídavku kokosového oleja. Podobne

fínsky autori v in vitro experimentoch zistili, že n -6 PNMK redukovali adherenciu baktérií produkujúcich

kyselinu mliečnu, zatiaľ čo n -3 PNMK adherenciu zvyšovali. Pri testovaní antimikrobiálneho efektu iba

kyselina linolénová pri nízkej koncentrácii podporovala rast Lactobacillus casei. Pretože adhézia probiotík na

sliznicu čreva zohráva kľúčovú úlohu pri podpore zdravia, vo svojich prácach poukazujú na to, že pôsobenie

probiotík v čreve môže byť ovplyvňované prostredníctvom n -3 PMNK (Kankaanpää a kol., 2001). Zloženie

mastných kyselín v diéte môže ovplyvňovať dynamiku enterocytov. Napríklad skrmovanie tukov kurčatám malo

za následok zvýšenie obratu črevných epiteliálnych buniek a zvýšenie proliferácie hepatocytov (Dibner a kol.,

1996). Taktiež n-3 PNMK ovplyvnili počet gobletových buniek a produkciu mucínu a zvýšili uzdravenie

poškodeného črevného tkaniva infekciou u potkanov (Nieto a kol., 2002).

Kyselina α-linolénová (ALA) je najviac zastúpenou mastnou kyselinou v ľanovom semene (do 60,5%

celkových mastných kyselín) pričom obsah závisí od odrody (DeClercq, 2005). Ľanové semeno je bohaté na

slizovité vo vode rozpustné polysacharidy, ktoré sa nachádzajú hlavne v šupke, ktorá je ťažko oddeliteľná od

endospermu a klíčneho listu a dajú sa extrahovať horúcou vodou (Bhatty, 1995). Ľanové semeno je taktiež

19

bohatým zdrojom fytoestrogénov a rastlinných lignanov. Unikátne chemické zloženie ľanového semena a jeho

špecifických frakcií naznačuje jeho vhodné nutričné „omega-3 PNMK obohatené vajcia a mäso“ (Lewis, 2000;

Kouba a kol., 2003) a antimikrobiálne vlasnosti, avšak jeho vplyv na črevnú mikroflóru prasiat je zatiaľ málo

známy. Smith (2006) sledovala efekt ľanového semena (WF) a jeho frakcií - šupky z ľanového semena (H),

ľanový olej (O) a horúcou vodou extrahované ľanové semeno (HWE) na kolonizáciu komenzálnych

a patogénnych baktérií v ileu kanylovaných prasiat. Diéta obsahujúca šupky získané z ľanového semena

jednoznačne signifikantne zvýšila počty laktobacilov v porovnaní s kontrolou. Podobný efekt avšak

nesignifikantný bol pozorovaný v skupine O. Diéta HWE nemala vplyv na počty laktobacilov. Pomer

laktobacily:enterobaktérie u pokusných skupín bol v rozmedzí od 1,57:1 do 2,04:1 u kontroly 1,43:1.

Signifikantne bol najvyšší v skupine WF.

Podobne Alzueta (2003) zistil vyššie počty laktobacilov u hydiny kŕmenej celým ľanovým semenom

v porovnaní s hydinou kŕmenou ľanovým semenom, z ktorého boli slizovité vo vode rozpustné polysacharidy

odstránené. Tieto vo vode rozpustné ľanové polysacharidy pozostávajú z neutrálnej frakcie a kyslej frakcie.

Kyslú frakciu tvoria hlavne pektinooligosacharidy (obsahujúce L-ramnózu, D-galaktózu a D-kyselinu

galakturonovú), zatiaľ čo neutrálnu frakciu tvorí β-D-(1,4)-xylanová kostra arabinoxylanového komponentu.

Bifidobacterium spp. a Bacteroides spp. sú schopné efektívne utilizovať oligosacharidy ako arabinoxylany (van

Laere, 2000). Počas in vitro štúdií črevnej mikroflóry ľudí sa zistilo, že rozložené arabinoxylany zvyšujú

produkciu propionátu, ako aj počty Bacteroides fragilis (Hopkins a kol., 2003). Nízka molekulová hmotnosť

galaktooligosacharidov môže stimulovať rast bifidobaktérií a laktobacilov v čreve dojčiat (Moro, 2002). Črevná

mikroflóra prasiat je schopná efektívne fermentovať veľké množstvo galaktooligosacharidov ako stachyóza

a rafinóza (Smiricky-Tjardes a kol., 2003). Kyselina oligogalakturonová alebo pektíny nachádzajúce sa v ľane sú

efektívne redukované čistou kultúrou Bacteroides thetaiotaomicron (Dongowski a kol., 2000).

6.6. Probiotiká a vakcíny

Na základe mnohých molekulárno-biologických a genetických štúdií sa zistilo, že kyselinu mliečnu

produkujúce baktérie na svojom povrchu môžu niesť rôzne proteíny a prezentovať antigény, čo umožňuje použiť

tieto baktérie ako nosičov vakcín (Pouwels a kol., 1998; Dieye a kol., 2000). V súčasnej dobe sa venuje stále

viac pozornosti vývoju nových účinných slizničných vakcín, predovšetkým živých orálnych a intranasálnych.

Výhoda takto aplikovaných vakcín je v ochrane slizníc, ktoré sú bránou vstupu mnohých patogénov do

organizmu. Antigény naviazané na bunkový povrch sú menej vystavené degradácii a denaturácii napr.

v tráviacom aparáte a adjuvantná aktivita bunkovej steny zvyšuje imunitnú odpoveď organizmu (Sheshko a kol.,

2000; Dieye kol., 2000).

Methner a kol. (1999) overovali účinnosť kombinácie kompetitívnej exklúzie (CE) a vakcinácie proti

salmonelovej infekcii u kurčiat rôzneho veku. Výsledky ich modelovej štúdie dokazujú, že kombinácia CE a

imunizácie proti salmonelovej infekcii má za následok stupeň ochrany, ktorý značne prevyšuje ten, ktorý sa

dosiahne použitím len jednej z týchto dvoch metód samostatne. Promsopone a kol. (1998) po aplikácii

špecifických protilátok S. typhimurium a kmeňov Lb. acidophilus a Enterococcus faecium brojlerovým

kurčatám v prvý deň života vo forme spreja a orálne po dobu prvých 3 dní po osadení zistili signifikantné

zníženie kolonizácie S. typhimurium v céku a v kolóne brojlerov.

20

6.7. Probiotiká a stopové prvky

Vzťahy medzi mikroorganizmami a minerálnymi látkami, ktoré sa nachádzajú v ich životnom prostredí

sú veľmi rôznorodé. Ich vzájomné interakcie prebiehajú na rôznych úrovniach, buď ako metabolicko-

enzymatické (katalyzátory bakteriálnych enzymatických reakcií, donory alebo akceptory elektrónov

v energetickom metabolizme, enzymatická mikrobiálna detoxifikácia toxických prvkov, anaeróbna biokorózia

kovov, atď.) alebo ako metabolicko-neenzymatické (akumulácia kovov na povrchu, prípadne vo vnútri

bakteriálnej bunky) (Ehrlich, 1997). Z uvedeného vyplýva, že dostupnosť alebo nedostupnosť niektorých

stopových prvkov pre mikroorganizmy ovplyvňuje ich metabolizmus a vlastnosti.

Selén: kvasnice a laktobacily (Lb. delbrueckii subsp. bulgaricus, Lb. casei subsp. casei a Lb. plantarum;

Calomme a kol., 1995) sú schopné koncentrovať selén zo svojho rastového média do buniek vo vysokej

koncentrácii a produkovať organickú formu selénu (napr. selenometionín, selenocysteín) z anorganickej (napr.

selenid alebo seleničitan sodný). Okrem toho kvasnice produkujú selenometionín, ako aj veľké množstvo

zlúčenín selénu, z ktorých mnohé ešte neboli identifikované (Wolffram, 1999). Laktobacily tiež obsahujú zmes

selénu v rôznych chemických formách, ale ich hlavným produktom je selenocysteín (Calomme a kol., 1995).

V súčasnosti sa ako selénový suplement používajú selénom obohatené kvasnice a laktobacily. Chróm:

trivalentný chróm je aktívnou zložkou glukózotolerančného faktora GTF, čo je kofaktor potrebný na

potencovanie inzulínu (Anderson a Mertz, 1977). Kvasnice sú schopné produkovať GTF a teda slúžiť ako

potravinový doplnok bioaktívnej a netoxickej formy chrómu (Ingledew, 1999). Železo: pozícia Fe

v bakteriálnom metabolizme je špecifická. Fe je základnou živinou pre všetky mikroorganizmy s výnimkou

rodu Lactobacillus, ktorý namiesto toho využíva mangán a kobalt (Archibald, 1983). Na druhej strane môže Fe

reagovať s redukovanými formami kyslíka, čo vedie k produkcii voľných radikálov, ktoré sú zodpovedné za

peroxidatívne zmeny bunkových membrán, a preto je potrebné striktne kontrolovať homeostázu Fe.

Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus a Lb. acidophilus sú schopné oxidovať Fe2+ a viazať Fe(OH)3 na

bunkový povrch (Kot a kol. 1997). Viazanie železa bifidobaktériami a laktobacilmi, ktoré sa rozsiahle využívajú

ako probiotiká, môže slúžiť na redukovanie disponibility železa pre patogénne mikroorganizmy. Mangán:

Určité druhy laktobacilov, napr. Lb. plantarum, Lb. casei subsp. casei (Calomme a kol., 1995) sú schopné

koncentrovať vysoké hladiny mangánu, čo súvisí s ich pseudokatalázovou a superoxidismutázovou aktivitou.

Tieto kmene sú tolerantnejšie voči peroxidom kyslíka a vodíka, voči radikálom týchto peroxidov (Archibald,

1986). Pridanie mangánu do rastového média zvyšuje počty životaschopných Lb. casei subsp. casei a Lb.

plantarum v porovnaní s nesuplementovanými kultúrami (Callome a kol., 1995). Zinok: Zn je esenciálny

mikroprvok pre všetky živé systémy vrátane mikroorganizmov. Zn je dôležitý tak pre stabilitu, ako aj pre

činnosť alkoholdehydrogenázy (izolovanej napr. z kvasníc a Bacillus subtilis) ako aj pre stabilitu mnohých

ďalších mikrobiálnych zinočnatých metaloenzýmov (Fridovich, 1978; Magonet a kol., 1992). Napriek tomu, že

zinok hrá úlohu ako štrukturálny a katalytický kofaktor mnohých metaloproteínov, jeho aplikácia

prostredníctvomm probiotík nie je veľmi preskúmaná. Sú však dobre známe antimikrobiálne účinky zinku.

Zinok inhibuje rast E. coli., Ent. faecalis, niektorých druhov pôdnych baktérií a húb. Tento inhibičný účinok

zinku sa úspešne využíva v liečbe poodstavovej hnačky prasiat (Holm a Poulsen, 1996).

21

7. Nové poznatky získané pri štúdiu účinku probiotických baktérií a naturálnych látok na moduláciu

biologických bariér tráviaceho traktu zvierat

7.1. Vplyv aplikácie laktobacilov a fruktooligosacharidov na inhibíciu salmonel v tráviacom trakte

kurčiat

Kmene laktobacilov boli izolované z tráviaceho traktu domácej dospelej hydiny a selektované na

základe rastu v prítomnosti žlčových kyselín, žalúdočnej šťavy, citlivosti na ATB, inhibičnej aktivity, agregačnej

a koagregačnej schopnosti. Na základe uvedených kritérií výberu bol vytipovaný kmeň Lactobacillus fermentum

2I3.

V pokuse na konvenčných prepeličích kuriatkach bol porovnávaný rast a kolonizácia GIT kmeňom

Lactobacillus fermentum 2I3 v lyofilizovanenej a aktivovanej forme v intervale od 0.-24. hodine po jeho

jednorázovej aplikácii. Výsledky poukazujú na rozdielnosť oboch skupín v percentuálnom výskyte nenulových

hodnôt a v priemernej kvantite živých mikrobiálnych buniek vo fekáliách vylúčených za 1 hodinu. Hodnoty

obidvoch parametrov zistené v skupine, ktorá dostávala aktivovanú formu Lactobacillus fermentum 2I3 (skupina

2) boli vyššie ako v skupine, ktorej bola aplikovaná lyofilizovaná forma kmeňa (skupina 1). Časový priebeh

percenta výskytu nenulových hodnôt bol u oboch skupín podobný. Maximálne hodnoty boli zistené v 2. a 16.

hodine po aplikácii kmeňa (Graf 1).

Graf 1: Výskyt nenulových hodnôt v %

Časový priebeh priemernej kvantity mikrobiálnych buniek v truse vylúčených za 1 hodinu u oboch skupín bol

rôzny. Pri aplikácii aktivovanej formy kmeňa bola zistená krivka s maximálnymi hodnotami v 2.,4. a 16. hodine,

zatiaľ čo pri aplikácii lyofilizovanej formy kmeňa iba v 10. hodine (Graf 2).

22

Graf 2: Priemerná kvantita mikrobiálnych buniek v truse za hod.(x50)

,

V ďaľšom pokuse bol sledovaný vplyv Lactobacillus fermentum 2I3 a fruktooligosacharidov (FOS) na

počty Salmonella enterica var. Düsseldorf v truse a tráviacom trakte gnotobiotických prepeličích kuriatok. V in

vitro podmienkach uvedený laktobacilový kmeň bol schopný rásť v prostredí 0,3 % žlčových kyselín

a žalúdočnej šťavy pH 2,5, prejavoval inhibičnú aktivitu voči indikátorovým kmeňom s priemerom inhibičných

zón 18-34 mm, vykazoval agregačnú a koagregačnú schopnosť a produkoval kyselinu mliečnu a octovú. In vitro

testy tiež potvrdili jeho rast v prítomnosti fruktooligosacharidov. Naproti tomu kmeň Salmonella enterica var.

Düsseldorf nerástol v prítomnosti testovaných FOS. Bol zaznamenaný inhibičný efekt Lb. fermentum 2I3 na

počty salmonel vo všetkých sledovaných vzorkách gnotobiotických prepeličích kuriatok. Počty Salmonella

enterica var. Düsseldorf vo výkaloch pokusných skupín odobratých po 8. – 24. a 48. hodine od infekcie boli

nižšie v rozmedzí od 0,4-1,2 log oproti kontrole (Graf 3). Počty salmonel v céku, ileu a truse pokusných skupín

odobratých po 168. hodine od infekcie boli nižšie v rozmedzí od 0,5 – 1,8 log oproti kontrole (Graf 4). Vo

všetkých prípadoch bol zaznamený potencujúci účinok fruktooligosacharidov na inhibičnú aktivitu Lb.

fermentum.

Graf 3: Počty Salmonella enterica var. Düsseldorf v céku, ileu a truse prepeličích kurčiat

23

Graf 4: Počty Salmonella enterica var. Düsseldorf v truse prepeličích kurčiat

Závery pre realizáciu v spoločenskej praxi

Na základe týchto výsledkov bol vypracovaný metodický postup nového konceptu prevencie

salmonelóz u hydiny, ktorý spočíva v preventívnej aplikácii potencovaného probiotického prípravku na báze

Lactobacillus fermentum a fruktooligosacharidov. Laktobacily konkurujú uchyteniu salmonel na sliznici čreva

a zároveň produkciou organických kyselin vytvárajú nevhodné prostredie pre ich množenie, podporujú činnosť

tráviacich enzýmov a pozitívne stimulujú imunitný systém k lepšej ochrane pred chorobami. Prebiotikum -

fruktooligosacharid podporuje rast a množenie prirodzenej črevnej mikroflóry vrátane probiotických

laktobacilov v čreve. Uvedený postup je v súčasnosti overovaný v terénnych podmienkach so zameraním sa na

sledovanie zdravotných a produkčných parametrov u hydiny. Praktickým výsledkom výskumu bude vývoj

nového probiotického prípravku pre hydinu PRO-BIOCENOL PO – ako preventívneho prípravku na tlmenie

salmonelóz hydiny, ktorý napomôže zníženiu rizika prenosu salmonel do ľudskej populácie a to hydinovým

trusom, kontaminovanou technikou a náradím, vajcami, jednodňovou hydinou a hydinovým mäsom. Prípravok

bude využívaný v živočíšnej výrobe priamo v poľnohospodárskych podnikoch.

7.2. Vplyv zlúčenín zinku na inhibičnú aktivitu laktobacilov voči črevným patogénnym baktériám

Podľa doterajších výskumov sa zdá, že zinok je esenciálny pre všetky živé systémy, vrátane

mikroorganizmov. Sú známe mnohé mikrobiálne zinok obsahujúce enzýmy nevyhnutné pre bunkový

metabolizmus. Na druhej strane sú však známe antimikrobiálne vlastnosti zinku. Citlivosť baktérií voči zinku

v prostredí je nielen druhovo, ale aj kmeňovo závislá.

V in vitro štúdiách bol sledovaný vplyv zinočnatých zlúčenín na baktérie, v rámci ktorých bol

sledovaný vplyv síranu zinočnatého na probiotický, voči vysokým koncentráciám zinku tolerantný kmeň

Lactobacillus plantarum, ďalej bolo sledované pôsobenie rôznych zinočnatých zlúčenín na rast G+ a G- baktérií a

bol porovnaný účinok anorganickej (ZnSO4) a organickej (propionát zinočnatý) formy zinku na vlastnosti a rast

patogénov a probiotických laktobacilov. Kým nízke koncentrácie <100 mg Zn2+/l rastového média

24

neovplyvňovali rast a probiotické vlastnosti Lactobacillus plantarum, koncentrácie 100 – 500 mg Zn2+/l mali

stimulačný vplyv na celkové počty, produkciu organických kyselín, adherenciu na izolované prasačie enterocyty

a inhibíciu patogénov, vysoké koncentrácie >500 mg Zn2+/l tieto vlastnosti inhibovali. Síran zinočnatý

v koncentrácii 250 mg Zn2+/l neznižoval rezistenciu Lactobacillus plantarum voči pôsobeniu nízkeho pH (pH 2)

a žlčovým soliam. Ďalej bol sledovaný rozdiel v účinku síranu zinočnatého, ako anorganickej formy a

propionátu zinočnatého, ako organickej zlúčeniny Zn na niektoré probiotické vlastnosti Lb. plantarum a Lb.

fermentum. Najvyššie počty KTZ boli ako pri Lb. plantarum tak aj pri Lb. fermentum zaznamenané po prídavku

ako síranu tak aj propionátu zinočnatého v koncentrácii 500 mg Zn2+/l rastového média. Podobne ako síran

zinočnatý, aj propionát zinočnatý pozitívne ovplyvnil adherenciu na izolované prasačie enterocyty a inhibíciu

patogénov (E.coli O8:K88+ent+, Salmonella enterica ser. Düsseldorf) a to nielen pri kmeni Lb. plantarum, ale aj

pri Lb. fermentum. Propionát zinočnatý mal výraznejší vplyv na laktobacily ako síran zinočnatý. Zinok vo forme

síranu ani propionátu (konc. 0 – 2500 mg Zn2+/l) neovplyvňoval citlivosť laktobacilov na antibiotiká. Pri

sledovaní inhibičnej aktivity rôznych zlúčenín zinku na G- a G+ baktérie sme zistili silnú antibakteriálnu

účinnosť karboxyláto-zinočnatých komplexov, v ktorých bol hlavným nositeľom inhibičnej aktivity zinok. Ak

bol na komplexoch naviazaný ligand – teofilín, fenazón alebo nikotínamid, antibakteriálny účinok sa výrazne

zvýšil. Gramnegatívne baktérie boli výrazne citlivejšie na pôsobenie všetkých testovaných zinočnatých zlúčenín

v porovnaní s grampozitívnymi baktériami. Výrazne najrezistentnejšie boli testované laktobacily.

In vivo štúdie boli zamerané na porovnanie účinku podávania samotného Lb. fermentum a kombinácie

tohto kmeňa s propionátom zinočnatým na Salmonella enterica var. Düsseldorf u japonských prepelíc a účinnosť

Lactobacillus plantarum v kombinácii so síranom zinočnatým na počty E. coli O8:K88+ent+ u odstavčiat.

Aplikácia Lb. fermentum a kombinácie tohto kmeňa s propionátom zinočnatým prepeličím kurčatám

experimentálne nakazeným Salmonella enterica var. Düsseldorf poukázala na výrazné zníženie počtov trusom

vylučovaných salmonel, a to už od 8. hodiny po infekcii, ako aj počtov salmonel v obsahu slepých čriev (Graf 5

a 6), takisto došlo k redukcii počtov celkových aeróbov a zvýšeniu hmotnostných prírastkov, pričom účinok Lb.

fermentum na baktérie bol prídavkom Zn-propionátu pozitívne ovplyvnený. Aplikácia Lb. plantarum

v kombinácii so síranom zinočnatým (1500 ppm) 5 dní pred a 14 dní po odstave prasatám, ktoré boli v deň

odstavu experimentálne infikované enterotoxigénnym kmeňom E. coli O8:K88+ent+ signifikantne znížila počty

trusom vylučovaných E. coli, celkových aeróbov, zvýšila zastúpenie laktobacilov (p<0,05-0,001), zvýšila

priemerné denné prírastky a fagocytárnu aktivitu neutrofilov. Účinok laktobacilov bol vo všetkých

experimentoch na zvieratách pozitívne ovplyvnený prídavkom zinku a súčasne bola zabezpečená optimálna

suplementácia organizmu zvierat zinkom.

25

Graf 5: Počty Salmonella enterica var. Düsseldorf v truse prepeličích kurčiat v rôznom čase po infekcii.

0

2

4

6

8

10

8h 24h 48h 7d

odber

log10 K

TZ

/g

kontrola Lb.fermentum Lb.fermentum+Zn(prop)2

* *

* * * *

* p<0,001

* *

Graf 6: Zastúpenie sledovaných bakteriálnych druhov v obsahu slepých čriev 7 dní po infekci Salmonella

enterica var. Düsseldorf.

0

2

4

6

8

10

12

salmonely aeróby lactobacily

log

10

KT

Z/g

kontrola Lb.fermentum Lb.fermentum+Zn(prop)2

*

*

*•

*

*p<0,001 •p<0,05

*

26

Závery pre realizáciu v spoločenskej praxi a daľší rozvoj vedy

Výsledky týchto experimentov rozširujú poznatky o inhibičných resp. potenciačných účinkoch širokej

škály zlúčenín zinku na rôzne druhy patogénnych a probiotických baktérií a poskytujú podklady pre ďalší

výskum v tejto oblasti. Pokusy, v ktorých boli testované mnohé nové koordinačné zlúčeniny Zn s bioaktívnymi

ligandami odkrývajú možnosti ich farmakologického využitia pre selektívne ovplyvňovanie mikroorganizmov,

ktorého základom je ich rozdielny vplyv na G- a G+ baktérie. Výsledky in vitro štúdií boli následne využité pri

realizácii experimentov na zvieratách, ktoré potvrdili výhody spoločnej aplikácie probiotických kmeňov

laktobacilov a zinku pri úprave zloženia črevnej mikroflóry, potláčaní črevných patogénnych baktérií, stimulácii

rastových schopností a imunity a suplementácii makroorganizmu týmto stopovým prvkom. Získané výsledky

odkrývajú nové cesty k zvyšovaniu účinnosti probiotík pri prevencii bakteriálnych hnačkových ochorení

ošípaných a hydiny a môžu byť základom pre ďalší výskum, ktorého výsledkom by mohol byť vývoj nového

probiotického prípravku na báze laktobacilov a zinku. Probiotické prípravky s obsahom zinku by tak mohli

predstavovať účinnú prevenciu na jednej strane voči hnačkovým ochoreniam a na strane druhej voči nedostatku

zinku v makroorganizme. Jeho karencie môžu spôsobiť vo veľkochovoch ošípaných a hydiny vysoké

ekonomické straty, predovšetkým v dôsledku ich hromadného výskytu. K rozšíreniu poznatkov v tejto oblasti by

prispeli štúdie o vplyve ďalších mikro prípadne makroelementov vo vzťahu k baktériám s cieľom vývinúť nové

účinnejšie probiotické prípravky, ktoré by súčasne suplementovali organizmus daným prvkom alebo prvkami.

7.3. Sledovanie inhibičnej aktivity rastlinných esenciálnych olejov (EO) voči črevným baktériám a vplyvu

kombinácie laktobacilov a EO na inhibíciu salmonel

V súčasnej dobe sa vedecký výskum v oblasti naturálnych aditív okrem iného sústreďuje aj na aplikáciu

vyselektovaných rastlinných extraktov alebo esenciálnych olejov (EO) do krmív zvierat, za účelom zlepšenia

zdravotného stavu zvierat a zvýšenia ich produktivity. Esenciálne oleje svojim antimikrobiálním účinkom môžu

ovplyvňovať mikroflóru tráviaceho traktu, zvyšujú sekréciu tráviacich štiav čím stimulujú a zároveň

optimalizujú tráviace procesy a taktiež vykazujú imunostimulačné účinky. Jedným z dôležitých kritérií,

nevyhnutných pre používanie rastlinných extraktov vo väčšom rozsahu, je poznanie vlastností a aktivity ich

jednotlivých účinných zložiek hlavne z hľadiska toxických vplyvov pri aplikácii vyšších koncentrácií, ale tiež

z hľadiska možnosti kombinácie fytoaditív s inými biologicky aktívnymi látkami so zámerom synergizácie ich

účinkov.

V in vitro pokusoch bola sledovaná inhibičná aktivita rastlinných EO voči 11 druhom patogénov z

rodov Salmonella, Bacillus, Staphylococcus, Proteus a E. coli a tiež voči 18 nepatogénnym druhom baktérií

z rodov Enterococcus a Lactobacillus. MIC bola zaznamenaná v rozmedzí 0,1–7,5%-ných koncentrácií EO,

pričom boli sledované rozdiely medzi jednotlivými testovanými kmeňmi. Pri tymiánovom oleji bola

zaznamenaná MIC už pri použití 0,1% koncentrácie oleja a to konkrétne u nasledovných kmeňov: E. coli 08, E.

coli O149, Lb. plantarum a Lb. fermentum. Pre S. aureus bola stanovená MIC pri koncentrácii oleja 0,2%

a u Salmonella enterica var. Düsseldorf a Salmonella enterica ser. Choleraesuis pri koncentrácii 0,25%.

Oreganový EO vykazoval MIC pri podobných koncentráciách ako tymiánový, pri 0,15% u E. coli O149,

Salmonella enterica var. Düsseldorf, Salmonella enterica ser. Choleraesuis, Lb. plantarum a Lb. fermentum,

27

kým pre S. aureus a E. coli O8 to bolo pri 0,2%. Pri 0,15% koncentrácii klinčekového oleja bola sledovaná MIC

u všetkých testovaných patogénov (S. aureus, obidva kmene E. coli a obidva salmonelové kmene). Rast

laktobacilových kmeňov pri tejto koncentrácii nebol inhibovaný, MIC bola u týchto kmeňov bola sledovaná až

pri použití 0,4% koncentrácie oleja. MIC čajovníkového oleja bola 0,5% pre oba kmene E. coli, o niečo vyššia -

1% pre S. aureus a obidva salmonelové kmene a 2% pre oba laktobacilové kmene. 5%-ná koncentrácia

šalviového EO bola stanovená ako MIC pre E. coli O149 a S. aureus, koncentrácia 5-6% pre E. coli O8 a pre

všetky ostatné testované bakteriálne kmene to bola 7,5%-ná koncentrácia oleja. MIC u ďalších troch testovaných

EO (rozmarínový, citrónový a rumančekový) bola zaznamenaná až pri použití koncentrácie vyššej ako 7,5%

(s výnimkou rozmarínového oleja, pri ktorom bola sledovaná MIC u oboch laktobacilových kmeňov pri použití

2,5% koncentrácie) pre všetky testované bakteriálne kmene. V druhej časti práce bol sledovaný rast vybratých

baktérií kultiváciou a stanovením pH a absorbancie v živnom médiu. Použité boli EO z oregana a tymiánu

v dvoch koncentráciách, 0,05% a 0,1%. Obidve koncentrácie esenciálnych olejov inhibovali rast E. coli a

salmonel po 24 hod. inkubácii vo vodnom kúpeli oproti kontrole bez prídavku esenciálnych olejov. Na druhej

strane sme zistili, že 0,05% koncentrácia oreganového aj tymiánového oleja nemala inhibičný vplyv na rast

oboch kmeňov laktobacilov. Ich rast bol potvrdený znížením pH a stúpajúcimi hodnotami absorbancie. Je to

dôležitý poznatok z hľadiska kombinácie EO s potenciálnymi probiotickými kmeňmi. Na základe in vitro testov

(metóda MIC) sme vyselektovali EO oregána a tymiána, ktoré vykazovali najvyššiu bakteriocídnu aktivitu na

patogénne G- indikátorové kmene. Karvakrol aj tymol, ako účinné látky týchto esenciálnych olejov, sú schopné

spôsobiť dezintegráciu vonkajšej membrány gramnegatívnych baktérií, s uvoľnením lipopolysacharidov

a zvýšením permeability cytoplazmatickej membrány. Zistili sme zvýšenú vnímavosť indikátorových kmeňov

pri použití kombinácie EO oregána a pomnoženej kultúry laktobacila v in vitro podmienkach. Udáva sa, že in

vitro inhibičný efekt rastlinných extraktov je silnejší pri kyslejšom pH, znižuje sa so zvyšujúcou sa hodnotou pH.

Najsilnejší inhibičný efekt bol dokázaný pri pH pohybujúcom sa v rozmedzí 3-4. Pri nízkom pH sa hydrofóbnosť

esenciálnych olejov zvyšuje a tým sa silice stávajú ľahšie rozpustnými v lipidoch bunkových membrán

cieľových baktérií.

V pokuse na konvenčných prepeličích kuriatkach sme testovali vplyv rôznych koncentrácií EO oregána

a tymiána (0,1%-0,05%-0,025%-0,013%-0,006%) na počty Salmonella enterica ser. Düsseldorf a Lb. fermentum

v truse a céku zvierat. Sledovali sme dynamiku zmien z hľadiska ich časového rozvoja i z hľadiska rôznych

koncentrácií. Kuriatka boli individuálne vážené na začiatku pokusu a pri odberoch. Zvieratám bola aplikovaná

jednorazovo per orálne Salmonella enterica ser. Düsseldorf v prvý deň veku. Lb. fermentum a rôzne

koncentrácie EO boli podávané kontinuálne v krmive hneď po narodení. Vyšetrované boli zmesné vzorky trusu

z každej skupiny vyprodukované za 1 hodinu. Vzorky boli odoberané po 8., 24., 48., 72. a 96. hodine

v skupinách infikovaných salmonelou s prídavkom EO oregana resp. tymiána v krmive a v skupinách, ktorým

bol aplikovaný Lb. fermentum a EO. Ako kontrola boli použité zvieratá infikované len salmonelou resp. ktorým

bol aplikovaný len laktobacil a zvieratá bez infekcie a aditív. Zistili sme, že koncentrácia EO oregana a tymiána

0,05% najúčinnejšie inhibovala počty salmonel v truse prepeličích kurčiat. Táto inhibícia sa najvýraznejšie

prejavila po 96. hodine od infekcie keď v kontrolnej skupine počty salmonel boli 4,82 log KTJ/g a v pokusných

skupinách 2,11 resp. 3,48 log KTJ/g. Počty laktobacilov v pokusných skupinách neboli ovplyvnené počas

jednotlivých odberov oproti kontrole. EO pozitívne ovplyvnili priemerné denné prírastky hlavne v skupinách kde

28

bol aplikovaný EO oregana v koncentrácii 0,05%-0,025%-0,013% a Lb. fermentum ( o 50% vyššie prírastky

oproti kontrolnej skupine). Tento efekt súvisel aj s vyššou žravosťou týchto zvierat.

V ďalšom pokuse sme sa zamerali na sledovanie účinku rastlinných esenciálnych olejov (oregano a

tymián v koncentrácii 0,05%) pri súčasnom podávaní probiotického kmeňa Lb. fermentum 2I3 na redukciu

Salmonella enterica var. Düsseldorf u kurčiat. V skupine SLOT (kombinovaná aplikácia laktobacilov aj

esenciálnych olejov) došlo k redukcii kolonizácie hrvoľov a slepých čriev salmonelami o 86% a 57%

v porovnaní s kontrolnou skupinou. Pri aplikácii len laktobacilového kmeňa (SL) došlo k redukcii kolonizácie

hrvoľov kurčiat o 43% a v prípade aplikácie len esenciálnych olejov (SOT) o 57% oproti kontrole. Záchyt

salmonel v pečeni a slezine experimentálnych kurčiat v kontrolnej skupine (SC) bol 57% a 43%. U kurčiat

v skupine SLOT nebol zaznamenaný žiadny záchyt salmonel ani v pečeni ani v slezine experimentálnych zvierat

(Graf 7). Najlepšie výsledky boli dosiahnuté v skupine SLOT, táto kombinácia sa zdá vhodnou na potlačenie,

resp. redukciu kolonizácie hrvoľov a slepých čriev salmonelovými infekciami u mladých kurčiat.

V experimente na brojleroch sme sledovali vplyv kombinovanej aplikácie Lb. fermentum a EO oregana

a tymiána na produkciu organických kyselín v tráviacom trakte, mikroflóru tráviaceho traktu a hmotnostné

prírastky. Pokusným zvieratám bol počas obdobia 42 dní aplikovaný Lb. fermentum vo vode a zmes EO

v koncentrácii 0,05% v krmive. V cekálnom obsahu a v obsahu hrvoľa pokusných zvierat bola zistená

signifikantne vyššia koncentrácia kyseliny maslovej (p<0,01) a acetoctovej (p<0,001) oproti kontrolnej skupine.

Aplikácia EO oregana a tymiána neovplyvnila počty sledovanej prirodzenej mikroflóry (celkové aeróby, celkové

anaeróby, enterobaktérie, enterokoky, laktobacily) ani podávaného kmeňa Lb. fermentum. Zaznamenali sme

signifikantné zvýšenie hmotnostných prírastkov (p<0,01) oproti kontrolnej skupine.

Graf 7: Percentuálny výskyt Salmonella enterica var. Düsseldorf v orgánoch kurčiat 5 dní po infekcii

0

20

40

60

80

100

Hrvoľ Cékum Pečeň Slezina

%

SC

SL

SOT

SLOT

29

Závery pre realizáciu v spoločenskej praxi a daľší rozvoj vedy

Výsledky týchto experimentov rozširujú poznatky o inhibičných resp. potenciačných účinkoch

rastlinných esenciálních olejov na rôzne druhy patogénnych a probiotických baktérií a poskytujú podklady pre

ďalší výskum v tejto oblasti. Výsledky in vitro štúdií boli následne využité pri realizácii experimentov na

zvieratách, ktoré potvrdili výhody spoločnej aplikácie probiotických kmeňov laktobacilov a rastlinných

esenciálních olejov voči salmonelám. Získané výsledky odkrývajú nové cesty k zvyšovaniu účinnosti probiotík

pri prevencii salmonelóz hydiny a môžu byť základom pre ďalší výskum, ktorého výsledkom by mohol byť

vývoj nového probiotického prípravku na báze laktobacilov a rastlinných esenciálních olejov.

7.4. Sledovanie adherenčnej schopnosti laktobacilov na črevnú mukózu prasiat

Adherenčná schopnosť probiotických mikroorganizmov je rozhodujúcim kritériom pre ich kolonizáciu

v tráviacom trakte. Použité 2 druhovo špecifické kmene laktobacilov - Lb. casei a Lb. fermentum boli izolované

z črevného traktu prasiatok. Tieto kmene sa vyznačovali pomerne dobrou adherenciou v in vitro podmienkach.

Oba kmene sa vyznačovali schopnosťou adherovať na mukózu jejuna a ilea pričom počty laktobacilov vo

všetkých prípadoch sa signifikantne zvýšili na 5. deň po poslednej aplikácii (p< 0,05) čo poukazuje na to, že

kmene kolonizovali mukózu čreva a boli schopné v tomto prostredí rásť a množiť sa. Bola potvrdená korelácia

medzi schopnosťou adherovať v in vitro a in vivo podmienkach. V slizničnom filme jejuna inokulovaných

ciciakov boli zistené signifikantne (p<0,05) vyššie koncentrácie kyselín mliečnej (25,3 vs. 10,8 mmol.l-1),

propionovej (18,5 vs. 5 mmol.l-1) a acetoctovej (297 vs. 112 mmol.l-1) v porovnaní s ich koncentráciou v obsahu

jejuna a nesignifikantne zvýšená koncentrácia kyseliny octovej (11,0 vs. 5,8 mmol.l-1). V ileu gnotobiotických

ciciakov bola zistená signifikantne vyššia koncentrácia kyseliny propionovej v slizničnom filme v porovnaní

s obsahom (21,2 vs. 9,5 mmol.l-1, p<0,05). Vyššie koncentrácie kyseliny mliečnej, octovej a acetoctovej

v slizničnom filme ilea neboli signifikantné. Dosiahnuté výsledky naznačujú, že signifikantne vyššie

koncentrácie organických kyselín produkovaných laktobacilmi v slizničnom filme monogastrov v porovnaní

s ich koncentráciou v črevnom obsahu môžu predstavovať účinnú bariéru inhibujúcu adhéziu patogénov

tráviaceho traktu na črevnú sliznicu. Zaujímavým bol aj poznatok, že kmene rôzne kolonizovali jednotlivé úseky

čreva. Lb. casei lepšie kolonizoval mukózu ilea a Lb. fermentum lepšie kolonizoval mukózu jejuna. To že

laktobacily sú schopné kolonizovať mukózu jednotlivých úsekov čreva s rôznou aktivitou je dôležité z hľadiska

selekcie takých probiotických kmeňov, ktoré kolonizujú rovnaké úseky čreva ako enteropatogénne E. coli.

7.5. Vplyv krátkodobej a kontinuálnej aplikácie laktobacilov na inhibíciu E. coli K88 v tráviacom trakte

prasiat

Cieľom našej práce bolo študovať vplyv krátkodobej a kontinuálnej preventívnej aplikácie

Lactobacillus casei voči E. coli na aktuálnu aciditu a koncentráciu organických kyselín v tráviacom trakte

gnotobiotických prasiatok. V dvoch experimentoch boli prasiatka rozdelené do pokusnej skupiny (L-E) a

kontrolnej skupiny (E). V prvom experimente, pri krátkodobej preventívnej aplikácii bola skupina L-E

inokulovaná Lb. casei vo veku 2, 3 a 4 dni. V druhom experimente, pri kontinuálnej aplikácii bola pokusná

skupina (L-E) inokulovaná Lb. casei denne, počas celého experimentu (od 2. do 10. dňa života). Vo veku 5 dní

30

boli prasiatka v pokusnej skupine (L-E) i kontrolnej skupine (E) v oboch experimentoch inokulované E. coli O8:

K88.V prvom experimente pri krátkodobej preventívnej aplikácii Lb. casei malo pH obsahu tráviaceho traktu

gnotobiotických prasiatok vzostupný charakter od duodena po ileum, s následným poklesom v kolóne, v oboch

sledovaných skupinách. pH obsahu duodena a jejuna dosahovalo nižších hodnôt u prasiatok v pokusnej skupine

(L-E), zatiaľ čo v ďalších úsekoch črevného traktu u prasiatok kontrolnej skupiny E so signifikantným rozdielom

(p<0,05) v ileu (skupina E 7,03 ± 0,16, skupina L-E 7,63 ± 0,22). Pri kontinuálnej preventívnej aplikácii Lb.

casei vykazovalo pH tráviaceho traktu kolísavý charakter s najvyššími hodnotami v kolóne. Okrem duodena,

dosahovalo pH tráviaceho traktu gnotobiotických prasiatok nižších hodnôt v skupine L-E s najväčším rozdielom

v jejune (skupina E 6,28 ± 0,57, skupina L-E 6,1 ± 0,24), pričom rozdiely medzi skupinami neboli signifikantné.

Pri krátkodobej aplikácii Lb. casei bola koncentrácia kyseliny mliečnej a kyseliny octovej v obsahu jejuna a ilea

gnotobiotických prasiatok nižšia v skupine L-E v porovnaní so skupinou E. Naopak, pri kontinuálnej aplikácii

Lb. casei dosahovala koncentrácia oboch kyselín vyšších hodnôt v skupine L-E v jejune a ileu. Pri kontinuálnej

aplikácii boli rozdiely medzi sledovanými skupinami u kyseliny mliečnej (skupina E 33,5 ± 1,8 mmol/l, skupina

L-E 53,3 ± 13,1 mmol/l) i kyseliny octovej (skupina E 17,3 ± 5,9 mmol/l, skupina L-E 24,5 ± 9,6 mmol/l) väčšie

v ileu. Rozdiely medzi skupinami neboli signifikantné. Štatisticky nevýznamné rozdiely medzi sledovanými

skupinami boli zistené v koncentrácii kyseliny propiónovej, tak pri krátkodobej, ako aj pri kontinuálnej aplikácii

Lb. casei. Pri krátkodobej aplikácii Lb. casei bola koncentrácia kyseliny maslovej vyššia u gnotobiotických

prasiatok skupiny L-E v obsahu jejuna a nižšia v obsahu ilea, bez signifikantných rozdielov. Koncentrácia

kyseliny maslovej dosiahla pri kontinuálnej aplikácii Lb. casei v oboch sledovaných úsekoch tráviaceho traktu

vyšších hodnôt v skupine E, so signifikantným rozdielom v ileu (skupina E 2,7 ±0,9 mmol/l, skupina L-E 1,5 ±

0,3 mmol/l).Vo veku 7 dní neboli zistené výrazné rozdiely v počtoch E. coli O8:K88 adherovaných na mukózu

jejuna medzi sledovanými skupinami pri krátkodobej, ani pri kontinuálnej aplikácii Lb. casei Vo veku 10 dní pri

krátkodobej aplikácii Lb. casei adherovali E. coli O8: K88 na sliznicu jejuna gnotobiotických prasiatok

v skupine E v počtoch 7,23 log 10.cm-2 a v skupine L-E v počtoch 6,98 log 10.cm-2. V rovnakom veku pri

kontinuálnej aplikácii Lb. casei boli počty E. coli O8: K88 adherovaných na sliznicu jejuna prasiatok v skupine

L-E (5,6 log 10.cm-2) signifikantne nižšie (p< 0,05) ako v skupine E (7,2 log 10.cm-2). U gnotobiotických

prasiatok, ktorým bol kontinuálne preventívne aplikovaný Lb. casei sme zistili v porovnaní s kontrolnou

skupinou vyššiu koncentráciu kyseliny mliečnej a octovej v jejune a ileu sprevádzanú nižším pH ich obsahu.

Kontinuálna aplikácia Lb. casei mala výrazný inhibičný efekt voči adhézii E. coli adherovaných na sliznicu.

Výsledky našej práce ukazujú, že kontinuálna preventívna aplikácia Lb. casei voči E. coli mala v porovnaní s

krátkodobou preventívnou aplikáciou pozitívnejší vplyv na produkciu organických kyselín, aktuálnu aciditu

a inhibíciu adhézie E. coli O8: K88 v tráviacom trakte gnotobiotických prasiatok.

7.6. Efekt aplikácie Lactobacillus casei a fruktooligosacharidov (FOS) na počty fekálnych baktérií,

koncentráciu fekálnych organických kyselín a imunitný systém odstavčiat.

Oligosacharidy sú využívané ako špecifické rastové substráty prospešnými baktériami. Nie sú

využívané patogénmi, resp. potenciálnymi patogénmi. Oligosacharidy indukujú enzymatický systém

prospešných baktérií, ktorý ich štiepi na organické kyseliny a plyny. Tým sa vytvárajú priaznivé podmienky pre

kolonizáciu tráviaceho traktu prospešnými baktériami a naopak, rast nežiadúcej mikroflóry je potlačený.

31

Kombinácia probiotík s oligosacharidami môže zabezpečiť zvýšenie prežívania probiotického kmeňa počas

pasáže tráviacim traktom a jeho začlenenie medzi endogénne baktérie a tým stimulovať rast a aktivitu tak

exogénnych (probiotických) ako aj endogénnych baktérií.

V in vivo pokuse bol sledovaný efekt aplikácie Lactobacillus casei a fruktooligosacharidov na počty

fekálnych baktérií, koncentráciu fekálnych organických kyselín a imunitný systém odstavčiat. Zistili sme, že vo

féces pokusných zvierat, ktorým bola podávaná zmes Lactobacillus casei a FOS, boli zistené signifikantne

vyššie počty laktobacilov (p<0.01), bifidobaktérií (p<0.05),celkových anaeróbov (p<0.05) a celkových aeróbov

(p<0.05) oproti kontrole a signifikantne vyššie počty celkových anaeróbov (p<0.05), celkových aeróbov

(p<0.05), bifidobaktérií (p<0.05) a laktobacilov (p<0.05) oproti skupine Lactobacillus casei. V porovnaní s

kontrolou bolo pozorované signifikantné zníženie počtov klostrídií (p<0.05),enterobaktérií (p<0.01) a

nesignifikantné zníženie počtov E. coli o 1 log. Počty enterokokov boli signifikantne znížené (p<0.001) oproti

kontrolnej skupine ako aj skupine, ktorej bol podávaný Lactobacillus casei. Vo féces pokusných zvierat, ktorým

bol aplikovaný Lactobacillus casei bolo zaznamenané signifikantné zníženie počtov klostrídií (p<0.05) a

enterobaktérií (p<0.05) oproti kontrole. Počty E. coli boli nižšie o 0.5 log oproti kontrole. Avšak tento rozdiel

nebol štatisticky významný, podobne ako u E. coli v predchádzajúcej pokusnej skupine v dôsledku veľkého

rozptylu hodnôt v jednotlivých skupinách. Počty laktobacilov, enterokokov a celkových anaeróbov boli rovnaké

v oboch skupinách. Zaznamenané bolo štatisticky nevýznamné zvýšenie celkových aeróbov v prospech pokusnej

skupiny a naopak štatisticky nevýznamné zníženie bifidobaktérií oproti kontrolnej skupine (Tab.1). Neboli

zistené signifikantné rozdiely v koncentrácii sledovaných organických kyselín v jednotlivých pokusných

skupinách zvierat. V prípade kyseliny maslovej došlo k zvýšeniu v skupine ktorej bola podávaná zmes

Lactobacillus casei a FOS oproti kontrole a skupine, ktorej bol aplikovaný Lactobacillus casei, avšak tento

rozdiel nebol štatisticky významný. Aplikácia FOS mala pozitívny vplyv na imunitný systém odstavčiat. Väčšina

sledovaných imunologických parametrov (Le, Ly, Ne, CD4, B lymfocyty, %FA, IFA, %FANe, IFANe) dosiahla

svojho maxima v skupine Lactobacillus casei s FOS. Signifikantné rozdiely (p<0,05) boli zaznamenané v

počtoch CD4 T buniek a B lymfocytov. Na základe uvedených výsledkov možno konštatovať, že aplikácia

Lactobacillus casei v kombinácii s FOS sa prejavila významnou zmenou počtov všetkých sledovaných baktérií

vo féces odstavčiat. Vo féces zvierat, ktorým bola podávaná zmes Lactobacillus casei a FOS sme zaznamenali

signifikantne vyššie počty laktobacilov a bifidobaktérií oproti ostatným sledovaným skupinám. Zvýšená

produkcia kyseliny maslovej sa môže spájať s nami zistenými signifikantne vyššími počtami celkových

anaeróbov a aeróbov, pričom by bolo vhodné tieto druhy bližšie identifikovať. Kyselina maslová je dôležitým

substrátom pre energetický metabolizmus v mukóze hrubého čreva a tým aj pre stimuláciu rastu epiteliálnych

buniek. FOS sú vhodným aditívom pre zlepšenie imunostimulačného efektu pôsobenia laktobacilov resp.

bifidobaktérií cez ich podporný vplyv na ich prežívateľnosť a adherenciu na črevnú sliznicu hlavne v období,

kedy je mikroflóra čreva nestabilná resp. má pre hostiteľa nevhodné zloženie. Naviac, samotné FOS môžu

reagovať s proteínovými receptormi na povrchu imunokompetentných buniek črevnej sliznice, čím môžu

aktivovať imunitnú odpoveď. Takýto efekt potvrdzujú aj výsledky sledovaných imunologických parametrov,

ktoré sa prejavili zvýšenými hodnotami v kombinovanej skupine.

32

Tab.1 Zloženie fekálnej mikroflóry odstavčiat po aplikácii Lactobacillus casei a Lactobacillus casei s fruktooligosacharidmi

Baktérie Skupina K Skupina L Skupina LF

Celkové anaeróby

Celkové aeróby Bifidobaktérie Laktobacily Enterokoky Klostrídie Enterobaktérie E. coli

9,8 ± 0,2

8,0 ± 0,5

7,5 ± 0,3

9,9 ± 0,1

9,3 ± 0,1

8,1 ± 0,1

7,9 ± 0,4

6,8 ± 0,7

9,8 ± 0,3

8,3 ± 0,2

7,1 ± 0,7

9,9 ± 0,3

9,3 ± 0,3

7,4± 0,4

a* 6,5 ± 0,9

a* 6,3 ± 0,7

10.2 ± 0,2

a*,b* 9,3 ± 0,7

a*,b* 8,2 ± 0,3

a*,b* 10,3 ± 0,1

a**,b* 8,2 ± 0,2

a***, b*** 7,7 ± 0,3

a* 5,9 ± 0,9

a** 5,8 ± 0,7

a - signifikantný rozdiel oproti kontrolnej skupine b - signifikantný rozdiel oproti skupine Lactobacillus casei

7.7. Vplyv oligosacharidov na inhibičnú aktivitu laktobacilov voči patogénnym E. coli K88

V in vitro pokusoch sme zistili, že všetky kmene testovaných laktobacilov boli schopné rásť

v prítomnosti fruktooligosacharidov (FOS). Tento rast bol potvrdený aj znížením pH, ktoré sa pri glukóze

pohybovalo od 3,77 do 4,18 a pri FOS od 3,77 do 4,81. Naproti tomu pri E. coli 08:K88ab:H9 bol zaznamenaný

len čiastočný rast v prítomnosti FOS v porovnaní s glukózou. Všetky laktobacily inhibovali rast E. coli

08:K88ab:H9 v prítomnosti glukózy. Inhibícia bola pravdepodobne spôsobená produkciou organických kyselín

vzniknutých fermentáciou uvedených substrátov s následným znížením pH. Priemer inhibičných zón sa

pohyboval od 17,7 do 40 mm. V prípade FOS, väčšina kmeňov laktobacilov vykazovala inhibičné zóny voči E

coli. 08:K88ab:H9, ktorých veľkosť sa pohybovala od 17,9 do 30,3 mm. Na základe týchto výsledkov môžeme

konštatovať, že laktobacily môžu signifikantne prispieť k fermentácii FOS v tráviacom trakte zvierat a naopak

FOS môžu indukovať ich rast, inhibičný efekt a kolonizáciu tráviaceho traktu. Z hľadiska vývoja

kombinovaných prípravkov je však potrebné pri výbere produkčného kmeňa zohľadniť jeho špecifitu

k príslušnému rastovému substrátu.

V in vivo pokuse sme porovnávali vplyv podávania rôznych kombinácií Lactobacillus casei,

maltodextrínu Maldex 150 a fruktooligosacharidov Raftifeed IPX na inhibíciu adhézie E. coli K88 na mukózu

jejúna, ilea a kolóna a na koncentráciu organických kyselín v črevnom obsahu konvenčných ciciakov. Aplikácia

trojkombinácie Lactobacillus casei, Maldex 150 a Raftifeed IPX (skupina LMF) sa prejavila najúčinnejšou

inhibíciou počtov E. coli 08 : K88 adherovaných na črevnú mukózu jejuna a kolóna (Graf 8). Inhibícia

adherencie E. coli 08 : K88 v jejune v prípade kombinácie Lactobacillus casei s maltodextrínom ( skupina LM)

nekorelovala so zvýšením produkcie organických kyselín v črevnom obsahu oproti kontrole ktorej bol

aplikovaný samostatný kmeň Lactobacillus casei (skupina L) čo nasvedčuje tomu, že maltodextrín nemal

špecifický efekt na Lactobacillus casei. Zdá sa, že mechanizmus tohto inhibičného efektu nespočíva v

potencovaní rastu laktobacilov a produkcii organických kyselín.

33

Graf 8: Počty E.coli K88 adherované na črevnú mukózu 7 dňových prasiat

Naproti tomu inhibičný efekt kombinácie Lactobacillus casei s fruktooligosacharidami v kolóne (skupina

LF) bol spôsobený vyššou produkciou kyseliny mliečnej a octovej v črevnom obsahu oproti kontrole (skupina

Lactobacillus casei), čo môže súvisieť s indukciou rastu nášho kmeňa resp. iných prospešných endogénnych

baktérií (Graf 9). Chromatogram TLC analýzy črevného obsahu prasiat preukázal prítomnosť jednotlivých

frakcií testovaných sustrátov v jejune a v ileu v skupine LF a LMF.V prípade skupiny LM a L nebola zistená

prítomnosť frakcií ani v jednom úseku čreva. TLC analýza črevného obsahu prasiat, ktorým bol aplikovaný

Raftifeed IPX potvrdzujú jeho hydrolýzu a absorbciu v kolóne. Tieto synergicky pôsobiace komponenty

prirodzeného pôvodu môžu potencovať probiotický efekt v tenkom i hrubom čreve.

34

Graf 9: Koncentrácia organických kyselín v črevnom trakte 7 dňových prasiat

p < 0.05 *

Acetacetic acid

0

10

20

30

40

50

60

L LM LF LMF

Jejunum

Ileum

Colon

Acetic acid

0

10

20

30

40

50

60

70Jejunum

Ileum

Colon

Lactic acid

0

5

10

15

20

25

30

35

40

Jejunum

Ileum

Colon

mmol. l-1

*

* *

*

* *

* *

*

*

35

7.8. Vplyv aplikácie laktobacilov a oligosacharidov na vybrané biochemické, mikrobiologické a produkčné

parametre odstavčiat

V in vivo experimente v klinických podmienkach sme študovali vplyv podávania kombinácie

Lactobacillus plantarum, maltodextrínu Maldex 150 a fruktooligosacharidov Raftifeed IPX na vybrané

biochemické, mikrobiologické a produkčné parametre odstavčiat. Týždňová aplikácia trojkombinácie (L.

plantarum, Maldex 150 a Raftifeed IPX) prasiatkam skupiny LMF pozitívne ovplyvnila celkové počty E.coli

v obsahu jejuna, ilea a céka 28.dňových prasiatok, so signifikantným znížením počtov E. coli (p<0,05) oproti

laktobacilovej skupine L v obsahu jejuna. Na 42. deň veku prasiatok (trojtýždňovej aplikácii trojkombinácie)

sme zaznamenali vo všetkých sledovaných úsekoch tráviaceho traktu (Graf 10) najnižšie celkové počty E.coli

v pokusnej skupine LMF. Štatisticky významné zníženie celkových počtov (p<0,05 a p<0,01) bolo pozorované

v úseku jejuna, v porovnaní s kontrolnou skupinou K a MF. V distálnych úsekoch tráviaceho traktu (ileum,

cékum) sme zaznamenali nesignifikantne nižšie celkové počty E.coli v pokusnej skupine LMF, v porovnaní so

sledovanými skupinami, a celkové počty baktérií sa pohybovali o 0,7-1,7 log nižšie v úseku ilea a 0,2-0,8 log

nižšie v úseku céka. Na 28. deň veku (týždňová aplikácia trojkombinácie – L. plantarum, Maldex 150

a Raftifeed IPX) pozitívne ovplyvnila aj celkové počty laktobacilov u LMF skupiny prasiatok a celkové počty

sledovaných baktérií (Graf 11) boli vyššie v porovnaní s kontrolnou skupinou K o 1,5 log v jejune, o 1,0 log

v úseku céka oproti skupine K, a o 0,5log vyššie oproti skupine L. Tento nárast celkových počtov pretrvával aj

v obsahu jejuna a ilea 35. dňových prasiatok, kde sme v počtoch sledovaných baktérií zaznamenali podobnú

tendenciu ako v rovnakých úsekoch na 28. deň veku. Celkové počty laktobacilov (LMF skupiny) v obsahu jejuna

sa pohybovali o 2,5 log vyššie v porovnaní so skupinou K, ale v úseku ilea tieto počty nepresahovali 0,5log.

V céku sme u skupiny LMF zaznamenali vyššie počty laktobacilov o 0,6log oproti skupine L. Na 42. deň veku

boli v jejune (LMF) pozorované nesignifikantne zvýšené celkové počty laktobacilov o 1,8 log, v porovnaní

s kontrolnou skupinou K, a v úseku céka boli počty laktobacilov o 0,7 log vyššie v porovnaní so skupinou L.

Aplikácia trojkombinácie Lactobacillus plantarum, Maldex 150 a Raftifeed IPX mala pozitívny vplyv aj na

črevný metabolizmus, prejavujúci sa zvýšenou produkciou organických kyselín. Najvyššiu koncentráciu k.

acetoctovej v úseku jejuna na 28. deň veku sme zaznamenali u pokusnej skupiny LMF so signifikanciou (p<

0,01) oproti pokusnej skupine MF. Podiel kyseliny acetoctovej a k. mliečnej v obsahu ilea 28. dňových prasiatok

bol u skupiny LMF vyšší, so signifikantným rozdielom (p<0,05) v porovnaní so skupinou MF. Koncentrácia

kyseliny mliečnej (LMF) 42.dňových prasiatok sa pohybovala na úrovni 45 mmol/l. Na 28. deň veku vykazovala

pokusná skupina LMF v obsahu kolóna najvýznamnejšiu produkciu kyselín (k. mliečnej, octovej a propiónovej),

so štatisticky významnými hladinami kyseliny mliečnej (p<0,001) a kyseliny propiónovej (p<0,05), v porovnaní

s kontrolou K, a rovnako signifikantnou koncentráciou kyseliny octovej (p<0,05), oproti skupine MF. V období

1. týždňa po odstave sme zistili štatisticky významne vyššiu koncentráciu kyseliny mliečnej (p<0,05) v pokusnej

skupine LMF, v porovnaní s kontrolnou skupinou K. Pokusná skupina LMF 35.dňových prasiatok vykazovala

v porovnaní s ostatnými skupinami vysokú, ale štatisticky nevýznamnú koncentráciu kyseliny propiónovej

(78,72mmol/l). U všetkých sledovaných skupín bola v rovnakom období zaznamenaná vysoká koncentrácia

kyseliny octovej, pohybujúca sa viac-menej na rovnakej úrovni v rozmedzí hodnôt 90-93mmol/l. U pokusnej

skupiny LMF 42.dňových prasiatok sme zaznamenali signifikantne vyššiu koncentráciu kyseliny mliečnej

(p<0,05) oproti skupine K, a kyseliny octovej (p<0,05; p<0,01), v porovnaní so skupinami L a K (Graf 12).

36

Podobne aj produkcia kyseliny propiónovej (Graf 13) bola najvýznamnejšia u pokusnej skupiny LMF (p<0,05;

p<0,01). Najvyššia produkcia kyseliny maslovej bola zistená u pokusnej skupiny LMF (p<0,01; p<0,05;),

v porovnaní s prasiatkami skupiny K v 1. aj 2. týždni po odstave. Aplikácia trojkombinácie Lactobacillus

plantarum, Maldex 150 a Raftifeed IPX výrazne ovplyvnila celkové priemerné hmotnosti a váhové prírastky

prasiatok počas celého sledovaného obdobia. Najväčšie rozdiely v celkových hmotnostiach vykazovali prasiatka

pokusnej skupiny LMF v deň odstavu so štatisticky významnou hodnotou (p<0,05) oproti pokusným skupinám L

a MF a kontrolnej skupine K (p<0,001). Aj na 35. a 42. deň veku sme zaznamenali u LMF skupiny vyššie,

štatisticky nevýznamné hodnoty celkových hmotností prasiatok, ktoré sa na 35. deň veku pohybovali v rozmedzí

od 1,12 – 1,9kg a 2.týždeň po odstave (0,49 – 0,98kg), v porovnaní s ostatnými sledovanými skupinami.

Priemerné váhové prírastky prasiatok pokusnej skupiny LMF boli na 28. deň veku signifikantne zvýšené

(p<0,05) oproti pokusným skupinám L a MF, a taktiež signifikantne zvýšené (p<0,01) oproti kontrolnej skupine

K. Na 35. deň sme u pokusnej skupiny LMF zaznamenali signifikantné zvýšenie (p<0,05) hmotnostných

prírastkov v porovnaní s pokusnou skupinou MF, a nesignifikantné zvýšenie v porovnaní so skupinami K a L,

ktoré sa pohybovalo v rozmedzí 0,76 – 0,82 kg. Aj na 42. deň veku prasiatka pokusnej skupiny LMF vykazovali

zvýšené, ale štatisticky nevýznamné hodnoty hmotnostných prírastkov v porovnaní s pokusnými skupinami L

a MF, s rozmedzím od 0,74 – 1,03 kg.

Graf 10

Celkové počty E.coli v obsahu tráviaceho traktu na 42. deň veku.

3

3,5

4

4,5

5

5,5

6

6,5

7

Jejunum Ileum Cékum

Lo

g 1

0/m

l K

L

MF

LMF

* K

* MF

37

Graf 11

Celkové počty Laktobacilov v obsahu tráviaceho traktu na 28. deň veku.

5

5,5

6

6,5

7

7,5

8

8,5

9

9,5

10

Jejunum Ileum Cékum

Lo

g 1

0/m

l K

L

MF

LMF

Graf 12: Koncentrácia kyseliny octovej v obsahu kolona odstavčiat

Kyselina octová

0

20

40

60

80

100

120

140

28 deň 35 deň 42deň

mm

ol/l

K L MF LMF

* MF* L***K

Graf 13: Koncentrácia kyseliny propiónovej v obsahu kolona odstavčiat

Kyselina propiónová

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

28 deň 35 deň 42deň

mm

ol/l

K L MF LMF

* K

* MF

** L

38

7.9. Efekt aplikácie laktobacilov a oligosacharidov na zdravotné ukazovatele u prasiat

V experimente v terénnych podmienkach sme overovali účinnosť kombinácie Lactobacillus casei,

maltodextrínu a fruktooligosacharidov v prevencii diarhoického syndrómu a v optimalizácii výživy mláďat

hospodárskych zvierat so zameraním na zdravotné a produkčné parametre ciciakov a odstavčiat. Porovnávali

sme niektoré ukazovatele vo veľkochove ošípaných pri používaní kombinovaného probiotického prípravku

s rovnakými ukazovateľmi v tom istom chove v predchádzajúcom roku, keď boli používané antibiotické rastové

stimulátory. Celkové náklady na liečivá a liečebné úkony za celé sledované obdobie poklesli v kategórii ciciakov

o 44,6%, v kategórii odstavčiat dokonca o 78,5% pri používaní kombinovaného probiotického prípravku

v porovnaní s výsledkami dosiahnutými pri podávaní antibiotických rastových stimulátorov. Zaznamenali sme

signifikantný pokles ( p < 0,005 ) mortality prasiat do odstavu (Graf 14). Priemerná mortalita v tejto kategórii u

prasiat, ktoré dostávali antibiotický rastový stimulátor bola 16,18 ± 2,38%. V období podávania probiotického

prípravku bola mortalita 11,15 ±1,4 %. Zvlášť bola hodnotená mortalita ciciakov s nízkou pôrodnou váhou.

V tejto kategórii bol rovnako zaznamenaný signifikantne nižší úhyn ( p< 0,05) v skupine zvierat, ktorým bol

aplikovaný probiotický prípravok ( 56,26 ± 8,64% oproti 34,27 ± 5,74% ). Percento odstavených prasiat

z celkového počtu narodených stúplo z 82,01 ± 2,76% na 83,47 ± 3,16%.

Graf 14: Úhyn prasiatok z počtu máloživotaschopných pri narodení v % za sledované obdobie

53,84

38,7

56,63

25

46,8742,1

88,88

30,86

51,35

30,9

57,89

45 47,56

30,43

47,12

31,24

20

30

40

50

60

70

80

90

%

júl august september október november december január február

r. 2000, 2001 r. 2001, 2002

39

Závery pre realizáciu v spoločenskej praxi

Na základe týchto výsledkov bol vypracovaný metodický postup nového konceptu prevencie

diarhoického syndrómu u ošípaných, ktorý spočíva v preventívnej aplikácii potencovaného probiotického

prípravku na báze Lactobacillus casei v kombinácii s maltodextrínom a oligosacharidom. Uvedený postup bol

overený v terénnych podmienkach so zameraním sa na sledovanie zdravotných a produkčných parametrov u

ciciakov a odstavčiat. Boli podané prihlášky vynálezu PÚV 342-2002: Potencované probiotiká a PÚV 336-2002:

Potencovaný probiotický kŕmny doplnok pre ciciaky a odstavčatá. Praktickým výsledkom výskumu je vývoj

nového probiotického prípravku pre prasatá, ktorý sa v súčasnosti zavádza do praxe ako PRO-BIOCENOL SW -

preventívny prípravok pri tlmení ochorení prasiat v kritických obdobiach života. Demonštrácia celkového

procesu účinku probiotika a synergicky pôsobiacich látok naturálneho pôvodu, ich vplyvu na organizmus jedinca

až po dopady na ekonomiku chovu a kvalitu mäsa napomôže pri presadzovaní neľahkého procesu náhrady

antibiotík prírodnými bioregulátormi. Prípravok bude využívaný v živočíšnej výrobe priamo

v poľnohospodárskych podnikoch.

7.10. Vplyv polynenasýtených mastných kyselín (PNMK) na adherenčnú schopnosť Lactobacillus casei a

efekt kombinovanej aplikácie Lactobacillus casei a PNMK na vybrané parametre črevného metabolizmu a

imunitný systém gnotobiotických ciciakov.

V poslednom období sa venuje zvýšená pozornosť PNMK a ich účinku na: metabolizmus lipidov,

zvýšiť biologickú a nutričnú hodnotu živ. produktov, podporou imunity a zlepšením zdravotného stavu by sa

zvýšila produkčná schopnosť zvierat a životaschopnosť mláďat.Tým že sa PNMK dostanú cestou krmiva alebo

potravy do tráviaceho traktu môžu ovplyvňovať črevnú mikroflóru. Môžu inhibovať alebo podporovať rast

baktérií alebo tým že sú zodpovedné za chemicko-fyzikálne vlastnosti membrán buniek môžu meniť ich hrúbku,

vlastnosti lipoidnej fázy a tým ovplyvňovať adherenčné miesta baktérií. Predpokladá sa, že mastné kyseliny

diéty ovplyvňujú receptory črevných mikroorganizmov pravdepodobne zmenou zloženia mastných kyselín v

črevnej stene. Zlepšenie kolonizácie sliznice tráviaceho traktu probiotickými mikroorganizmami môže

významnou mierou potencovať inhibičný efekt probiotík voči adhézii patogénov. Esenciálne polynenasýtené

mastné kyseliny sú štrukturálnymi zložkami bunkových membrán a slúžia ako prekurzory v produkcii

eikozanoidov, ktoré sú dôležitými modulátormi humorálnej a bunkovej imunity.

Pri štúdiu vplyvu aplikácie PNMK na adherenčnú schopnosť Lactobacillus casei sme zistili, že počty

laktobacilov kolonizujúcich sliznicu jejuna ciciakov pokusnej skupiny boli signifikantne vyššie (p<0,05)

v porovnaní s kontrolnou skupinou, ktorej bol aplikovaný samotný kmeň laktobacila. Počty laktobacilov

kolonizujúcich sliznicu ilea a kolonu pokusných a kontrolných ciciakov neboli signifikantne rozdielne medzi

sledovanými skupinami (Graf 15).

40

Graf 15: Kolonizácia sliznice jejuna, ilea a kolona gnotobiotických prasiatok Lactobacillus casei po

aplikácii PNMK

4

4,2

4,4

4,6

4,8

5

5,2

jejunum ileum kolon

log

10.c

m-2

P K

*

*p< 0,05

Hodnoty pH tráviaceho traktu pokusných ciciakov bolo okrem žalúdka nesignifikantne nižšie v porovnaní

s kontrolnou skupinou. Bola zistená signifikantne vyššia koncentrácia kyseliny propiónovej (p< 0,05),

acetoctovej a jantárovej (p< 0,01) v obsahu gnotobiotických ciciakov pokusnej skupiny. Neboli zistené

signifikantné rozdiely v koncentrácii kyseliny mliečnej a octovej v obsahu tráviaceho traktu, pričom

koncentrácia kyseliny octovej v obsahu celého tráviaceho traktu bola vyššia u ciciakov pokusnej skupiny. Boli

zaznamenané signifikantné rozdiely vo fagocytárnej aktivite a v počte subpopulácii T lymfocytov oproti kontrole

(Tab.2 a 3). Výsledky pokusu ukazujú na pozitívny vplyv PNMK na adherenciu Lactobacillus casei v jejune

gnotobiotických ciciakov. Uvedený účinok nebol pozorovaný v nižších úsekoch tráviaceho traktu. Domnievame

sa, že tento efekt bol obmedzený v dôsledku ich metabolizácie v tomto úseku tráviaceho traktu. Keď črevná

sliznica je vystavená vplyvom stráviteľných tukov mení sa jej zloženie, a tým aj mechanizmus adherencie

mukózy. To znamená, že PNMK môžu ovplyvňovať adherenčné miesta črevnej mikroflóry cestou modifikácie

zloženia mastných kyselín v črevnej stene. Tento mechanizmus efektu PNMK bude predmetom ďalšieho

výskumu na úrovni mikroštruktúr tráviaceho traktu. Jedným z pozitívnych účinkov probiotík na črevný

metabolizmus je zníženie aktuálnej acidity a zvýšenie produkcie organických kyselín. Zaznamenali sme znížené

pH obsahu tráviaceho traktu a signifikantné zvýšenie koncentrácie kyseliny propiónovej, acetoctovej a jantárovej

v skupine pokusných zvierat. Veľmi pozitívne možno hodnotiť aj zvýšenie koncentrácie kyseliny octovej oproti

kontrole v celom obsahu tráviaceho traktu z hľadiska optimalizácie prostredia tráviaceho traktu. Možný efekt

PNMK na biologické receptory, signálnu transdukciu a proliferáciu lymfocytov závisí od zloženia PNMK

v imunitných bunkách. Kombinovaná aplikácia PNMK a Lactobacillus casei sa odrazila na aktivite

nešpecifického obranného systému zvýšením percenta buniek zapojených do fagocytózy a zvýšeným počtom

subpopulácii T lymfocytov. Možno predpokladať, že nárast týchto hodnôt súvisí aj s vplyvom PNMK na

zvýšenú schopnosť Lactobacillus casei adherovať na črevnú sliznicu.

41

Tab.2 Efekt aplikácie ω-3 PNMK a kolonizácie Lactobacillus casei na fagocytárnu aktivitu a index fagocytárnej aktivity neutrofilov u germ-free prasiat

Dni odberu Fagocytárna aktivita (%) Index fagocytárnej aktivity

Kontrola Pokus Kontrola Pokus 21 14.29 ± 3.81 24.73 ± 9.18 1.38 ± 0.19 2.02 ± 1.48 28 18.80 ± 3.65a 37.13 ± 7.87a 2.80 ± 1.22 2.79 ± 0.98

a = (P<0.05)

Tab.3 Efekt aplikácie ω-3 PNMK a kolonizácie Lactobacillus casei na absolútne počty CD2, CD4 a CD8

subpopulácií lymfocytov u germ-free prasiat

Dni odberu CD2 CD4 CD8

Kontrola Pokus Kontrola Pokus Kontrola Pokus 21 2.59±0.40a 4.00±0.88b 1.09±0.08x,c 1.28±0.02x,d 0.84±0.24y 1.79±0.49y,e 28 1.45±0.38a 1.55±0.48b 0.57±0.08c 0.54±0.15d 0,58±0.16 0.68±0.29e

a,b signifikantné rozdiely medzi dňami odberu P<0.01 c signifikantné rozdiely medzi dňami odberu P<0.001 d, signifikantné rozdiely medzi dňami odberu P<0.01 e, signifikantné rozdiely medzi dňami odberu P<0.05 x, y signifikantné rozdiely medzi pokusnou a kontrolnou skupinou P<0.05 7.11. Vplyv probiotických kmeňov Lact. plantarum BIOCENOL TM LP96 a Lact. fermentum BIOCENOL TM LF99 (probiotický syr) a ľanového semena na mikrobiologické, biochemicko-enzymatické,

morfologické a imunologické parametre u odstavčiat .

Cieľom experimentu bolo štúdium vplyvu probiotických kmeňov Lactobacillus plantarum,

Lactobacillus fermentum (probiotický syr) a ľanového semena (odroda Flanders- zdroj omega 3 PNMK a vo

vode rozpustných poly- a oligosacharidov) na mikrobiologické, biochemicko-enzymatické, morfologické

a imunologické parametre u odstavčiat ako aj na zdravotný stav zvierat v priebehu odstavu.

Realizáciou experimentu sme dospeli k nasledovným poznatkom: Aplikácia kmeňov Lact. plantarum BIOCENOL TM LP96 a Lact. fermentum BIOCENOL TM LF99 (probiotický

syr) a ľanového semena (odroda Flanders- zdroj omega 3 PNMK a vo vode rozpustných poly- a oligosacharidov

- prebiotiká) mala pozitívny vplyv :

- Na zvýšenie pomeru výšky klkov a hĺbky krýpt, čo nám charakterizuje zvýšenie resorpčnej plochy

a funkčnej schopnosti črevnej sliznice. To sa najvýraznejšie prejavilo v jejune u skupiny prijímajúcej ľanové

semeno a skupiny prijímajúcej ľanové semeno a probiotické kmene.

- Na mitotickú aktivitu črevných epitelových buniek a schopnosť regenerácie. Štatisticky významné zvýšenie

bolo zistené v deň odstavu a rovnako 7 dní po odstave v skupine prijímajúcej ľanové semeno a probiotické

kmene.

- Na sledovanú mikroflóru, čo sa prejavilo signifikantným znížením koliformných baktérií v jednotlivých

úsekoch čreva na 3.a 7. deň po odstave u všetkých pokusných skupín a signifikantne vyšším pomerom

medzi laktobacilmi a E. coli oproti kontrole

42

- Na črevný metabolizmus, prejavujúci sa zvýšenou produkciou organických kyselín. Zistená signifikantne

vyššia produkcia kyseliny maslovej môže mať pozitívny vplyv na zvýšenú proliferáciu enterocytov.

Kyselina maslová sa považuje za najdôležitejší fermentačný produkt bakteriálnej fermentácie z hľadiska jej

schopnosti modifikovať rast epitelu v čreve.

Zistili sme, že:

- chemické zloženie ľanového semena a jeho špecifických frakcií naznačuje jeho vhodné nutričné vlastnosti,

ktoré sme zaznamenali pri jeho pozitívnom vplyve na vybilancovaní bielkovinového a energetického profilu

zvierat pokusných skupín

- V období odstavu a v prvom týždni po odstave skupiny s ľanovým semenom mali tendenciu zvýšenej

prítomnosti intraepitelových lymfocytov, čo môže svedčiť v súvislosti s klinickým nálezom v chove

o zvýšenej aktivite lokálnych obranných mechanizmov čreva.

- Kombinovaná aplikácia laktobacilov a ľanového semena so zvýšeným obsahom ω -3 PNMK viedla k

signifikantnému zvýšeniu ω-3 PNMK (ALA, EPA a DHA) a súčasne k poklesu AA, čo viedlo k zmene

pomeru ω-6 : ω-3 plazmatických lipidov v prospech ω-3 PNMK, t.j. k pozitívnemu ovplyvneniu

metabolizmu MK.

- aj napriek nepriaznivej zdravotnej situácii v chove, odkiaľ boli zvieratá zaradené do pokusu, sme

u pokusných skupín, ktorým bolo aplikované ľanové semeno a kombinácia probiotických kmeňov

a ľanového semena, zaznamenali pozitívny vplyv na parametre hematologického profilu, hlavne z hľadiska

zdravotných ukazovateľov.

- V skupinách, kde boli prasatám aplikované probiotické laktobacily a mastné kyseliny došlo k stimulácii ako

lokálnej, tak aj celkovej T-lymfocytárnej imunitnej odpovede. V skupine, kde bola podávaná kombinácia

probiotických laktobacilov a mastných kyselín bolo zaznamenané zvýšené zastúpenie B-lymfocytov

v jejunálnych Peyerových plakoch a B- aj T-lymfocytov v krvi. Keďže v črevnom trakte zvierat v chove boli

identifikované E. coli K88 a salmonely , imunitná odpoveď mohla byť ovplyvnená aj týmito patogénmi.

Závery pre realizáciu v spoločenskej praxi a daľší rozvoj vedy

Dosiahnuté výsledky naznačujú, že účinok probiotík v čreve možno ovplyvniť polynenasýtenými

mastnými kyselinami. Stimulačný účinok polynenasýtených mastných kyselín na adhéziu lactobacilov a

na imunitné parametre by mohol byť využitý na zvýšenie účinnosti probiotík pri inhibícii patogénov tráviaceho

traktu. Boli získané nové poznatky v oblasti vplyvu probiotických kmeňov Lact. plantarum BIOCENOL TM

LP96 a Lact. fermentum BIOCENOL TM LF99 (probiotický syr) a ľanového semena na mikrobiologické,

biochemicko-enzymatické, morfologické a imunologické parametre u odstavčiat. Výsledky tohto výskumu

prispejú k poznaniu vplyvu spoločnej aplikácie probiotických kmeňov laktobacilov a PNMK na zloženia črevnej

mikroflóry, na potláčanie črevných patogénnych baktérií, stimuláciu rastových schopností a imunity.

Realizačným výstupom pre prax by mohol byť vývoj nového probiotického prípravku na báze laktobacilov

a ľanového semena. Zároveň predpokladáme, že správnym pomerom PNMK ovplyvníme nutričnú a biologickú

hodnotu živočišných produktov (zníženie cholesterolu, vyšší obsah PNMK), čo môže vyústiť k zdravšej výžive

obyvateľstva.

43

8. Záver

Kvalita zdravia ľudskej populácie úzko súvisí so znižovaním záťaže životného prostredia a zvyšovaním

kvality a bezpečnosti potravín. Chov hospodárskych zvierat má v potravinovom reťazci mimoriadne významné

postavenie. Produkcia kvalitných a bezpečných potravín a surovín živočíšneho pôvodu je podmienená dobrým

zdravotným stavom odchovávaných zvierat. Doposiaľ sa prevencia a terapia chorôb zvierat zväčša riešila

pomocou syntetických látok enormne zaťažujúcich nielen samotný organizmus, ale aj životné prostredie ako

celok. Z uvedených dôvodov prijala Európska únia od roku 2006 zákaz používať antibiotiká ako rastové

stimulátory v kŕmnych zmesiach pre zvieratá. V celosvetovom meradle neustále stúpa záujem o využívanie

ekologických metód v poľnohospodárstve, potravinárstve i medicíne v oblasti prevencie a liečby chorôb. Nami

dosiahnuté výsledky predstavujú významný prínos pre spoločenskú prax. Vypracovaný koncept potencovaných

resp. kombinovaných probiotík poskytuje základ pre vývoj a výrobu účinnejších probiotických prípravkov novej

rady, ktoré pri ich aplikácii v praxi výrazne zefektívnia odchov mláďat hospodárskych zvierat čo bude mať

priamy vplyv na zvýšenie kvality a bezpečnosti potravín živočíšneho pôvodu pre človeka.

Literatúra u autorov

44

ISBN 978-80-8077-185-0