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Londrina 2014
CENTRO DE PESQUISA EM CIÊNCIAS DA SAÚDE MESTRADO EM CIÊNCIAS DA REABILITAÇÃO
PRISCILA DANIELE DE OLIVEIRA
TERAPIA ULTRASSÔNICA DE BAIXA INTENSIDADE EM
CULTURA CELULAR DE FIBROBLASTOS
Londrina 2014
PRISCILA DANIELE DE OLIVEIRA
TERAPIA ULTRASSÔNICA DE BAIXA INTENSIDADE EM CULTURA CELULAR DE FIBROBLASTOS
Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Ciências da Reabilitação (Programa Associado entre Universidade Estadual de Londrina - UEL e Universidade Norte do Paraná - UNOPAR), como requisito parcial à obtenção do título de Mestre em Ciências da Reabilitação.
Orientador: Prof. Dr. Rodrigo Franco de Oliveira
Co-orientador(a): Prof. Dra. Regina Célia
Poli-Frederico
PRISCILA DANIELE DE OLIVEIRA
TERAPIA ULTRASSÔNICA DE BAIXA INTENSIDADE EM CULTURA CELULAR DE FIBROBLASTOS
Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Ciências da Reabilitação
(Programa Associado entre Universidade Estadual de Londrina [UEL] e Universidade
Norte do Paraná [UNOPAR]), como requisito parcial à obtenção do título de Mestre em Ciências da Reabilitação.
BANCA EXAMINADORA
____________________________________
Prof. Dr. Rodrigo Franco de Oliveira
Prof. Orientador Universidade Norte do Paraná
____________________________________
Prof. Dra. Deise A. de Almeida Pires Oliveira Membro Interno
Universidade Norte do Paraná
____________________________________
Dra. Cristina Pacheco Soares Membro Externo
Universidade do Vale do Paraíba
Londrina, 03 de Outubro de 2014.
AUTORIZO A REPRODUÇÃO TOTAL OU PARCIAL DESTE TRABALHO, POR
QUALQUER MEIO CONVENCIONAL OU ELETRÔNICO, PARA FINS DE ESTUDO E PESQUISA, DESDE QUE CITADA A FONTE.
Dados Internacionais de catalogação-na-publicação Universidade Norte do Paraná
Biblioteca Central
Setor de Tratamento da Informação
Oliveira, Priscila Daniele de. O45e Terapia ultrassônica de baixa intensidade em cultura celular de fibroblastos /
Priscila Daniele de Oliveiras. Londrina: [s.n], 2014. 73f.
Dissertação (Mestrado). Ciências da Reabilitação. Universidade Norte do Paraná / Universidade Estadual de Londrina.
Orientador: Prof. Dr. Rodrigo Franco de Oliveira. 1- Ciências da reabilitação - dissertação de mestrado - UNOPAR /UEL 2-
Dosimetria 3- Tecido conjuntivo 4- Técnica de cultivo de células 5- Ultrassom I- Oliveira, Rodrigo Franco de, orient. II- Universidade Norte do Paraná. III-
Universidade Estadual de Londrina CDU 615.8
Dedico este trabalho aquele, que da minha vida teve grande compaixão e
amor. Meu único e poderoso, Deus, à quem, deve ser dada toda a honra e glória, pois sem Ele, não estaríamos aqui
reunidos, desfrutando, juntos, deste momento único, mágico, indescritível,
digno de ser chamado milagre ou dádiva celestial.
AGRADECIMENTOS
Nesse momento que encerro mais uma etapa da minha jornada, agradeço e
mais uma vez reflito sobre tantos caminhos trilhados, torna-se evidente que tenho
muito a agradecer a muitos. Sendo tarefa impossível reconhecer nominalmente a
todos. Em geral, minha eterna gratidão.
Agradecimentos especiais,
Á Deus que tenho certeza que me acompanhou durante toda esta caminhada,
dando-me força, saúde, sabedoria, determinação, prudência, oportunidades e,
principalmente, fé;
Aos meus pais, Adilson e Marcia, que não mediram esforços, para realizar
aquilo que aos olhos da razão seria humanamente impossível. Escolhendo muitas
vezes entre os seus deveres ou à minha formação;
Às incessantes orações da minha mãe para me guardar de todas as
tempestades e tribulações que enfrentei para chegar até aqui;
À minha querida avó Dulce, que depositou imensurável confiança e não
mediu esforços e sacrifícios para suprir todas as minhas necessidades e
dificuldades;
Ao meu orientador, professor e amigo Prof. Dr. Rodrigo Franco de Oliveira e
sua esposa e companheira profª Drª. Deise A. de Almeida Pires Oliveira, pela
incansável orientação, dedicação e constante apoio, que foram fundamentais e
insubstituíveis.
Orientador ao qual, expresso profunda admiração e carinho, podendo dizer,
que fez parte da minha vida como um verdadeiro pai, que ensina o filho os primeiros
passos.
À querida professora Regina Célia Poli-Frederico, com seus conselhos,
doçura e paciência ao atender-me sempre tão prontamente, sem mensurar
dificuldades ao co-orientar uma fisioterapeuta, a minha gratidão;
À professora Drª. Cristina Pacheco Soares, Dr. Newton Soares e alunos, pela
acolhida e confiança, em que em nenhum momento mediram esforços para transferir
todo e necessário conhecimento, abrindo as portas de seu grupo e laboratório com
grande carinho. Isso não tem preço!
A todos os pastores, que com as belas palavras e orações, me direcionaram
as melhores decisões;
Ao meu amado esposo, que nos momentos de desespero, enxugou minhas
lágrimas, respondeu meus enormes apelos e me incentivou a continuar perseguindo
a vitória, sempre carinhoso e compreensivo. Meu amor, que Deus recompense tudo
o que você fez e faz por mim, te amo muito;
À minha amiga Simone Tano, que não hesitou em auxiliar-me em todos os
momentos, no início desta caminhada... Aconselhando-me e acolhendo-me, muito
obrigada;
À amiga Cintia C. Martignago que colaborou para que tudo acontecesse,
sempre pronta para os imprevistos e dúvidas.
À companheira de caminhada, Stheace Szezerbaty, sempre compartilhando
conosco os sorrisos e as decepções, disposta a qualquer empreitada;
À professora Sonia Maria Marques Gomes Bertolini, pelos conselhos e
ensinamentos que foram imprescindíveis e preciosos;
A todos meus colegas de classe, vocês foram peças-chave em cada trabalho,
dúvida, conversa... Sucesso a cada um de vocês...
Aos funcionários Gleidson e Jéssica do Centro de Pesquisa pela prontidão em
ajudar...
E, por fim, a todos os professores da equipe de trabalho do Programa de
Ciências em Reabilitação UEL/UNOPAR pelo emprenho em criar e manter um
programa de excelência e qualidade no campo da reabilitação...
“O temor do SENHOR é o
princípio do saber, no entanto, os
insensatos desprezam a
sabedoria e o ensino.”
(Provérbios 1:7)
“Adquire a sabedoria, e não te
esqueças nem te apartes das
palavras da minha boca. Não a
desampares, e ela te guardará:
ama-a e ela te conservará. Exalta-
a, e ela te exaltará, e abraçando-a
tu, ela te honrará.”
(Provérbios 4:5-8)
OLIVEIRA, Priscila Daniele de. Terapia ultrassônica de baixa intensidade em
cultura celular de fibroblastos. 2014. 73 folhas. Trabalho de Conclusão de Curso
do Programa de Pós-Graduação em Ciências da Reabilitação – Universidade Norte
do Paraná, Londrina, 2014.
RESUMO
Dentro da área da saúde os distúrbios osteomusculares possuem alta prevalência, de modo que, para estes casos, um dos recursos fisioterápicos mais utilizados na
prática clínica, é o ultrassom terapêutico. O qual induz nos tecidos biológicos, diversos efeitos fisiológicos térmicos e atérmicos que colaboram com a abreviação
do processo curativo. Ressalta-se ainda, a relevância dos estudos em cultura celular quando correlacionados à ação do ultrassom, uma vez que possibilitam a complementação das investigações in vivo. Assim, o objetivo deste estudo foi avaliar
o efeito da irradiação Ultrassônica de Baixa Intensidade, com diferentes pulsos e intensidade, em cultura celular de fibroblastos L929, de modo a verificar a viabilidade
celular e definir parâmetros de dosimetria. Para isso, utilizou-se a aplicação de ultrassom em cultura de células fibroblásticas, divididas em cinco grupos (controle; 0,3 W/cm2-10%; 0,3 W/cm2-20%; 0,5 W/cm2 - 10% e US 0,5 W/cm2 - 20%). A
irradiação ocorreu por dois minutos, com intervalos de 24, 48 e 72 horas e após 24 horas de cada irradiação foi realizado o teste de MTT Brometo de [3-(4,5-
dimetiltiazol)-2,5-difeniltetrazólio] destinado à avaliação da viabilidade celular. Os resultados revelaram que, ao comparar os valores de células viáveis pelo método MTT nos cinco grupos, não foi possível encontrar diferença estatisticamente
significativa em nenhum deles, nos três momentos avaliados (24, 48 e 72 horas); e, ao se realizar a análise de medida repetida nos diferentes grupos, encontrou-se
diferença estatisticamente significativa apenas no grupo irradiado com ultrassom a 0,5 W/cm2 com regime de pulso de 10% (p=0,003). Com base nesses resultados, conclui-se que a irradiação Ultrassônica de Baixa Intensidade 0,3 W/cm2 10%-20% e
0,5 W/cm2-20% aumentou percentualmente a viabilidade celular em cultura de fibroblastos L929, sem diferenças estatísticas significantes; enquanto que somente o
grupo com terapêutica de 0,5 W/cm2-10% obteve o crescimento numérico, com diferenças estatisticamente significantes em todos os períodos de avaliação.
Palavras-chave: Dosimetria. Tecido Conjuntivo. Técnica de Cultivo de Células.
Ultrassom.
OLIVEIRA, Priscila Daniele de. Low-intensity ultrasound therapy in cell culture of
fibroblasts. 2014. 73 folhas. Completion of course work in the Graduate Program in
Rehabilitation Sciences – Universidade Norte do Paraná, Londrina, 2014.
ABSTRACT
Within the health musculoskeletal disorders have high prevalence, so that, for these cases, one of the most used resources in physical therapy clinical practice, is the therapeutic ultrasound. Which leads us biological tissues, several thermal and
athermal physiological effects that contribute to the abbreviation of the healing process. We also stress the relevance of studies in cell culture when correlated to the
action of ultrasound, because they enable the completion of investigations in vivo. The objective of this study was to evaluate the effect of Low Intensity Ultrasonic irradiation with different pulse and intensity in L929 fibroblast cell culture, to ascertain
cell viability and set parameters dosimetry. For this, we used the application of ultrasound in cultured fibroblast cells, divided into five groups (control, 0.3 W/cm2-
10%, 0.3 W/cm2-20%, 0.5 W/cm2 - 10% and US 0.5 W/cm2 - 20%). Irradiation was done for two minutes at intervals of 24, 48, 72 hours and 24 hours after each irradiation the test MTT [3 (4,5-dimethylthiazol) -2,5-diphenyltetrazolium bromide]
was performed for the assessment of cellular viability. The results showed that when comparing the values of viable cells by MTT method in the five groups, we could not
find statistically significant difference in any of them, in these three conditions (24, 48 and 72 hours); and, when performing the analysis of repeated measures in the different groups, we found statistically significant differences only in the group
irradiated with ultrasound at 0.5 W/cm2 with pulse regime of 10% (p = 0.003). Based on these results, we conclude that the Ultrasonic irradiation of low intensity 0.3
W/cm2 10%-20% and 0.5 W/cm2-20% percentage increased cell viability in cultured fibroblasts L929, with no statistical differences significant; while only the group with 0.5 W / therapeutic cm2-10% obtained numerical growth, with statistically significant
differences in all periods.
Key words: Dosimetry. Connective Tissue. Cell Culture Techniques. Ultrasound.
LISTA DE ILUSTRAÇÕES
Figura 1 – Comparação da viabilidade celular entre os grupos nos diferentes
momentos avaliados ............................................................................................................ 41
LISTA DE TABELAS
Tabela 1 – Proliferação e viabilidade de fibroblastos .................................................... 41
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
ANOVA Análise de Variância
CO2 Gás Carbônico
DNA Ácido Desoxirribonucléico
DMSO Dimetilsulfóxido
EROs Espécies Reativas de Oxigênio
Hz Hertz
MEM Minimum Essencial Medium
mg/mL Miligrama por Mililitro
mL Mililitro
MHz Megahertz
MPa Mili Pascal
MTT Brometo de [3-(4,5-dimetiltiazol)-2,5-difeniltetrazólio]
nm Nanômetro
O2 Oxigênio
pH Potencial hidrogeniônico ou potencial de hidrogênio
PZT Titanato e Zirconato de Chumbo
TPP Placa de Petri em Poliestireno
UST Ultrasssom Terapêutico
W Watts
W/cm² Watts por centímetro ao quadrado
ºC Graus Celsius
μL Microlitro
12
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO ................................................................................................................... 14
2 REVISÃO DE LITERATURA - CONTEXTUALIZAÇÃO............................................. 16
2.1 ULTRASSOM TERAPÊUTICO .............................................................................................. 16
2.1.1 Conceito ..................................................................................................................... 16
2.1.2 História ..................................................................................................................... 16
2.1.3 Equipamento ................................................................................................................ 17
2.1.4 Efeito Piezoelétrico ..................................................................................................... 18
2.1.5 Indicações e Contraindicações ................................................................................. 18
2.1.6 Formato das Ondas Ultrassônicas ........................................................................... 19
2.1.7 Campo Ultrassônico .................................................................................................... 19
2.2 EFEITOS GERAIS DO ULTRASSOM ................................................................................... 20
2.2.1 Classificação dos Efeitos Biofísicos do Ultrassom ................................................ 21
2.2.1.1 Térmicos .................................................................................................................. 21
2.2.1.2 Atérmicos ou mecânicos ....................................................................................... 22
2.2.1.2.1 Cavitação............................................................................................................... 23
2.3 COMPORTAMENTO DO ULTRASSOM NOS TECIDOS ......................................................... 24
2.3.1 Atenuação..................................................................................................................... 24
2.3.2 Absorção ..................................................................................................................... 25
2.3.3 Reflexão e Refração ................................................................................................... 25
2.4 REPARAÇÃO TECIDUAL..................................................................................................... 26
2.4.1 Fase Inflamatória ......................................................................................................... 26
2.4.2 Fase Proliferativa......................................................................................................... 27
2.4.3 Fase de Remodelação Celular.................................................................................. 27
2.5 CULTURA DE CÉLULAS ..................................................................................................... 28
3 OBJETIVOS
3.1 GERAL........................................................................................................ ............. 30
3.2 ESPECÍFICOS..................................................................................................................... 31
13
ARTIGO ................................................................................................................................. 32
CONCLUSÃO GERAL ........................................................................................................ 44
REFERÊNCIAS .................................................................................................................... 45
ANEXOS ................................................................................................................................ 57
ANEXO A – Normas de formatação da Revista Fisioterapia e Pesquisa.................... 58
ANEXO B – Parecer consubstanciado do Comitê de Ética em Pesquisa (CEP)....... 69
14
1 INTRODUÇÃO
A frequência das lesões musculoesqueléticas é expressiva, tanto no ambiente
de trabalho como nas práticas esportivas, sendo suas incidências decorrentes de
uma gama de mecanismos1,2. Tais mecanismos podem ter fatores de risco
ocupacionais, biomecânicos ou individuais3; tendo origens indiretas (mutações
genéticas ou alterações neurológicos)4 ou diretas, como a laceração, a contusão, a
tensão muscular5,6 e as fraturas ósseas7.
Segundo Walsh et al.8 os distúrbios osteomusculares são considerados um dos
mais graves problemas na esfera da saúde, gerando uma alta demanda por serviços
em saúde, ocorrendo nos âmbitos preventivos, curativos e reabilitativos9, áreas estas,
marcantes no campo da fisioterapia.
Neste sentido, dentro da fisioterapia, diversas são as possibilidades quanto aos
protocolos de tratamento das lesões musculoesqueléticas e, no campo dos agentes
físicos, pode-se citar o uso de compressas, tração mecânica, bandagens, diatermia,
turbilhão, correntes elétricas, eletromagnéticas e, por fim, o laser e o ultrassom10.
Este último, um dos procedimentos físicos, não invasivos, mais utilizados no campo
da fisioterapia.
Desde a década de 40, o ultrassom terapêutico (UST) é empregado para o
diagnóstico por imagem ou reabilitação11,12, e, desde então, sua utilização vem
sendo marcante na prática clínica fisioterápica no tratamento de uma gama de
afecções, como: processos inflamatórios, lesões articulares, edema, cicatrizes,
fraturas ósseas, lesões musculares, epiteliais, nervosas e tendinosas13-21.
Neste contexto, Wilkin et al.22 reportam-se à ação terapêutica, deste agente
físico, por meio das modificações na permeabilidade de membrana, do estímulo do
transporte de substâncias, como cálcio e pela promoção da cicatrização tecidual.
Entretanto, a multiplicidade de dosimetrias utilizadas na prática clínica denota
o uso indiscriminado do UST para afecções que envolvam o sistema
musculoesquelético23 e, uma lacuna de evidências científicas no tocante aos seus
efeitos terapêuticos24. Afinal, além de escassas, algumas das evidências são ainda,
contraditórias.
Paralelamente, Farcic et al.21 confirmam os autores supracitados, relatando a
limitação de literatura disponível, quanto a padronização dosimétrica ideal para
15
reparo tecidual, mecanismo de ação e seus reais efeitos para o tratamento em
questão.
Assim, conforme Johns25, alguns estudos como os in vitro, são fundamentais
para o complemento das pesquisas in vivo, especialmente quando avaliam o
potencial do UST, pois, podem contribuir com novos domínios deste recurso e, como
consequência, com a cultura celular pode-se ter um controle rígido sobre múltiplas
variáveis, com possibilidade de questionamentos mais sistemáticos.
Portanto, visto que Mendonça e Coutinho-Neto26 fazem menção à importância
de estudos que investiguem métodos curativos, capazes de estimular o processo
cicatricial, visando redução dos custos com doenças correlacionadas. Ainda, o fato
de que a definição dos seus efeitos e relação com a dosagens estão aquém da
elucidação, e, apesar da larga utilização do UST, não existem evidências suficientes
para a confiabilidade do seu uso27, faz-se notória a relevância deste estudo.
16
2 REVISÃO DE LITERATURA – CONTEXTUALIZAÇÃO
2.1 ULTRASSOM TERAPÊUTICO
2.1.1 Conceito
Na terapêutica contemporânea, o ultrassom é uma das modalidades
eletrofísicas mais usadas como método diagnóstico ou reabilitativo28-31. Essa
irradiação foi descoberta no passado, devido o uso de uma corrente elétrica senoidal
sobre um cristal, culminando na geração de uma vibração de alta frequência32 capaz
de produzir alterações celulares30,33.
Essa recurso baseia-se em vibrações mecânicas inaudíveis de alta
frequência34, haja vista que, todas as formas de som consistem em ondas que
propagam energia por compressão e rarefação35.
É denominado ultrassom, frequências com valores entre 20.000 e 20.000.000
de ciclos por segundo (1 ciclo/segundo = 1 Hertz)35-37, ao passo que, a acuidade
auditiva humana capta frequências da ordem de 20 a 20.000 Hz, logo as ondas
ultrassônicas são imperceptíveis ao ouvido humano37.
Quanto à sua potência (total de energia de um feixe) é expressa em watts e a
quantidade de energia que irá atingir o alvo específico se sujeita a peculiaridades
como intensidade, amplitude, frequência, foco, uniformidade do feixe e do meio pelo
qual ele irá se dissipar34,38.
Logo, os aparelhos de ultrassom terapêuticos (UST’s) habitualmente
apresentam na escala de 0,7 a 3,3 MHz para acentuar a captação de energia em
profundidades de 2 a 5 cm de tecido mole36, contudo no Brasil, o mais comum são
equipamentos com 1 e 3 MHz de frequência. Sendo que, os aparelhos com
frequência de 1 MHz, alcançam maiores profundidades e, os com 3 MHz, regiões
mais superficiais11,35.
2.1.2 História
Em meados de 1880, o casal Pierre e Marie Curie descobriu o ultrassom, por
meio da geração de vibração de alta frequência, por uma corrente elétrica senoidal
sobre um cristal de quartzo colocado entre duas placas metálicas, conhecido como
17
efeito piezoelétrico. Posteriormente, em 1917, Langevin, Tournier e Howeck, na
cidade de Paris, desenvolveram um sonar piezoelétrico para a Marinha, que após a
emissão de sons, culminava com a morte dos peixes de habitat lacustre39-41.
Já, em 1926 e 1927, nos Estados Unidos, Wood e Loomis verificaram que a
absorção de energia ultrassônica trazia alterações permanentes em peixes, rãs,
células e tecidos; levando-os a um aumento aparente de temperatura. Sendo este
efeito estendido à propriedade do aparelho produzir mecanismos atérmicos
associados39,42.
Após alguns anos, em 1940 Wall et al., em 1950 Fry e Fry, nos Estados
Unidos e 1960 Oka et al. no Japão, associaram a irradiação ultrassônica à estudos
in vitro, no sistema nervoso central39.
Desta forma, após o emprego do UST nas áreas médicas e indústriais, a partir
de 1940 até a atualidade, sua eficácia e aplicações são objeto de discussões e
análises39,43.
2.1.3 Equipamento
Os equipamentos específicos para UST são compostos por um circuito
elétrico e um transdutor. O circuito elétrico ou gerador transforma a tensão da rede
de alta frequência em corrente alternada que é convertida por um transdutor em
vibrações acústicas ou mecânicas pela inversão do efeito piezoelétrico44-46.
Assim, o transdutor, que é formado essencialmente por um cristal intercalado
por dois eletrodos, recebe uma voltagem com a frequência de ressonância
semelhante a do cristal44-46. Logo, este cristal fará, respectivamente, expansões e
contrações, que comprimirão o material à sua frente ou provocarão a rarefação no
material em questão, formando então, a onda ultrassônica, por esta alternância
compressão-rarefação47.
O cristal (elemento piezoelétrico) deve apresentar propriedades
piezoelétricas, podendo ser formado por um disco de material natural, tais como o
quartzo ou uma cerâmica sintética feita de uma mistura de sais complexos,
conhecida como Titanato Zirconato de Chumbo - PZT, os quais podem ser
polarizados por correntes elétricas44,46-48.
Atualmente, visando à extensão da eficiência e durabilidade do equipamento,
18
a utilização do cristal cerâmico sintético PZT tornou-se mais frequente, pois ambos
possuem características físicas pertinentes para o recebimento da corrente elétrica
e deformação, produzindo ondas essenciais para o adequado funcionamento do
aparelho49,50.
2.1.4 Efeito Piezoelétrico
O efeito piezoelétrico só pode ser obtido se o material cristalino possuir
dipolos (regiões com cargas negativas e positivas) em suas moléculas51,52. Com o
rearranjo molecular as paredes do cristal são metalizadas e quando uma tensão é
aplicada nessas faces, as moléculas se atraem do pólo positivo para o negativo e
em sentidos contrários, gerando as vibrações ultrassônicas43.
Caso o material seja aquecido acima da temperatura de Curie (quando há
perda do campo eletromagnético), essas partículas poderão mover-se sem
impedimentos ou, se estiverem abaixo do ponto de Curie, sob campo elétrico, a
orientação das moléculas não será modificada. Por esse motivo, os alinhamentos
das moléculas não são paralelos ao campo53, ou seja, em um circuito cristalino
dentro dos padrões de normalidade, estes dipolos são aleatoriamente orientados e
não podem migrar51,52.
Esse efeito, então, transforma tanto energia acústica em energia elétrica,
quanto, energia elétrica em acústica52,54, produzindo uma vibração mecânica que é
o ultrassom43.
Esta condição permite que o tecido receptor de tal terapia desenvolva
características piezoelétricas análogas às dos elementos cristalinos, abreviando o
reparo tecidual em regiões de injúria e síntese proteica, especialmente em tecidos
constituídos de colágeno, conforme Katchburian e Arana55.
2.1.5 Indicações e Contraindicações do Ultrassom
A aplicação principal do UST tem sido voltada às lesões de tecidos moles e
duros, como ósseas, articulares e na otimização da cicatrização41,56. De maneira
que, suas indicações abrangem um vasto leque de doenças músculo-esqueléticas
que envolvem desde traumas, cicatrizações de úlceras, no aumento da circulação
sanguínea de tecidos isquêmicos, na redução de edema, no estímulo cicatricial
19
tendinoso, na liberação de aderências, como recurso, anti-inflamatório e
analgésico57-59.
Tendo como exemplos mais comuns: artralgias, artrose, bursite, contusões e
contraturas, fibrose, neuromas, entorses, distensões, braquialgia, ciatalgia e a
reparação tecidual em geral60. Em contrapartida, seu uso é desaconselhado em
casos de útero gravídico, carcinomas, esclerose óssea, febre, trombose, epífises,
área cardíaca, olhos e testículos. Vale ressaltar, a importância de atentar-se para o
“déficit” de sensibilidade e presença de implantes metálicos57,60,61.
2.1.6 Formato das Ondas Ultrassônicas
A transmissão das ondas ocorre pela propagação, de forma longitudinal no ar,
nos gases e nos líquidos. Por outro lado, enquanto no vácuo não há propagação,
nas superfícies de alta coesão molecular (sólidos), o transporte das ondas segue
transversalmente ao meio34,62,63.
Kitchen64 acrescenta que a voltagem do transdutor pode ser ajustada em
pulsos (ligada em um período e desligada em outro), denominado modo pulsado, ou
ainda, aplicada ininterruptamente durante todo o tempo, conhecido como onda
contínua, restando a interrupção de energia, como diferencial entre ambas34,65.
Essa referida descontinuidade de carga elétrica é explanada por Bassoli34 e
Rucavado et al.65, colocando que no modo contínuo acontece um acúmulo de
energia nos tecidos, à medida que no pulsado, com a suspensão intermitente de
energia, a frequência de onda e de repetição de pulso sofrem constante variação.
Também, merece destaque o fato de que a emissão contínua é normalmente
destinada para produção de efeitos térmicos e, opostamente, o modo pulsado,
visando os efeitos atérmicos. Podendo-se concluir, que estes efeitos são passíveis
de serem utilizados para obtenção antecipada das metas curativas, desde que o
UST seja aplicado corretamente, em momento apropriado e em doenças
indicadas66.
2.1.7 Campo Ultrassônico
De acordo com Hedrick, Hykes e Starchman67, a onda se propaga em
conformidade com as oscilações de pressão, indo do ponto de maior pressão ou
20
compressão, até regiões de baixa pressão (rarefação). Essas oscilações podem ser
provenientes da variação das cargas elétricas da corrente e podem influenciar
diretamente a frequência com que o transdutor irá vibrar.
O campo de um disco circular piezoelétrico é complexo e, por intermédio dele,
o transdutor do UST emite um progressivo campo de ondas ultrassônicas. Assim, à
proporção que o feixe se distancia do transdutor, o comportamento torna-se mais
simétrico, chamado de campo distante ou zona de Fraunhoffer 43, 64,67.
Porém, na região mais próxima desse local existe uma zona chamada de
Fresnel ou campo próximo, que detém uma série de feixes irregulares e depressões
e, é neste espaço, onde ocorre a maioria das exposições do UST 43, 64,67.
2.2 EFEITOS GERAIS DO ULTRASSOM
Apesar de existir um consenso de que o UST promove efeito benéfico sobre
diversos tecidos, há um contraponto na escassez de estudos sobre os reais efeitos
biológicos que esta terapia pode desencadear no organismo tratado68.
Tais efeitos estão vinculados a fatores biológicos e físicos, que podem ser
delimitados pela intensidade, estrutura do campo ultrassônico, estado fisiológico do
objeto e período de exposição40,69,70-72. Desta maneira, os mecanismos físicos,
térmico e atérmico, acarretam sobre o organismo, órgãos, tecidos e células,
respostas clinicamente significantes73.
Neste contexto, vários autores corroboram, nomeando algumas das
consequências da exposição à irradiação, como: o aumento do metabolismo, da
circulação/angiogênese, da extensibilidade do tecido e da regeneração tecidual; o
estímulo de biomarcadores de regeneração muscular e transporte de substâncias de
mensageiros secundários (cálcio) pela ampliação da permeabilidade de membrana
celular; a intensificação do tecido de granulação e da atividade enzimática celular,
bem como, a redução de atividade elétrica nos tecidos, infiltrados celulares e
mediadores de processo inflamatório22, 53,74-76.
E, mais especificamente, autores reafirmam a diminuição de leucócitos,
radicais livres e macrófagos; a degranulação dos mastócitos e a multiplicação do
fator de crescimento interleucina-8, propiciando alívio nos sinais e sintomas
patológicos, com o avanço na velocidade da cicatrização e qualidade do tecido
neoformado22,53,74-78.
21
Tais respostas biomodulatórias, justificam o abrangente uso do UST na
fisioterapia, com o objetivo de redução do edema e dor, cicatrização de
manifestações ortopédicas e reumatológicas68,79, embora, encontram-se poucas
evidências dos efeitos clínicos do mesmo. Por esta razão, vê-se a necessidade de
sistemática investigação concernente aos seus efeitos e a associação entre suas
doses80.
2.2.1 Classificação dos Efeitos Biofísicos do Ultrassom
A aplicação do UST desencadeia nas células e tecidos vários efeitos através
de vibração, que podem ser classificados em térmicos e atérmicos (mecânicos)
73,80,82,83.
No entanto, Baker et al.80 defendem que a classificação em UST térmico
(onda contínua) e atérmico (onda pulsada), não pode ser completamente
segmentada, devido aos efeitos não estarem completamente separados. Pois, não
existe possibilidade de apenas um efeito biofísico estar presente durante o
tratamento fisioterapêutico80,82.
Sempre os efeitos mecânicos ou atérmicos serão seguidos pelo aumento de
temperatura, por menor que seja, posto que, a relação entre o ultrassom e o tecido
poder ser térmica e atérmica concomitantemente82.
2.2.1.1 Efeitos Térmicos do Ultrassom
A frequência, a intensidade e o tipo de tecido submetido à irradiação implicam
no grau de aquecimento gerado pelo aparelho e, esta capacidade de mensuração
térmica não é inata do equipamento, portanto pode ser obtida por meio de
termógrafos ou termômetros 25,38,88-90.
Mas, para que esteja dentro dos padrões desejados é fundamental que o
tecido alvo atinja uma temperatura entre 40 e 45°C, por cerca de cinco minutos89-90.
Caso a temperatura não alcance os 40°C, existe a probabilidade de não serem
obtidas as ações terapêuticas, e em condições de valores superiores ao limite, pode
haver danos celulares90.
Alguns autores argumentam que, para que exista a resposta fisiológica, o
modo de emissão (pulsado ou contínuo), o período de aplicação e de aquecimento,
22
a dimensão a ser aquecida, a área a ser tratada, a presença de superfícies
refletoras, a temperatura máxima alcançada, a profundidade (1 MHz ou 3 MHz), a
técnica de aplicação (estacionária ou móvel), e finalmente, as características
específicas de cada aparelho, são essenciais em sua delimitação60, 64, 89,91.
Assim, quando fala-se em aquecimento, é convencionado que a temperatura
aumente 0,2ºC por minuto (1 W/cm² e 1 MHz), isso em tecidos moles, in vivo. Vale
expor que, esse crescimento não é uma constante, afinal, a perda energética pela
reflexão de superfícies vizinhas, pela atenuação e variações na emissão da
intensidade do equipamento podem interferir na variação térmica36.
De acordo com Cameron36, onde a reflexão é maior (nas interfaces teciduais)
são observadas temperaturas mais elevadas e, para que seja evitada tal condição,
deve-se deslocar o transdutor pela superfície tratada, o que fará com que haja
dissipação do calor e minimização de áreas extremamente frias ou quentes.
Essa ação térmica está voltada para fins curativos em enfermidades de partes
moles e ósseas25, com foco no objetivo analgésico, redução inflamatória e
espasmódica, redução da rigidez articular e, aumento do fluxo sanguíneo e
extensibilidade do colágeno25,38,88,92,93.
2.2.1.2 Efeitos Atérmicos ou mecânicos do Ultrassom
Uma série de processos biológicos do ultrassom não são restritos ao
aquecimento tecidual, por serem oriundos dos impulsos mecânicos, compreendendo
as correntes acústicas, as ondas estacionárias, a micromassagem e a cavitação94,95.
O formato de onda, pulsado (com ciclo de trabalho de 20%), faz com que
ocorra a perda de parte do calor gerado durante a emissão de ondas, culminando
em tênues oscilações de temperatura. Evento este, motivo de investigação de
alguns estudos, que selecionaram intensidades muitos baixas, a fim de examinar os
efeitos mecânicos em questão92-94.
Farcic66 associa a esses achados, à ponderação de que os processos
mecânicos alteram a permeabilidade das membranas e a movimentação de fluido, a
síntese de aminoácidos, a motilidade dos fibroblastos, o gradiente de concentração
entre cálcio e potássio, a secreção de mastócitos, os impulsos elétricos nervosos,
dentre outros14,16,44,56,96.
No entanto, vale lembrar que para serem obtidos os resultados positivos em
23
relação ao UST, a intensidade da irradiação ultrassônica precisa ser ideal, ou seja,
segura e, a vibração deverá ocorrer nos limites da membrana com o líquido
circunjacente. Para que assim, a terapia ultrassônica obtenha sucesso desde a
restruturação de lesões e consolidação de fraturas até à reinervação, quando com
comprometimentos nervosos25, 56,97.
2.2.1.2.1 Cavitação
A cavitação é descrita como o desenvolvimento de cavidades de ar, com
dimensão de micrômetros em um determinado meio. Este meio pode ser
representado por fluidos teciduais ou o sangue, que contendo gases, são
submetidos a uma micromassagem, proveniente das trocas de pressões do campo
acústico do ultrassom64,73,98-100.
Essas bolhas podem ser benéficas ou não dependendo da amplitude de
pressão da energia64,100, ou seja, variações de pressão baixas proporcionam
porosidades reversíveis das membranas celulares. Pois, quando a cavitação é
originada por ondas pulsadas, produz exacerbação da circulação sanguínea e
respostas anti-inflamatórias, contendo maior valor terapêutico73,101.
Neste caso em particular, de acordo com Dyson73 é chamado de cavitação
estável, quando há contração e dilatação, pequena ou moderada, das bolhas a cada
ciclo acústico, sendo resultantes de microvibrações, porém num estado estável,
permanecem intactas101,102.
Assim, as bolhas podem crescer repentinamente e se colapsarem
violentamente. Ao passo que, essas oscilações mais intensas, provindas de altas
amplitudes de pressão acústica (acima de 1.000 MPa), permitem ou não o
surgimento de radicais livres altamente reativos e prováveis lesões teciduais,
fenômeno este denominado cavitação transitória ou transiente64,73,100-102.
Nesse sentido, Guirro e Guirro12 citam que a explosão dos núcleos bolhosos
por gases, por desequilíbrio térmico, propicia disparos de descargas elétricas e,
consequente, formação de radicais livres e desestruturação proteica, frente ao
abrupto choque hidrodinâmico.
Exemplificando, os autores Zhao e Yan103 simularam, em células, o aumento
da população das espécies reativas de oxigênio (EROs) frente ao estímulo da
24
membrana celular por meio da cavitação (UST pulsado). Mas, quando houve um
crescimento exagerado destas moléculas de oxigênio, observaram a diminuição da
viabilidade das células do tecido e interferência na regeneração da lesão.
Por isso, o uso do UST deve ser seguro e sempre abaixo do limiar de
cavitação, uma vez que, somente assim têm-se as respostas desejáveis, traduzidas
em estimulação da reparação e regeneração tecidual104-106.
2.3 COMPORTAMENTO DO ULTRASSOM NOS TECIDOS
Existe uma interdependência de fatores para que os efeitos do UST sejam
eficazes, como a amplitude, foco e uniformidade do feixe, os parâmetros de
aplicação, a intensidade, o modo da onda, a frequência e a quantidade de
energia24.
Desta maneira, quando a energia percorre o tecido tratado, sofre
interferências pelas várias densidades encontradas e pela própria frequência
administrada. Sendo que estas alterações são classificadas em absorção,
reflexão, atenuação e refração11,24,61,107,108.
Nesse sentido, a cada passagem da energia pelos tecidos, ocorre a
redução da energia disponível para os tecidos situados em camadas mais
profundas11,24,61,107,108. Além disso, a impedância acústica, controlada pela
densidade dos tecidos tratados, está diretamente associada com a dissipação da
onda e, por conseguinte, com os efeitos constatados24.
Todos estes fatores, em síntese, independente do método de interação do
UST com o organismo em estudo, possibilitam essa terapia promover uma
terapêutica dentro dos limiares seguros, no intuito de não ocorrerem eventos
lesivos109.
2.3.1 Atenuação
Segundo Ter Haar et al.110, à proporção que as ondas sonoras penetram no
tecido ou o local de aplicação, parte da energia transforma-se em calor, pela
absorção e, outra parte é refletida nas interfaces teciduais. Logo, a atenuação se
deve a estes dois mecanismos, onde a absorção assume a perda de 60-80% da
25
energia56,80,110.
2.3.2 Absorção
Quando a energia é transformada de vibratória para molecular, os tecidos
adquirem a capacidade absortiva, também chamada de armazenamento de energia,
fundamental para o processo curativo. Portanto, a absorção é proporcional à
concentração proteica local, pelo fato das proteínas serem as moléculas com melhor
coeficiente de armazenagem e, por isso, a eficiência do tratamento torna-se
dependente desses aminoácidos complexos61,82,107,108,111,112.
Deste modo, o percentual de proteínas é proporcional ao aquecimento local,
ou seja, quanto maior o número de proteínas, maior, o aquecimento. Então, tecidos
como ossos e tendões se aquecem mais do que os epiteliais ou adiposos, isto é, os
que detêm alta taxa de água (sangue e gordura), uma vez que na superfície do
periósteo, até 60% da energia poderá ser absorvida61,107,108.
Por este motivo, houve a necessidade da categorização dos tecidos
conforme o nível de absorção acústica e observação quanto à diferenciação entre as
proteínas situadas em células nervosas, muscular, colágenas e na própria
hemoglobina61,82,107,108,111,112.
2.3.3 Reflexão e Refração
No momento em que uma onda ultrassônica depara-se com uma ligação
entre meios diferentes, parte da energia é refletida e outra é refratada. A reflexão
tem a propriedade de regresso do pulso (direção contrária à superfície) com a
mesma velocidade de propagação, não permitindo que o feixe passe para outro
meio. Isto ocorre no periósteo/ossos e na relação entre o cabeçote transdutor com
ar, onde até 40% da onda poderá ser refletida43,61,107,108,112.
Já na refração, a onda permanece no mesmo sentido da irradiação com uma
velocidade distinta em função das peculiaridades do meio. Nesse desvio, a onda
refratada penetrará a interface de um ângulo (incidência) e sairá destes tecidos ou
interfaces em um ângulo distinto ao inicial43,61,107,112.
26
2.4 REPARAÇÃO TECIDUAL
A reparação tecidual consiste em uma sucessão de complexas reações
celulares e moleculares, in loco ou sistemicamente, que objetivam recompor o
espaço lesado26,113-115, cujas células destruídas são repostas por células vitais,
provindas do estroma do tecido conectivo lesionado (cicatrização) ou do parênquima
(regeneração)115.
Esse processo biológico acontece de forma sobreposta no tempo, porém,
suas fases são subdivididas em: fase inflamatória, proliferativa ou neoangiogênica e
de remodelamento116-118.
Neste fenômeno de reestruturação anatômica e da função natural da região
lesionada, a escassez ou um desequilíbrio de elementos biológicos, podem afetar a
eficiência do processo de cicatrização, principalmente na configuração do
colágeno119.
Huseyin et al.120 e Galvão et al.121 apontam que o reparo de lesões pode ser
promovido pelo uso de ultrassom em baixas intensidades e laser de baixa potência,
recursos amplamente aplicados na prática clínica. Embora, a conformidade entre
parâmetros dosimétricos fique aquém do esperado para promoção de reparo mais
ágil e com melhor qualidade.
Além disso, o UST, quando empregado na fase de restauração tecidual,
proporciona a elevação do número de células ativas, pela agitação molecular e a
ascendência da temperatura, culminando em uma cicatrização com maior
qualidade122-124.
2.4.1 Fase Inflamatória
Constatado o dano tecidual ou a desregulação da fisiologia normal celular por
injúria, inicia-se a fase inflamatória que é a precursora de um tecido restaurado.
Neste momento, entram em ação alterações vasoativas que fazem a liberação de
fagócitos circulantes para a periferia da lesão, perdurando todo o ciclo, do primeiro
ao décimo dia116,125,126.
Nesta fase, se aplicado o UST, pode-se obter a otimização da cicatrização,
isto, se o causador do processo inflamatório for retirado. Essa aceleração, pode
estar correlacionada ao crescimento fagocitário e o movimento de células e
27
partículas por meio da vibração do cito gel, ou ainda, pela secreção de serotonina e
de histamina dos mastócitos, promovidas pela modificação da permeabilidade da
membrana da plaqueta e fatores liberados dos macrófagos73,127,128.
2.4.2 Fase Proliferativa
Esta fase inicia-se com três dias após a lesão e, em até cinco dias é
estruturada a trama de granulação, com deposição de matriz extracelular129,130.
Inicialmente, esta etapa é marcada pela presença de células como os fibroblastos,
miofibroblastos e endoteliais vasculares na área lesada114,126,130.
Segundo Pereira126 e Józsa e Kannus114, a proliferação e a migração das
células acima citadas, são intermediadas por fatores de crescimento liberados pelos
macrófagos teciduais e plaquetas, possibilitando a síntese de colágeno e sua
deposição131.
Assim, Robbins et al.130 mencionam que à partir da produção de colágeno, o
processo de fibroplasia é evidenciado e o novo tecido formado (granulação) passa a
ter como características a presença de colágeno e fibroblastos neoformados,
macrófagos, substância matricial e micro vasos permeáveis.
Por fim, autores indicam que o uso da terapia ultrassônica, neste período,
não somente institui ampliação da produção colágena, pela motilidade fibroblástica,
mas, propicia maior distensibilidade tecidual, isto, em decorrência do acréscimo no
fluxo de íons de cálcio que controlam a atividade celular40,73,127,128.
2.4.3 Fase de Remodelação Celular
A última e terceira etapa é denominada de fibrose ou maturação, também
conhecida como remodelagem. Este estágio tem seu início em torno da segunda
semana de cicatrização e pode perdurar por até mais de um ano, variando em
conformidade com a natureza da ferida64,115,125,132,133.
Józsa & Kannus116, citam um exemplo inerente a esta fase, um tendão
lesionado, que mesmo após quatro a doze meses na fase de reparo, ainda assim,
não atingirá a função biomecânica e morfológica de um tendão completamente
normal.
28
Nesta fase, ocorre a troca do tecido granulado pelo fibroso, onde o colágeno
tipo III é convertido por colágeno fibrilar maduro tipo I125. Vale ressaltar, que neste
momento de realinhamento do colágeno e dos fibroblastos (com formato mais
alongado), os feixes colágenos orientam-se em paralelismo e tornam-se mais
espessos, ganhando força e elasticidade, em busca de restituir a função inicial do
tecido11,40,64,117,133-135.
Desta forma, a correspondência entre as propriedades mecânicas da cicatriz
está conectada à quantidade de colágeno e arranjo ou alinhamento de colágeno da
ferida o que afetará diretamente ou indiretamente a eficácia da reparação
tecidual40,136,137.
2.1 CULTURA DE CÉLULAS
A técnica de cultivo celular ou tecidual teve sua origem no início do século XX,
com o intuito de observação de células animais livres das interferências do
organismo interno e com a manutenção da exposição ao ambiente externo138. O
pesquisador pioneiro nesta área foi o americano Ross Harrison (1908), zoólogo, que
utilizou métodos in vitro para o estudo de fenômenos in vivo, por meio de cultura de
medula espinhal embrionária de anfíbios139.
Segundo Coura140, a técnica de cultivo celular é derivada de uma dispersão
de células oriundas de um tecido original de uma linhagem celular, cultura primária
ou pela desagregação enzimática, mecânica ou química. Inicialmente, existiam
grandes dificuldades com a técnica em questão, mas, que foram progressivamente
solucionadas com uso de materiais descartáveis e estéreis, meios de cultura
apropriados e métodos seguros de manuseio139.
Apesar da necessidade de um local de trabalho asséptico e de treinamento do
pesquisador, atualmente, estudos in vitro tem relevante elegibilidade, devido à
vantagem de economia em reagentes, a homogeneidade da amostra e possibilidade
de padronização por controle preciso de pressão osmótica, tensão de CO2 e O2, pH e
temperatura141,142.
Vale frisar que, apesar da associação entre o agente físico ultrassônico e a
cultura celular fibroblástica não ser uma constante na literatura, o UST também é
aplicado em cultura de osteoblastos, periósteo, condrócitos, entre outros85,86 . Assim,
podemos citar as pesquisas de Zhou et al.85, que observaram após indução de
29
ondas pulsadas, a proliferação de fibroblastos em cultura de células de epiderme, ou
Harle et al.94, que em células osteoblásticas, obtiveram influência positiva sobre os
processos de reparo, quando associado com tratamento com UST.
Nesta mesma linha, Artilheiro et al.87 observaram a proliferação e viabilidade
de células musculares em conjunto com a referida terapia, enquanto que, Deng et
al.104, notaram que oócitos de mamíferos, começaram a apresentar porosidades em suas
membranas, posteriores às irradiações.
Já, em células da medula óssea de ratos, Naruse et al.143 encontraram a
expressão relevante de genes atuantes no processo de formação óssea, isto, logo
após o tratamento com ultrassom de baixa intensidade pulsado. Outros autores,
registraram efeitos dessa mesma terapia, no estímulo ao metabolismo da matriz
extracelular em células de disco intervertebral ou em alterações à nível nuclear, com
remodelação de cromatina em fibroblastos após exposição ao UST pulsado144-145.
Shah et al.146 quando estudaram os efeitos do ultrassom pulsado (a 1 MHz e
350 mW/cm2) sobre células-tronco mesenquimais notaram a produção de matriz
extracelular e aumento do número celular. Assim como, Lim et al.147 que ao usar
UST (1MHz, 20% e 50% e 50 mW/cm2) constataram o crescimento na viabilidade
celular e de genes voltados à diferenciação osteogénica, em Células-Tronco
Mesenquimais derivadas de osso humano.
Outro aspecto, largamente usado nos dias atuais, são as pesquisas
envolvendo cultura fibroblástica, células obtidas a partir de “tecido conjuntivo,
cartilagens, revestimentos de vasos sanguíneos, músculos e estromas de vários
órgãos e outros tecidos”139. Estas células fibroblásticas são fundamentais na
produção de matriz extracelular (no tecido conectivo) e de colágeno (no tecido
fibroso), estando diretamente envolvidas nos mecanismos de reparo tecidual e na
fase de remodelamento dos tecidos148,149.
Neste sentido, uma das linhagens de fibroblastos bastante utilizadas é a
L929, derivada do tecido aureolar subcutâneo e adiposo de camundongos machos
Mus musculus (C3H/An) de 100 dias. Estas células foram umas das primeiras
linhagens celulares a serem estabelecidas em cultura contínua, desenvolvidas por
Earle em 1940150.
Nos estudos de Oliveira et al.146, observa-se a utilização de células
fibroblásticas L929 e o ultrassom (0.2 W/cm2, 0.6 W/cm2, 0.8 W/cm2, 1.0 W/cm2, 2.0
W/cm2, 1MHz - 10% e 20%), com implicações, na aceleração do processo cicatricial
30
na dosimetria de 0.6 W/cm2 a pulso de 10%151, bem como, em outro trabalho que,
como o primeiro, evidencia as propriedades biofísicas do UST na proliferação
celular, pois, os autores apontam que, doses de 0.6 W/cm2 e 0,2 W/cm2, além de
minimizarem os danos celulares viabilizam o crescimento celular152.
Pires-Oliveira153 também analisaram o comportamento do Ultrassom pulsado
de baixa intensidade (0,2 e 0,6 W/cm2, com pulsos de 10 e 20%) e Laser de baixa
potência (904 nm, 5 e 6 J/cm 2) em cultivos L929 e, ao compararem as duas
terapias, constataram que ambas podem induzir mudanças em níveis intracelulares,
com repercussões em retículo endoplasmático e filamentos do citoesqueleto.
Bohari et al.154 Investigaram a ação ultrassônica (0,2 W/cm2 -20%) sobre
fibroblastos de ratos e, sugeriram que apesar da proliferação celular não ter sido
significativa, existe uma tendência à indução na promoção de colágeno e
glicosaminoglicanos nestas células.
Desta maneira, Johns et al.84 citam a hipótese de que a energia fornecida pelo
UST pode, até mesmo, alterar a atividade enzimática, promovendo modificações na
transdução de sinais intracelulares para a síntese de proteínas, uma vez que, dentro
da biologia celular, a irradiação ultrassônica ao alcançar um determinado limiar,
estimulará a célula tanto in vivo como in vitro, mas com maior sensibilidade se, in
vitro, devido a ausência de barreiras e dissipações80.
Portanto, quando correlacionado o tratamento ultrassônico com cultura de
fibroblastos, assume-se a relevante complementação dos estudos in vivo, uma vez
que, admite-se a minimização dos efeitos térmicos do UST, assim como, a
viabilização das análises84,87. Além de que, com esta técnica de manipulação
laboratorial, pode-se conseguir um rígido controle das inúmeras variáveis envolvidas,
questionar as respostas de forma mais sistemática e, finalmente, alcançar maior
esclarecimento sobre a utilização do UST84,87.
3 OBJETIVOS
3.1 GERAL
Analisar os efeitos da irradiação ultrassônica pulsada de baixa intensidade em
cultura celular fibroblástica L929.
31
3.2 ESPECÍFICOS
Analisar os efeitos do ultrassom em cultura celular de fibroblasto L929,
avaliando viabilidade celular;
Identificar parâmetros de dosimetria da irradiação ultrassônica
correlacionando com os processos de estimulação e/ou reparo tecidual.
32
ARTIGO
EFEITO DA TERAPIA ULTRASSÔNICA DE BAIXA INTENSIDADE EM
CULTURA CELULAR DE FIBROBLASTOS
EFFECT OF LOW-INTENSITY PULSED ULTRASOUND ON FIBROBLASTS
CELL CULTURE
(Submetido à Revista Fisioterapia e Pesquisa em 28/12/2013)
EFEITO DO ULTRASSOM EM CULTURA DE FIBROBLASTOS (título
condensado)
Priscila Daniele de OliveiraI
Deise A. A. Pires OliveiraII
Cintia Cristina MartinagoI
Regina Célia Poli FredericoIII
Cristina Pacheco SoaresIV
Rodrigo Franco de OliveiraII
I- Fisioterapeuta, especialista e mestranda em Ciências da Reabilitação pela Universidade
Estadual de Londrina (UEL)/Universidade do Norte do Paraná (UNOPAR)– Londrina-Pr.
II- Fisioterapeuta, Dr(a) e Prof(a) Titular do Programa de Mestrado e Doutorado Ciências da Reabilitação - UEL/UNOPAR – Londrina-Pr.
III- Bióloga, Dra e Profa Titular do Programa de Mestrado e Doutorado Ciências da Reabilitação - UEL/UNOPAR – Londrina-Pr.
IV- Bióloga, Dra e Profa integral da Universidade do Vale do Paraíba (UNIVAP) no Departamento de Biologia Celular e Tecidual, São José dos Campos, SP.
33
Endereço para correspondência
Rodrigo Franco de Oliveira UNOPAR - Centro de Pesquisa em Ciências da Saúde.
Laboratório de Cultura Celular (LACCEL). Av. Paris, 675. Jd. Piza, CEP: 86041-140, Londrina-PR. e-mail: [email protected]
Fonte de financiamento: Fundação Nac. de Desenv. do Ensino Sup. Particular (Funadesp) e
Coord. de Aperf. de Pessoal de Nível Sup. (Capes).
Instituição sede do estudo: UNOPAR - Universidade do Norte do Paraná. Centro de Pesquisa em Ciências da Saúde. Laboratório de Cultura Celular. Av. Paris, 675. Jd. Piza, CEP: 86041-140, Londrina-PR.
RESUMO
Dentro da prática fisioterápica verifica-se a ampla utilização do ultrassom terapêutico para tratamento das
diversas afecções musculoesqueléticas. O objetivo deste estudo foi avaliar o efeito da irradiação Ultrassônica de
Baixa Intensidade, com diferentes pulsos e intensidade, em cultura celular de fibroblastos L929 (ATCC CCL-1
NCTC), de modo a verificar a viabilidade celular e definir parâmetros de dosimetria. Para isso, utilizou -se a
aplicação de ultrassom pulsado, com frequência de 1Mhz, em cultura de células fibroblásticas, divididas em
cinco grupos (controle e com intensidade instantâneas de 0,3 W/cm2-10%; 0,3 W/cm
2 -20 %; 0,5 W/cm
2 -10% e
US 0,5 W/cm2 -20 % - 100Hz). A irradiação ocorreu com intervalos de 24, 48 e 72 horas, por dois minutos e
após 24 horas de cada irradiação foi realizada teste de MTT Brometo de [3-(4,5-dimetiltiazol)-2,5-
difeniltetrazólio]. Os resultados revelaram que ao comparar-se os valores de células viáveis pelo método MTT
nos cinco grupos, não foi possível encontrar diferença estatisticamente significativa em nenhum deles, nos três
momentos avaliados (24, 48 e 72 horas). Enquanto que, ao se realizar a análise de medida repetida nos diferentes
grupos, encontrou-se diferença estatisticamente significativa apenas no grupo irradiado com ultrassom a 0,5 W/
cm2
com regime de pulso de 10% (p=0,003). Com base nesses resultados, conclui-se que a irradiação
Ultrassônica de Baixa Intensidade em cultura celular de fibroblastos L929, somente no grupo com intensidade de
0,5 W/cm2-10% obteve o crescimento numérico, com diferenças estatisticamente significantes em todos os
períodos de avaliação.
Descritores: Dosimetria; Tecido Conjuntivo; Técnica de Cultivo de Células; Ultrassom.
ABSTRACT
Within the physiotherapy practice there is wide use of therapeutic ultrasound for the treatment of various
musculoskeletal disorders. The aim of this study was to evaluate the effect of Low Intensity Ultrasonic
irradiation with different pulse and intensity in cell culture of L929 fibroblasts (ATCC CCL-1 NCTC), so check
cell viability and define parameters of dosimetry. For this, we used the application of pulsed ultrasound with a
frequency of 1MHz, in cultured fibroblast cells, divided into five groups (control and instantaneous intensity of
0.3 W/cm2 - 10%, 0.3 W/cm
2 - 20%, 0.5 W/cm
2 - 10% and US 0.5 W/cm
2 - 20% - 100Hz). Irradiation occurred
at intervals of 24, 48 and 72 hours for two minutes and 24 hours after each irradiation test MTT [3 (4,5-
dimethylthiazol) -2,5-diphenyltetrazolium bromide] was performed. The results showed that when comparing the
values of viable cells by MTT method in the five groups, we could not find statistically significant difference in
any of them, in these three conditions (24, 48 and 72 hours). Whereas, when performing the analysis of repeated
measures in the different groups, we found a statistically significant difference only in the group irradiated with
ultrasound at 0.5 W/cm2 with pulse regime of 10% (p = 0.003). Based on these results, it is concluded that the
Low Intensity Ultrasonic irradiation in L929 fibroblast cell culture, only in the group with an intensity of 0.5
W/cm2 -10% obtained numerical growth, with statistically significant differences in all periods evaluation.
Keywords: Dosimetry; Connective Tissue; Cell Culture Techniques; Ultrasound.
34
INTRODUÇÃO
Dentro da prática fisioterápica, quando observados os recursos utilizados na clínica
reabilitativa verifica-se a ampla utilização do ultrassom terapêutico (UST) para tratamento das
diversas afecções musculoesqueléticas agudas ou crônicas1-2. Isto decorre principalmente pelo
fato de ser um método seguro que evita aos pacientes os riscos de procedimentos invasivos3.
Este método está presente no exercício clínico há mais de seis décadas4, em
contrapartida, Wardejn e McMeeken5 frisam a escassez quanto a evidências científicas sobre
seus efeitos terapêuticos e a normatização da aplicação.
De maneira que, os artigos disponíveis confirmam a contradição acima citada quanto
à padronização e o próprio reparo tecidual, em virtude dos mesmos denotarem a escassez na
comprovação dos reais efeitos biológicos ou mecanismos de ação e, a falta de determinação
concreta nos critérios indicados para este tipo de tratamento4,6,7.
Deste modo, dá-se a importância de constante investigação de seus resultados clínicos,
bem como, estudo da relação entre doses e respostas biológicas para um consenso dosimétrico
do agente físico em questão1,8. Afinal, como aponta Ishikawa at al.9, a correta aplicação do
UST é imprescindível não somente para fundamentar os níveis de exposição que induzem a
repercussão biológica significativa, quanto para a proteção dos pacientes.
Mediante, esta perspectiva, constata-se em diversos trabalhos uma gama de efeitos
fisiológicos térmicos e não térmicos que o UST induz nos tecidos biológicos por meio da
vibração10.
Dessas acepções, pode-se ressaltar a ativação fibroblástica, o aumento na
extensibilidade do colágeno e cicatrização, a diminuição de células inflamatórias (leucócitos e
macrófagos) por aceleração do metabolismo celular, síntese proteica, osteogênese, ativação do
ciclo de cálcio, angiogênese (com consequente acréscimo na circulação sanguínea e perfusão),
a produção do fator de crescimento, redução dos espasmos musculares, rigidez articular e
finalmente, a analgesia11-18.
Neste contexto, com base nos estudos de Zhou et al.19, destaca-se que os efeitos do
UST quando aplicado in vitro denotam íntima ligação com o tipo celular, propiciando síntese
de DNA em periósteo, osteoblastos e fibroblastos.
Por fim, com base nas considerações apresentadas por Johns20, ressalta-se a relevância
dos estudos em cultura celular quando correlacionados à ação do ultrassom, uma vez que
possibilitam a complementação das investigações in vivo, proporcionam controle rígido sobre
35
as inúmeras variáveis e, ainda, potencializam os conhecimentos no tocante ao emprego dessa
ferramenta terapêutica.
Assim, o objetivo deste estudo foi avaliar o efeito da irradiação Ultrassônica de Baixa
Intensidade, com diferentes pulsos e intensidade, em cultura celular de fibroblastos L929, de
modo a verificar a viabilidade celular e definir parâmetros de dosimetria.
METODOLOGIA
Este estudo caracteriza-se como experimental e para a realização deste utilizou-se
células de fibroblastos, derivados de tecido conjuntivo de camundongos, da linhagem L929
(ATCC CCL-1 NCTC) fornecida pelo Instituto Adolfo Lutz-SP, Brasil. O estudo recebeu
aprovação do Comitê de Ética da Universidade Norte do Paraná (UNOPAR), sob o protocolo
nº 462.478/2013.
Cultura Celular
As células L929 de fibroblastos foram rotineiramente cultivadas em placas de 25cm2
(TPP, Switzerland, Europe) com MEM (Minimum Essencial Medium, Gibco® - Invitrogen
Corporation, Grad Island, USA) suplementado com 10% de Soro Fetal Bovino (Cultilab,
Brazil) e 1% de Antibiótico -Antimicótico (Gibco®, by Life Technologies), e mantidos em
estufas de CO2, atmosfera 5%, a 37ºC (Thermo Forma Scientific, Waltham, MA). As células
utilizadas neste experimento seguiram as recomendações de utilização para o teste de
toxicidade in vitro que constam na ISO 10993-5.
Ultrassom
A irradiação ultrassônica foi realizada com um equipamento da marca KLD® –
(Biossistemas Equipamentos Eletrônicos Ltda.), modelo Avatar III, com cabeçote de 1 MHz,
BNR (taxa de não uniformidade do feixe) ≤ 6 e com área de radiação efetiva (ERA) de 1 cm2,
devidamente calibrado pelo fabricante.
36
Irradiação
Após a cultura apresentar confluência foi realizada a tripsinização nas placas TPP de
12 poços, com 24 mm de diâmetros e 18 mm de profundidade, em uma densidade de 1x106
células/mL. Em seguida, as células ficaram por 24 horas em repouso (over night) para a
sedimentação. Posteriormente, iniciou-se o tratamento nos intervalos de 24, 48 e 72 horas,
respeitando a seguinte separação grupos (Tabela 1):
Tabela 1 - Descrição dos grupos experimentos e respectivas dosimetrias.
Grupo Intensidade
Instantânea
Regime de
Pulso
Intensidade
Média
Ciclo de
trabalho
Frequência
G1 Grupo controle (não recebeu irradiação)
G2 0,3 W/cm2 10% 0,03 W/cm2 1:9 100 Hz
G3 0,3 W/cm2 20% 0,06 W/cm2 2:8 100 Hz
G4 0,5 W/cm2 10% 0,05 W/cm2 1:9 100 Hz
G5 0,5 W/cm2 20% 0,10 W/cm2 2:8 100 Hz
Visando um bom acoplamento da interface do ultrassom (distância da camada de
células ao transdutor: de 18 mm) e propagação da onda mecânica, os volumes dos poços
foram completados com meio MEM até a borda, e cada poço irradiado, mantido sempre na
mesma posição em relação à face do transdutor do ultrassom.
Quanto ao tempo de aplicação, realizou-se a irradiação, por 2 minutos em cada poço,
em temperatura ambiente, nos intervalos de 24, 48 e 72 horas, sendo descartado o
aquecimento da placa. Todos os experimentos foram realizados em triplicata e após cada
período, as culturas tiveram a viabilidade celular avaliada pelo teste de citotoxicidade MTT.
Teste de citotoxicidade celular por MTT
Os experimentos de citotoxicidade foram avaliados pelo método de MTT Brometo de
[3-(4,5-dimetiltiazol)-2,5-difeniltetrazólio]. As culturas de células L929 receberam irradiação
ultrassônica nos intervalos de 24, 48 e 72 horas, sendo que, após 24 horas de cada irradiação
foi realizado teste de MTT de acordo com ensaio a seguir: depois de retirado o meio MEM,
cada poço recebeu 80 μL de MTT, uma concentração final de 0,5mg/mL e foram incubados
por 1 hora a 37ºC, em atmosfera de 5% de CO2; em seguida, adicionou-se a cada poço 400
μL de Dimetil Sulfóxido (DMSO). As placas foram mantidas em agitação por 30 minutos
para a solubilização dos cristais de formazana. A sua concentração foi quantificada
37
espectroscopicamente por meio de um leitor de microplacas (Leitor ELISA - SpectraCount –
Packards Istrument, Offeburg – Alemanha), em comprimento de onda de 570 nm.
Análise estatística
Os resultados foram expressos em valores médios e desvio padrão, com avaliação da
normalidade verificada pelo teste de Shapiro-Wilk. Para comparação e verificação de
diferenças expressivas entre os grupos, utilizou-se a Análise de Variância (ANOVA) e o teste
post hoc de Tukey HSD e, entre as avaliações, ANOVA de Medidas Repetidas. Na análise
estatística utilizou-se o programa SPSS versão 20.0, onde o intervalo de confiança foi de 95%
e valores de p < 0,05 foram considerados estatisticamente significativos.
RESULTADOS
Ao comparar os valores de células viáveis pelo método MTT nos grupos
(G1=controle, G2=0,3-10%, G3=0,3-20%, G4=0,5-10% e G5=0,5-20%), não foi encontrado
diferença estatisticamente significativa entre eles, nos três momentos avaliados (24, 48 e 72
horas) (Tabela 02).
Ao se realizar a análise de medida repetida nos diferentes grupos, encontrou-se
diferença estatisticamente significativa apenas no grupo irradiado com ultrassom a 0,5 W/cm2
com regime de pulso de 10% (p=0,003). Nesse grupo, ocorreu aumento da viabilidade celular
tanto de 24 para 48 horas, de 48 para 72 horas, como de 24 para 72 horas.
Entretanto, vale destacar determinadas diferenças, em números absolutos,
concernentes à viabilidade celular, especialmente do grupo G3, irradiados com ultrassom
pulsado a 20% na intensidade de 0,3 W/cm², o que pode sugerir que mesmo não tendo sido
encontradas diferenças estatisticamente significantes entre todos os grupos experimentais,
ocorreu um crescimento considerável no número de células irradiadas.
Fato este que possibilita entender que o ultrassom não atuou de maneira deletéria às
células, sendo que não houve decréscimos em números, em nenhum dos grupos e, que os
fibroblastos não permanecem inertes à ação do ultrassom, pois, em todos os grupos houve
crescimento no seu valor total (Figura 1).
38
DISCUSSÃO
Segundo Silva et al.16 os efeitos terapêuticos do ultrassom não dependem
exclusivamente da intensidade, modo de emissão e frequência, mas também encontram-se
diretamente sujeitos à duração da intervenção. No presente estudo, o tempo de aplicação
terapêutico foi padronizado em dois minutos, com base nas conclusões de Oliveira et al.21,
que com este mesmo protocolo de aplicação confirmam o aumento na viabilidade celular.
Quanto a utilização do modo de emissão pulsado, vem de encontro aos achados de
Cunha et al.22, que em suas considerações denotam que a modalidade em questão, mostrou ser
mais eficaz que o regime de pulso contínuo. Fato este, dentro do processo de reparação de
tendões em ratos, que sinalizou otimização na organização e agregação de feixes das fibras de
colágeno, visto que, o ciclo de trabalho contínuo exibiu desorganização do material, a
exemplo de efeito deletério no reparo.
Lirani-Galvão et al.23 e Hsieh24 reportam que o ultrassom pulsado apresenta um
comportamento relevante, relacionado aos efeitos terapêuticos, como: aumento da
permeabilidade e difusão de membrana, bem como, de cálcio intracelular.
Já, com relação aos benefícios da dose 0,5W/cm2 (pulsado a 10 e 20%, 100 Hz e
intensidade instantânea) encontrados também em nossos resultados, podem estar atrelados à
associação dos efeitos atérmicos, os quais seriam responsáveis pela referida estimulação do
transporte de substâncias e modificação na permeabilidade da membrana celular25.
Os achados deste experimento também reforçam os estudos de Demir et al.26, onde o
ultrassom terapêutico tem evidenciado sua eficácia na estimulação de cultura de fibroblastos
com intensidade entre 0,1 e 0,5 W/cm², abreviando a fase inflamatória de reparo. De igual
forma, Lowe et al.27 e Oliveira et al.28, também confirmaram sua eficácia, na fase de reparo,
utilizando de doses de ultrassom com intensidades de aproximadamente 0,5 W/cm2 em modo
pulsado (10 e 20% - 100Hz) e frequência de 1 MHz.
Enquanto que, ao utilizar a intensidade de 0,3W/cm2 (pulsado a 10 e 20%, 100 Hz,
frequência de 1 MHz e intensidade instantânea) visando ressaltar a ação não térmica do UST,
nesse processo em particular, a atenuação, pode ter reduzido o tamanho da onda de escolha,
que por sua vez, já possui uma amplitude muito baixa. O que remete ao fato de que, a
intensidade empregada, pode não ter sido suficiente para ocasionar as implicações biofísicas,
pois as mesmas são dependentes da intensidade29.
Ainda, podemos acrescentar, que segundo Garret et al.30, para atingir o efeito térmico,
são imprescindíveis, mais que cinco minutos de aplicação. Sendo assim, o tempo de aplicação
39
de ultrassom (dois minutos) nos grupos 0,3 W/cm2 (pulsado a 10 e 20%, com 1 MHz,
frequência de 1 MHz e intensidade instantânea), pode ter sido insuficiente para promover as
respostas estatisticamente significantes, assim como os resultados expressos pelos autores
supracitados.
Deste modo, outros estudos nessas linhas temáticas, divergem em alguns aspectos dos
nossos resultados e, discorrem a respeito da elevação do metabolismo ósseo em ratos (com
dose de 0,3W e frequência 1 MHz)14,17 ou aumento quantidade de fibroblastos e alinhamento
colágeno com uso de ultrassom pulsado (20%) a uma intensidade de 0,5 W/cm² 13.
Mas, vale ressaltar, demais autores que não obtiveram resultados estimulatórios, como
Artifon et al.25, com o grupo de 0,5 W/cm² no sóleo de ratos. E, Frasson et al.31 que também
não verificaram aumento de células fibroblásticas e capilares sanguíneos em tenotomias do
calcâneo quando aplicado UST pulsado (20% com intensidades de 0,3 W/cm2 e 1,5 W/cm2).
Dentro deste cenário, a cultura celular também contribui com seus achados, já que
expõe que os efeitos do ultrassom estão correlacionados aos parâmetros utilizados e ao tipo
celular, sendo capaz de assegurar a proliferação de fibroblastos21, osteoblastos32, e
condrócitos33.
Corroborando com tais afirmações, demais pesquisas in vitro atestam que após
diferentes períodos de incubação (24, 48 e 72 horas), que a viabilidade celular, analisada pelo
método MTT, demonstrou que não houve diferença significativa15. Do mesmo modo, como
Bohari et al.34 que apresentou os mesmos resultados quando em cultura de fibroblastos.
Desta forma, salientamos que em nosso estudo foi possível constatar que assim como
Artilheiro et al.15, ocorreu a ampliação quantitativa de células, conforme esperado. Ainda que,
esse aumento não tenha sido significativo em todos os grupos o UST não causou a inibição na
viabilidade celular.
Por fim, mediante aos aperfeiçoamentos terapêuticos baseados nos desenvolvimento
tecnológicos decorrente dos últimos tempos, o ultrassom tornou-se um recurso que tem
revelado resultados promissores como terapia cicatricial. Isto, em razão de que na fase
inflamatória inicial do reparo, proporciona o aumento na liberação de fatores de crescimento,
pela granulação de plaquetas, mastócitos e macrófagos21.
Diante disto, a fase de proliferação inicia-se antecipadamente, diminuindo seu
intervalo de tempo e atuando na fase de remodelagem, assim, a cicatrização, etapa acelerada
pela liberação desses fatores de crescimento, pode ser estimulada pelo ultrassom35.
40
CONCLUSÃO
Com base nos resultados deste estudo, podemos concluir que a irradiação Ultrassônica
de Baixa Intensidade 0,3 W/cm2 10% - 20% e 0,5 W/cm2-20% aumentou percentualmente a
viabilidade celular em cultura de fibroblastos L929, enquanto que somente o grupo com
terapêutica de 0,5 W/cm2-10% obteve o crescimento numérico, com diferenças
estatisticamente significantes em todos os períodos de avaliação (24, 48 e 72 horas).
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Figura 1 - Comparação da viabilidade celular entre os grupos nos diferentes momentos
avaliados. G1-não irradiado; G2- recebeu irradiação US 0,3 W/cm2 (10%); G3- irradiado com US 0,3 W/cm
2
(20%); G4- Grupo irradiado com US 0,5 W/cm2 (10%) e, G5- US 0,5 W/cm
2 (20%).
◊ diferença estatisticamente significativa entre a primeira e segunda avaliação (24/48 horas)
* diferença estatisticamente significativa entre a segunda e a terceira avaliação (48/72 horas)
● diferença estatisticamente significativa entre a primeira e terceira avaliação (24/72 horas)
43
Tabela 2 – Proliferação e viabilidade de fibroblastos, em valores absolutos, na ausência
(controle) e presença de tratamento com Ultrassom em diferentes períodos e dosimetrias (média±DP).
Grupos 24 horas 48 horas 72 horas
G1-Controle 100,3±43,5 100±8,1 110,3±31,7
G2-US 0,3 W/cm2 10% 129 ± 52,8 132± 54 138± 57,2
G3-US 0,3 W/cm2 20% 91 ± 16,6 134,6± 5,3 230,67 ± 133,5
G4-US 0,5 W/cm2 10% 82,67 ± 9,4* 96,6± 14,5* 183,3± 15,3 *
G5-US 0,5 W/cm2 20% 83,3 ± 12,8 107,6 ±10,5 201 ± 142,9
Valores apresentados em média e ± desvio padrão. Observar (*) diferença estatisticamente significativa,
entre a primeira e segunda avaliação, segunda e a terceira e entre, a primeira e terceira avaliação.
44
CONCLUSÃO GERAL
Frente aos resultados encontrados no presente estudo, conclui-se que a
irradiação Ultrassônica de Baixa Intensidade 0,3 W/ cm2 10% - 20% e 0,5 W/ cm2-
20% aumentou gradualmente a viabilidade celular em cultura de fibroblastos L929,
enquanto que somente o grupo irradiado a 0,5 W/ cm2-10% obteve o crescimento
celular, com diferenças estatisticamente significantes em todos os períodos de
avaliação (24, 48 e 72 horas).
Fato que permite sugerir, que esta última dose apresentada, em decorrência
da melhor condição observada na viabilidade celular, pode propiciar processos de
estimulação e/ou reparo tecidual, ou seja, respostas biomodulatórias, desde que
utilizada em fases iniciais ou agudas da regeneração tecidual.
Finalmente, pode-se elencar como limitação do estudo a não utilização de
regimes de pulso mais elevados (50%) ou contínuos (100%), para observação e
acompanhamento das possíveis respostas biomoduladoras de todos estes
parâmetros em conjunto na cultura celular.
45
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ANEXOS
58
ANEXO A
Normas de formatação da Revista Fisioterapia e Pesquisa
Instruções aos Autores
Responsabilidade e ética
Estudos envolvendo animais devem explicitar o acordo com os princípios éticos
internacionais e instruções nacionais (Leis 6638/79, 9605/98, Decreto 24665/34) que
regulamentam pesquisas com animais e trazer na folha de rosto o número do
parecer de aprovação pela respectiva Comissão de Ética em Pesquisa Animal.
2 – A página de rosto deve conter:
a) título do trabalho (preciso e conciso) e sua versão para o inglês;
b) título condensado (máximo de 50 caracteres)
c) nome completo dos autores, com números sobrescritos remetendo à afiliação
institucional e vínculo, no número máximo de seis;
d) instituição que sediou, ou em que foi desenvolvido o estudo, (curso, laboratório,
departamento, hospital, clínica etc.), faculdade, universidade, cidade, estado e país;
e) afiliação institucional dos autores (com respectivos números sobrescritos); no
caso de docência, informar título; se em instituição diferente da que sediou o estudo,
fornecer informação completa, como em “d)”; no caso de não-inserção institucional
atual, indicar área de formação e eventual título;
f) endereço postal e eletrônico do autor principal;
g) indicação de órgão financiador de parte ou todo o estudo, se for o caso;
f) indicação de eventual apresentação em evento científico;
h) no caso de estudos com seres humanos ou animais, indicação do parecer de
aprovação pelo comitê de ética; no caso de ensaio clínico, o número de registro do
Registro Brasileiro de Ensaios Clínicos-REBEC (http://www.ensaiosclinicos.gov.br)
ou no Clinical Trials (http://clinicaltrials.gov/).
3 – Resumo, abstract, descritores e key words:
A segunda página deve conter os resumos em português e inglês (máximo de 250
palavras). O Resumo e abstract devem ser redigidos em um único parágrafo,
buscando-se o máximo de precisão e concisão; seu conteúdo deve seguir a
estrutura formal do texto, ou seja, indicar objetivo, procedimentos básicos, resultados
mais importantes e principais conclusões. São seguidos, respectivamente, da lista
de até cinco descritores e key words (sugere-se a consulta aos DeCS – Descritores
em Ciências da Saúde da Biblioteca Virtual em Saúde do Lilacs
59
(http://decs.bvs.br/) e ao MeSH – Medical Subject Headings do Medline
(http://www.nlm.nih.gov/mesh/meshhome.html).
4 – Estrutura do texto:
Sugere-se que os trabalhos sejam organizados mediante a seguinte estrutura formal:
Máximo 25 mil caracteres com espaços.
a) Introdução – estabelecer o objetivo do artigo, justificando sua relevância frente ao
estado atual em que se encontra o objeto investigado;
b) Metodologia – descrever em detalhe a seleção da amostra, os procedimentos e
materiais utilizados, de modo a permitir a reprodução dos resultados, além dos
métodos usados na análise estatística;
c) Resultados – sucinta exposição factual da observação, em seqüência lógica, em
geral com apoio em tabelas e gráficos –cuidando tanto para não remeter o leitor
unicamente a estes quanto para não repetir no texto todos os dados dos elementos
gráficos;
d) Discussão – comentar os achados mais importantes, discutindo os resultados
alcançados comparando-os com os de estudos anteriores;
e) Conclusão – sumarizar as deduções lógicas e fundamentadas dos Resultados e
Discussão.
5 – Tabelas, gráficos, quadros, figuras e diagramas:
Tabelas, gráficos, quadros, figuras e diagramas são considerados elementos
gráficos. Só serão apreciados manuscritos contendo no máximo cinco desses
elementos. Recomenda-se especial cuidado em sua seleção e pertinência, bem
como rigor e precisão nos títulos. Note que os gráficos só se justificam para permitir
rápida apreensão do comportamento de variáveis complexas, e não para ilustrar, por
exemplo, diferença entre duas variáveis. Todos devem ser fornecidos no final do
texto, mantendo-se neste, marcas indicando os pontos de sua inserção ideal. As
tabelas (títulos na parte superior) devem ser montadas no próprio processador de
texto e numeradas (em arábicos) na ordem de menção no texto; decimais são
separados por vírgula; eventuais abreviações devem ser explicitadas por extenso na
legenda.
Figuras, gráficos, fotografias e diagramas trazem os títulos na parte inferior, devendo
ser igualmente numerados (em arábicos) na ordem de inserção. Abreviações e
outras informações vêm em legenda, a seguir ao título.
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6 – Referências bibliográficas:
As referências bibliográficas devem ser organizadas em sequência numérica, de
acordo com a ordem em que forem mencionadas pela primeira vez no texto,
seguindo os Requisitos Uniformizados para Manuscritos Submetidos a Jornais
Biomédicos, elaborados pelo Comitê Internacional de Editores de Revistas Médicas
– ICMJE (http://www.icmje.org/index.html).
7 – Agradecimentos:
Quando pertinentes, dirigidos a pessoas ou instituições que contribuíram para a
elaboração do trabalho, são apresentados ao final das referências.
Envio dos manuscritos
Para a submissão do manuscrito, o autor deve acessar a Homepage
da SciELO disponibilizada abaixo, com o seu login e senha. No primeiro acesso, o
autor deve realizar o cadastro dos seus dados. Juntamente com o manuscrito,
devem ser enviados no item 4 do processo de submissão - TRANSFERÊNCIA DE
DOCUMENTOS SUPLEMENTARES, os três arquivos disponibilizados
abaixo, devidamente preenchidos e assinados e a aprovação do Comitê de Ética
em Pesquisa.
a) Carta de Encaminhamento (Download) - informações básicas sobre o
manuscrito.
b) Declaração de Responsabilidade e Conflito de Interesses (Download) - é
declarada a responsabilidade dos autores na elaboração do maunscrito, bem como
existência ou não de eventuais conflitos de interesse profissional, financeiro ou
benefícios diretos ou indiretos que possam influenciar os resultados da pesquisa.
c) Declaração de Transferência de Direitos Autorais (Download) - é transferido
o direito autoral do manuscrito para a Revista Fisioterapia & Pesquisa / Physical
Therapy & Research, devendo constar a assinada de todos os autores .
Enviar Preparando um manuscrito para submissão a uma revista médica
1. Princípios Gerais
O texto de artigos relatando a pesquisa original é normalmente dividido em Introdução, Métodos, Resultados e Discussão. Esta chamada estrutura "IMRAD" não
é um formato de publicação arbitrária, mas um reflexo do processo de descoberta científica. Artigos muitas vezes necessitar de subtítulos dentro dessas seções para organizar melhor o seu conteúdo. Outros tipos de artigos, tais como meta-análises,
podem exigir diferentes formatos, enquanto relatos de casos, revisões narrativas e editoriais podem ter formatos menos estruturados ou não estruturados.
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Formatos eletrônicos criaram oportunidades para adicionar detalhes ou seções, a
informação em camadas, cross-linking, ou extrair partes de artigos em versões eletrônicas. Suplementar material exclusivamente eletrônico deverá ser apresentado
e enviado para revisão por pares, simultaneamente com o manuscrito principal.
2. Diretrizes para Relatórios
Diretrizes para Relatórios foram desenvolvidos para diferentes modelos de estudo, exemplos incluemCONSORT para ensaios clínicos randomizados, STROBE para
estudos observacionais, PRISMA para revisões sistemáticas e meta-análises e STARD para estudos de acurácia diagnóstica. Revistas são encorajados a solicitar aos autores que siga estas orientações, porque eles ajudam autores descrevem o
estudo em detalhe suficiente para que possa ser avaliado pelos editores, revisores, leitores e outros pesquisadores que avaliaram a literatura médica. Os autores dos
manuscritos de revisão são encorajados a descrever os métodos utilizados para localizar, selecionar ¬ ing, extrair e sintetizar os dados, o que é obrigatório para revisões sistemáticas. Boas fontes para relatar diretrizes são a Rede EQUATOR e
da NLM Diretrizes para Relatórios de Pesquisa e Iniciativas .
3. Secções do manuscrito
São requisitos gerais para a comunicação dentro das seções de todos os projetos de estudo e formatos manuscritos.
a. Título da página
Informações gerais sobre um artigo e seus autores são apresentadas em uma
página do manuscrito e geralmente inclui o título do artigo, informações sobre o autor, todos os avisos, as fontes de apoio, contagem de palavras, e às vezes o
número de tabelas e figuras.
Título do artigo . O título apresenta uma descrição destilada do artigo completo e deve incluir informações que, juntamente com o resumo, fará recuperação eletrônica do artigo sensível e específico. Diretrizes para Relatórios recomendar e algumas
revistas exigem que as informações sobre o desenho do estudo ser uma parte do título (particularmente importante para os ensaios clínicos randomizados e revisões
sistemáticas e metanálises). Alguns periódicos exigem um título curto, geralmente não mais de 40 caracteres (incluindo letras e espaços) na página de título ou como uma entrada separada em um sistema de submissão eletrônica. Sistemas de
submissão eletrônica podem limitar o número de caracteres no título.
Informações sobre o autor: mais altos graus académicos de cada autor devem ser listados, embora alguns jornais não publicam estes. O nome do departamento (s) e
instituição (s) ou organizações onde o trabalho deve ser atribuído deve ser especificada. Sistemas de submissão mais eletrônicos exigem que os autores fornecer informações de contato completo, incluindo correio terra e endereços de e-
mail, mas a página de título deve listar os números de telefone e fax dos autores correspondentes e endereço de e-mail.
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Renúncias . Um exemplo de uma declaração de renúncia é a declaração do autor de
que as opiniões expressas no artigo são apresentadas a sua própria e não uma posição oficial da instituição ou financiador.
Fonte (s) de apoio . Estes incluem bolsas, equipamentos, drogas e / ou outros tipos
de apoio que facilitou a conduta de trabalho descrito no artigo ou a escrita do próprio artigo.
A contagem da palavra . A contagem de palavras para o texto do jornal, excluindo
seu resumo, agradecimentos, tabelas, legendas de figuras e referências, permite aos editores e revisores para avaliar se as informações contidas no Livro mandados de comprimento do papel, e se o manuscrito submetido encaixa dentro formatos da
revista e limites de palavras. Uma contagem de palavras separada para o resumo é útil para a mesma razão.
Número de figuras e tabelas . Alguns sistemas de envio requer especificação do
número de figuras e tabelas antes de fazer o upload dos arquivos relevantes. Esses números permitem que a equipe editorial e revisores para confirmar que todas as figuras e tabelas foram realmente incluído com o manuscrito e, por tabelas e figuras
ocupam espaço, para avaliar se as informações fornecidas pelas figuras e tabelas mandados de comprimento do papel e se o manuscrito se enquadra limites de
espaço da revista.
Conflito de declaração de interesse . Conflito de informação de interesse para cada autor tem de ser parte do manuscrito, cada revista deve desenvolver padrões no que diz respeito à forma, as informações devem tomar e onde ele será lançado. O
Comitê tem desenvolvido um uniforme conflito de interesse forma de divulgação a ser utilizado por revistas membros do ICMJE e ICMJE encoraja outras revistas para
adotá-lo. Apesar da disponibilidade do formulário, os editores podem requerer conflito de declarações de interesse na página do título do manuscrito para salvar o trabalho de coleta de formas de cada autor antes de tomar uma decisão editorial ou
salvar revisores e leitores o trabalho de leitura de forma de cada autor.
b. Abstrato
Pesquisas originais, revisões sistemáticas e meta-análises exigem resumos estruturados. O resumo deve fornecer o contexto ou fundo para o estudo e deve
indicar a finalidade do estudo, procedimentos básicos (seleção dos participantes do estudo, ajustes, medidas, métodos analíticos), achados principais (dando a
dimensão dos efeitos específicos e sua significância estatística e clínica, se possível ), e principais conclusões. Deve enfatizar aspectos novos e importantes do estudo ou das observações, observe as limitações mais importantes, e não overinterpret
descobertas. Resumos de ensaios clínicos deve incluir itens que o grupo CONSORT identificou como essencial . As fontes de financiamento devem ser listados
separadamente após o Resumo para facilitar a exibição correta e indexação para recuperação de busca por MEDLINE.
Como os resumos são a única parte substantiva do artigo indexada em várias bases de dados eletrônicos, ea única parte que muitos leitores lêem, os autores precisam
garantir que eles refletem com precisão o conteúdo do artigo. Infelizmente, os dados
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de resumos difere frequentemente do que no texto. Autores e editores devem
trabalhar no processo de revisão e revisão para garantir que a informação é consistente em ambos os lugares. O formato exigido para resumos estruturados
difere de periódico para periódico, e algumas revistas utilizam mais de um formato, os autores precisam preparar seus resumos no formato especificado pela revista que escolheram.
O Comitê recomenda que os jornais publicam o número de registro de ensaios
clínicos no final do resumo. O Comitê também recomenda que, quando um número de inscrição está disponível, a lista de autores que o número da primeira vez que
usar uma sigla julgamento para se referir ao julgamento que eles estão relatando ou outras provas que eles mencionam no manuscrito.
c. Introdução
Fornecer um contexto ou para o estudo (isto é, a natureza do problema e o seu
significado). Declare o propósito específico ou o objetivo da pesquisa, ou a hipótese testada pelo estudo ou observação. Cite apenas referências diretamente pertinentes e não incluir dados ou conclusões do trabalho que está sendo relatado.
d. Métodos
O princípio orientador da seção de Métodos deve haver clareza sobre como e por que foi feito um estudo de uma forma particular. A seção deve incluir apenas informações que estavam disponíveis no momento em que o plano ou protocolo
para o estudo estava sendo escrito, todas as informações obtidas durante o estudo pertence à seção de resultados.
i. Seleção e descrição dos participantes
Descrever claramente a seleção dos participantes observacionais ou experimentais
(indivíduos saudáveis ou doentes, em ¬ cluindo controles), incluindo critérios de elegibilidade e de exclusão e uma descrição da população fonte. Devido a relevância de variáveis como idade, sexo ou etnia não é sempre conhecido no momento do
desenho do estudo, os pesquisadores devem apontar para a inclusão de populações representativas em todos os tipos de estudo e, no mínimo, fornecer dados
descritivos para estas e outras variáveis demográficas relevantes . Se o estudo foi feito, envolvendo uma população em exclusivo, por exemplo, em apenas um sexo, os autores devem justificar por que, exceto em casos óbvios (por exemplo, câncer
de próstata). "Os autores devem definir como eles mediram raça ou etnia e justificar sua relevância.
ii. Informações Técnicas
Especificar os objetivos principais e secundários, geralmente resultados primárias e
secundárias identificadas como do estudo. Identificar os métodos, equipamentos (indicar o nome do fabricante e endereço entre parênteses) e procedimentos em
detalhes suficientes para permitir que outros a reproduzir os resultados. Dar referências de métodos estabelecidos, incluindo métodos estatísticos (ver abaixo); fornecer referências e breves descrições ¬ ções para os métodos que têm sido
64
publicados, mas não são bem conhecidos; descrever métodos novos ou
substancialmente modificados, dar as razões para usá-los, e avaliar suas limitações. Identificar com precisão todas as drogas e produtos químicos utilizados,
incluindo o nome genérico (s) dose (s) e via (s) de administração. Identificar nomes científicos adequados e nomes de genes.
iii. Estatística
Descrever os métodos estatísticos com detalhes suficientes para permitir que um
leitor informado, com acesso aos dados originais para julgar sua adequação para o estudo e para verificar os resultados relatados. Sempre que possível, quantifique os achados e apresentá-los com indicadores apropriados de medida de erro surement ¬
ou incerteza (como intervalos de confiança). Evite depender exclusivamente de testes de hipóteses estatísticas, como os valores de P, que não conseguem
transmitir informações importantes sobre o tamanho do efeito e precisão das estimativas. As referências para o design do estudo e métodos estatísticos devem ser obras-padrão sempre que possível (com as páginas indicadas).Definir os termos
estatísticos, abreviações ea maioria dos símbolos. Especifica o pacote de software estatístico (s) e as versões utilizadas. Distinguir pré-especificado de análises
exploratórias, incluindo análises de subgrupos.
e. Resultados
Apresente seus resultados em seqüência lógica no texto, tabelas e figuras, dando as descobertas principais ou mais importantes primeiro. Não repetir todos os dados nas tabelas ou figuras no texto, enfatizar ou resumir somente as observações mais
importantes. Fornecer dados sobre todos os desfechos primários e secundários identificados na Secção Método. Materiais extras ou complementares e detalhes
técnicos podem ser colocados em um apêndice onde eles serão acessíveis, mas não vai interromper o fluxo do texto, ou eles podem ser publicadas apenas na versão eletrônica da revista.
Dar resultados numéricos não apenas como derivados (por exemplo, os
percentuais), mas também como os números absolutos dos quais os derivados foram calculados e especificar a significância estatística que lhes são inerentes, se
houver. Restringir tabelas e ilustrações àquelas necessárias para explicar o argumento do artigo e para avaliar dados de apoio. Usar gráficos como uma alternativa ao ta ¬ veis com muitas entradas; não duplicar os dados em gráficos e
tabelas. Evite usos não técnicos dos termos técnicos em estatística, como "aleatório" (que implica um método de randomização), "normal", "significativo", "correlações" e
"amostra".
Relatórios separados dos dados por variáveis demográficas, como idade e sexo, para facilitar a partilha de dados para um subgrupo entre os estudos e deve ser
rotina, a menos que existam razões imperiosas para não estratificam relatórios, que devem ser explicadas.
f. Discussão
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Enfatizar os aspectos novos e importantes do estudo e as conclusões que se
seguem a partir deles no contexto da totalidade da melhor evidência disponível. Não repetir em detalhes dados ou outras informações dadas em outras partes do
manuscrito, como na seção de Introdução ou Resultados. Para estudos experimentais, é útil para iniciar a discussão resumindo brevemente as principais conclusões, em seguida, explorar os possíveis mecanismos ou explicações para
estes achados, comparar e contrastar os resultados com outros estudos relevantes, declarar as limitações do estudo e explorar as implicações da os resultados para
pesquisas futuras e para a prática clínica.
Relacione as conclusões com os objetivos do estudo, mas evitar afirmações não qualificadas e conclusões que não sejam suportados pelos dados. Em particular, a distinção entre significado clínico e estatístico, e evitar fazer afirmações sobre
benefícios econômicos e custos, a menos que o manuscrito inclua dados e análises econômicas apropriadas. Evite reivindicação de prioridade ou aludindo ao trabalho
que não tenha sido concluído. Estado novas hipóteses quando a guerra ¬ vociferou, mas classificá-los claramente.
g. Referências
i. Considerações Gerais Relacionadas às Referências
Os autores devem fornecer referências diretas às fontes originais de pesquisa
sempre que possível.Apesar de referências a artigos de revisão pode ser uma maneira eficiente de orientar os leitores para um corpo de literatura, artigos de revisão nem sempre refletem um trabalho original com precisão. Por outro lado,
extensas listas de referências à obra original em um tópico pode usar o espaço excessivo.Menos referências aos principais trabalhos originais muitas vezes servem
como listas mais exaustivas, particularmente desde que as referências podem agora ser adicionados à versão eletrônica de artigos publicados, e desde que a pesquisa literatura eletrônica permite aos leitores recuperar literatura publicada de forma
eficiente.
Não use resumos de conferências como referências: eles podem ser citados no texto, entre parênteses, mas não como notas de rodapé das páginas. As referências
a artigos aceitos mas ainda não publicados devem ser designadas como "no prelo" ou "próximo". Informações de manuscritos submetidos, mas não aceitos devem ser citadas no texto como "observações não publicadas" com autorização por escrito da
fonte.
Evite citar uma "comunicação pessoal" a menos que forneça informação essencial não disponível a partir de uma fonte pública, caso em que o nome da pessoa ea
data da comunicação devem ser citados entre parênteses no texto. Para artigos científicos, obter permissão por escrito e confirmação de precisão da fonte de uma
comunicação pessoal.
Alguns, mas não todos os periódicos verificar a exatidão de todas as citações de referência, assim, erros de citação às vezes aparecem na versão publicada de artigos. Para minimizar tais erros, as referências devem ser verificadas usando uma
fonte bibliográfica eletrônica, tais como PubMed, ou cópias de fontes originais de
66
impressão. Os autores são responsáveis por verificar que nenhuma das referências
citar artigos retraídos exceto no contexto de se referir à retratação. Para artigos publicados em periódicos indexados no MEDLINE, o ICMJE considera PubMed a
fonte oficial de informações sobre retrações. Os autores podem identificar artigos recolhido em MEDLINE, pesquisando PubMed para "pub Retraído ¬ cação [pt]", onde o termo "pt" entre colchetes significa tipo de publicação, ou indo diretamente
para o PubMed lista de publicações retraídos .
As referências devem ser numeradas consecutivamente na ordem em que são mencionadas pela primeira vez no texto. Identificar as referências no texto, tabelas e
legendas por números arábicos entre parênteses.
As referências citadas somente em tabelas ou em legendas devem ser numeradas de acordo com a seqüência estabelecida pela primeira identificação no texto da
tabela ou figura particular. Os títulos de periódicos devem ser abreviados de acordo com o estilo usado para MEDLINE ( www.ncbi.nlm.nih.gov / nlmcatalog / revistas ). As revistas variam sobre se eles solicitam que os autores citam
referências eletrônicas entre parênteses no texto ou em referências numeradas após o texto. Os autores devem consultar a revista para a qual eles planejam apresentar
seu trabalho.
ii. Estilo e formato das referências
As referências devem seguir os padrões resumidos na da NLM Comitê Internacional de Editores de Revistas Médicas (ICMJE) Recomendações para a Conduta, Relatórios, edição e publicação de trabalhos acadêmicos em revistas médicas:
Referências Amostra webpage e detalhado no da NLM Citando Medicina, 2 ª edição . Esses recursos são atualizados regularmente como desenvolver novos
meios de comunicação, e atualmente incluem orientação para imprimir documentos, material inédito; mídia de áudio e visual, material em CD-ROM, DVD, ou disco, e material na Internet.
h. Tabelas
Tabelas capturar informações de forma concisa e exibi-lo de forma eficiente, mas também fornecer informações a qualquer nível desejado de detalhe e precisão. Incluindo os dados em tabelas em vez de texto frequentemente torna
possível reduzir o comprimento do texto.
Prepare tabelas de acordo com as exigências do periódico específico, para evitar erros, é melhor se as tabelas podem ser importados diretamente no software de
publicação da revista. Tabelas de números consecutivamente na ordem de sua primeira citação no texto e forneça um título para cada uma. Títulos das tabelas deve ser curto, mas auto-explicativo, contendo informações que permite aos leitores a
compreender o conteúdo da tabela, sem ter que voltar ao texto. Certifique-se de que cada tabela é citado no texto.
Dê a cada coluna um curto ou um título abreviado. Os autores devem colocar a
matéria explicativo em notas de rodapé, não no título. Explicar todas as abreviaturas não padronizadas em notas de rodapé, e usar símbolos para explicar informações,
67
se necessário. Símbolos podem variar de periódico para periódico (letra do alfabeto
ou tais símbolos como *, †, ‡, §), de modo a verificar as instruções de cada revista para os autores para a prática necessária. Identificar as medidas estatísticas de
variações, tais como o desvio padrão e erro padrão da média.
Se você usar dados de outra fonte publicada ou não, obter autorização e reconhecer que a fonte totalmente.
Tabelas adicionais, contendo dados de backup muito extenso para publicar na
imprensa pode ser apropriado para publicação na versão eletrônica da revista, a ser depositado com um serviço de arquivo, ou disponibilizados para os leitores diretamente pelos autores. Uma declaração apropriada deve ser adicionado ao texto
a informar os leitores que esta informação adicional está disponível e onde ele está localizado. Enviar essas tabelas para consideração com o papel de modo que eles
estarão disponíveis para os revisores.
i. Ilustrações (Figuras)
As imagens digitais das ilustrações do manuscrito deverá ser apresentado em um formato adequado para publicação impressa. A maioria dos sistemas de submissão tem instruções detalhadas sobre a qualidade das imagens e vê-los depois de fazer o
upload do manuscrito. Para envios de impressão, os valores deverão ou profissionalmente desenhado e fotografado, ou submetidas como impressões digitais
de qualidade fotográfica.
Para os filmes de raios-X, exames e outras imagens diagnósticas, bem como imagens de espécimes patológicos ou fotomicrografias, enviar arquivos de imagem fotográfica de alta resolução. Desde manchas são usados como evidência primária
em muitos artigos científicos, os editores podem exigir a deposição das fotografias originais de borrões no site da revista.
Embora algumas revistas redesenhar números, muitos não o fazem. Letras,
números e símbolos em números devem, portanto, ser clara e consistente por toda parte, e grande o suficiente para permanecer legíveis quando o valor é reduzido
para publicação. As figuras devem ser feitas como auto-explicativo possível, pois muitos vão ser usado diretamente em apresentações de slides. Títulos e explicações detalhadas pertencem à lendas, e não nas ilustrações si.
As fotomicrografias devem ter marcadores de escala internos. Os símbolos, setas ou
letras usados em fotomicrografias devem contrastar com o fundo. Explique a escala interna e identificar o método de coloração nas fotomicrografias.
As figuras devem ser numeradas consecutivamente de acordo com a ordem em que
foram citadas no texto. Se uma figura já foi publicada anteriormente, mencionar a fonte original e enviar a autorização escrita do titular dos direitos de autor para reproduzi-lo. A permissão é exigida independentemente da autoria ou da editora,
exceto para documentos de domínio público.
No manuscrito, legendas para as ilustrações devem estar em uma página separada, com algarismos arábicos correspondentes às ilustrações. Quando símbolos, setas,
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números ou letras são usados para identificar partes das ilustrações, identificar e
explicar cada uma claramente na legenda.
j. Unidades de Medida
Medidas de comprimento, altura, peso e volume devem ser relatadas em unidades métricas (metro, quilograma ou litro) ou seus múltiplos decimais.
As temperaturas devem ser expressas em graus Celsius. Pressão arterial deve ser
em milímetros de mercúrio, a menos que outras unidades sejam especificamente exigidas pela revista.
As revistas variam nas unidades que eles usam para relatar hematológica, química
clínica e outras medidas. Os autores devem consultar as informações para autores da revista especial e deve relatar informações laboratório em sistema local e Internacional de Unidades (SI).
Os editores podem solicitar que os autores de adicionar unidades alternativas ou não-SI, uma vez que as unidades SI não são usados universalmente. Concentrações da droga podem ser relatadas em unidades de
massa ou SI, mas deve ser fornecido entre parênteses a alternativa se for o caso.
k. Abreviaturas e símbolos
Use somente abreviaturas padrão, o uso de abreviaturas não padronizadas pode ser confuso para os leitores. Evite abreviações no título do manuscrito. A abreviatura
escrito-out seguido da abreviatura entre parêntesis deve ser usado em primeira menção a não ser que a sigla é uma unidade de medida padrão.
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ANEXO B
Parecer consubstanciado do Comitê de Ética em Pesquisa (CEP)
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