Principi della

propagazione cellulare

in vitro

Corso di Laurea in Biotecnologie a.a. 2013/2014

Corso monodisciplinare: Tecnologie per linee cellulari e cellule staminali

Docente: Grazyna Ptak

Coltura cellulare

Indispensabile tecnologia per studiare la regolazione della proliferazione e differenziazione cellulare, e la formazione del prodotto in condizioni controllate.

Many different cellular activities, including endocytosis, cell

movement, cell division, membrane trafficking and macromolecular synthesis, can be studied in culture (movies); and cultured cells respond to treatment with drugs, hormones, growth factors and other active substances (examples by students)

movies: 15.4: cell compartments (Essential), endocytosis, gap junction, gap junction reduction by cycloheximide, 12.1: nuclear import, 15.1: calcium signaling, 17.1: apoptosis, 24.5: killer T-cells

Coltura cellulare

A) Per la propagazione della nuova linea cellulare con lo scopo di studiare la morfologia cellulare

B) per la comparazione degli effetti di agenti sulla crescita e il metabolismo cellulare, è sufficente la coltura nelle fiasche (fino a 1 L di volume (175 cm2 di superfice)

C) Applicazioni che neccessitano un grande numero di cellule:

1) l’estrazione di un componente cellulare (100 milla cellule possono fornire 7 mg DNA)

2) produzione di virus per i vaccini

3) per produzione di altri prodotti cellulari (interferone, plasminogen activator, interleukine, ormoni, enzimi, eritropoietine, anticorpi)

Eterogeneità della coltura cellulare primaria

Fattori unificanti:

• selettive condizioni del medium e del substrato

• Prevalenza del tipo cellulare con la abilità di sopravivenza e di proliferazione maggiore degli altri

• Fattori nutrizionali (Ca++, ormoni, siero)

• Interazioni tra le cellule e la matrice extracellulare, densità cellulare

Proprietà dinamiche di coltura cellulare:

proliferazione, migrazione, utilizzo dei nutrienti, secrezione del prodotto

Biologia delle cellule in coltura Origine e caratterizzazione

Biologia delle cellule in coltura

1. Origine e caratterizzazione:

coltura dei organi o sistema istotipico (organotipico) (- skin equivalent models)

Le interazioni cellula-cellula in vivo sono spesso difficili da ricreare in vitro; per questo si e pensato di mantenere la integrità cellulare del tessuto originale, anzichè favorire la propagazione seriale delle cellule.

Biologia delle cellule in coltura

1. Origine e caratterizzazione:

Biologia delle cellule in coltura

1. Origine e caratterizzazione

Culture cellulari si sono evolute per favorire la massima proliferazione delle cellule tramite:

- bassa densità cellulare,

- bassa concentrazione del Ca++ (300-1500 mM)

- presenza dei fattori di crescita (EGF, FGF, PDGF)

Queste condizioni spesso non sono favorevoli per la differenziazione cellulare dove la crescita cellulare e spesso limitata o completamente abolita.

Inibizione da contatto

- Inibizione della divisione cellulare, dipende dalla densità

Molti tipi di cellule animali normali hanno bisogno di ancoraggio per crescere e proliferare

Quando un singolo lammelipodio non riesce ad aderire al substrato,

viene in genere sollevato sulla superficie dorsale della cellula e

trasportato rapidamente all’indietro come un’increspatura movies: 16.2: microtubule and ER dynamics; 22.1: wound healing in vitro

Bordo avanzante di un fibroblasto umano che migra in coltura

Inibizione da contatto

Biologia delle cellule in coltura

2. Differenziazione

Diverse condizioni sono necessarie per la

propagazione e la differenziazione. Quindi -

diversi protocoli sono utilizzati per la fase di

crescita e della espansione (per la replicazione dei

campioni), seguiti dalla non-growing fase di

maturazione per incrementare l’espressione delle

funzioni differenziative.

Movie 21.5: neurite outgrowth

Biologia delle cellule in coltura

2. Differenziazione spesso collegata con la citostasi

La differenziazione cellulare e citostasi è favorita da:

- alta densità cellulare (>1 X 105 cells/cm)

- Alta concentrazione del Ca++ (300-1500 mM),

- Presenza dei fattori di differenziazione come ormoni (hydrocortisone), oppure fattori paracrini (IL-6, NGF, retinoidi), oppure composti planari (DMSO).

- Il ruolo del siero nella differenziazione delle colture cellulari è complesso, e dipende dal tipo di cellule e dal medium usato

Biologia delle cellule in coltura

2. Differenziazione

Differenziazione Adesione calcio dipendente

Cellule di Sertoli del testicolo di rato coltivate in vitro per due settimane

La concentrazione di Ca++ nel terreno di

coltura troppo bassa.

I sistemi di adesione (inegrine e

caderine) non possono funzionare.

La parte extracellulare della caderina

viene rapidamente degradata dai enzimi

proteolitici

Più ioni Ca++ presenti nel terreno

La scelta dei materiali

1. Tipo di coltura: tessuti (organ culture) o cellule

2. Fonte dei tessuti

3. Selezione del medium

4. Fase gassosa

5. Substrato

1.Tipo di coltura

• Coltura del tessuto – termine generico che indica coltura di organi, dove un frammento del tessuto, o un intero organo embrionale viene espiantato per mantenere l’architettura del tessuto

• Coltura cellulare – il tessuto viene disperso meccanicamente o enzimaticamente, oppure le cellule migrano dall’espianto, quindi le cellule vengono propagate come monostrato

oppure in sospensione

La scelta dei materiali

• Embrionali o adulte

Cellule derivate dal mesoderma (fibroblasti, endotelium, mioblasti) sono più facili da coltivare che epitelio, neuroni o cellule endocrini.

• Embrionali:

- Tessuti embrionali proliferano meglio di quelli adulti

- Minore livello di specializzazione

- Propagazione più facile

- Più lungo lifespan in coltura

- Meno strutturata e quindi più facile da disgregare matrice extracellulare

La scelta dei materiali

• Normali o neoplastiche

- Colture dai tumori possono dare linee cellulari continue, mentre tessuti normali danno tipicamente colture con determinata durata della vita (anche se esistono pure le linee continue non tumorigeniche: (MDCK dog kidney, 3T3 fibroblast)

- Cellule neoplastiche possono differenziarsi mantenendo la capacità di dividersi

- Cellule normali cresceranno generalmente come cellule staminali non differenziate oppure cellule precursori e inizio di differenziazione e accompagnato dalla cessazione di proliferazione

Movie 23.1: breast cancer cells

La scelta dei materiali

Dissociation is accomplished with the aid of

proteolitic enzyme, such as trypsin, which

digest the extracellular domains of proteins

that mediate cell adhesion.

EDTA (ethylenediamine tetraacetate) binds

(chelates) calcium ions. Calcium ions play a key role in cell-cell adhesion.

La scelta dei materiali

Advantage: cells have been minimally modified

Disadvantages:

requires sacrifice of animal

mortal; must be generated for each experiment

heterogeneous cell population

First developed in 1907:

1 day

axons grow

in culture

spinal cord explant

+

lymphatic fluid

Mass culture Clonal culture

May obscure the fact that the population

contains several distinct phenotypes only

detectable by cloning

Cloning Single cell (scanning EM) 1 cell colony

Multiple

cell colonies

in a dish

0.01 mm 1 mm

100 mm

Colture primarie sono di solito eterogene però danno la

possibilità di espansione in coltura per derivare la linea

cellulare e la possibilità di cloning.

La scelta dei materiali

Permette la:

• espansione di cultura

• Clonazione

• Caratterizazione

• Preservazione

Può provocare la perdita di specializzazione delle cellule

Vantaggio: fornisce grande quantita di materiale

omogeneo che può essere utilizzato a lungo termine

La scelta dei materiali

Colture a termine, oppure linea cellulare continua?

• Dopo una serie di passaggi la linea cellulare

muore, oppure si trasforma per diventare una

linea cellulare continua

• Si assume che questo sia dovuto alla mutazione,

ma la presenza di cellule immortalizate (stem

line), particolarmente, nelle colture da neoplasmi,

non può essere esclusa

3. Subcultura Colture a termine, oppure linea cellulare continua?

L’aspetto della linea continua è caratterizzato da:

• alterazione della citomorfologia

(cellule più piccole, meno aderenti, piu rotonde, e con la proporzione nucleo-citoplasma alternata)

• Incremento della crescita delle colonie

(il tempo di duplicazione cellulare si riduce da 36-48 ore fino a 12-36 ore)

• La riduzione della dipendenza dal siero

• Aumento di efficenza della clonazione

• Riduzione di dipendenza dall’ancoraggio

• Aumento di tumorigenicità

• Aumento di eteroploidia (instabilità cromosomica)

• Perdita di markers tessuto specifici

3. Subcultura

Propagazione in sospensione

• Maggioranza delle colture viene propagata

come monolayer attaccato al substrato, ma

alcune, quali cellule trasformate,

ematopoietiche, e le cellule ascitiche

possono essere propagate in sospensione

• Vantaggi: più semplice propagazione (non

necessitano di tripsinizzazione, nè aumento

della area di superfice)

4. Selezione del medium

4. Selezione del medium

Vantaggi dell’utilizzo di siero:

1. Costo/timing dello sviluppo del serum-free media formulations

2. L’esigenze del serum-free media sono più specifiche al tipo cellulare

Serum must be prescreened and qualified for cell culture

5. Fase gassosa

Fase gassosa è determinata dal:

• Tipo di terreno (concentrazione di sodio bicarbonato)

• Tipo di vessel: aperto (petri dishes, multiwell plates), o

chiuso (fiasche, bottiglie)

• Quantità del tampone

CO2/HCO3 sono essenziali per la maggioranza delle

cellule, quindi fiasche non possono essere chiuse

senza instaurare del CO2 nel atmosfera

5. Substrato • vetro

• Polystyrene trattato per ottenere la carica negativa e rendere

bagnabile (wettable)

• Rivestimento di fibronectine, collagene, laminine, gelatina,

poly-L-lysine (carica positiva)

• Matrigel (matrice composta, prodotta da Engelberth Holm Swarm

sarcoma cell line)

• Siliconizzazione (per evitare l’adesione delle cellule)

• Gel di collagene in flotazione

permette l’interazione con la matrice extracellulare, accesso

per il medium da tutte le due parti, particolarmente alla

superficie basale dove i recettori e tutti i trasportatori dei

nutrienti vengono espressi. La plasticità del substrato assicura

la naturale forma della cellula e la polarità cellulare.

Esempio: fibronectin coated dishes e la migrazione delle cellule della cresta neurale.

• Movie 1. Fibroblast morphology and migration when cultured on fibronectin-

coated polyacryamide surface. Note the prominent lamellipodia in many cells. Duration, 16 h.

• Movie 2. Fibroblast morphology and migration in fibronectin-coated double-substrate culture. Most cells show an elongated, bipolar or tripolar morphology and appear to glide along the surface without clear ph

I fibroblasti producono la matrice extracellulare del tessuto connettivo

5. Substrato Rivestimento della matrice

• Bagnare la superfice della plastica con i componenti della matrice (30 min), poi, dopo la rimozione dell’eccesso di matrice, la piastra viene utilizzata entro una settimana (conservata in frigo); asciuta oppure bagnata

• Aggiungendo collagene o Matrigel, a consentire la gelificazione

Rivestimento con il gel viene utilizzato per promuovere la differenziazione.

Rivestimento asciutto e bagnato viene utilizzato per la propagazione delle cellule.

5. Substrato

Rivestimento della matrice

Copertura con la matrice extracellulare

preparata in laboratorio:

• Crescere le cellule nel monolayer

• Lavare con 1% Triton X in ultrapure water

• Usato per coltivare delle cellule difficili da

propagare senza la matrice (epitelio

bronchiale, endotelio vascolare, neuroni)

Movie 16. 4: beating heart cell

Degradazione del materiale extracellulare:

- La degradazione avviene tramite enzimi proteolitici (proteasi)

secreti localmente dalle cellule.

La proteolisi delle proteine della matrice contribuisce nella migrazione tramite:

1. Preparazione per il passaggio di cellule nella matrice

2. Esposizione dei siti nascosti delle proteine che promuovono la migrazione

3. Promozione del distacco della cellula – quindi la cellula si puo muovere

4. Il rilascio delle proteine/segnale che promuovono la migrazione

La matrice extracellulare puo

influenzare la forma della cellula,

la sua sopravivenza e la

proliferazione

Laminina e collagene di tipo IV sono I principali componenti di un tipo di matrice

extracellulare, definito lamina basale.

Le cellule epiteliali sintetizzano una fitta lamina basale fondata sulla laminina, mentre

le cellule mesenchimiali secernono una lassa lamina reticolare construita

principalmente da collagene. Movie 19.1

Ruolo della matrice nel differenziamento cellulare

Cellule di Sertoli del testicolo di rato coltivate in vitro per due settimane

Piastre di plastica

Piastre rivestite di lamina basale

Espressione genica diretta dalla membrana basale in tessuto di

giandola mammaria

- divisione

- secrezione