primer vali 1 introdruction primer vali 1 introdruction¼•言...
TRANSCRIPT
cGMP
GCP
ISO 17025PIC/S GxP
FDA
LOD/LOQ
OECD
QA/QC
API EP
SOP
USP <1225/1226>ICH Q2(R1)
分析方法验证
分析方法验证
© 安捷伦科技(中国)有限公司，20102010年 3月 1日中国印刷发行号：5990-5140CHCN
安捷伦科技（中国）有限公司客户服务中心：免费专线： 800-820-3278
400-820-3278（手机用户）
www.agilent.com/chem/cn
基础导论
第 1章
引言
引言 任何分析测试的目的都是为了获得稳定、可靠和准确的数据。分析方
法验证在其中起着极为重要的作用。方法验证的结果可以用于判断分
析结果的质量、可靠性和一致性，这是所有分析质量管理体系不可分
割的一部分。许多法规和质量管理标准也要求实验室进行分析方法
验证。
在下列情况下，要求对分析方法进行验证、证实或重新验证：
首次用于常规检测前
转到另一个实验室时
对于验证过的方法，其条件或方法参数发生变化时（例如，仪器性
能参数发生改变或样品基质不同时），并且这种变化超出了方法的原
适用范围
从文献可以看出，行业委员会和监管机构对方法验证相当重视。本章
概述了方法验证对于获得高质量数据有怎样的帮助（还有其他因素，
将在以后阐述）。
2
1
3
本书主要讲述实施方法验证的概念和策略。书中并不详细阐述方法验
证的细节。不过，读者可以找到这方面的各种信息和指南，有研究机
构发布的研究成果，也有个人作者发表的文章。本章对这些文献作一
综述。与分析方法转移以及一些特征参数有关的其他参考文献参见相
关章节。
英国政府检测标准集团（The Laboratory of the Government Chemist,
LGC）制定了实验室内部方法验证指南 1，其中包含了对实验室认可
相关要求的讨论
美国食品药品管理局（US FDA）制定了两个行业指南，分别是分析方
法验证 2和是生物分析方法验证 3
ICH出版了两个方法验证指南。Q2A4给出了验证中必须考虑的 8种
验证参数的术语和定义。Q2B5中包含了方法学内容，但是同时声明
允许一定的灵活性：“申请人有责任选择最适合其产品的验证步骤和
方法。”
IUPAC6出版了“单个实验室分析方法验证的协调指南”
EURACHEM7 出版了方法验证的详细指南。这是最详尽的官方指南，
包含了方法验证的理论和实践。它最初是为 ISO/IEC认可实验室制
定的，但是由于其全面性，也成为（生物）药物实验室很好的参考
资料
Huber8著有分析实验室验证参考书，其中有一章就是方法验证
AOAC9出版了按 ISO 17025认可要求进行分析方法证实的技术文件
Viswanathan及共同作者 10撰写了生物分析方法验证的综述
11.1 文献综述
1对于分析方法的验证和证实，存在很多有关这两个术语的讨论，它们
也经常被交叉互用。USP通则<1225>和<1226>中解释了这两个术语
的差异。通则<1225>11的标题是：“法定方法的验证”。它阐述了分析
方法的验证，包括从建立方法开始的所有验证参数，结果得到某一特
定样品的验证方法。这一过程建议用于内部制定方法的验证。
通则<1226>12题为“法定方法的证实”。它建议在应用法定方法时，
应证明实验室有能力成功应用该方法。在方法转移时，接受方法的实
验室也应进行方法证实。本书在后面将对法定方法的证实和方法转移
展开讨论。
验证分析方法的目的是证明“预期目标的适用性”。分析测量的目的
是产生准确可靠的数据。只有方法验证无法保证这一目标的实现，但
是应当将其作为分析测量质量保证体系的一部分。USP通则<1058>
分析仪器确认中明确提出了这一点 13。该通则开头部分讨论了实验室
数据质量的不同要素的重要性，其中还解释了为何系统适用性试验或
质量控制图的分析不足以确保分析检测结果的准确可靠，仪器确认和
方法验证同样重要。
图 1揭示了影响数据质量的不同因素：分析仪器确认、分析方法验证、
系统适用性试验以及通过质控样品进行分析质量控制。
4
1.3 实验室数据质量的要素
1.2 术语：验证与证实
1
5
仪器确认意味着仪器有确定的技术指标、经过检测并证实其适用于需
要验证的方法。接着，在经过确认的仪器上验证分析方法，证明其按
预期要求运行。这个过程不依赖于任何特定的仪器。如果我们希望方
法能在不同厂家的仪器上使用，也应使用那些仪器进行方法验证。
这之后，在特定的仪器上应用具体的方法进行系统适用性试验。系统
适用性参数应在方法验证时加以选择。系统适用性试验的成功运行确
保整个系统在特定的检测条件下符合分析人员的预期目标。
最高级别的测试是对质量控制样品的分析。分析已知含量的标准品或
样品，并将分析结果与已知值进行比较。
图 1. 分析数据质量的影响因素
1方法验证在分析仪器确认和系统适用性试验之间进行，并与其他质量
要素相联系。分析方法应使用经过确认的仪器进行验证。通过方法验
证，应确定系统适用性试验和质量控制检查的参数和接受限度。
6
第 2章
法规和质量管理标准
法规和质量管理标准
8
2
2.1 美国食品药品监督管理局
（FDA）
对分析实验室有影响的法规和质量管理标准都要求进行分析方法验证。
有的法规中直接使用“验证”一词，并列出特定参数，也有的法规用
这样的陈述暗示验证要求——“检测方法应适合于预期用途。”本章对
最为重要的法规、质量标准和官方指南进行综述。验证要求指南出自
各类不同的机构，但验证目的都是为了获得有效的分析检测结果。这
对于通过分析检测来确保产品质量和安全而言是非常重要的。
cGMP（药品动态生产质量管理规范）14和 GLP（临床前研究实验室质
量管理规范）等法规要求必须进分析方法的验证。美国 cGMPs 在
211.165(e)和 211.194两小节中提出了验证要求：
165(e)：公司应用检测方法时，应建立并记录准确度、灵敏度、
专属性以及重现性。这类验证及文件制作应按 194(a)(2)完成
194(a)(2)：实验室的记录应包含用于样品检测的每个方法的声明。
声明中应指明建立方法的数据位置，这些数据应能证明该检测方法
在应用于产品检测时符合特定的准确度和可靠性标准要求。所有检
测方法的适用性应在实际应用条件下得到证实
194(b)：如对应用于检测的已确认方法有任何变更，应保存完整的
变更记录。该记录中应包含变更原因以及相关数据，以证实方法变
更后的样品检测结果至少能达到原方法相同的准确度和可靠性
FDA GLP法规 21 CFR第 58部分 15并未用到“验证”一词，但是依据
58.113中的要求，检查员需要检查验证研究记录：“应采用合适的
分析方法进行检测”，其中“合适的”即意味着验证。并且 FDA的
生物分析方法验证指南 3中规定临床前毒理研究也属于验证范围
9
FDA关于生物利用度和生物等效性要求的法规 21 CFR 32016第 29
节中规定：(a) 用于体内生物利用度研究以检测体液或排泄物中活性
药物成分或治疗成分检测的分析方法，或用于急性药理作用检测的
方法，应证明其具有准确性和足够的灵敏度以及恰当的精密度，能
满足体内的活性药物成分/治疗成分或其代谢产物的实际浓度的检测
要求。
PIC/S的使命是“领导制定、实施和维护国际性的、统一的药品生产
质量管理规范（GMP）标准以及药品领域检查工作质量体系”。
这一使命通过以下手段得以实施：制定和推广统一的 GMP标准和指
导文件；培训主管部门、尤其是检查员；评审（和复评审）检查活动；
以及促进主管部门和国际组织的合作和网络化。2009年 11月，有 36
个政府组织参加了 PIC/S，包话所有的欧盟成员国。很多国家的政府
机关申请加入 PIC/S，包括美国 FDA。许多新的成员国还没有按照
PIC/S GMPs17建立自己的 GMP法规。PIC/S的 GMP与欧盟的 GMP指
令 18非常相似。
例如，两个文件都在第 6.1.5部分以相同的文字规定了分析方法验证
的要求：
分析方法应进行经过验证。申请上市许可的所有检测均应按照批准
的方法进行
2
2.2 药品检查协定和药品监察检查合
作计划(PIC/S)和欧洲
2在 PIC/S的实验室现场检查指南第 8.7小节 19中有很多的详细信息与
检查员希望了解的情况有关。该指南中包含检查员检查质量控制实验
室时的一些提问。这些问题包括：
方法验证是不是验证总体计划的一部分？
有没有通用的方法验证 SOP？方法验证报告是否经过正式批准？
是否明确验证目的？
是否按 ICH5规定的参数对每一种方法进行完整的验证并记录？
是否规定了每种方法的接受限度并能符合该限度规定？
有无分析方法转移的 SOP？
国际协调会议（ICH）发起于 1990年，汇集了欧盟、日本和美国的监
管机构和这三个地区的制药行业专家，一起讨论产品注册方面的科学
和技术问题。
ICH出版的指导原则，有些被成员国（如欧盟）写入法律，有些被国
家权力机构（如美国 FDA）推荐为指南。
其中，最为重要的 ICH文件是活性药物成分的 GMP指南 20。在第 12
章中规定了方法验证的要求：
应对分析方法进行验证，所用方法收载于相关的药典或其他认可的
标准参考文件中的除外。所有检测方法均应在实际使用条件下证实
其适用性
实施分析验证的程度应能反映分析的目的以及活性药物成分的生产
工艺状况
开始验证分析方法前，应考虑对分析设备进行适当的确认
10
2.3 国际协调会议（ICH）
2
11
美国药典（USP）为具体的应用制定方法，并针对 FDA监管的行业内
不同的分析特点制定通则。根据联邦食品药品和化妆品法案 501部分
的规定，USP方法构成法定标准。USP制定了两个与方法验证有关的
通则，还有一个通则中允许不经过验证变更方法。
通则<1225>是“法定方法的验证”11。该通则中给出了用于新方法
验证的各种参数。通则中的建议可以被药品实验室用作自行制定方
法的验证
通则<1226>是“法定方法的证实”12。本通则用于实施药典和标准
方法的实验室。这些内容也适用于实验室应用其他实验室验证过的
方法
通则<621>为“色谱法”21。本通则中有一些有用的建议，是关于
如何调整或改变 GC和 HPLC方法而无需重新验证的
ISO/IEC 17025是与化学实验室最为相关的 ISO标准 22。它规定了检测
和/或校准实验室能力的通用要求。该标准作为质量体系标准，在环境、
食品、化学和临床实验室得到了广泛应用。它被用于对那些寻求认可
地位的实验室进行评审。
标准中有许多要求与本书的主题有关。最为重要的要求见 5.4.5：
实验室应对非标准方法、实验室设计（制定）的方法、超出其预定
范围使用的标准方法、扩充和修改过的标准方法进行确认，以证实
该方法适用于预期的用途
在引入检测或校准之前，实验室应证实能够正确地运用这些标准
方法
2.4 美国药典（USP）
2.5 ISO/IEC 17025
2当对已确认的非标准方法作某些改动时，应当将这些改动的影响制
订成文件，适当时应当重新进行确认
如果对于某特定的样品检测存在标准方法，应确保使用标准的最新
有效版本
确认包括对要求的详细说明、对方法特性量的测定、对利用该方法
能满足要求的核查以及对有效性的声明
确认实验室自行制定的方法时应考虑以下因素：检测限、定量限、
准确度、选择性、线性、重复性或重现性、耐用性和交互灵敏度
ISO/IEC 17025与法规不同，其规定相当具体。尽管该标准目前尚未得
到药品实验室的广泛接受，仍建议验证专家们在制定方法验证程序时
将其作为参考，在具体应用中适当采纳其中的要求。
12
第 3章
方法验证的参数和试验
方法验证的参数和试验 USP<1225>规定实验室应采用试验方式进行方法验证：“应通过实验
室的研究制定成一定的分析方法验证程序，证明方法的性能参数符合
预期的分析应用要求。”不同国家和国际委员会的工作组都对方法验
证所要求的实验室试验作出了规定，这些在文献中都有阐述。不幸的
是，一些定义在不同的组织间差异很大。因此，实验室应根据他们对
术语定义的理解制定一个术语表。为了达到标准化的目的，ICH来自
美国、欧洲和日本的行业和监管机构代表定义了分析方法验证的参数、
要求和方法。图 2中列出了 ICH和其他组织及作者定义的参数，并将
在下文中分别简述。
14
3
USP, ICH
ISO 17025
USP, ICH
ICH, ISO 17025
ICH
ICH USP ISO 17025
USP, ICH, ISO 17025
USP, ICH, ISO 17025
USP, ICH
USP, ICH, ISO 17025
USP, ICH, ISO 17025
USP ISO
USP ICH
图 2. ICH、USP和 ISO 17025中的方法验证参数
15
ICH把专属性定义为“当预料到一些组分可能存在时，准确无误地检
测被分析物的能力。通常这些可能存在的组分有杂质、降解产物、基
质等。”USP<1225>中对此有相同的定义，但同时说明其他著名组织
如 IUPAC和 AOAD等使用“选择性”表明相同的含义。这里留着“专
属性”用来表示每一种被分析物只产生一个响应的过程。ISO/IEC很
可能也有相同的理解，因为它要求方法具有“选择性”而非专属性。
我们的目的是从所有的其他化合物中区分出目标化合物的响应并加以
定量分析。
那些能够在所有可能存在的样品组分中检测被分析物响应值的分析技
术，应进行专属性验证。有时无法证明某个分析过程专属于某种特定
的被分析物。在这种情况下，建议采用两种或两种以上的分析方法组
合以达到必要的鉴别水平。在药品实验室经常使用的一种技术是高效
液相色谱法（HPLC），有些情况下也用气相色谱法（GC）。实际操作时，
制备一个包含有被分析物和所有可能存在组分的混合样品，将结果与
被分析物的响应值相比较。在药品混合样品中，可能有来自合成中间
体、赋形剂和降解产物的组分。把样品置于苛刻的条件下（如高温、
高湿或光照等），可以加速降解产物的生成。
通过选择合适的色谱柱和设置色谱条件可以获得液相色谱的专属性，
如调整流动相组成、柱温和检测器波长等。除了色谱分离过程外，
样品制备步骤也可以优化以达到最优的选择性。
在色谱中，确认样品色谱图中的色谱峰纯度是一件困难的事，色谱峰
可能存在不止一个化合物。分析工作者应该知道样品中存在多少化合
物，而这通常是不可能的。因此，应评价目标化合物色谱峰的纯度。
33.1 专属性/选择性
3过去的做法是改变流动相组成或色谱柱等色谱参数，而现在是使用
与色谱同步的在线光谱检测器。紫外-可见二极管阵列检测器和质谱仪
在整个色谱图运行期间均能在线采集光谱数据。比较和洗脱的色谱峰
相对应的光谱图，如果光谱图不同，说明该色谱峰中至少包含两个化
合物。
使用光谱检测器进行专属性评价的原理见图 3，以高效液相色谱法
（HPLC）和紫外-可见二极管阵列检测器为例。图中显示了一个专属性
色谱方法和一个非专属性色谱方法。两个色谱峰看起来非常相似。从
峰形来看，无法明显看出该色谱峰中包含一个或几个化合物。
这两个例子中，分别在色谱峰的上行和下行处查看其 UV光谱图，归
一化后进行比较。左例中，光谱图是相同的，表明该色谱峰中只有一
个化合物，或者说该色谱峰是光谱纯的。右例中，两个 UV光谱图不
同，由此证明该色谱峰显然不纯。先进的二极管阵列检测器能够对光
谱图进行自动比较，并打印出每个色谱峰的匹配因子。这样，结合图
形可视化技术，就可以在不增加工作负担的同时进行选择性评估。
16
UV UV
图 3. 色谱峰的不同位置有相同的光谱图，证明该色谱峰是纯的（左）光谱图不同，证明该色谱峰不纯（右）
3
17
当共洗脱化合物的光谱图非常接近时，紫外-可见二极管阵列检测器就
有其局限性，这在代谢物及其母体化合物时极有可能发生。这种情况
下，最好为 HPLC配一个质谱检测器。质谱通常比紫外光谱专属性更
强，因此常用于色谱的选择性评价。一个 HPLC与质谱配合使用的例
子见图 4。对于 4.86分钟洗脱的色谱峰，在不同部位采集的质谱图不
同，显示该色谱峰不纯。
选择性研究还应评估基质可能带来的干扰，如尿、血、土壤、水或食
品等。好的样品制备可以消除大部分基质成分。对于一个定量方法，
应分析至少 5种不同来源的控制基质以证明其不受基质干扰。
8060
100
208.
1 216.
023
0.1
235.
023
7.0
255.
1
207.
120
8.1
2.20
6
3.23
43.
328
3.58
13.
767
4.32
44.
475
4.68
44.
861
5.12
45.
392
5.62
25.
826
5.99
3 7.21
2
207.
1
229.
125
2.2
158.
94020
0
8060
100
4020
0150
1 2 3 4 5 6 7
200 250 300 350 min. 150 200 250 300 350 400
25000
75000
125000
175000
225000
图 4. 4.86分钟时色谱峰不同部位采集的质谱图显示该色谱峰不纯
3ICH把分析方法的精密度定义为在规定条件下，对均匀的样品多次取
样并进行一系列测量，其结果的一致性（离散程度）。精密度可以在
以下三个层面考虑：重复性、中间精密度和重现性。
重复性是通过在很短的时间间隔里和相同的操作条件下得到的结果
来表达精密度。重复性也称作同一次分析的组内精密度
中间精密度通过实验室内不同日期、不同分析人员、不同设备等所
得结果来表达精密度
重现性表示不同实验室间的精密度（协作研究时通常用其进行方法
标准化）
ICH5在进行重复性计算时，要求待测组分浓度在 100%时重复测量至
少 6次，或覆盖整个规定浓度范围并重复测量至少 9次。例如，可以
在三个不同浓度分别进样三次。
中间精密度通过比较同一实验室数日内各次检测的结果计算而得。方
法的中间精密度可以反映以下因素引起的结果差异：
不同的操作人员
不一致的操作实际
不同的仪器
不同供应商的标准品和试剂
不同批次的色谱柱
综合因素
中间精密度验证的目的是证实当方法开发阶段结果后，在同一个实验
室内运用该方法能够得到相同的结果。
18
3.2 精密度
3
19
重现性的目的是证实方法在不同实验室运行能够能到相同的结果。分
析方法的重现性通过不同实验室的不同分析人员对均匀样品各部分分
析的结果计算而得。另外，通常操作人员和环境条件产生的偏离可能
不同，但仍在所用方法的规定参数范围内。重现性的验证对于在不同
实验室使用的方法非常重要。可能影响重现性的因素有房间温湿度的
差异，或设备的特征参数不同（如 HPLC系统的延迟时间不同），色谱
柱的厂家或批号不同，以及操作人员的经验和想法不同。
ICH把分析方法的准确度定义为测定值与传统真值或接受的参考值之
间接近或一致的程度。
准确度也可以定义为方法的测定值与真值接近的程度。
用作准确度评价的真值可以通过几种方式获得。一种做法是把方法结
果与已建立的参考方法比较。这种办法认为参考方法的不确定度是已
知的。
第二种准确度评价办法是分析已知浓度的样品（例如，控制样或有证
标准物质），把测得值与该物质提供的真值相比较。如果无法得到有
证标准物质或控制样，可以在空白的样品基质中加入已知质量或体积
浓度的被分析物。
从基质中提取出被分析物，注入分析仪器后，比较提取物的响应值与
溶解在纯溶剂中的参考物质的响应值。由于准确度评价能够检查样品
制备的有效性，在制备模拟样品时应尽可能与实际样品的制备过程相
一致。如果经过准确验证，可以用不同浓度所得的回收率对最终结果
进行校正。
3.3 准确度和回收率
3准确度试验浓度应能覆盖整个考虑范围，并且应包含接近定量限的浓
度点，一个在浓度范围的中间值，还有校正曲线的最高点。另一种做
法是使用关键决定值当作准确度最高的浓度点。
ICH关于验证方法的文件中推荐采用覆盖待定范围的最少 3个浓度点
的最少 9次测定进行准确度评价（例如，三个浓度点，每个浓度三次
重复测定）。准确度可以报告为样品中已知加入被测成分含量的百分
回收率，或平均值与接受的真值之间的偏差，同时包括置信区间。
ICH把分析方法的线性定义为在给定范围内通过样品中被分析物的浓
度比例直接获得检测结果的能力。
线性可以直接用待测物质测定（通过稀释标准贮备液）或分别称取待
测品种的各组分后合成混合物。
配制 5 个以上不同浓度的标准溶液（浓度范围在期望浓度的 80～
120%之间），每个进样 5～6次，用这些结果计算线性。响应值应与
被分析物的浓度成直接的比例关系，或通过定义明确的数学计算形成
比例关系。用于结果计算的线性回归方程其截距不得明显偏离零点。
如果得到一个显著的非零截距，应证明其对方法准确度没有影响。
通常用图形化的方式来评价线性，加上一个数学等式，或仅采用等式
表示。公式通常表示为用信号高度或峰面积对被分析物浓度的函数作
图。有时由于线性的偏离不易检测，可以采用两种其他的作图方式。
第一种是用回归线的偏差相对浓度作图，如果浓度范围覆盖不同的数
量级，则相对于浓度的对数作图。在线性范围内，这些偏差应均匀分
布于正负值之间。
20
3.4 线性和校正曲线
21
另一种方法是把信号数据除以相应的浓度，产生相对响应值。以相对
响应值为 y轴，相应的浓度为 x轴，按对数比例作图。所得的直线在
整个线性范围内应为水平。在较高的浓度水平，通常会与线性呈负偏
离。在图上相应的位置（如 95%和 105%处）画两条平行的水平线，
该方法在相对响应线与 95%线的交点以上均呈线性。图 5比较了两种
图形评价法在 HPLC法中的应用。
3
2500
2000
1500
1000
500
0
2
3
4
2.2
2.4
2.5
2.80.95 Rc
1.05 RcRc
3.2
3.4
3.6
3.8
0 200
1 10 100 10000.1
400 600 800 1000 [ng/L]
[ng/L]
[mA
U]
[mA
U]/
[ng/
L]
图 5. HPLC法线性图的图形表示
画出灵敏度（响应值/含量）就能够明确地指示线性范围。对于较宽的
线性范围，用含量的对数作图更为合适。Rc表示稳定的响应线。
ICH建议用线性曲线的相关系数、y轴截距、回归线斜率和残差平方
和来报告准确度。报告中还应包括数据图。另外，分析实际数据与回
归线上数据点的偏差也有助于评价线性。一些分析方法，如免疫分析，
经过任何转化都不成线性关系。在这种情况下，响应值应表示为样品
中被分析物浓度（含量）的合适的函数。为了建立线性关系，建议至
少要用 5个浓度点。采用其他方法时应证明其合理性。
ICH把分析方法的范围定义为样品中被分析物的高浓度/含量到低浓度/
含量之间的范围（包括这两个浓度），在此范围内，已证明该分析方
法具有合适的精密度、准确度和线性水平。
分析方法的范围是已经证明方法的精密度、准确度和线性的高低浓度
之间的浓度范围（包括这两种浓度水平在内）。分析方法的范围一般
用与检测结果相同的单位表述（例如，百分比、百万分之几）。
对于含量测定，ICH要求规定的最小范围是检测浓度的 80～120%。
它还要求杂质的范围扩展为定量限到每种杂质规定限度的 120%，
或杂质规定限度的 50%到 120%。图 6为线性和范围定义的图示。
22
3
3.5 范围
23
3.6 检测限 ICH把一个独立分析过程的检测限定义为样品中被分析物能够检出但
无需准确定量的最低量。
检测限（LOD）是测定值略大于其不确定度的那一点。它是样品中被
分析物能被检出的最低量，但不需要准确定量。检测限常常与方法的
灵敏度相混淆。分析方法的灵敏度是该方法区分待测成分的浓度或质
量的最小差异的能力。实际上，灵敏度是以响应值对被分析物的浓度
或质量作图所得校正曲线的斜率。
在色谱图中，检测限是峰高为基线噪声的 2～3倍时的进样量。除了
信噪比法之外，ICH5还规定了另外三种方法。
视觉判断：通过测定待测成分浓度已知的样品，并确定该成分能被可
靠检出的最低水平来计算检测限。
3
LOQ
LOD
RSD > 10%, S/N > 20
S/N > 3
图 6. 线性和范围的定义
基于空白的响应值标准偏差：通过分析适当数量的空白样品并计算所
得响应值的标准偏差来测量分析背景响应值的大小。
基于空白的响应值标准偏差：通过分析适当数量的空白样品并计算所
得响应值的标准偏差来测量分析背景响应值的大小。
ICH把一个独立分析过程的定量限（LOQ）定义为能够以适当的精密
度和准确度对样品中的被分析物进行定量测定的最低量。定量限是对
样品基质中低含量化合物进行定量分析的一个参数，也常用于杂质或
降解产物的测定。
定量限常常通过以下方法确定：对已知被分析物浓度的样品进行分析，
并确定该成分能够以可接受的准确度和精密度得到定量分析的最低浓
度水平，以此来计算定量限。如果能够确定方法在定量限的精密度要
求，则取 5～6份被分析物含量递减的样品，进样 6次。被分析物的
含量范围从测得的已知 LOD到 LOD的 20倍。
24
3
3.7 定量限
= 2-3 = 10 - 20
图 7. 通过信噪比评价检测限和定量限
25
用计算得到的 6次重复进样精密度的相对标准偏差（RSD）对被分析
物含量作图。与预先规定的精密度要求相对应的含量即等于定量限。
定量限试验中，重要的是不只是使用纯的标准物质，还应采用与未知
样品相接近、并能代表未知样品的加标基质。图 8显示要求的实验步
骤和典型图例。
液相色谱的 LOQ还可以通过比较样品中已知低浓度被分析和空白样品
的信号得到。这样就确定了能够可靠定量的最低浓度。典型的信噪比
为 10:1。
任何检测限或定量限的测量结果可以通过实验进行证实，即利用被分
析物的浓度水平在这两个范围的样品进行实验。同样重要的是对与检
测限和定量限关系密切的其他方法验证参数的评价，如精密度、重现
性和准确度等。图 6表明了定量限的测定以及与检测限、范围和线性
的关系。图 7揭示了基于信噪比的检测限和定量限的确定。
3
[% RSD]
• • • 6• RSD%• •
图 8. 基于选定精密度的定量限
3.8 耐用性 ICH文件 4.5中未提及耐用性（ruggedness）。其定义用重现性代替，
两者具有相同的含义。USP中把耐用性定义为不同条件下结果重现的
程度，其中，不同条件指不同的实验室、分析人员、仪器设备、环境
条件、操作者和实验材料等等。耐用性是在常规的、期望的操作条件
下对不同实验室和不同分析人员间的检测结果的重现性的量度。在不
同实验室分析同一批次均匀样品的不同部分，可以确定分析方法的耐
用性。
ICH把分析过程的耐用性定义为当方法参数发生小而复杂的变化时，
不受其影响的能力的量度。它表示分析过程在日常使用中的可靠性。
耐用性试验检验操作参数对分析结果的影响。确定方法的耐用性时，
使一系列的方法参数在一定的范围内变动，测定这些变动对结果的量
化影响。考虑的参数有 pH、流速、柱温、进样量、检测波长或流动相
组成等。如果参数的影响在预先设定的容许范围内，则称该参数在方
法的耐用性范围内。
这些影响数据的获得，可以帮助评估一种或某种参数变化后，方法是
否需要重新验证，例如，能否用时间来补偿色谱柱的性能。在 ICH文
件 5中，推荐在方法开发阶段考虑方法的耐用性评价，并且任何影响
方法的关键结果均应制成文件。
化学化合物可能在进行色谱分析前发生降解，比如，在制备样品溶液、
提取、净化、相转移或样品瓶的贮存（在冰箱或在自动进样器里）过
程中可能发生降解。在这些情况下，方法开发时应考察被分析物和标
准物质的稳定性。使用同一份溶液，测定其在预先选定的时间间隔里
（例如，每小时测定一次，直到 46小时）产生的结果偏差，以此来测
定稳定性。
26
3
3.10 稳定性
3.9 耐用性
27
稳定性试验对于估计从样品采集到样品分析之间的允许时间非常重要。
它对于评价分析方法在有降解产物存在时检测药品的能力也很重要。
实验应在真实的样品贮存条件下进行，因为药物成分的稳定性是贮存
条件、药物的化学性质、基质以及贮存体系稳定性的函数。稳定性研
究是在样品的采集和处理并经过特定条件的贮存后评价被分析物的稳
定性，这里，特定的贮存条件有长期贮存（以预定的贮存温度冷冻）、
短期贮存（在室温下经过一系列的样品分析），以及经过冻融循环。
用于稳定性实验的条件应反映实际样品在处理、贮存和分析时遇到的
各种条件。
所有的稳定性试验应使用以适当的不含被分析物和干扰成分的基质配
制的含有被分析物的贮备液制得的一系列样品溶液。被分析物贮备液
以合适的溶剂制备成已知浓度的溶液，用作稳定性试验。
应评价室温下至少存放 6小时的药品和内标贮备液的稳定性。在经过
一段预期时间的贮存后，通过比较该溶液与新鲜制备溶液的仪器响应
值来检测稳定性。通过样品溶液的重复分析、并计算响应值的 RSD来
确定系统稳定性。当 RSD不超过短期系统精密度相应值的 20%时，
认为该系统的稳定性是适宜的。如果以分析结果对时间作图，可以计
算样品溶液使用的最长期限。
为加速降解，ICH4还推荐实施加速试验，在高温、高湿或光照条件下
证明存在降解产物时分析方法的专属性，其目的是产生预期的典型降
解产物。根据经验，应选择能使 5～20%药物成分发生降解的加速
条件。
另外，建议测量不同的冻融周期（短期和长期）下的稳定性。以下是
建议用于生物分析稳定性研究的条件示例 3。具体条件取决于应用中
特定的贮存条件。
3
冻融稳定性
应测定被分析物经过三次冻融周期的稳定性。至少应取高低浓度的样
品各三份，在预定的温度下贮存 24小时，并取出在室温下自然融化。
短期温度稳定性
应取高低浓度的样品各三份，在室温下融化并在此温度下存放 4～24
小时（取决于样品在预期的研究中室温存放的时间）并分析。
长期稳定性
长期稳定性的贮存时间应超出第一次样品采集到最后一个样品分析的
时间。应取高低浓度样品至少各三份，在与样品研究相同的条件下贮
存，以测定长期稳定性。所有稳定性样品的浓度应与相应浓度的标准
溶液从长期稳定性试验的第一天起的回算平均值相比较。
经处理样品的稳定性
应测定经处理样品的稳定性，包括在自动进样器里等待分析的时间。
应考虑验证样品的批量大小以及需要的运行时间，通过测定相对于最
初校正标准品的浓度来评价药品和内标物质的稳定性。
28
3
第 4章
方法验证步骤
方法验证步骤 某个具体方法的有效性应通过实验加以证明，使用与常规分析的未知
样品接近的样品或标准品进行验证试验。其准备和执行应按照验证协
议进行，最好写成一步一步指令的格式。本章阐述了验证非标准分析
过程的方法和步骤。假定现在已经选择了合适的仪器，并且已经完成
了方法开发。验证过程应满足以下条件：易于使用；能够用计算机系
统自动控制；每次分析的成本；样品能量；运行时间；以及环境、健
康和安全要求。
与设备确认或计算机系统验证相同的是，方法确认不是一个孤立事件。
这一过程从某人想要在实验室里实施一个新方法开始，到方法不再使
用为止。由于其时间长度和复杂性，把整个过程分成不同阶段。整个
过程如图 9所示。
30
4
4.1 使用周期概念
•
••
••
••
•••
图 9. 不同的验证阶段
31
应制定验证计划，包括责任人、职责和交付成果。第一步是定义方法
的范围。它包含化合物的浓度范围、样品基质、需要使用的具体设备，
以及该方法在何处用于样品分析。一旦得知分析目标，我们就可以设
定性能参数、性能测试和接受限度。然后制定包含所有实验细节的测
试方法草案，并按照方法草案进行试验。所得测试结果与接受限度相
比较。最后，制定常规的方法规程以确保在分析时间内有持续的系统
性能。性能测试包括系统适用性试验以及对质控样品的分析。所有实
验条件和验证结果应记录于验证报告中。
成功的验证要求一个组织内几个部门的通力合作，包括法规事务部、
质量保证部、质量控制部和分析开发部等。因此，关键的是按照制定
好的验证总体计划进行分析方法验证。总体计划中规定公司的分析方
法验证办法和步骤，并且服务于以下两个目的：一是总体计划如能得
到正确实施，它将保证始终如一地有效执行验证项目；另外，它能回
答检查员有关公司中分析方法验证的各个方面的问题。总体计划也是
对方法验证的有关人员进行培训的理想工具。总体计划应包括：
1. 目的和范围
2. 术语表
3. 职责，如使用部门、管理部门及 QA等
4. 方法性能参数和测试方法
5. 方法验证步骤
6. 选择测试项目和接受限度
7. 系统适用性试验的方法和参数
4
4.2 验证计划
48. 方法变更和重新验证
9. 法定方法和标准方法的证实
10. 分析方法转移
11. 要求的标准操作规程（SOP）清单
12. 审批程序、文件化和归档
13. 项目计划、测试草案和验证报告模板
对于每一个独立的验证项目，应分别制定项目计划。在项目计划中列
明如何做才能使某一特定的方法或过程得到验证。这个项目计划应根
据总体计划制定。计划中应包含具体任务的时间表、交付成果和责
任人。
方法的范围以及验证的接受限度应在验证开始前予以规定。范围的确
定需要几个不同部门的共同努力，包括业务开发部、分析研发部、质
量控制和质量保证部。应明确以下问题：
应对哪些样品进行分析？
应测量哪些被分析物？
预期的浓度水平是多少？
样品基质是什么？
是否存在预期的干扰物质，并且是否能被检出和定量？
是否有特别的法律法规要求？
应对信息进行定性还是定量分析？
要求的检测限和定量限是多少？
32
4.3 范围和方法技术指标
4
33
预期的浓度范围是什么？
预期的精密度和准确度是多少？
方法应有怎样的耐用性？
应使用哪一类设备？方法是只适用于一种特定的仪器，还是可以用
于同类的任何仪器？
方法只适用于某一特定的实验室，还是可以在一个地方或全球的所
有实验室应用？
参与使用方法的人员需要哪些技能？
确定方法的范围对于寻找最佳的检测手段非常重要。举例来说，如考
虑不同供应商的设备就会增加验证试验的难度，但同时提高了实验室
在日常分析中使用不同仪器的灵活性。如果方法只在某一特定的仪器
上使用，则在做验证试验时不需要使用其他供应商的仪器。这种情况
下，可以根据需要减少试验。同样的，在验证研究时考虑不同的场所
也会增加试验工作量，但是便于将方法转移到曾经参与验证研究的
场所。
对于一个有效的验证过程，重要的是确定合适的验证参数和接受限度。
方法的性能参数和限度应基于方法的预期用途来确定。并不一定需要
对某一特定技术的所有分析参数进行验证。例如，如果方法用于痕量
水平的定性分析，则不需要测试和验证方法的定量限或仪器整个动态
范围的线性。参数越多，用于验证的时间就越多。并非总要对所有的
分析性能参数进行验证，但是必须确定需要验证的参数。验证参数和
接受限度的选择应根据业务、法规和客户的要求，并且应证明其合理
性和制成文件。
4.4 选择验证参数和限度
4
34
2
1 3
* *
*
*
*
*
* *
*
123
*
图 11. USP验证参数
图 10. ICH验证参数
4
35
USP11和 ICH4均包含有关不同分析任务验证参数的章节（图 10和图
11）。ICH规定了需要验证的不同类型的分析过程。
鉴别试验
杂质含量的定量检测
杂质控制的限度试验
活性成分或药物中其他主要成分的定量检测
按照 ICH的规定，如果分析任务是鉴别，则不要求任何形式的精密度、
检测限和定量限。在 USP第 1类的含量测定中，需要检测的主要成分
或活性成分通常以高浓度存在，因此，无需验证检测限和定量限。
技术指标的接受限度还取决于方法的预期用途。例如，FDA有关生物
分析方法验定的指南（3）建议，对于生物样品，可以接受 20% RSD作
为定量限的精密度。而另一方面，常规质控时药物成分的精密度应为
2% RSD或更好。
应根据药物开发期间收集的数据、产品发布的技术指标、贮存期限的
要求以及药典的检测要求，对药物中的每一个化合物制定相应的检测
限和定量限技术指标和接受限度。随着以后在产品生产过程中获得更
多可靠信息，这些技术指标和接受限度应接受审查，必要时加以变更。
ICH指南中有设定检测限和定量限技术指标和限度的建议。例如，ICH
Q3A(R)指南中关于杂质 23的陈述：“对于已知具有异常作用或可产生
毒性或意外的药理作用的杂质，分析过程的定量限/检测限应与能够控
制杂质的水平相适应。”至于如何确定验收标准和控制限度，该指南
参考了 ICH Q6A指南的技术规范 24。这一过程的所有决定均应证明其
合理性并形成文件。
对于合同检验，应根据客户和合同实验室签订的正式协议来确定方法
的性能指标和接受限度。
4.5 性能参数的检测：准备和实施 一旦确定了检测项目和接受限度，必须按照验证方法草案对检测试验
进行全面的准备、完成和记录。
准备阶段
好的准备工作对于有效地完成试验非常重要。最重要的是使用合格的
材料、确认过的设备、经培训的人员以及文件化的规程。
用于测定关键验证参数的化学品，如试剂和标准物质，应具备足够
的数量，经过准确的鉴别，足够稳定，并且按照技术指标核查其具
有确切的成分和纯度
其他材料和消耗品也应符合要求，例如，应选用新的并且符合色谱
柱性能指标要求的色谱柱。这样，能够确保一整套消耗品能够用于
大部分的验证试验，并且避免在方法验证过程中发生不愉快的意外
事件
分析设备应有明确的规定和良好的性能，并经过确认或校准，以确
保其满足分析方法要求的功能和性能指标。应选择中等性能的设备，
而不要选择性能最好的设备。否则，用不同设备进行中间精密度和
重现性研究时可能会有问题，不容易满足标准限度的要求
操作人员应对技术和设备足够熟悉。这样，他们可以更容易地识别
和诊断不可预见的问题，并且更加高效地完成整个过程
36
4
37
如果只有很少或没有方法性能参数方面的信息，建议在方法开发阶段
或开始验证试验时对方法的适用性加以证明。这类研究应包括大致的
精密度、工作范围和检测限。如果初期的验证数据看起来不合适，则
应调整方法本身的技术指标、仪器设备或分析技术。因此，方法开发
和验证是个反复的过程。例如，在液相色谱法中，通过选择流动相的
组成来达到选择性要求。对于定量检测，两个色谱峰之间的分离度应
达到 2以上。如果没有达到这样的分离度，则应进一步优化流动相组
成。如果方法开发阶段没有对运行参数的影响进行评估和优化，则应
该在这一阶段对这些影响进行评价。例如，评价 pH、流动相组成或流
速对方法性能的影响等。
检测执行阶段
验证试验的顺序没有官方的指南。最佳顺序取决于方法本身。根据作
者的经验，对于液相色谱法，以下顺序证明是有效的：
1. 专属性/选择性
2. 保留时间和峰面积重复性
3. 线性、定量限、检测限、范围
4. 不同浓度的准确度
5. 中间精密度
6. 重现性
耗时最长的实验一般放在最后，如中间精密度和重现性。列在 2～4
条的一些参数可以合并在一起试验。例如，在测量整个浓度范围的峰
面积精密度的同时，这些数据可以用来验证线性。
4
4.6 制定常规分析的质量控制计划 分析方法验证的目的不仅是在开始使用方法时保证分析数据的有效性，
还要在方法的整个使用周期内都确保其有效性。为了证实方法和系统
的性能在样品分析时与最初规定的相同，应在常规的样品分析中纳入
适当的检查手段。这类检查无需覆盖最初测试的所有参数，但必须重
视最为重要的参数，尤其是那些最可能随时间改变的参数。应制定这
类检查的实施程序并作为方法验证程序的一部分加以文件化，因为在
这个过程中最容易发现那些重要项目的信息。
常用的持续试验是系统适用性试验和质控样品分析。色谱方法的系统
适用性试验在药典 21,25中有规定，通常包括两个色谱峰之间的分离度、
峰面积重复性、拖尾因子，以及理论板数。建议把系统适用性试验作
为任何分析过程的组成部分，而不仅是那些涉及色谱技术的方法。例
如，基于滴定的分析过程通常也应该包含对空白样品的评价。
诸如 ISO/IEC 17025等质量管理标准和认可准则要求对质控样品进行
分析，并有判定依据指明何时方法和系统超出了统计控制。其目的是
为了优化这些实验，从而以较少的控制分析使方法和整个分析系统在
长时期内给出满意的结果，满足方法范围中规定的目标。控制样品相
对于未知样品的比例取决于样品的临界值以及系统的稳定性，通常为
5～20%。法规和质量管理标准对具体数字没有要求，但希望能有确
定的和合理的频次并制定成公司的程序文件。一旦程序中明确了质量
控制的频次，检查员将检查程序是否充分以及是否得到执行。程序中
还应指出没有达到判据的要求时应采取何种措施。
38
4
39
一旦方法开发并经过验证，即应形成验证报告。报告应包含足够的信
息以使经验丰富的分析人员能够重复验证研究。验证报告通常应包含
以下内容：
方法的目的和范围（适用性、类型）
方法简述
职责
化合物类型和基质
所有化学品、试剂、参考标准、QC样品及其纯度、级别、来源或制
备的详细要求
标准物质和化学品的质量检查程序
安全预防措施
从方法开发实验室转到常规分析的方法实施计划和程序
从耐用性试验得到的重要参数
如何进行实验的详细参数和条件，包括样品制备和方法参数
统计程序和代表性计算公式
常规分析中的 QC过程，如系统适用性试验
代表性图表，如色谱图、光谱图和包含原始数据的校正曲线
方法的接受限度和性能数据
预期的测量不确定度结果
重新验证的判断准则
方法开发和验证人员的资质记录
44.7 验证报告和其他文件
参考文献（必要时）
对验证计划和方法草案的偏离
总结和结论
负责审核和批准分析检测程序的人员姓名、职务、批准日期和签名
40
4
第 5章
方法的调整、变更、重
新验证以及标准方法和
法定方法的证实
方法的调整、变更、重新
验证以及标准方法和法定
方法的证实
分析方法在其使用周期里极有可能发生变更或调整。例如，如果方法
不再满足性能要求，就可能要求改变方法参数以达到最初制定的性能
指标。如果方法的使用范围发生了变化，也要求相应地改变方法，比
如增加了新的目标化合物，或样品基质发生了变化。本章讨论何时要
求对方法进行重新验证以及如何将其形成文件的情形和建议。
验证过的分析方法常常不能达到预期的效果。比如，液相色谱峰达不
到方法规定的分离度。可能的原因有：
方法由研发实验室转移到常规实验室，或在常规实验室间进行转移
把法定方法或标准方法引入实验室
使用了相同或不同厂家不同型号的仪器，其性能参数不同，比如不
同 HPLC的延迟体积不同
使用时间久了，色谱柱性能发生改变
新批号的色谱柱性能不同
引进新技术优化分析，例如，节约运行成本，减小色谱柱内径以节
约流动相，或减小粒径以节约分析时间
通常分析人员会尝试改变一些方法参数，如流动相组成、柱温或流速，
以使方法性能达到原来的技术指标。但分析人员对这类改变以后是否
需要重新验证方法不甚清楚。
在欧洲药典 25和美国药典 21的色谱法通则中可以找到这个问题的答案。
这些通则中列出了液相色谱和气相色谱中的一些性能参数，只要符合
系统适用性的要求，这些参数即使改变也无需重新验证。
42
5
5.1 方法调整
43
USP和 EP中有关 HPLC和 GC的要求分列于图 12。USP和 EP的要求
几乎相同。比如，USP和 EP的色谱柱参数完全一样。
5
USP EP
±70% ±70% ±25%
50% 50%
±50% ±50%
±10 C ±10% 60 C
LOD LOD pH ±0.2 ±0.2 ±1%UV
±10% ±10% <50%
±30% ±30% ±10% ±2%
USP EP
±70% ±70% ±50% ±50%
-50%
-50~100% -50~100% ±50% ±50% ±10 % ±10%
LOD LOD
图 12. 允许改变的 HPLC和 GC条件
5以上给定的限度范围不得理解为任何方法都可以在所有性能参数的限
度范围内任意改变。USP和 EP要求在任何变更之后进行系统适用性
试验。如果能够达到系统适用性的标准，则不要求进行重新验证。换
句话说，应对方法的性能进行证实，但不需要重新验证。基点应该是
前一次重新验证的参数，而不是方法发生变更的前一次参数。例如，
如果最初验证的流速是 1.0ml/min，第一次变为 1.4（40%），接着又
变成 1.7（从前一次变化算是 20%，而按基点计算应是 70%），这时，
即使能够通过系统适用性试验，也要重新进行方法验证。图 13给出
了色谱法需要变更时可以遵循的流程图。
44
图 13. 方法变更流程图
5
45
USP最初规定的 HPLC内径变化和 EP相同，均为±25%。但是 USP32
（2009年 12月 1日）改变了这一规定。只要线速度保持不变，允许
任意改变色谱柱直径。线速度按下式计算：
其中 F，l和 d分别为流速、色谱柱长度和色谱柱直径，变化前为下标
1，变化后为下标 2。
这就允许通过减小柱径和流速来降低流动相消耗，并且只需要在新的
条件下对方法的性能进行证实。
另外，通则中不允许改变各论下规定的色谱柱。例如，改变色谱柱的
粒径和尺寸可提高分离速度，而且具有相同的色谱性能。然而，这两
种情况目前需要重新验证。USP也知道这个情况，并且可能通过修订
来解决这个问题。由 USP的 H. Pappa领导的一个委员会在药典论坛 26
上发表了一个鼓励性的文章。文中提出了一个新的办法，既能保持分
离质量，又能扩大粒径的变化范围，最大减小幅度可以达到目前的两
倍。这个设想的目的是允许色谱工作者在节约分析时间的同时免去重
新验证，前提条件是能够保持色谱性能。
F2 = F1
l2d22
l1d12
5下列情况要求重新进行方法验证：
为达到最初的性能要求而变更方法，且该变更超出了 USP 的容许
范围
分析的新化合物不在方法的原定范围内
样品基质发生改变
发生任何这类变更时，均应按变更控制程序要求将其形成文件，并对
方法进行重新验证。变更控制程序应要求明确变更原因。变更应得到
授权并制成文件后方可实施。应证明性能测试的合理性并制成文件，
并且变更应予以正式发布。
在规范化或质量管理标准环境下运行的实验室推荐采用正式方法，诸
如 EPA、美国试验与材料学会（ASTM）、APAC、ISO或 USP等组织制
定的方法。例如，美国食品药品和化妆品法案要求 FDA监管行业使用
法定方法或证明其等效性。ISO/IEC 17025要求：“应优先使用以国际、
区域或国家标准发布的方法。”这些方法已经得到验证，因此，许多
分析人员错误地认为这类方法不需要在实验室中做任何进一步的验证、
证实或试验即可投入使用。US FDA cGMP法规在 21 CFR 211.194 (a)(2)
中规定：“如果应用的方法收载于现行的美国药典或其他认可的标准
方法中，或在批准的新药应用中有详细方法且未改变这一参考方法时，
有指明方法和参考文献的声明即满足要求。所有检测方法的适用性应
在实际应用条件下得到证实。”ISO/IEC 17025在 5.4.2中有类似的要
求：“在引入检测或校准之前，实验室应证实能够正确地运用这些标
准方法。如果标准方法发生了变化，应重新进行证实。”
46
5.3 标准方法和法定方法的证实
5.2 重新验证
5
47
这里明确了正式方法只要不发生变更，不需要进行验证，但实验室应
证实其有能力成功运行该方法。当决定选择什么样的证实方式最好时，
问题又来了。是否需要重做部分验证试验还是全部的验证试验都要重
做，或者仅仅系统适用性试验或质控样品结果满意是否足够，这些都
不清楚。
USP在通则<1226>法定方法的证实 12中回答了这些问题。该通则中
给出的建议适用于法定方法和标准方法的实施。
关键的建议有：
通过系统适用性试验证明实验室和系统的性能
评价方法的临界性和复杂性
选择最重要的方法性能参数
根据方法的临界性和复杂性，重复 1～3个最为重要的验证试验
与内部制定方法的验证相同，标准方法的评价和证实也应该遵循文件
化的程序，如验证计划或 SOP。应按验证方法草案要求记录结果并形
成文件。所有文件将成为验证报告的主要资料。
法定/标准方法的证实过程见图 14。
1. 确定在实验室中实施分析测试的范围
2. 证实法定/标准操作的范围与确定的范围相同
3. 如果确定的范围不同，变更已有的方法或制定一个新的方法，并验
证不同的性能参数
4. 如果方法相同，运行系统适用性试验，并根据方法的临界性，
做 1～3项验证试验。如果试验达到接受限度的要求，则应把范围、
测试和测试结果制成文件，并声明方法可以投入使用
5. 如果测试结果不能被接受，应努力寻找问题的根本原因。原因可能
是没有足够的设备或参考物质。如果查出原因，采取纠正措施并重
新测试。这个过程可能是个反复的过程
6. 如果无法找到根本原因，则变更方法或开发新方法
7. 如果要求的变更超出药典规定的接受限度，需要重新进行方法验证
48
5
1 3
图 14. 分析方法的证实过程
49
证实试验的选择与应用类型相关。图 15显示对于特定的药物分析应
用所推荐的证实试验。
AOAC发布了按 ISO/IEC 17025实施标准方法时建议应采取的证实活动。
不同的应用示例列于图 16。
5
#
1
2
3
图 15. USP <1226>为特定应用推荐的证实试验
50
5
# 1 •
2 •
•
•
•
3 •
•
4 •
•
•
图 16. AOAC为特定的应用推荐的证实试验（摘自参考文献 9中的表 2～5）
第 6章
分析方法转移
分析方法转移 当验证过的方法在实验室间转移时，接收实验室应证明其能够成功执
行方法。典型的方法转移情况有：从研发（R&D）实验室转到质控
（QC）实验室，生产线搬迁后从 A场所转移到 B场所，从主办单位转
到合同实验室，以及当另一个公司购买产品后从 X公司转到 Y公司。
目前，没有正式文件可以作为接收实验室的性能证明试验指南。最有
希望的是 USP的 H. Pappa领导下的 USP通则专家委员会发表的一篇鼓
励性文章，标题为“分析方法的转移——建议作为一个新的通则”27。
文章描述了最常用的方法转移办法：比对试验、两个实验室或两个场
所共同验证、全部或部分验证或重新验证，以及不作正式转移处理的
情形，有时称为转移豁免。
比对试验
比对试验是检测实验室最为常用的方法转移方式。由转出实验室和接
收实验室对性质明确的代表性样品进行分析。方法转移前，应注意该
方法及其重要参数能被接收实验室的员工很好地理解。具体的转移办
法、文件化的方法实施程序，以及转出部门和接收部门之间的良好沟
通同样重要。转移办法中不仅列出检测试验和两个实验室的任务，还
应确定传递方法的接受限度值。如果结果符合事先确定的接受限度，
则方法可以在接收实验室使用。分析的样品数取决于方法的临界性、
复杂性，以及接受实验室是否有类似的方法学应用经验。比对试验的
考虑因素有：
样品数、批次（例：2～5）
不同浓度（例：1～3）
重复试验次数/样品数（例：4～6）
不同分析人员（例：1～2）
持续时间（例：2～5天）
一个或多个厂家的设备（1个～所有可用设备）
52
6
6.1 转移程序
53
两个或多个实验室的共同验证
比对试验的另一种办法是把接收实验室纳入待转移方法的验证体系。例
如，接收实验室可以参与耐用性试验的实验室间检测。基本上这是一
种特殊形式的比对试验。其优点是可以共享方法验证和方法转移需要
的共同资源。然而，这只有当所有参与实验室都计划在差不多同时实
施方法时才有意义。方法转移必须制定成正式的文件，包括预先经过
批准的方法草案和预先设定的接受限度。
转移豁免
在某些情况下，可以省去一般的转移确认试验。当适用转移豁免时，
接收实验室可以通过讨论决定采用分析测试程序，而无须取得比对试
验或验证数据。这种选择必须小心处理，并且，如果选用，必须证明
其合理性并形成文件。豁免的理由可能是转入的方法与目前常用的方
法相类似，或者最初开发和验证方法的人员从转出实验室调到了接收
实验室。
分析方法的转移必须经过完整的计划、执行并形成文件。本节给出通
过比对试验完成成功的方法转移所必要的步骤。
制定转移计划。计划包括活动内容、时间表、责任人和交付成果。
这种针对项目的计划应在总体计划的基础上制定，总体计划规定了
公司分析方法转移的做法
制定转移办法。办法中规定转移对象、范围、转出实验室和接收实
验室的责任、试验材料、设备和方法参数。转移办法还应包括试验
的详细情况、接受限度、试验理由、记录要求，以及支持性材料如
色谱图和光谱图等。另外，办法还应包括批次、每批重复次数、进
样顺序以及出现偏差如何处理等信息
制定试验操作的 SOP。SOP包括样品和标准物质的制备，以及试验
结果的检查和记录
6
6.2 方法转移步骤
6培训员工。由转出实验室的员工对接收实验室的分析人员进行培训。
培训包括转移办法的细节、方法学，以及过去发生的所有问题
在两个实验室同时执行转移办法。将实际结果与预期结果相比较，
是否满足接受限度的要求
如有问题，识别其根本原因。如果不满足接受限度，找出根本原因
并解决问题
形成计划中规定的文件和记录。所有计划中规定的文件和记录生成
后，均应得到转出和接收单位的实验室和 QA的审查和签署
54
第 7章
生物分析方法的验证
生物分析方法的验证 生物分析方法用于生物基质（血、血清、血浆或尿）中药物和/或代谢
物的定量测定。在药物开发的临床前和临床研究中，分析结果对生物
利用度、生物等效性、药代动力学、毒代动力学试验等研究的评价和
解释非常重要。这些研究常常作为支持性材料，与其他文件一并提交
给监管机构。
样品的性质决定了生物分析方法非常复杂，并且与成品药和原料药的
质量控制相比，方法验证的难度更大。这是由于生物分析方法包含更
复杂的基质，各种代谢物可能产生干扰，并且样品量通常较少。另外，
生物分析数据要求准确可靠，因为它们用于一些重要的应用中，如对
药物或制剂效能的重要评价指标药代动力学参数的计算等。因此，生
物分析方法需要进行完全的验证。
本章阐述了最重要的生物分析方法验证参考文献、验证参数、接受限
度、常规分析的质量控制程序以及所要求的文件和记录。本章的验证
建议是基于 FDA指南 3和 2006年 AAPS的工作报告 10提出来的。
自 19世纪 80年代后期以来，生物分析方法及验证的重要性得到了监
管机构和来自行业与大学的科学家的重视。当时没有任何正式或非正
式的指南可以被生物分析工作者用于指导生物分析方法的验证工作。
从那时开始，召集了一些工作组和会议，以会议报告的形式作为最初
的验证实践指南。最重要的是美国药学科学家协会（AAPS）和 FDA
在 1990、2000和 2006年共同主办的会议。
最初的研讨会 28就需要验证的生物方法参数达成了共识。他们识别出
必要的验证参数，如准确度、精密度、选择性、重现性、检测限和稳
定性，另外还确定了一些参数的接受限度。
56
7
7.1 研讨会和 FDA提出的验证指南
57
在 2000年举行的第二次会议 29中，代表们主要讨论了第一次会议以
来的实验和进展。研讨会发布了报告“生物分析方法验证——十年来
的进展回顾”，FDA根据这个报告在 2001年出版了指南。
AAPS在 2006年的第三次会议的主题是对生物等效性、药代动力学和
可比性研究样品的定量生物分析程序的范围和适用性进行回顾。另一
个目的是评价色谱法和配体法定量分析生物大分子的验证和实施要求。
编写本书时，能够得到的最重要的参考文献是 FDA针对生物分析方法
验证的指南 3和 AAPS工作组在 2006年的报告：“定量生物分析方法
验证和实施：色谱法和配体结合法分析的最佳实践”10。FDA的指南
主要着重于方法学，目前仍然有效，而 AAPS的会议报告还就如何提
高生物分析工作的质量提供了一些解释和最好的实践建议。例如，研
讨会还解释了 QC样品处置、基质效应的确定、稳定性考虑因素、内
标的使用和系统适用性试验等一系列问题。
另外，研讨会的报告中还明确指出了哪些验证研究记录需要保留。产
生于方法验证阶段和样品分析研究阶段的记录是原始记录，应予以保
留，以证明方法的有效性。例如，色谱图以及每次样品的制备、提取
和运行汇总表被认为是原始数据。这其中包括样品测试的运行记录以
及失败的运行记录。另外，重新积分的色谱图应明确加以识别。应记
录重新积分的原因及重新积分的方式。最好应保留原始色谱图和重新
积分色谱图的电子记录。记录积分参数变更的电子审计跟踪功能不能
设置为“不启用”。
7
7生物分析方法验证的基本验证参数与前面章节中讲到的参数没有多大
差异。它们包括：选择性/专属性、精密度、回收率、线性和被分析物
的稳定性。本节中我们主要讨论在生物分析方法中有特殊要求的那些
参数。稳定性研究的原则见“第三章 方法验证的参数和试验”，此处不
再赘述。
选择性/专属性
对于选择性/专属性，应选取合适的生物空白样品进行分析，并应至少
包括六种来源的基质。每个空白样品应做干扰试验，并确保其选择性
低于定量下限（LLOQ）。
精密度
根据 ICH的指南 4,5，精密度分为短期精密度（运行内或批内精密度）
和中间精密度（运行间或批间精密度），精密度根据时间的不同而测
定，并且可能涉及不同的分析人员、设备和试剂。批内精密度的每个
浓度至少应测定 5个值。建议在期望的浓度范围内至少选取三个浓度
水平。求得每个浓度水平的精密度，变异系数（CV）不得超过 15%，
其中 LLOQ除外，其 CV不得过 20%。
对于批间精密度，应由不同的分析人员在四个不同的日期重复批内精
密度实验。将四天实验的精密度与批内精密度进行比较。
准确度
准确度通过含有已知量的被分析物样品的重复分析来测定。测定准确
度时，每个浓度至少应测定 5个值。建议在期望的浓度范围内至少选
取三个浓度水平。实际测得量平均值的偏差应在 15%以内，而 LLOQ
除外，其偏差可能大于 20%。平均值与真值的偏差可以作为准确度的
量度。
58
7.2 验证参数
7
59
回收率
回收率与准确度类似，但其中考虑了分析方法的提取效率。被分析物
的回收率不一定需要达到 100%，但是被分析物和内标的回收率大小
应该恒定、精密而且可重现。回收率试验可以这样做：在高、中、低
三个浓度水平，将提取后样品的分析结果与不经提取的标准品（代表
100%的回收率）进行比较。
校正/标准曲线
FDA指南中，这个验证参数的定义和本书前面提到的线性的定义相同。
它反映了仪器响应值和已知的被分析物浓度之间的关系。样品中每种
被测组分均应建立一条校正曲线，并且响应值应与被测组分浓度成
比例。
取与样品基质相同的生物基质制备校正曲线，可以通过往基质中标准
加入已知浓度的被分析物来进行预期的研究。校正曲线应包含一份空
白样品（取基质样品同法处理，但不加内标），一份零含量样品（取基
质样品同法处理，加入内标），以及覆盖预期浓度范围（包括 LLOQ）
的 6～8份非零样品。如果被测组分的响应值达到空白响应值的五倍
以上，并且被测组分的响应是可识别的、离散的和可重现的，精密度
达到 20%，准确度为 80～120%，则该校正曲线的最低标准浓度可以
作为定量限。
应采用足以描述浓度-响应值关系的最简单的模型。至少 4～6个非零
标准溶液应落在名义值的 15%偏差范围内，LLOQ除外，其偏差应不
得过 20%。
定量下限（LLOQ）
LLOQ是被测成分能够以适当的精密度和准确度得到定量检测的最小
量。LLOQ的推荐精密度为 20%或更低。测定 LLOQ的方法有多种。最
好的做法是测定精密度和准确至少达到 20%处的含量。
7如果精密度和准确度的变化总是落在可接受的容许限度以内，生物样
品用验证过的方法测定一次即可。如果不是这种情况，应进行两次甚
至三次分析。
为了确保获得稳定的质量和分析数据，应建立在常规分析过程中维护
最佳条件和最小准确度与精密度的程序。需要考虑的重要因素有：
在最低浓度到预期的最高样品浓度的范围内应用校正标准品进行多
个浓度水平的校正
校正（标准）曲线应覆盖预期的未知样品浓度范围，并应用校正样
品测定 LLOQ
不要用外延的标准曲线估计低于 LLOQ或高于最高标准点的未知样
品浓度。而是应重新确定标准曲线，或者当样品浓度较高时，可以
稀释后重新测定
每次分析均应包含空白基质（不含内标）、零标准点（含有内标的基
质）以及至少 6个非零标准点
应在样品测试的同时分析 QC样品和加标样品，分析间隔根据样品
的总数来确定
QC样品数最少应为样品总运行次数的 5%
QC样品应在三个浓度水平重复分析。例如，一个浓度可以是 LLOQ
的三倍，一个在中等浓度，还有一个在测量范围的最高点
每 6份 QC样品中，与名义值的偏差在 15%以内的至少应有 4份。
6 份中另 2 份样品其偏差值可能超出 15%，但不应为相同的浓度
水平
用于生物分析法的仪器应经过确认并正确维护。应确定系统适用性
参数、接受限度和频次，以确保系统正常运行。系统适用性试验不
能代替要求的 QC样品和接受标准
60
7.3 生物分析日常检测中的质量
控制
参考文献
术语表
62
R1. LGC, In-House Method Validation: A Guide for Chemical Laboratories（实验室内部方法验证：化学实验室指南）, 2003
2. U.S. FDA – Guidance for Industry (draft): Analytical Procedures andMethods Validation: Chemistry, Manufacturing, and Controls andDocumentation（美国 FDA—行业指南（草案）：分析过程和方法验证：化学、制造和控制以及文件编制）, 2000
3. U.S. FDA – Guidance for Industry, Bioanalytical Method Validation（美国 FDA—行业指南，生物分析方法验证）, 2001
4. ICH Q2A, Validation of Analytical Procedures: Definitions andTerminology（分析过程的验证：定义和术语）, Geneva, 1995, in 2005incorporated in Q2(R1)
5. ICH Q2B, Validation of Analytical Procedures: Methodology（分析过程的验证：方法学）, adopted in 1996, Geneva Q2B, in 2005 incorporatedin Q2(R1)
6. IUPAC Technical Report, Harmonized Guidelines for Single-LaboratoryValidation of Methods of Analysis（IUPAC技术报告，单个实验室分析方法验证的协调指南）, Pure Appl. Chem., 74 (5) 835/855, 2002
7. Eurachem – The Fitness for Purpose of Analytical Methods A LaboratoryGuide to Method Validation and Related Topics（分析方法的适用性方法验证及相关主题的实验室指南）, 1998
8. L. Huber, Validation and Qualification in Analytical Laboratories（分析实验室的验证和确认）, Informa Healthcare, New York, USA, 2007
9. AOAC, How to Meet ISO 17025 Requirements for Methods Verification（如何满足 ISO17025的方法证实要求）, 2007
10. C. T. Viswanathan et al., Workshop/Conference Report — QuantitativeBioanalytical Methods Validation and Implementation: Best Practicesfor Chromatographic and Ligand Binding Assays（研讨会报告—定量生物分析方法验证和实施：色谱法和配体结合分析的最佳实践）.AAPS Journal; 9(1), E30-E42, 2007
参考文献
63
R11. USP 32 – NF 27, General Chapter 1225, Validation of Compendial
Methods（通则 1225, 法定方法的验证）, 2009
12. USP 32 – NF 27, General Chapter 1226, Verification of CompendialMethods（通则 1226, 法定方法的证实）, 2009
13. USP 32 – NF 27, General Chapter 1058, Analytical InstrumentQualification（通则 1058, 分析仪器确认）, 2009
14. U.S. FDA, Title 21 of the U.S. Code of Federal Regulations: 21 CFR 211Current good manufacturing practice for finished pharmaceuticals（美国联邦管理法规第 21篇：21 CFR 211 成品药动态生产质量管理规范）, Revised as of April 1, 2009
15. U.S. FDA, Title 21 of the U.S. Code of Federal Regulations: 21 CFR 58Good Laboratory Practice for Preclinical Studies（美国联邦管理法规第 21篇：21 CFR 58 临床前研究实验室质量管理规范）, Revised asof April 1, 2009
16. U.S. FDA, Title 21 of the U.S. Code of Federal Regulations: 21 CFR 320Bioavailability and Bioequivalence Requirements（美国联邦管理法规第 21篇：21 CFR 320生物利用度和生物等效性要求）, Revised asof April 1, 2009
17. PIC/S Guide To Good Manufacturing Practice For Medicinal Products（医药产品生产质量管理规范指南）, 2004
18. European commission: The rules governing medicinal products in theEuropean Union, Volume 4: Good manufacturing practices MedicinalProducts for Human and Veterinary Use（欧盟委员会：欧盟医药产品管理规则第四卷：人用和兽用医用产品生产质量管理规范）, 2004
19. PIC/S Guide: Inspection Of Pharmaceutical Quality ControlLaboratories（药品质量控制实验室的检查）, 2005
20. ICH Q7: Good Manufacturing Practice Guide for Active PharmaceuticalIngredients（活性药物成分的生产质量管理规范指南）, update 2000
64
R21. USP 32 – NF 27, General Chapter 621, Chromatography（通则 621,色谱法）, 2009
22. ISO/IEC 17025, General requirements for the competence of testingand calibration laboratories（检测和校准实验室能力的通用要求）,2005
23. ICH, Q3A(R2): Impurities in New Drug Substances（新原料药中的杂质） (Revised Guideline)（修订的指南）, 2006
24. ICH, Q6A; Specifications: Test Procedures and Acceptance Criteria forNew Drug Substances and New Drug Products: Chemical Substances（质量标准：新原料药和新制剂的测试方法和接受标准：化学物质）, 1999
25. European Pharmacopeia 5（欧洲药典第 5版）, Section 2.2.4, 2004
26. USP Stimuli Paper: Transfer of HPLC Procedures to suitable Columns ofReduced Dimmensions and Particle Sizes（USP鼓励性论文：将 HPLC方法转换到直径和粒径更小的色谱柱上运行）,, PharmacopeialForum, Vol. 35 (6), 2009
27. USP Stimuli Paper: Transfer of Analytical Procedures: A Proposal for aNew general Information Chapter（USP鼓励性论文：分析方法的转移——建议作为一个新的通则）, Pharmacopeial Forum, Vol. 35 (6),2009
28. V. P. Shah et al.等, Analytical methods validation: Bioavailability,bioequivalence and pharmacokinetic studies（分析方法验证：生物利用度、生物等效性和药代动力学研究）. Eur. J. Drug Metabolism andPharmacokinetics 16 (4):249–255 (1991) and Pharm. Res.9:588–592, 1992
29. V.P. Shah, et al., Bioanalytical Method Validation – a Revisit with aDecade of Progress（生物分析方法验证——十年来的进展回顾）.Pharm.Res. 17; 1551-1667, 2000
65
AOAC Association of Official Analytical Chemists, （美国）公职分析化学家协会
API Active Pharmaceutical Ingredients, 活性药物成分
ASTM American Society for Testing and Materials, 美国测试和材料协会
CFR Code of Federal Regulations, 美国联邦法规
EP European Pharmacopeia, 欧洲药典
EU European Union，欧洲联盟，欧盟
FDA Food and Drug Administration，（美国）食品药品监督管理局
GC Gas Chromatography, 气相色谱法
GCP Good Clinical Practice，药品临床试验管理规范
GLP Good Laboratory Practice，药物非临床研究质量管理规范
GMP Good Manufacturing Practice，药品生产质量管理规范
HPLC High Performance Liquid Chromatography，高效液相色谱法
ICH International Conference for Harmonization，国际协调会议
IEC International Electrotechnical Commission, 国际电工委员会
ISO International Organization for Standardization，国际标准化组织
IUPAC International Union of Pure and Applied Chemistry, 国际纯粹和应用化学联合会
LGC Laboratory of the Government Chemist, 英国政府检测标准集团
LOD Limit of Detection, 检测限
LOQ Limit of Quantitation, 定量限
NATA National Association of Testing Authorities, 澳大利亚国家检测机构协会
PIC/S Pharmaceutical Inspection Cooperation Scheme，药品检查协定和药品监察检查合作计划
QA Quality Assurance, 质量保证
QC Quality control，质量控制
SOP Standard operating procedure，标准操作规程
SST System suitability testing，系统适应性试验
USP United States Pharmacopeia，美国药典
G术语表
分析方法验证
Ludwig Huber
前言 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . III
1. 引言. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2
1.1 文献综述 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3
1.2 术语：验证与确认 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4
1.3 实验室数据质量的要素 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4
2. 法规和质量管理标准. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 7
2.1 美国食品药品监督管理局（FDA） . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 8
2.2 药品检查协定和药品监察检查合作计划(PIC/S)和欧洲 . . . . . 9
2.3 国际协调会议（ICH） . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 10
2.4 美国药典（USP） . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 11
2.5 ISO/IEC 17025 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 11
3. 方法验证的参数和试验. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 13
3.1 专属性/选择性 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 15
3.2 精密度 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 18
3.3 准确度和回收率 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 19
3.4 线性和校正曲线 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 20
3.5 范围 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 22
3.6 检测限 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 23
3.7 定量限 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 24
3.8 耐用性 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 26
3.9 耐用性 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 26
3.10 稳定性 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 26
目录
I
4. 方法验证步骤 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 29
4.1 使用周期概念 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 30
4.2 验证计划 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 31
4.3 范围和方法技术指标 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 32
4.4 选择验证参数和限度 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 33
4.5 性能参数的检测：准备和实施. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 36
4.6 制定常规分析的质量控制计划. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 38
4.7 验证报告和其他文件 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 39
5. 方法的调整、变更、重新验证以及标准方法和法定方法的证实 . . 41
5.1 方法调整 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 42
5.2 重新验证 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 46
5.3 标准方法和法定方法的证实 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 46
6. 分析方法转移 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 51
6.1 转移程序 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 52
6.2 方法转移步骤 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 53
7. 生物分析方法的验证 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 55
7.1 研讨论和 FDA提出的验证指南 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 56
7.2 验证参数 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 58
7.3 生物分析日常检测中的质量控制. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 60
参考文献 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 61
术语表 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 65
II
本手册旨在为生物/制药、食品、化工、环境和其他规范实验室的管理
人员和检测提供全面的分析方法验证指南。通过对相关法规、质量标
准和指南的深入讨论，无论是质量管理人员或其他员工，还是监管部
门，都将从中受益。本手册将针对内部开发新方法的验证以及对法定
方法和标准方法的证实给出策略和特别建议。
在不到一天的时间里，您可以读到：
• 法规和质量管理标准要求的概述
• 文献综述
• 实施策略
• 检测参数、接受限度以及检测条件的信息
• 对于特殊应用的建议，诸如生物分析方法验证、法定方法的证实
以及分析方法的转移
本书中的观念和想法均代表本人的人个观点，并不一定反映安捷伦或
Labcompliance的官方政策。
本书中的一些文本信息和图片摘自 Ludwig Huber博士的参考书，已得
到纽约 INFORMA HEALTHCARE出版公司的许可。
• L. Huber, 分析实验室的验证和确认, Interpharm, Informa Healthcare,
New York, USA, 2007
文字和图片的版权归出版者所有。
法规和质量管理标准是动态的。每隔几年就会更新。根据监管任务和
行业任务制定的实施指南，其发布更为频繁，因此今天的最新要求到
以后未必如此。
前言
III
应对所有信息进行定期更新，这一点非常重要，而且只可能通过在线
的信息工具（如因特网）才能做到。因此，我推荐以下能够提供与实
验室质量管理标准有关的定期更新的网站：
http://www.fda.gov
分析方法和操作规程验证的法规和特殊指南。
http://www.agilent.com/chem/pharmaqaqc
Aglient药品 QA/QC网站，每月有电子期刊，提供定期更新的信息。
http://www.labcompliance.com
这是定期更新的网站，包含与实验室所有的法规适应性问题相关的教
程和参考文献。
Dr. Ludwig Huber
全球 FDA认证首席顾问
Labcompliance
IV
cGMP
GCP
ISO 17025PIC/S GxP
FDA
LOD/LOQ
OECD
QA/QC
API EP
SOP
USP <1225/1226>ICH Q2(R1)
分析方法验证
分析方法验证
© 安捷伦科技(中国)有限公司，20102010年 3月 1日中国印刷发行号：5990-5140CHCN
安捷伦科技（中国）有限公司客户服务中心：免费专线： 800-820-3278
400-820-3278（手机用户）
www.agilent.com/chem/cn
基础导论