1. Metoda fotodynamiczna w zastosowaniu do diagnozy i terapii chorb nowotworowych. Perspektywy i ograniczenia. Alfreda Padzik-Graczyk Instytut Optoelektroniki WAT, Pracownia Biochemii Kaliskiego 2 00-908 Warszawa

2. HISTORY 1900 - first observation of the photodynamic effect by C. RAAB 1924 - enhanced accumulation of endogenic dyes in cancer tissue - A. POLICARD 1960 - first application of the HPD dye for diagnostic purposes - R.B. LIPSON 1975 - first observation of cancer tissue inactivation using the HPD dye and light - T.D. DOUGHERTY 1978 - 1980 first clinical application. By the end of 1986 - 3000 patients treated by this method. Evaluated number of treatments (PDT applications) - 3. Photodynamic Therapy - General Statements" Photodynamic therapy (PDT) is a new cancer treatment modality, which can be used both for diagnostic and therapeutic purposes. PDT selectively destroys cancer cells and tissues by an interaction of absorbed visible light with a photosensitizer retained in tumors. PDT reuires 3 components: * photosensitizer (dye, e.g. HpD, P II) selectively accumulated in tumor; * molecular oxygen; * yisible light low power density with appropriate wavelength. PDT is a very selective, low invasive method: side-effects ar low and efficiency is high (esp. for early stages). Coutaneous photosensitivity is the only one known side- and late-effect of PDT. The same dyes and light sources (lamps & lasers) can be used for early cancer detection: fluorescence reddish hue" decorates the neoplastic tissue. 4. SENSITIZER Light * SENSITIZER Type l Type 2 SubstrateRADICALS {Oxy-products} {Oxy-products} 1. Peroxides 2. Epoxides 3. Diols, di-ketones 4. Organosulfide oxides 5. Phenols 1. Peroxides 2. Epoxides 3. Diols, di-ketones 4. Organosulfide oxides 5. Phenols Two types of photooxidation reactions involving the excitation of a sensitizer molecule by light * JAMES B. MITCHELL, JOHN A. COOK AND ANGELO RUSSO 3 O2 1 O2 5. BIOLOGICAL BASIS FOR PHOTOTHERAPY Figure 4b Dlagraoimatic repretcmation of a mamma!ran ccii and h tubccllular componcnis -*'hich hsvc bccn rcporicd (o bc damagcd by PDT. inscn of mitochondrion was kindly contributcd by Drt R. Hilfand shows thc Iocationof3 mitochondrial cnzymcs(cytochromecoxidasc, succinatc dchydrcg,-nasc( F0 F; syntmc) ihai havc bccn shown io bc inhibitcd following PDT. 6. Diagram Jaboskiego w zastosowaniu do fotouczulaczy 7. Widma absorpcji barwnikw endogennych i wody 8. Dihematoporfirynowy eter 9. SYNTEZA PPIX IN VIVO Z WYKORZYSTANIEM ALA 10. AMINOACID DERIVATIVES OF PROTOPORPHYRIN - PP(dAA) : NEW CLASS OF DYES FOR PDT Why these compounds? there is a selective mechanism of interaction of different aminoacid residues of PP(dAA) with cellular receptors of various tissues; aminoacid side-chains mk the sensitizer penetration into malignant cells much mor effective; aminoacid derivatives of protoporphyrine are very efficient photosensitizers both In vitro and In vivo: similarly to the protoporphyrin ring they retain high quantum yield of fluorescence (diagnosis) and reveal high efficiency of singlet oxygen generation (therapy); aminoacid derivatives of protoporphyrin also contain double arginine side-chains - this mk them perfectly water-soluble (they can be stored in a dried form - this has its potential for clinical applications). 11. Sl Argininowa Protoporfinyny PP (Arg)2 12. Di-aminokwasowe pochodne Protoporfiryny PP(AA)2(Arg)2 13. Efficiency of destruction (%) of neoplastic cells sensitized by selected PP(dAA)2 Arg2 derivatives (light dose of 150 J/cm2 , = 360-400 nm). PP(Asp)2 Arg2 PP(Met)2 Arg2 PP(Phe)2 Arg2 PP(Ser)2 Arg2 PP(Ala)2 Arg2 HpDArg2 Compound SoTNB2aBT5cMew-132DETAMCFL1M45MTC/c1GRMT/F6 HBT- 39w KBHep-2HelaT-47D --99791009955,1307552845362356 -------9275929510095905 ---9797,198,899,5-50891007989154 95,281,482,59995,698,51006388781007585813 88,280,699,89999,510099,58810089889795752 99,799,899,328,398916083671001008582751 Cell linesNo 1. T-47D -Effusion human 2. Hela - Cervix carcinoma, human 3. Hep-2 - Epidermoid carcinoma larynx, human 4. KB - Epidermoid carcinoma ora, hunian 5. HBT-39w - Breast tumor 6. GRMT/F6 - Mammary tumor from GR mouse 7. M45MT/c1 - Mammary tumor from C3H mouse 8. L1- Sarcoma L1, mouse 9. MCF - Mammary carcinoma female 10. DETA - Colon carcinoma, human 11. Mew-132 - Melanoma, human 12. BT5c - Glioma cells, rats 13. NB2 a - Neuroblastoma, mouse 14. SoT - Bladder carcinoma, human. Celi lines were obtained from : Cancer Center, Warsaw (Poland), Cancer Institute, Wena (Austria), FIBIGER Laboratory (Denmark). 14. Fot. l - 4. Hodowla komrek nowotworowych linii HeLa eksponowanych na protoporfiryn PP(Arg)2 w steniu l O"3 mola/L przez okres l min, 15 min, 30 min i 45 min. Fluorescencj przedstawiono w umownym czerwonym kolorze. Powikszenie 600 x. 15. Fluorcscencja w komrkach nowotworowych EJ-138 po stosowaniu PP(Ala)2(Arg)2 w steniu 1x10-4 mola/L przez 24 godziny in vitro. Powikszenie 600x. Fluoresccncja w komrkach nowotworowych EJ-138 po stosowaniu PP(Ala)2(Arg)2 w steniu 1x10-3 mola/L przez 24 godziny in vitro. Powikszenie 600x. 16. Absorption in noncancer tissue (G5-AS) 17. Melanoma Malignum (G12-KM) 18. MERKEL Ca. (GI-RK) 19. Change of luminescence intensity in tissue with PP(Ala)2 Arg2 (Xexc=380-390 nm, emission 630-690 nm) 20. Fluorescence images of superficial tumors after injection of PP(Ala)2Arg2 a, b - MERKEL, c - MELANOMA, d - CARCINOMA MAMMAE (exc=390 nm, 2 mW/cm2 , emission band 600-680 nm) 21. Raport z bada klinicznych wykonanych w okresie 1996 - 2003 Diagnostyka w rakach krtani i puc Diagnostyka rdoperacyjna, leczenie skojarzone z chirurgi, leczenie stanw nieoperacyjnych Mezothelioma, rak drobnokomrkowy, rak wielkokomrkowy, ziarnicze nacieki w rdpiersiu ALA Sensyphiryna przetoczenia doylne 220 62 Klinika Terakochirurgii Kierownik prof. dr hab. n. med. Stanisaw Jabonka Akademia Medyczna w Lublinie Ca planoepitelialae nosogarda, garda Choandriosarcoma Ca spinocellulare ALA Sensyphiryna 18 Klinika Otolaryngologii Wydzia Stomatologii Akademii Medycznej Kierownik prof. dr hab. n. med. Andrzej Kukwa Warszawa Diagnostyka wczesnych zmian oraz stanw przednowotworowych Diagnostyka zmian wieloogniskowych 124 pacjentki -rak szyjki macicy 29 pacjentek -rak sromu ALA 153 Katedra i Klinika Poonictwa i Ginekologii II Wydzia Lekarski Akademii Medycznej Kierownik prof. dr hab. n. med. Jerzy Stelmachw Warszawa Niemelanotyczne choroby nowotworowe skry i stanw je poprzedzajcych np. rogowacenie soneczne, choroba Bowena, rak podstawno komrkowy i kolczystokomrkowy oraz rogowiak kolczystokomrkowy ALA 210 Klinika Dermatologii Kierownik prof. dr hab. Stanisaw Zabielski Wojskowy Instytut Medyczny Warszawa Nowotwory Merkla, czerniaki, nowotwory sutka, nowotwory jajnika, jelita grubego, prcia, przerzutu do skry PP(Ala): Arg2 Sensyphiryna 50 Klinika Chirurgii Oglnej i Onkologicznej Kierownik prof. dr hab. n. med. Edward Stanowski Wojskowy Instytut Medyczny Warszawa UwagiRodzaj nowotworuFotouczulaczIlo pacjentwNieoczekiwany koniec formuy W piciu Klinikach w latach 1996-2003 stosowano metod fotodynamiczn - 700 razy: 1. do diagnostyki ~370przypadkw 2. w 70 przypadkach do diagnostyki rdoperacyjnej skojarzonej z leczeniem 3. do diagnostyki i leczenia -220 przypadkach - leczenie stosowano do niemelanotycznych nowotworw skry oraz do rnego rodzaju nowotworw z przerzutem do skry jako leczenie paliatywne, lub jako leczenie ostateczne w skutek niemonoci zastosowania innych technik leczenia (nieoperacyjna mezothelioma). 22. Wpyw PDT na ukad immunologiczny Efekt leczniczy uzyskany w wyniku reakcji fotodynamicznej powstaje w skutek niszczenia komrek rakowych w procesie stresu oksydacyjnego oraz szeregu reakcji wtrnych, ktre rwnie prowadz do mierci komrki. Do tych wtrnych nale: zniszczenie naczy krwiononych w guzie i podcielisku guza oraz reakcja ukadu immunologicznego pacjenta. 23. Substancje naczynioaktywne, Skadniki dopeniacza, Kaskada krzepnicia, Biaka fazy ostrej, oraz proteinazy, peroksydazy, substancje chemotaktyczne leukocytw, cytokiny, czynniki wzrostu i inne immunoregulatory. Proces zapalny wywoany reakcj PDT zwizany jest z uwolnieniem szeregu mediatorw takich jak: 24. Antynowotworowa reakcja komrek zapalnych Reakcja immunologiczna na PDT, wywoana czciowym uszkodzeniem komrek w procesie nawietlania, Zmiany wywoane w membranach organelli wewntrz komrkowych, ktre powstaj w czasie reakcji PDT, z uyciem wikszoci fotosensybilizatorw, s przyczyn szeregu reakcji mogcych doprowadzi do mierci komrki po pewnym czasie po zakoczeniu nawietlania. 25. Wystpowanie klonw zaktywowanych komrek nie jest ograniczone tylko do miejsca gdzie nastpia reakcja PDT ale moe obejmowa rwnie rozsiane przerzutowe ogniska tego samego nowotworu. Tak wic chocia leczenie za pomoc PDT jest ograniczone do guza, to jego dziaanie wywouje efekty oglnoustrojowe zwizane z rozwojem reakcji immunologicznej. 26. Aktywacja rnych podgrup limfocytw dotyczy rwnie tych zlokalizowanych w innych tkankach takich jak ledziona, czy gruczoy limfatyczne i dziaa przez pewien czas po zakoczeniu nawietlania. Te zaktywowane przez PDT podgrupy limfocytw posiadaj pewien rodzaj pamici" PDT. W przeciwiestwie do innych terapii antyrakowych moe to wywoywa odporno nawet przeciw mniej immunogennym nowotworom. 27. Najwaniejsz zasad wspczesnych metod stosowanych w leczeniu guzw jest denie do zniszczenia caej populacji komrek nowotworowych tzw. total cell kill. adna jednak ze stosowanych metod nie spenia tego zadania. Jeli zniszczymy mas nowotworow nawet w 99,9 % to przy cakowitej masie guza rwnej 1 g, pozostaje jeszcze okoo 106 yjcych komrek nowotworowych. 28. 1. Szybko podziau komrek nowotworowych. 2. Zdolno komrek do ycia w warunkach braku kontaktu z innymi komrkami. 3. Odporno na leki. 4. Selekcja klonalna. 5. Nagromadzenie mutacji 6. Oddziaywanie komrek z macierz midzykomrkow. 7. Oddziaywanie komrka zdrowa - komrka uszkodzona o charakterze uszkodzenia postpujcego. Efekt kocowy terapii zaley od wielu czynnikw takich jak: 29. W eksperymentach in vitro wykazano wystpowanie oddziaywania midzy komrk nieuszkodzon i uszkodzon wskutek dziaania np. efektu termicznego lub fotodynamicznego. Jest to tzw. efekt przygodnego widza" lub efekt towarzyszcy (bystander effect). 30. Model propagacji uszkodzenia zakada moliwo przekazywania uszkodzenia od komrek uszkodzonych dziaaniem efektu fotodynamicznego do komrek zdrowych, ktre ulegaj uszkodzeniu, a nastpnie przekazuj to uszkodzenie do nastpnych komrek. W badaniach Dahle i wsp (1997, 2000, 2001) wykazano, e efekt ten nie jest specyficzny i wystpuje roznie w rnych liniach komrkowych. Wykazano, e dla fotouczulaczy rozpuszczalnych w wodzie przenoszenie uszkodzenia" zwizane jest z obecnoci fotouczulacza w cytoplazmie i zalene jest od pocze typu GjIC (Gap junction). GjIC - poczenie midzykomrkowe typu Gj 31. RECEPTORY to wyspecjalizowane biaka odbierajce informacje ze rodowiska zewntrzkomrkowego i przekazujce je do odpowiednich elementw efektorowych komrki. Naturalne substancje sygnaowe posiadajce tak budow, e mog si wiza z receptorem nazywamy LIGANDAMI. 32. Ligandy Wizanie si naturalnych ligandw ma charakter kowalencyjny, odwracalny. Niektre syntetyczne ligandy wi si w sposb nieodwracalny. W wyniku wizania si liganda moe doj do pobudzenia lub blokowania receptora. 33. Pobudzenie - blokowanie Pobudzenie nastpuje wwczas, gdy dojdzie do zmiany konformacyjnej biaka receptorowego w efekcie ktrej dojdzie do zmiany procesw metabolicznych komrki, zmiany potencjau bonowego lub ekspresji odpowiednich genw. AGONICI 34. Pobudzenie - blokowanie Blokada nastpuje wwczas, gdy ligand przyczajc si do receptora nie zmienia jego konformacji oraz uniemoliwia naturalnym substancjom sygnaowym poczenie z receptorem i jego pobudzenie. ANTAGONICI 35. Klasyfikacja receptorw Receptory bezporednio zwizane z kanaem jonowym, jonotropowe. Receptory zwizane z ukadem efektorowym poprzez biako G, metabotropowe. Receptory zwizane z enzymem Receptory wewntrzkomrkowe 36. Receptor benzodiazepinowy PBR - Peripherial Benzodiazepine Receptor-wystepuje w rnych narzdach: puca, wtroba, nerki, obwodowy ukad nerwowy. Bierze udzia w steroidogenezie, immunomodulacji, transporcie porfiryn, biosyntezie hemu, administruje aldosteronem, dexametazonem CBR - Central Benzodiazepine Receptor -wystpuje w centralnym ukadzie nerwowym (CNS) 37. PBR PBR to proteina o c.cz. 18 kD zawierajca 169 aminokwasw, posiada wasnoci hydrofobowe i jest bogata w tryptofan. Posiada adunek dodatni o pI=9,6. PBR klonowany dla rnych gatunkw w 80% jest podobny skadem do biaka ludzkiego. Biako to posiada 5 helis uoonych warstwowo tworzc lipidowe biwarstwy. PBR moe tworzy trimeryczny kompleks z 32kD kanaem jonowym (VDAC) oraz z 30 kD nukleotydem adeninowym. PBR oddziauje rwnie z innymi proteinami jak 10 kD PRAX-1, oraz protein o 240 kD, ktra bierze udzia w oddziaywaniu proteina-proteina. 38. Czynniki wpywajce na ekspresj PBR Catecholaminy reguluj gsto PBR w szyszynce, lecz nie w miniu sercowym Zarwno hypo- jak i hypertyroidyzm wpywa na ekspresj PBR w sercu, nerkach, wtrobie i jdrach Rwnie interleukiny, dopamina, serotonina i norepinerfina s modulatorami PBR i wpywaj na jego ekspresj stany neuropatologiczne takie jak stres, padaczka, encefalopatia Wernicka, choroba Alzheimera, choroba Huntingtona, urazy, wpywaj na zmian ekspresji PBR 39. Rola PBR w komrkach nowotworowych Gsto receptora PBR mona modulowa poprzez leki (furosemid zwiksza gsto PBR). Najwiksz gsto receptorw PBR maj komrki tkanek nowotworowych. Nowotwory jajnika, wtroby, jelita, gruczolakoraki oraz glejaki wykazuj wzrost gstoci PBR proporcjonalnie do zaawansowania choroby. W wielu wypadkach ekspresja PBR jest skorelowana ze zoliwoci nowotworu i pozwala mwi o moliwoci i szybkoci proliferacji. Odnosi si to w szczeglnoci do nowotworw sutka, jajnika i wszystkich nowotworw hormonozalenych. PBR bierze udzia w proliferacji komrek w postaci kompleksw z ligandami: PK 11195 i Ro5-4864 oraz porfirynami PK 11195-karboksyamidoizocholina 40. PBR w PDT Biaka biorce udzia w powstawaniu przepuszczalnoci bonowej: PT(pore) -permeability transition pore, kinaza kreatynowa, transfaktor nukleotydu adeninowego (ANT), cyklofilina D, obwodowy receptor benzodiazepinowy PBR i kana jonowy napiciowo-zaleny (VDAC). PDT uszkadzajc heksokinaz moe inhibitowa fosforylacj glukozy, hamujc proces glikolizy, uposledzajc gwny szlak metaboliczny w komrce. Fotosensybilizator musi by zwizany z heksokinaz, za ta musi by zwizana z PBR w PT(pore) 41. PBR w PDT PBR jest wraliwy na PDT poniewa transportuje cholesterol do matrycy mitochondrialnej, gdzie jest zuywany do syntezy steroidw, a pochodne porfirynowe atwo si z nimi wi. Verma wykaza, e komrki zawierajce zwikszone stenie PBR s bardziej wraliwe na PDT ni komrki zdrowe. 42. Wpyw ligandw PBR na komrki nowotworowe indukcja apoptozy poprzez otwieranie PT(pore) zatrzymanie cyklu komrkowego w fazie G1 zwikszaj efektywno cytostatykw inhibituj biako Bcl-2, HA 14-1 niektre ligandy powoduj aktywacj kaspazy 9 i produkcj ROS, tumienie aktywnoci biaka Bcl-2 i translokacj Bax do mitochondriw uwalnianie z mitochondriw cytochromu C. Przy aktywacji kaspazy 9 nie obserwuje si obnienia potencjau bony mitochondrialnej 43. Wizanie PP IX do PBR 1040,00 1060,00 1080,00 1100,00 1120,00 1140,00 1160,00 1180,00 1200,00 1220,00 0 0,00005 0,0001 0,00015 0,0002 stenie Biaka [mg/ml] Fluorescencja[j.u.] 44. Reasumujac mozna powiedziec, e w swietle dostepnych badan na dzien dzisiejszy terapia fotodynamiczna nie dziala tylko miejscowo w miejscu stymulacji swietlnej ale ma skomplikowane dzialanie oglnoustrojowe. 45. LITERATURA 1 N. L. Oleiniek, R. L. Morris, I. Belichenko The role of apoptosis in response to photodynamic therapy, what, where, why, and how.; Photochemical and Photobiological Sciences 2002 vol1 nr 1 s 1-21 (rev) 2 Mladen Korbelik, Jinghai Seen, Ivana Cecik Photodynamic therapy- induced cell surface expression and release of heat shock proteins: Relevance for tumor response.; Cancer Res. 2005 (3) nr 1018-1026 3 Z. Tong, G. Singh, K. Valeric, A. J. Rinbow Activation of the stress- activated INK and p38 MAP kinases in human cells by Photofrin - mediated photodynamic therapy J. Photochem. Photobiol. Ser Biol 2003, 71, 77-85 4 S. Herman, J. Klaechman, U. Gafter, B. Sredni, Z. Malik Photofrin II induces cytokine secretion by mouse spleen cells and human peripheral mononuclear cells Immunolopharmacology 1996, 31, 195-204 5 A Verma, J. S. Nyc, S. H Smyder Porphyrins are endogenous ligands for mitochondrial (peripheral- type)benzodiazepine receptor Proc. Natl. Acad. Sci. 1987, 88, 2256-60 6 M. Mesenhller, E. K. Matthews A key role for the mitochondrial benzodiazepine receptor in cellular photosensitisation with 5-aminolevulinic acid European Journal of Parmocology 2000, 406, 171-180 7 K,. Frei, H.M. Bonel, H. Frick, H. Walt, R. A. Steiner Photodynamic detection of diseased axillary sentinel lymph mode after oral application of aminolevulinic acid in patients with breast cancer Brit. Journ. Of Cancer 2004, 90, 805-809 8 M. Kwitniewski, D. Kunikowska, B. Dera-Tomaszewska, E. Tokarska-Pietrzak, H. Dziaduszko, A. Graczyk, R. Gonicka Influence of diamino acid derivatives of porphyrin IX on mouse immunological system: Preliminary results J. Photochem. Photobiol. Ser Biol 2005 81 129-135