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Detección de los Patógenos I METODOS DE ANALISIS
M.Cs. Mercedes Iriarte P. CASA – UMSS
Enumeración de Microorganismos
• Medidas cuantitativas • Cualitativo (presence/absence)
• Para Bacteria: CFU=Unidad Formadora de Colonia
• Para Viruses: PFU =Unidad Formadora de placa
• Para Parásitos (y algunas bacterias) conteo celular
usando microscopia
• MPN : Número Más Probable (método estadístico para estimar las concentraciones con múltiples ensayos en diluciones para la extinción [0])
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Medida del crecimiento microbiano
• Métodos indirectos
– Actividad metabólica
– Peso seco
– Turbiedad
Cultivo/Métodos estandar para la detección de patógenos en el medio ambiente
• Virus
– Concentración/separación
– Cultivo celular (una linea celular, no detecta todas)
– Identificacion por PCR
• Bacteria
– Concentración/separación
– Medio de enriquecimiento
– Medio selectivo
– Test Bioquímico, serologia, immunoquímica
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BACTERIAS EN UNA PLACA EN AGAR COLONIAS FORMANDO UNIDADES UFC
Bacterias necesitan incubación para formar UFC en 24 a 48 horas
Salmonella, E. coli, Staphylococcus aureus, Streptococos faecalis
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Métodos basados en el crecimiento: Organismos
indicadores fecales para medida de la calidad del agua
Coliformes fecales
En agar y colonias
por FM
E.coli en agar y
colonias por FM
Coliformes
totales
NMP
Filtración de
100 ml de
muestra de
agua
Total coliforms
En agar y colonias
por FM
E.coli
NMP
Número Mas Probable
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cccc
Coliformes totales
Coliformes
termotolerantes
INDICADORES CLASICOS DE CONTAMINACION
Relación entre coliformes totales, termotolerantes y E. coli
Escherichia coli
Métodos de coliformes Totales
Método de filtración por membrana (FM) - Un total de 100 ml
de muestra en uno o más filtros; por ejemplo, 1 filtro con
100 ml ó 4 filtros con 25 ml cada uno.
Método de fermentación en tubos múltiples (FTM) o del
número más probable (NMP) - 10 tubos con 10 ml cada uno
ó 5 tubos con 20 ml cada uno.
Método de presencia-ausencia (PA) - 100 ml en 1 botella.
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VENTAJAS DEL MÉTODO DE FILTRACIÓN POR MEMBRANA
Proporciona recuentos directos.
Es más preciso (se obtienen resultados más
reproducibles) que la prueba de TM o NMP.
Rápido y fácil de realizar.
Analiza mayores volúmenes de muestras con bajas concentraciones de organismos.
DESVENTAJAS DEL MÉTODO DE FILTRACIÓN POR MEMBRANA
Interfieren los altos niveles de turbiedad.
Los coliformes debilitados pueden sobrevivir
mejor en la prueba de TM o NMP.
Las altas concentraciones de no coliformes
interfieren en el recuento.
Efecto del tipo de filtro de membrana.
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Métodos rápidos: Colilert (Ausencia/Presencia)
• Su formulación es específica para crecimiento de coliformes y
E. coli en agua dulce o tratada. Está basada en la tecnología de
substrato definido (DST).
• Enzima ß-galactosidasa. Bacteria coliforme metabolizará al
ONPG formando una coloración amarilla.
• E. coli - enzima ß-glucoronidasa. Si está presente en la
muestra, metabolizará al MUG, produciendo fluorescencia.
Conteo directo al microscopio
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CRECIMIENTO DE VIRUS EN CULTIVO CELULAR CELULAS no infectadas y células en tejido de mono
infectadas
Crecimiento puede tomar varias semanas para algunos virus
FAGOS (colifagos)
Microfotografía electrónica
Siembra en placa en agar
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INFECCION DEL VIRUS UNIDAD FORMADORA DE PLACA PFU CULTIVO CELULAR, CON AGAR DE RECUBRIMIENTO TEÑIDO PARA MOSTRAR DONDE HAY LISIS CELULAR
Metodos para la Detección de Patógenos
• Protozoarios
• Concentración o elución
• Purificación
• Centrifugación diferencial
• Separación Inmuno Magnetica
• Tinción con anticuerpos monoclonales
• Observación bajo la luz UV
• Observación de características
• Forma y tamaño
• Estructuras internas
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Volumen (típico) de muestra de agua
• Bacterias indicadoras y patogénicas • 100 to 1000 ml
• Viruses • Aguas negras 1-5 litros • Residual tratada 40 litros • Agua superficial 400 litros • Aguas subterraneas y de bebida 400 a
2000 litros
• Protozoarios • Residual tratada 4 liters • Agua superficial 10 a 100 litros • Agua de consumo 10 a 100 litros
Concentración de viruses del agua
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Elución de los virus, reconcentracion, filtracion de bacterias, tratamiento con antibióticos, listo para qPCR o cultivo celular
1M
DS
filte
r
Cartri
dge
housin
g
1.5% beef
extract
(pH9.5)
Viral particles
were eluted
from 1MDS
filter using
1.5% beef
extract (pH 9.5)
Dr, Xagoraraki, MSU
Sample/retentate reservoir
Ultrafilter (MWCO 30kDa)
Peristaltic pump
Filtrate/waste
Retentate
Feed
sistema de ultrafiltración de bajo costo con filtros de fibra porosa desechables - De exclusión por
tamaño
- Amplia gama de
virus se puede
recuperar en una
única muestra de
agua
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Muestreo de aerosol • Impingers • Impact- Anderson
Aerosol • Filters • High volume fluid
samplers • Electrostatic
participators • Settling plates
• Efficacy affected by
• Collection media • Relative humidity • Desiccation
Tipos de Fómites
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Algodón Laminado Dinero Poliéster
Cerámica Acrílico Acero Inox Vidrio
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Muestreo de Fómites
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A: Sample
B: Filter inlet
C: Filter outlet
D: Peristaltic pump
E: Flow meter
F: To waste
Graphic representation of the primary concentration step
Cryptosporidium y Giardia del agua
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Giardia y Cryptosporidium
- EPA 1623 (EPA 2005), kit Dynabeads GC-Combo de Dynal Biotech, tinción IFA (Cryptosporidium/Giardia de Merifluor)
concentración
- Separación inmunomagnética
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Separación Inmunomagnética de Cryptosporidium parvum oocysts
oocysts IMS beads captured oocysts
Perlas: superparamagnético, recubierto con una cubierta de polímero delgada (contenido de hierro: 20%)
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Observación al microscopio de epifluorescencia
Quistes de Giardia sp.
Ooquistes de Cryptosporidium sp.
Las estructuras son marcadas con anticuerpos específicos con marcadores fluorescentes
Conteo al microscopio de quistes de parásitos Giardia y ooquistes de Cryptosporidium. Microscopio de fluorescencia. Estados medioambientales
Huevos de helmintos
• Método modificado en el Centro de Aguas y Saneamiento Ambiental bajo la versión del Estándar Métodos de México (Secretaria de Comercio y Fomento Industrial 1999).
- Comprende: Procesos de coagulación, sedimentación, flotación, decantación y técnica bifásica (para recuperar los huevos y realizar el conteo).
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Procedimiento: - sedimentación (8 hrs. o una noche)
- Eliminación del sobrenadante
- Centrifugación
- Lavados sucesivos
- Lavado a través de tamices de diferentes tamaños
• Homogenización del concentrado
• ZnSO4.7 H2O (etapa
bifásica)
• Limpieza de la muestra
• Lavado a través de un tamiz de 160 µ
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• Lavados sucesivos a través de tamices
ayuda con una brocha
suave.
- Viabilidad: incubación de la muestra tratada por 15 dias a 25°C
Observación al microscopio
•
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