Curso 2017

Marcadores Moleculares

Esteban Hopp

Departamento de Fisiología, Biología Molecular y Celular Facultad de Ciencias Exactas y Naturales

Universidad de Buenos Aires

Marcadores Morfológicos

Fenotipos que resultan de mutaciones en el ADN

Tomado de “The Cartoon Guide to Genetics”, Larry Gonick, Marck Wheelis

¿Qué son los

marcadores

genéticos?

Gregor Mendel

(Moravian Museum, Brno)

• El concepto de marcador surge con

los trabajos de Mendel:

Utilizó los colores de las flores (y otros caracteres

morfológicos) como marcadores que le permitieron

estudiar los patrones de la herencia

Jardín del monasterio donde Mendel realizaba

sus experimentos con las arvejas

Tomado de: Griffiths et al., An Introduction to Genetic Analysis, 2000.

• Permiten establecer diferencias (polimorfismos) entre

dos individuos diferentes (genotipos) pertenecientes a la

misma especie (o a especies emparentadas).

• Su herencia suele responder a las leyes de Mendel.

• Los primeros marcadores utilizados fueron los de tipo

morfológico (fenotípicos), por ejemplo, color de la flor.

• Permiten la confección de mapas genéticos o de

ligamiento.

• Son puntos de referencia ubicados en los cromosomas.

¿Qué son los

marcadores

genéticos?

¿Puede un marcador genético ser fenotípico y

genotípico?

Fenotípicos: los polimorfismos de los genes se detectan a través de sus productos - Morfológicos: por ejemplo, color de flor - Bioquímicos: básicamente perfiles electroforéticos

de isoenzimas y de proteínas de reserva Genotípicos o moleculares: Los polimorfismos de genes u otras secuencias no codificantes se detectan a nivel del ADN

- Restricción + hibridación molecular (ejemplo, RFLP) - Amplificación por PCR (ejemplo, RAPD y microsatélites) - Restricción + PCR: (ejemplo, AFLP) - (re)Secuenciación directa, indirecta o parcial (SNP/GBS)

Tipos de

marcadores

genéticos

TIPOS DE MARCADORES:

“Neutros” Random DNA Markers (marcadores al azar)

derivados de cualquier parte del genoma,

fenotípicamente neutros (teóricamente asumidos

como tales para los programas bioestadísticos)

“Funcionales” Functional Markers (marcadores

funcionales)

sitios polimórficos dentro de genes afectando

causalmente la variación del carácter fenotípico.

Surgen como marcadores moleculares de las

regiones transcriptas/expresadas del genoma

Pueden no ser genotípicos: por ej el período de

aparición de moléculas defensivas (biomarcadores)

Para:

• Identificación (genotipificación) de hospe-

dantes o de patógenos

• Mapeo de genes y QTLs de resistencia

• Selección asistida por marcadores

• Clonado posicional de genes basado en mapa

• Estudios de variabilidad/diversidad genética en distintas

especies (plantas y fitopatógenos), germoplasma, identificación

de genotipos indicadores, etc

¿Para qué queremos usar

MM?

Volvamos a esta figura

Comparación

entre

marcadores

morfológicos

y moleculares

Marcadores

morfológicos

Influencia del ambiente

Bajo número

Baja cobertura del genoma

Bajo nivel de polimorfismo

Menos informativos

(dominantes o recesivos)

Caracteres de madurez

Entrenamiento y subjetividad

Sin influencia ambiental y

neutros

Cantidad ilimitada

Amplia cobertura del genoma

Alto nivel de polimorfismo

Más informativos

(en general codominantes)

Análisis en fases tempranas

Sencillos, rápidos y objetivos

Marcadores

moleculares

Sin embargo…. Hoy en día, a los morfológicos los empezamos

a llamar fenómicos

Mapa genético de tomate basado en marcadores morfológicos

Tomado de: Griffiths et al., An Introduction to Genetic Analysis, 2000.

• Isoenzimas

Grupo de múltiples formas moleculares de una misma

enzima presente en una misma especie, como resultado

de la presencia de uno o más genes que codifican cada

una de estas formas.

Las que son relevantes como marcadores genéticos son

las aloenzimas (o alozimas) que son variantes alélicas

del mismo gen (o locus) y que presentan una migración

electroforética diferencial.

Marcadores

bioquímicos:

isoenzimas

Ejemplo:

detección de

isoenzimas

de maíz

F isomerasa

Identificación de variantes isoenzimáticas. Se observan genotipos

homocigotas y heterocigotas para diferentes alelos en una población de

maíz analizada para dos loci isoenzimáticos (MDH y F isomerasa), lo que

revela la existencia de polimorfismos dentro de la misma.

Malato deshidrogenasa (MDH)

Gentileza de Instituto Nacional de Semillas, Argentina.

Perfiles electroforéticos de proteínas de reserva

de distintas variedades argentinas de avena.

Marcadores

bioquímicos:

Proteínas de

reserva

Gentileza de Instituto Nacional de Semillas, Argentina.

¿Se siguen usando?

¡Sí! Para registro y protección de variedades

comerciales

Marcadores

bioquímicos

Aunque tienen

algunos problemas

con el sindicato de

geles

Marcadores

genotípicos o

moleculares

basados en

la restricción

enzimática

del ADN Marcadores moleculares RFLP

Restriction Fragment Length Polymorphism

(polimorfismo de longitud de fragmentos

de restricción)

Mutaciones puntuales:

Ocurren en sitios de restricción.

Mutaciones estructurales:

Ocurren mediante inserciones, deleciones y rearreglos.

Origen del

polimorfismo

de los RFLPs

Adaptado de: Ferreira and Grattapaglia. Introdução ao uso de marcadores moleculares em análise genética, 1995.

Análisis utilizando RFLPs de los bulks resistente (R) y susceptble

(S) al virus PVX de Solanum commersonii empleando las enzimas

de restricción HinfI, DdeI, HindIII, DraI, EcoRI, XbaI y StyI (1 al 7).

Autoradiografía de los perfiles de RFLP obtenidos empleanado

la sonda s1+A/as1+T(584) marcada con radioactividad.

Perfiles de

RFLPs de

Solanum

commersonii

• Presentan bajo nivel de polimorfismo (en

comparación con otros marcadores

moleculares).

• Se requiere disponer de sondas específicas

para la especie en estudio.

• La utilización de radiactividad introduce altos

costos y problemas de bioseguridad.

• Requieren alta cantidad de DNA.

El procedimiento es laborioso y lento.

• ¡¡¡¡¡¡¡OBSOLETOS!!!!!!

Desventajas

de los RFLPs

Marcadores

moleculares

basados en la

amplificación

arbitraria

(o semi-

arbitraria)

del ADN Random Amplified Polymorphic DNAs

(polimorfismo de ADN amplificado al azar)

Marcadores moleculares RAPD

RAPDs Amplificación de ADN anónimo

con iniciadores de secuencia arbitraria

No permiten distinguir el heterocigota del homocigota dominante

Los RAPDs son marcadores genéticos dominantes

• La herencia es dominante (menor información

genotípica).

• Poseen problemas de

reproducibilidad.

• La interpretación de bandas presenta

dificultades.

• A medida que la distancia filogenética

aumenta, también aumenta la probabilidad de

que dos fragmentos de ADN diferentes

comigren y se cometan errores de cómputo

(no son confiables para comparación entre

especies distintas).

• Sólo se puede computar presencia compartida

de bandas y no la ausencia.

Desventajas

de los RAPDs

Amplified Fragment Length Polymorphism

(polimorfismo de longitud de fragmentos

amplificados)

Marcadores moleculares AFLP

Marcadores

moleculares

basados en la

amplificación

arbitraria

(o semi-

arbitraria)

del ADN

Procedimiento

para la

obtención

de AFLPs

AFLP fluorescentes

Detección de AFLPs usando durante la última etapa de amplificación iniciadores fluorescentes, resolviendo los fragmentos en un secuenciador

ABI3130XL

• Herencia dominante.

• Bajo contenido de información

genética por locus.

• Procedimiento medianamente

laborioso.

• Costo medio.

• Tecnología patentada (no es de

libre utilización).

Desventajas

de los

AFLP

Microsatélites

Repeticiones en tándem de secuencias cortas de

DNA de 1 a 10 pb de longitud

Ejemplos:

(GA)14

...GAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGA...

(GAT)10

...GATGATGATGATGATGATGATGATGATGAT...

(CATC)8

...CATCCATCCATCCATCCATCCATCCATCCATC..

Sinónimos: SSLP, SSRP, SSR o STMS

Microsatélites

5’...TGACAGTGGGTCACGACTTGAGCCAGTCGTAGCTTGATGATGATGATGATGATGATGATGATGATGATGATGATGATGATGACTCAGTGTGACGCTAGTCGGGTAGTAGCGA...3’

3’...ACTGTCACCCAGTGCTGAACTCGGTCAGCATCGAACTACTACTACTACTACTACTACTACTACTACTACTACTACTACTACTGAGTCACACTGCGATCAGCCCATCATCGCT...5’

16 repeticiones

5’...TGACAGTGGGTCACGACTTGAGCCAGTCGTAGCTTGATGATGATGATGATGATGATGATGATGATGATGATGATGATGATGACTCAGTGTGACGCTAGTCGGGTAGTAGCGA...3’

3’...ACTGTCACCCAGTGCTGAACTCGGTCAGCATCGAACTACTACTACTACTACTACTACTACTACTACTACTACTACTACTACTGAGTCACACTGCGATCAGCCCATCATCGCT...5’

5’ GTGGGTCACGACTTGAGCCAGTCGTAGCTTGATGATGATGATGATGATGATGATGATGATGATGATGATGATGATGACTCAGTGTGACGCTAGTCGGGTAGTAGC 3’

3’ CACCCAGTGCTGAACTCGGTCAGCATCGAACTACTACTACTACTACTACTACTACTACTACTACTACTACTACTACTGAGTCACACTGCGATCAGCCCATCATCG 5’

105 pb

iniciador

CTGCGATCAGCCCATCATCG 5’

5’ GTGGGTCACGACTTGAGCCAG

iniciador

PCR con iniciadores específicos

Producto de amplificación obtenido

Electroforesis en gel de poliacrilamida

desnaturalizante

Origen del polimorfismo de los microsatélites

Microsatélites en diploides

1

2

3

1 2 3

(+)

Los microsatélites son marcadores codominantes

Ejemplo: variedades de soja (Glycine max)

analizadas mediante SSR

Patrones obtenidos para 43 variedades de soja. Gel de poliacrilamida teñido con plata.

Gentileza Dra. S. Giancola.

Métodos de separación / detección

Agarosa/bromuro de etidio Poliacrilamida / nitrato de plata

Gentileza Lic. V. Nishinakamasu y Dra. N. Paniego

Gentileza Lic. P. Talia y Dra. N. Paniego

Radiactividad

Gentileza Lic. V. Nishinakamasu y Dra. N. Paniego

Fluorescencia

Tomado de : www.fsl.orst.edu/ tgerc/risk.htm

Marcación de marcadores moleculares con fluoróforos

Empleo de

secuenciador

automático

Homocigota alelo 1

Pico 147-149 pb

Homocigota alelo 2

Pico 153-155 pb

Heterocigota:

ambos alelos

Electroferogramas para 3 genotipos de sorgo

Gentileza Téc. L. Fernández

• Polimorfismo muy elevado (multialélicos)

• Enorme número de loci

• Herencia mendeliana codominante

• Interpretación sencilla de los resultados

• Reproducibilidad muy alta

• Resultados transferibles entre laboratorios

• Automatización

Ventajas

de los

microsatélites

• Se requiere conocer la secuencia nucleotídica

involucrada alto costo para desarrollar los primers

(oligonucleótidos iniciadores)

- Inicialmente lentos

- Inicialmente costosos

• Unilocus (aunque pueden hacerse multiplex)

• Alta tasa de mutación que puede afectar la

reproducibilidad en estudios genealógicos.

Desventajas

de los

microsatélites

SNP + (re)secuenciación

(ej. GBS)

• Diversidad nucleotídica: 90% de la variación del

genoma en cualquier organismo

• En general son bialélicos, aunque por definición

puede haber 4 variantes

• Ubicuos: pueden estar en cualquier región del

genoma

• Se encuentran cada 100 a 300 pb

• Estables

• Pueden ser funcionales si están en regiones

codificantes.

• Fáciles de procesar bioinformáticamente

SNPs Indels (Insertions/Deletions)

Caracterís-

ticas de los

SNPs

Ventajas y

desventajas

de los

marcadores

SNP

• Ventajas:

- Baja tasa de mutación (mayor estabilidad que los SSR)

- Muy abundantes

- Fáciles de analizar por métodos bioinformáticos

- Desarrollo continuo de nuevas metodologías analíticas

para su detección

- Simplificación de los estudios comparativos cruzados.

• Desventajas: - En la mayoría de los métodos, se requiere conocer la

secuencia nucleotídica involucrada

- Costosos de aislar y caracterizar (secuenciación)

- Bajo contenido de información para un único SNP

Técnicas para la detección de SNPs

Costo

Sensibilidad

Especificidad

Número de muestras a analizar

Posibilidad de automatización

Equipamiento necesario

Dificultad del ensayo

Intensa actividad comercial en este área

Detección

de SNPs:

métodos

de análisis

Métodos para pocas muestras (diagnósticos)

para uno o pocos loci

PCR de tiempo real

Secuenciación por Sanger

Métodos de análisis masivo de todo el

genoma

Microarreglos de DNA

Nanotecnología

Secuenciación en paralelo por NGS

Detección

de SNPs:

métodos

de análisis

PCR en tiempo real: sistema TaqMan Detección

de SNPs:

métodos

de análisis

Detección

de SNP

empleando

sondas

TaqMan®

para cada

alelo

Química de la discriminación alélica

La sonda sólo hibrida con la secuencia blanco si existe complementariedad

perfecta de bases. Así, la sonda marcada con FAM sólo reconoce al alelo 2 (AT)

y la sonda marcada con VIC sólo reconoce al alelo 1 (GC). Ambas sondas se

colocan en la misma reacción de PCR y, de acuerdo con el alelo presente, se

obtienen señales fluorescentes para uno u otro fluorocromo. En un individuo

heterocigota se puede detectar la señal correspondiente a ambos alelos.

Fig. 1 Example of intraspecies polymorphism of the ITS. The part of sequences of two different clones of

M. bovis (a, b) and Mycoplasma conjunctivae (c, d) are present.

Appl Microbiol Biotechnol (2006) 71: 680–698. Sequence of the intergenic 16S-23S rRNA spacer (ITS) regionof

Mollicutes species and their identification using microarray-based assay and DNA sequencing.

Métodos para pocas muestras (diagnósticos)

PCR de tiempo real

Secuenciación por Sanger

Métodos de análisis masivo

Microarreglos de DNA

Nanotecnología

Secuenciación en paralelo por NGS

Detección

de SNPs:

métodos

de análisis

¡En la práctica es una resecuenciación!

Appl Microbiol Biotechnol (2006) 71: 680–698. Sequence of the intergenic

16S-23S rRNA spacer (ITS) regionof Mollicutes species and their

identification using microarray-based assay and DNA sequencing.

Nanotecnología

Unión de un clon a una microesfera

PCR en emulsión

Análisis de fragmentos fluorescentes amplificados mediante una PCR alelo-específico

multiplexada.

R Tuberosa. 2nd National Workshop on Marker-Assisted Selection for Crop Improvement . ICRISAT

Genotipificación Marcadores moleculares tradicionales de (SSR, RFLP, AFLP, etc):

- Bajo rendimiento o low- throughput: número de marcadores

alrededor de 100.

- Desarrollo y descubrimiento es costoso y requiere de tiempo

- SSRs son especie específicos.

- Baja capacidad de multiplexado.

“The ideal molecular approach for population genomics should uncover

hundreds of polymorphic markers that cover the entire genome in a

single, simple and reliable experiment. Unfortunately, at present there is no

such approach.” Luikart et al 2003

(Davey et al, 2011)

SNP arrays de alto rendimiento

- High throughput: pero “solo” miles de marcadores

- La producción de una matriz de alta calidad requiere una

inversión sustancial de los recursos.

- Conocimiento previo de secuencias.

- Específicos de la población con la que los desarrollaron.

- Evaluación de uno o dos individuos a la vez.

NGS marker discovery and genotyping methods

- High throughput: miles a cientos de miles de marcadores

- Descubrimiento o desarrollo de nuevos marcadores

- Secuenciación y genotipificación simultánea

- Decenas o centenas de individuos

- Sin conocimiento previo de secuencias

En un sólo

ensayo!

Genotipificar en la era del NGS

Cómo reducir costos secuenciando

solo lo necesario Para estudios de poblaciones:

Resecuenciación de genomas:

Especies con genoma de referencia:

• Secuenciación del genoma a baja profundidad (<30X) para descubrir

SNPs en muchos individuos es costosa e innecesaria.

Especies sin genoma de referencia:

• La secuenciación y ensamblado del genoma de un individuo de novo es

un gran desafío, y costoso.

Genotipificar reduciendo la representación:

•Secuenciar sólo la región de interés de cada individuo: menor costo

•Más sencillo el análisis bioinformático de datos

•Menor tiempo

•Para especies con o sin genoma de referencia

Restriction site-associated DNA sequencing (RAD-Seq) (Baired

et al., 2008)

Reduce Representation Libraries (RRLs)

Complexity reduction of polymorphic sequences (CRoPS)

Restriction fragment sequencing (RESTseq)

Multiplexed shotgun genotyping (MSG)

EzRAD

Sequence-Based Genotyping (SBG)

2b-RAD

Genotyping by Sequencing (GBS) (Elshire et al., 2011)

Más populares:

Double digest Restriction site-associated DNA sequencing

(ddRAD-Seq) (Peterson et al., 2012)

1. Digestión de ADN genómico de muchas muestras

2. Selección o reducción de los fragmento de PCR resultantes

3. NGS del subconjunto de fragmentos (< a 1000pb)

Los polimorfismos de los fragmentos secuenciados se utilizan como marcadores moleculares.

Pasos en comunes a todos los protocolos

RADseq

Digestión

Ligación adaptadores-index

Pool

Corte al azar

Selección de tamaños

Ligación adaptadores Y

PCR

Lectura SE (50pb)

GBS

Digestión

Ligación adaptadores-index

Pool

PCR

Lectura SE 86pb (48 o 96plex en

GA)

RADSe

q

GBS

Truong HT, et al. (2012) Sequence-Based Genotyping for Marker Discovery and Co-Dominant Scoring in Germplasm and Populations.

PLoS ONE 7(5): e37565. doi:10.1371/journal.pone.0037565

ddRAD-Seq

Digestión doble

Ligación adaptadores-

barcode

Pool

Selección de tamaños

PCR-index

Lectura PE 125pb

• Elimina el corte por azar

- Se reduce 5 veces el costo de preparación de libraries en comparación con RAD-Seq

• Size Selection preciso

- Reduce duplicados de las regiones a secuenciar

- Profundidad de lectura similar entre individuos en cada región del genoma

ddRAD-Seq

GBS:

bioinformática

para la

identificación y

anotación de

marcadores

asociados

MEJORAMIENTO VEGETAL - TECNICAS CLÁSICAS

OBJETIVOS a) Obtener un mayor rendimiento agronómico b) Mejorar la calidad del producto c) Aumentar la seguridad de cosecha CARACTERÍSTICAS GENERALES a ) Acumulativo: las nuevas mejoras se suman a las anteriores

b) Continuo: debido a que siempre se exige más – cambios de hábitat – cambios en las técnicas de cultivo – cambios en los mercados compradores – cambios en las poblaciones de fitopatógenos

c) Competitivo: las nuevas variedades deben superar a las ya difundidas (ensayos comparativos de rendimientos — ECR) CONSIDERACIONES RESPECTO DE LA ESPECIE Y EL CARÁCTER A MEJORAR a) Modo de reproducción (alogamia, autogamia o agamia). Biología floral, sistemas de autoincompatibilidad, etc. b) Cantidad de genes y momento de expresión. c) Tiempo por generación d) Número de cromosomas y nivel de ploidía e) Otros: Condiciones de crecimiento, resistencia a enfermedades, etc.

Genética cuantitativa clásica Generación parental

Progenie

Ganancia

Diferencial de

Selección Parentales

seleccionados

Selección masal

DOMESTICACIÓN del TOMATE y el MAÍZ

Selección masal

F2

P2

F1

P1 x

Grandes poblaciones segregantes con

miles de recombinantes

SELECCION FENOTÍPICA

Mejoramiento convencional

Resistencia a estrés hídrico Resistencia a enfermedades Deficiencia nutricional

Diapositiva del IRRI Tomado de Bert Collard & David Mackill

Los métodos de

mejoramiento se

basan en los mismos

fundamentos

conceptuales que los

vistos en Genética I

F2

P2

F1

P1 x

Grandes poblaciones segregantes con

miles de recombinantes

SELECCION FENOTÍPICA

¿Y qué es lo moderno?....... Repasemos: mejoramiento convencional

Resistencia a estrés hídrico Resistencia a enfermedades Deficiencia nutricional

Diapositiva del IRRI

F2

P2

F1

P1 x

Grandes poblaciones segregantes con

miles de recombinantes

Resistente Susceptible

Selección asistida por Marcadores Moleculares (MAS)

Mejoramiento asistido por marcadores

En este esquema, la selección “fenotípica” se basa en marcadores

moleculares

Diapositiva del IRRI Tomado de Bert Collard & David Mackill

Ventajas del MAS • Método más sencillo

- comparado con la selección fenotípica si la evaluación de la característica fenotípica es laboriosa o compleja (recesiva, epistática, compleja como contenido de proteínas)

• La selección se realiza a nivel de plántula

– Importante para características como calidad del grano

• Aumenta la confiabilidad

– Se independiza de efectos ambientales

– Permite discriminar entre homcigotas y heterocigotas y seleccionar plantas individuales

Desventajas II

• Recursos

– Equipamiento, personal calificado

• Costos!!!!

• Conocimiento de los caracteres a seleccionar (posición en el mapa genético: disponer de marcadores ligados)

¿Cómo hacemos para mapearlos?

Identificación de regiones genómicas asociadas a caracteres de interés

Diapositiva gentilmente cedida por Ing. Gabriela Pacheco

Mapeo de QTLs

Mapeo de QTLs

Mapeo de Asociación y Genome-Wide Association Studies (GWAS)

Diapositiva gentilmente cedida por Ing. Gabriela Pacheco

DL

• Desequilibrio de ligamiento

Las flechas indican marcadores con asociación estadística significativa

Mapeo por asociación •Estrategia alternativa al mapeo de ligamiento.

•Ambos detectan asociaciones entre genotipos y fenotipos basados en la coheredabilidad de polimorfismos.

Mapeo de ligamiento Mapeo por asociación

Zhu 2008

•Parentales con fenotipo contrastantes para el carácter •Número limitado de eventos de recombinación •Baja resolución (pero mayor probabilidad de encontrar marcadores ligados)

•Población natural •Múltiples eventos de recombinación debido a la historia de la población •Alta resolución (pero menor probabilidad de encontrar marcadores ligados)

Mapeo por Asociación para la Podredumbre Húmeda del Capítulo en girasol

Evaluación fenotípica (Y)

• Se evaluó la incidencia de PHC en cada ensayo y se obtuvo la media ajustada para cada línea endocriada.

• Las LE se comportaron de manera diversa frente a la enfermedad.

• 52% de las líneas mostraron un comportamiento intermedio frente a PHC.

Y = G + Q ó P/K + E

Analisis estadístico Alelos asociados

Y = G + Q ó P/K + E

500

1000

Inci

de

nce

Candidate gene haplotypes

Un haplotipo de RhoBP_B mostró asociación significativa con una menor incidencia de PHC.

•Las estructura del gen RhoBP_B está caracterizada por 4 exones y 3 intrones.

•El genotipo 3:3 amplifica un fragmento de mayor tamaño.

RhoBP_B se ubicó en el GL11

¿Cómo se hace un GWAS/EWAS?

GWAS (Manhattan Plot) Esclerosis sistémica en humanos

Radstake y col. 2010