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ESPECTROSCOPIA UV-VISIBLE • FUNDAMENTOS • INSTRUMENTACION • FUNCIONAMIENTO • APLICACIONES

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ESPECTROSCOPIA UV-VISIBLE

• FUNDAMENTOS

• INSTRUMENTACION

• FUNCIONAMIENTO

• APLICACIONES

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FUNDAMENTOS

• La espectroscopia UV-Vis está basada en el proceso de absorción de la radiación

ultravioleta-visible (radiación con longitud de onda comprendida entre los 160 y 780

nm) por una molécula.

• La absorción de esta radiación causa la promoción de un electrón a un estado

excitado.

• Los electrones que se excitan al absorber radiación de esta frecuencia son los

electrones de enlace de las moléculas,

• la espectroscopia UV-Vis se utiliza para la identificación de los grupos funcionales

presentes en una molécula. Las bandas que aparecen en un espectro UV-Vis son

anchas debido a la superposición de transiciones vibracionales y electrónicas.

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INSTRUMENTACION

Una fuente de radiación estable.

Selector de longitud de onda.

Porta muestras.

Detector o transductor de la radiación.

Procesamiento de señales y dispositivo de salida.

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FUNCIONAMIENTO • Fuente de luz: Las lámparas halógenas de tungsteno, que tienen una temperatura radiante T

de 3000 K por encima de los 330 nm), lámparas de deuterio con región UV por debajo de los

330 nm, Las lámparas de arco de xenón menos de 190 nm y por encima de 1000 nm

• Sistema óptico: a través de filtros, lentes y redes de difracción se focaliza el haz de luz y se

selecciona una longitud de onda fija.

• Compartimiento muestra: es donde se coloca la muestra, con un espesor conocido,

normalmente disuelta y en una cubeta de 1cm de paso óptico, sobre la que se hace incidir el

haz de luz monocromática

• Sistema óptico: recibe la luz transmitida por la muestra, la focaliza y selecciona por

longitudes de onda

• Detector: recibe la señal de la intensidad de la luz transmitida a cada longitud de onda y la

transforma en señal eléctrica que un ordenador pueda procesar.

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APLICACIONES

• Determinación de iones metálicos y complejos de elementos de transición ( Ni+2, Cu+2,

Co+2, Cr2O7 -2 ) Fe(II –,Fe(III)

• Campos: industrial, clínico, forense, medio ambiente

• Determinación de grupos funcionales en moléculas orgánicas

• Análisis de muestras bioquímicas

• Análisis de semiconductores

• Determinación cuantitativa y cualitativa

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VALIDACIÓN DE UN MÉTODO

ANALÍTICO

ESPECTROFOTOMÉTRICO

PARA LA CUANTIFICACIÓN

DE METABOLITOS ESTABLES

DE ÓXIDO NÍTRICO

EN FLUIDOS BIOLÓGICOS

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REACCIÓN DE GRIESS

• La prueba de Griess es una prueba química que detecta la

presencia de nitritos orgánicos. La reacción de diazotación

de Griess, en la que se fundamenta el reactivo de Griess.

Este método se basa en la reacción del analito en medio

ácido para formar una sal diazonio que acoplada a aminas

aromáticas produce un colorante azo (diazotización de

Griess). Esta reacción de color es monitoreada fácilmente

por medio de espectrofotometría.

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RESUMEN • Se utilizo la espectrometría de UV-Vis para la cuantificación

de metabolitos estables de óxido nítrico (NO3-) en muestras

biológicas (suero). utilizando la reacción colorimé-trica de

Griess.

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INTRODUCCIÓN • El óxido nítrico (NO) es un gas incoloro escasamente soluble en agua, con un electrón no

apareado en su capa de valencia externa, lo que lo convierte en una molécula

paramagnética con naturaleza de radical libre que participa en procesos fisiológicos y

patológicos.

• El NO puede ser cuantificado por métodos directos (cromatografía de gases,

espectrometría de masas), ni indirectos (espectrometría de UV-Vis y métodos

electrométricos).

• Se han reportado varias técnicas para la detección de los metabolitos estables del NO

(NO3- y NO2-), siendo la más utilizada la detección colorimétrica con reactivos de Griess.

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METODOLOGIA

• Preparación de disoluciones

-Se preparan disoluciones de: cloruro de vanadio 0.08 % p/v en H₃PO₄ 1 M,

sulfonilamida 2% p/v en H₃PO₄ 5% v/v y una disolución de diclorhidrato de N-

etilendiamina 0.2 % p/v en agua destilada.

• Procedimiento experimental para disoluciones acuosas:

-Se utilizó solución stock de NaNO₃.

-Se evaluó la selectividad del sistema analítico frente a la presencia de otros aniones.

-Para la evaluación se utilizó una disolución de Krebs-Henseleit.

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-Se realizó un barrido en el espectrofotómetro entre 0 y 1100 nm.

-Con esto se realizó una serie de curvas patrón de NaNO₃ en el intervalo de

concentración de 0 a 100 µM.

-Se preparó otra serie de soluciones a partir del NaNO₃.

-Se evaluó la linealidad del sistema y del método utilizando como documentos guía a las

Guías de Validación de Métodos Analíticos

• Procedimiento experimental para fluidos biológicos:

-Se centrifugaron a 14000 rpm por 3 min muestras de sangre de pacientes sanos y

pacientes con afecciones cardiovasculares .

-Se evaluó el método analítico bajo los parámetros de: sueros sin desproteinizar y

sueros desproteinizados

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-Para evaluar la selectividad del sistema analítico se emplearon

aniones con estructura similar al NO⁻₃.

-Una vez obtenidos los sueros humanos se realizo un barrido en

UV-Vis entre 500 y 600 nm.

-Al suero obtenido a una cantidad de 20 µL se le adicionó una

serie de disoluciones.

-Finalmente se evaluó la linealidad, exactitud y precisión.

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RESULTADOS

• Selectividad del sistema analítico para disoluciones

acuosas:

El diazocompuesto formado presenta una banda de absorción en

la región UV-Vis a una longitud de onda de 540 nm, y ya que esta

bando no se encuentra en todos los espectros tomados se dice

que el sistema analítico es selectivo

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• Linealidad del sistema y método analítico en

disoluciones acuosas fuertemente electrolíticas:

Para el sistema analítico, se cumple con que el coeficiente de

determinación (r²) es mayor a 0.98, por lo que el sistema analítico

es lineal. El sistema analítico para disoluciones acuosas muestra

un límite de detección de 0.01 µM y el límite de cuantificación 0.04

µM.

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• Linealidad del sistema y método analítico en fluidos

biológicos:

La linealidad del sistema en el análisis del suero el cual era la

muestra biológica fue un (r²) de 0.9997, en el intervalo de

concentración de 0 a 40 µM, un límite de detección de 0.69 pM y

un límite de cuantificación de 2.10 pM, por lo que el sistema

analítico para fluidos biológicos es lineal.

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• Análisis de la exactitud del método analítico para el

análisis de fluidos biológicos:

Los resultados obtenidos en las condiciones para fluidos biológicos

cumplen con los requisitos necesarios para que el método analítico

sea considerado como exacto.

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• Análisis de la precisión del método analítico para el

análisis de fluidos biológicos:

Los resultados obtenidos cumplen con los requisitos para fluidos

biológicos, lo cual está estipulado para determinar si el método

analítico sea preciso como lo es en este caso.

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CONCLUSIONES

El método de Griess, modificado para los fines experimentales de nuestro laboratorio y validado de acuerdo a la Guía de validación de métodos bioanalíticos, ha mostrado ser un método analítico lineal, exacto y preciso, con un porcentaje de recobro analítico y un coeficiente de variación superiores a los calculados para kits disponibles actualmente en el mercado, por lo que representa una alternativa viable y rentable para la cuantificación de metabolitos estables de óxido nítrico (NO⁻₃ y NO⁻₂)

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GRACIAS


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