presenÇa de marcadores de neurodegeneraÇÃo e...

UNIVERSIDADE DO SUL DE SANTA CATARINA

SAMANTHA PEREIRA MIGUEL

PRESENÇA DE MARCADORES DE NEURODEGENERAÇÃO E ATIVAÇÃO DE

RAGE NO CÉREBRO DE RATOS SOBREVIVENTES DE SEPSE

Tubarão

2011




Dissertação apresentada ao curso de Mestrado em

Ciências da Saúde, da Universidade do Sul de Santa

Catarina, como requisito para obtenção do título de

Mestre em Ciências da Saúde.

Orientadora: Profª. Fabricia Petronilho, Dra.

Tubarão

2011




Esta Dissertação foi julgada adequada à obtenção do

título de Mestre em Ciências da Saúde e aprovado em

sua forma final pelo Curso de Ciência de Saúde, da

Universidade do Sul de Santa Catarina.

___________________________, ______ de ____________________ de 2011

Local dia mês ano

__________________________________________________________

Prof. e orientadora Fabricia Cardoso Petronilho, Dra.

Universidade do Sul de Santa Catarina - UNISUL

__________________________________________________________

Prof. Gislaine Tezza Rezin, Dra.

Universidade do Sul de Santa Catarina – UNISUL

__________________________________________________________

Prof. Gustavo da Costa Ferreira, Dr.

Universidade do Extremo Sul Catarinense

Dedico este trabalho e todo meu esforço a

minha mãe e ao meu esposo. Vocês são meus

amores... estarão sempre comigo!

AGRADECIMENTOS

São muitas as pessoas que fizeram parte desta minha etapa de estudo e a muitas

devo meus agradecimentos.

Gostaria então de iniciar meus agradecimentos à minha querida e doce

orientadora, Fabricia Petronilho. Foi ela que, assim que chegou à Universidade, aceitou meu

convite de orientação. Fa, você não foi apenas uma orientadora, foi amiga, companheira e

muito paciente, além de ter acreditado nos meus esforços e estar do meu lado durante todos os

momentos que precisei. Dessa forma, com todo carinho o meu muito obrigada.

Ao professor Gustavo da Costa que foi o primeiro professor que tive contato

assim que entrei no mestrado. Além de fazer parte da minha entrevista de seleção, foi quem

me ensinou os primeiros passos da pesquisa e me indicou à professora Fabricia. Muito

obrigada Gustavo, pela sua atenção e pela indicação.

A Lucinéia, minha ex-aluna e colega de pesquisa, que desde o início foi uma

adorável companheira e muito atenciosa, muito obrigada!

Ao meu esposo Andersson, que teve muita paciência, companheirismo e carinho

nos momentos em que pensei que não seria capaz... Você é meu amor e meu melhor amigo!

A minha mãe Albertina, minha grande incentivadora em todas as etapas de estudo

da minha vida. Mãe, certamente estou realizando um sonho que também é seu. És minha

estrela guia, eternamente vou te amar.

A minha irmã Sabrina, que me socorreu em vários momentos da pesquisa,

inclusive me mostrando caminhos que eu desconhecia...

Aos meus familiares, que sempre me deram incentivo aos estudos e de alguma

forma contribuíram para que eu alcançasse esse título.

Agradeço de coração cada um.

RESUMO

Sepse pode ser definida como a resposta inflamatória sistêmica frente como resposta à

infecção, denotando um processo progressivo de dano tecidual, onde a disfunção orgânica

múltipla representa sua expressão mais grave. Estudos de mortalidade indicam que a sepse é

uma das maiores causas de mortalidade em Unidade de Terapia Intensiva. No Brasil, a

mortalidade de pacientes com sepse grave chega a 43,6% e no mundo 23,9%. Já em pacientes

com choque séptico no Brasil a mortalidade chega a 65,7% enquanto no mundo, 37,4%.

Sobreviventes de sepse apresentam déficit cognitivo associados à diminuição da qualidade de

vida, aumentando a mortalidade a longo prazo. Certos aspectos dessas alterações resultam de

mecanismos fisiopatológicos de neurodegeneração, visto que encefalopatia séptica como uma

entidade que não possa ser explicada pela disfunção, hipotensão ou pela hipóxia hepática ou

renal, é relativamente nova, porém já está claro que a sepse e suas reações podem ser

associadas a danos e disfunções cerebrais. Nesse contexto, estudos mostram que o Receptor

de Produtos de Glicação Avançada (RAGE) parece ser importante na progressão da

neurodegeneração. Assim, nosso objetivo foi determinar a presença de marcadores de

neurodegeneração no cérebro de ratos sobreviventes de sepse e o possível envolvimento de

RAGE nessas alterações. Para tal, ratos Wistar machos (220-350g) foram sujeitos a sepse por

ligação e perfuração cecal (CLP) e trinta dias após, foram mortos por decaptação e foram

isolados o hipocampo e córtex pré-frontal para determinação das proteínas: β-amilóide (Aβ),

α-sinucleína, tau-DA, S100B, RAGE e a ativação de ERK 1/2 por técnica de imunoblotting.

Dessa forma, nossos resultados mostraram que o cérebro de animais sobreviventes à sepse

apresentaram vários marcadores de neurodegeneração, visto que houve aumento significativo

na expressão das proteínas Aβ, α-sinucleína e tau-DA no hipocampo, porém no córtex pré

frontal apenas a α-sinucleína apresentou-se aumentada de forma significativa. Houve aumento

na expressão de RAGE no hipocampo e no córtex pré-frontal e a ativação de ERK1/2

observou-se apenas no hipocampo. Em conclusão, os presentes resultados indicam que a via

Aβ-RAGE-MAPK pode ser a principal via responsável pelo déficit cognitivo a longo prazo

em sobreviventes de sepse.

Palavras-chave: Sepse. Neurodegeneração. RAGE. Disfunção cerebral.

ABSTRACT

Sepsis can be defined as the systemic inflammatory response in response to infection,

indicating a progressive process of tissue injury, where the multiple organ dysfunction

represents its more serious expression. Mortality studies indicate that sepsis is one of the

major causes of death in Intensive Care Unit. In Brazil, the mortality of patients with

severe sepsis reach 43,6%, while in the world it reaches 23,9% and patients with septic

shock as cause of the death in Brazil reached 65,7% while in the world, 37,4%. Survivors

of sepsis have cognitive decline associated with the decrease of the quality of life,

increasing the long-term mortality. Certain aspects of these changes are result of

pathophysiological mechanisms of neurodegeneration, seen asseptic encephalopathy as an

entity that cannot be explained by dysfunction, hypotension, and liver or kidney hypoxia

is relatively new, but it is already clear that sepsis and its reactions can be associated with

brain damage and impairment. In this context, some studies show that the Receptor for

Advanced Glycation Endproducts (RAGE) is important in the progression of

neurodegeneration. Thus, our objective was to determine the presence of

neurodegeneration markers in the brain of rats survivors of sepsis and possible

involvement of RAGE in these changes. So , male Wistar rats (220-350g) were subjected

to sepsis by cecal connection and perfuration (CLP) and, thirty days after that, they were

killed by decapitation and isolated the hippocampus and prefrontal cortex for the

determination of proteins: β-amyloid (Aβ), α-synuclein, AD-tau, S100B, RAGE and the

activation of Extracellular Signal-Regulated Kinase (ERK1/2) by the technique of

immunoblotting. So, our results showed that the brain of sepsis survivor animals showed

several markers of neurodegeneration, as there was a significant increase in expression of

Aβ, α-synuclein and tau-AD proteins in the hippocampus, but in the prefrontal cortex only

α-synuclein presented significantly. There was an increase in the expression of RAGE in

the hippocampus and in the prefrontal cortex and the activation of ERK 1/2 was observed

only in the hippocampus. In conclusion, the present results indicate that the Aβ -RAGE-

MAPK pathway may be the main responsable for the long-term cognitive deficit on sepsis

survivors.

Key-Words: neurodegeneration, RAGE, brain dysfunction.

LISTA DE ILUSTRAÇÕES

Figura 1 – Imunoconteúdo de Aβ, α-sinucleína e tau-DA no hipocampo dos animais

sobreviventes a sepse comparado ao grupo controle (sham)..... ............................................. 355

Figura 2 – Imunoconteúdo de Aβ, α-sinucleína e tau-DA no córtex pré-frontal dos animais

sobreviventes a sepse comparado ao grupo controle (sham). ................................................. 366

Figura 3 – Imunoconteúdo de RAGE, S100B e ERK1/2 fosforilada no hipocampo dos animais

sobreviventes sepse comparado ao grupo controle (sham).. .................................................. 377

Figura 4 – Imunoconteúdo de RAGE, S100B e ERK1/2 fosforilada no cortex pré-frontal dos

animais sobreviventes sepse comparado ao grupo controle (sham).. ..................................... 388

LISTA DE SIGLAS

OH- – Radical hidroxil

1O2 - Oxigênio singlet

AGE - Produtos finais de glicação avançada

Aβ – β-amilóide

BHE – Barreira Hematoencefálica

CLP – Ligação e perfuração cecal

DA – Doença de Alzheimer

DP – Doença de Parkinson

ERK1/2 - Quinase regulada por sinais extracelulares 1/2

ERN – Espécies reativas de nitrogênio

ERO – Espécies reativas de oxigênio

GSK-3β - Glicogênio Sintase Quinase 3β

HO-1 - heme oxigenase -1

IL-1 – Interleucina 1




ILAS – Instituto Latino Americano de Sepse

iNOS - Óxido nítrico sintase induzível

JA - Junções apertadas

JEA - Junções endoteliais aderentes

JNK - Quinase n-terminal c-Jun

LBP - Proteínas ligadoras de LPS

LPS - Lipopolissacarídeo

LTA - Ácido lipoteicóico

MAPK - Proteína quinase ativada por mitógeno

MD-2 - Proteína de diferenciação mielóide - 2

MyD88 - Fator de diferenciação mieloide humano 88

NF-kB - Fator nuclear-κB

NO• - Óxido nítrico

O2•- - Radical superóxido

ONOO- - Peroxinitrito

PAMPs - Padrões Moleculares Associados a Patógenos

PPR - Receptor de reconhecimento de padrão

RAGE - Receptor de Produtos de Glicação Avançada

SIRS – Síndrome da resposta inflamatória sistêmica

SNC – Sistema Nervoso Central

TIR - Domínio intracelular Toll/interleucina -1

TIRAP - Proteina adaptadora contendo o domínio TIR

TLR - Receptor toll-like

TLR-4 - Receptor toll-like-4

TNF-α - Fator de necrose tumoral – α

TRAM - Molécula adaptadora relacionada ao TRIF

TRIF - Domínio TIR contendo adaptador do indutor de interferon β

UTI – Unidade de Terapia Intensiva

SUMÁRIO

1 INTRODUÇÃO .................................................................................................................. 12

1.1 SEPSE: DEFINIÇÃO E ASPECTOS EPIDEMIOLÓGICOS .......................................... 12

1.2 FISIOPATOLOGIA DA SEPSE ....................................................................................... 14

1.2.1 Interação patógeno-hospedeiro .................................................................................. 144

1.2.2 Resposta Celular ........................................................................................................... 16

1.2.3 Radicais livres na progressão da sepse ........................................................................ 19

1.2.4 Barreira-hematoencefálica (BHE) ............................................................................... 20

1.3 ENCEFALOPATIA SÉPTICA ....................................................................................... 211

1.4 PROTEÍNAS RELACIONADAS A NEURODEGENERAÇÃO .................................... 23

1.4.1 Proteína Tau Fosforilada ............................................................................................ 233

1.4.2 Proteína β-amilóide (Aβ) .............................................................................................. 24

1.4.3 Proteína α-sinucleína .................................................................................................... 25

1.4.4 Proteína S100B ............................................................................................................ 266

1.5 NEURODEGENERAÇÃO E ATIVAÇÃO DE RAGE .................................................. 277

2 JUSTIFICATIVA ............................................................................................................ 300

3 OBJETIVOS ..................................................................................................................... 311

3.1 OBJETIVO GERAL ........................................................................................................ 311

3.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS .......................................................................................... 311

4 MATERIAL E MÉTODOS ............................................................................................ 322

4.1 TIPO DE ESTUDO ......................................................................................................... 322

4.1.1 Bioética ......................................................................................................................... 322

4.1.2 Animais ........................................................................................................................ 322

4.1.3 Indução de sepse .......................................................................................................... 333

4.1.4 Immunoblotting ........................................................................................................... 333

4.2 ANÁLISE ESTATÍSTICA .............................................................................................. 344

5 RESULTADOS ................................................................................................................ 355

6 DISCUSSÕES..................................................................................................................... 39

7 CONCLUSÕES ................................................................................................................ 433

8 PERSPECTIVAS ............................................................................................................. 444

REFERÊNCIAS ................................................................................................................... 455

APÊNDICE ........................................................................................................................... 600

APÊNDICE A – Artigo da Dissertação .............................................................................. 611

12

1 INTRODUÇÃO

1.1 SEPSE: DEFINIÇÃO E ASPECTOS EPIDEMIOLÓGICOS

Todo processo infeccioso desencadeia uma resposta inflamatória do hospedeiro,

cuja magnitude pode variar de indivíduo para indivíduo. A interação complexa entre o

organismo e o agente causador resulta no processo fisiopatológico que antigamente era

definido como septicemia e hoje é denominado como sepse (VICENT; KORKUT, 2008).

Louis Pasteur, em 1879-80, encontrou pela primeira vez, bactérias no sangue de

uma paciente que sobreviveu à sepse e assim as diferentes etapas desse processo foram

inicialmente definidas por Willian Osler em 1892 (BARON; BARON; PERRELLA, 2006).

Após a observação feita por Pasteur, aproximadamente um século depois é que finalmente se

chegou a um consenso sobre a definição de sepse. A relativa demora se deve principalmente à

dificuldade de identificação desta síndrome por clínicos e pesquisadores, uma vez que os

sinais e sintomas clínicos variam enormemente dependendo do estágio em que o paciente se

encontra (ANNANE; BELLISSANT; CAVAILLON, 2005).

Em 1991, na Conferência de Consenso feita pela American College of Chest

Physicians and the Society of Critical Care Medicine foram estabelecidos critérios para a

classificação de sepse e doenças similares (BONE et al., 1992). Optou-se por enquadrá-las

como Síndrome da Resposta Inflamatória Sistêmica (SIRS). Além disso, ficou estabelecido

também que o termo sepse deveria ser utilizado nos casos onde a infecção é documentada,

pois a SIRS pode ser causada por diversos outros insultos (além da infecção por bactérias,

vírus e fungos), considerada como “estéreis”, tais como trauma, queimaduras, choque

hemorrágico e pancreatite aguda (BEISHUIZEN; VERMES; HAANEN, 1999).

Esta medida foi necessária para adequação do tratamento à fase de evolução da

síndrome em que o paciente se encontra. Esses parâmetros vêm sendo reavaliados nas

subsequentes conferências e hoje compõe as diretrizes da “Surviving Sepsis Campaign” para

diagnóstico precoce e tratamento adequado em cada etapa do processo fisiopatológico da

sepse, com o objetivo único de diminuir a taxa de mortalidade (DELLINGER et al., 2008;

VICENT; KORHUT, 2008).

13

O desenvolvimento de alterações clínicas, hematológicas, bioquímicas e

imunológicas associadas à infecção caracteriza a sepse, a qual quando complicada pela

disfunção orgânica é denominada sepse severa. O choque séptico se refere a um estado de

falência circulatória aguda com hipotensão arterial apesar da reposição volêmica, fazendo-se

necessário a terapia vasopressora para manutenção de uma pressão arterial a valores

aceitáveis (VICENT; KORHUT, 2008).

O mau funcionamento dos mecanismos de regulação durante a sepse pode resultar

em uma perda de controle da inflamação, assim a fase precoce da sepse que é causada pela

excessiva ativação do sistema de reconhecimento do hospedeiro - patógeno pelos danos

teciduais em grande escala e/ou infecção grave, leva a uma desregulação de vários sistemas

do corpo. Atualmente, há evidências de que a sepse é uma condição que afeta não só o

sistema imunológico, mas também outros sistemas biológicos (RITTIRSCH; FLIERL;

WARD, 2008).

A ocorrência de falência orgânica segue um padrão comum: a disfunção pulmonar

ocorre quase sempre e precoce, persiste durante o choque que também ocorre precocemente, e

se resolve rapidamente ou é fatal. Sérias anormalidades da função hepática, coagulação e

manifestações neurológicas tendem a ocorrer horas ou dias após o início da sepse e persistem

por tempo indeterminado (BONE, 1996; HOTCHKISS; KARL, 2003; NATHENS;

MARSHALL, 1996; WARREN, 1997). O número de falências orgânicas, além da gravidade

destas, afeta o prognóstico do paciente, pois cada órgão adicional em falência acrescenta de

15-20% a taxa de mortalidade (BONE, 1992; FRIEDMAN; SILVA; VICENT, 1998;

HOTCHKISS; KARL, 2003; WARREN, 1997).

A incidência da sepse tem aumentado desde os anos 30 (DOMBROVSKIY et al.,

2007) e todas as recentes evidências sugerem que este aumento persiste. As razões para este

aumento sustentado são várias: aumento do uso de procedimentos invasivos, uso amplo de

imunossupressores e agentes citotóxicos, aumento na sobrevida de pacientes crônicos (como

por exemplo, diabetes) e aumento na infecção por organismos multiresistentes.

Dados de mortalidade mais recentes indicam (desde 2003) que a sepse está entre

as 10 causas mais comuns de morte nos Estados Unidos (KUNG et al., 2008), indicando que

ocorrem aproximadamente 751.000 casos de sepse por ano (REMICK, 2007) e se relata que o

choque séptico é a causa de 6 - 15% das internações em Unidades de Terapia Intensiva (UTI)

(ANTONELLI et al., 2007); a taxa de mortalidade anual é de 32,2% para sepse grave e 54,1%

para choque séptico (VINCENT et al., 2006), sendo que os índices aumentam continuamente

nos pacientes de maior idade (MARTIN; MANNINO; MOSS, 2006), isso ocorre devido à

14

tendência epidemiológica nessa faixa etária onde há um aumento de pacientes cronicamente

doentes (O'BRIEN; ALINA; ABEREGG, 2007).

Em abril de 2011, o ILAS – Latim American Sepsis Institute, em sua campanha

sobrevivendo a sepse (Surviving Sepsis Campaign), apresentou em seu relatório trimestral os

dados de mortalidade de pacientes sépticos no Brasil e no mundo. No Brasil, a mortalidade de

pacientes com sepse grave é de 43,6% e no mundo 23,9%. Já pacientes com choque séptico

no Brasil a mortalidade chega a 65,7% enquanto no mundo, 37,4%. (LATIM AMERICAN

SEPSIS INSTITUTE, 2011).

No Brasil, através de estudos do Brazilian Sepsis Epidemiologic Study (BASES)

mostrou que cerca de 25% dos pacientes internados nas UTIs (Unidade de Terapia Intensiva)

apresentaram diagnósticos de sepse severa e choque séptico, com uma mortalidade de 34,7%

para sepse, 47,3% para sepse severa e 52,2% para choque séptico (SILVA et al., 2004).

Enquanto que a taxa de mortalidade em outro estudo foi de 21,4% para sepse, 30,9% para

sepse severa e 47,7% para choque séptico em UTIs (FERNANDES, 2008). A taxa de

mortalidade por sepse e suas complicações vem apresentando uma discreta redução nas

últimas décadas, provavelmente devido a melhor definição da síndrome e a incrementos nas

medidas de suporte a órgãos-alvos e prevenção de complicações, mesmo na ausência de uma

terapêutica específica com impacto considerável na mortalidade (FRIEDMAN; SILVA;

VICENT , 1998)

Apesar dos avanços significativos na terapia intensiva e uso de antibióticos, a

mortalidade global na sepse está associada a um custo anual de cuidados de saúde de cerca de

17 bilhões de dólares (ANGUS; WAX, 2001; FRIEDMAN; SILVA; VICENT, 1998;

MUNFORD; PUGIN, 2001). A possibilidade de diminuir a mortalidade por sepse e reduzir os

gastos com internação em UTIs, além das sequelas tardias destes pacientes justificam a

necessidade de maior investimento no estudo desta doença.

1.2 FISIOPATOLOGIA DA SEPSE

1.2.1 Interação patógeno-hospedeiro

15

A inflamação é uma resposta normal do hospedeiro contra agentes infecciosos.

Sepse e SIRS são caracterizadas pela produção excessiva de mediadores inflamatórios e pela

excessiva ativação de células inflamatórias (BONE, 1991). Os mecanismos de

reconhecimento específico, componentes da resposta inata, foram caracterizados como uma

via de controle da imunidade adquirida. Esses mecanismos são deflagrados por receptores de

membrana celular, que, por sua vez, são ativados com o reconhecimento do microorganismo

através de estruturas conservadas, constitutivamente expressas na superfície dos patógenos,

denominadas Padrões Moleculares Associados à Patógenos (PAMPs) (CINEL; DELLINGER,

2007). Assim, os fatores desencadeadores da ativação celular e da cascata de eventos

plasmáticos são principalmente os componentes da parede celular dos microorganismos,

como o ácido lipoteicóico (LTA) e peptideoglicanos, derivados de bactérias Gram-positivas

(exotoxinas), ou o lipopolissacarídeo (LPS), no caso de bactérias Gram-negativas

(endotoxinas).

O LPS e as exotoxinas são liberados normalmente durante a replicação da bactéria

e/ou como consequência de sua morte, devido a lise da parede celular. Diversos receptores

foram encontrados nos últimos anos, capazes de reconhecer essas moléculas e ativar a

resposta imune inata (TRIANTAFILOU; TRIANTAFILOU, 2002). Assim, os PAMPs são

reconhecidos por receptores encontrados em células do sistema imune inato como neutrófilos,

polimorfonucleares, macrófagos e células dendríticas. Esses receptores são denominados de

Receptores de Reconhecimento de Padrões (PPRs).

Entre os membros mais importantes dos PPRs destacam-se os receptores Toll-like

(TLRs). Tais receptores são uma família de receptores transmembrana do tipo 1, codificados

em linhagem germinativa e não clonais, que são caracterizados por domínios extracelulares

repetitivos ricos em leucina e um domínio citoplasmático homólogo ao receptor de

interleucina-1 (IL-1) (WEIGHARDT; HOLZMANN, 2007). Atualmente, 11 homólogos

humanos dos TLRs foram identificados e, se não todos os maioria envolvida no

reconhecimento dos principais padrões microbianos (HOPKINS; SRISKANDA, 2005)

existindo a evidência de que o polimorfismo de proteínas dos TLRs pode explicar em parte a

grande variabilidade de respostas individuais aos estímulos infecciosos (LORENZ et al.,

2000).

Logo, a ativação de macrófagos estimulados por LPS é dependente da presença de

proteínas ligadoras de LPS (LBP) e da proteína de membrana CD-14 (COHEN, 2002; LIEW

et al, 2005). A LBP é uma proteína de fase aguda que catalisa a transferência do LPS para

CD-14 potencializando a ativação de macrófagos induzida por LPS de 100 a 1.000 vezes.

16

Nesse sentido, o CD-14 em conjunto com a proteína de diferenciação mielóide-2 (MD-2),

uma pequena molécula sem região transmembrana, participa da apresentação de LPS para o

receptor similar ao Toll e Poltorak e colaboradores (1998), mostraram que a sinalização pelo

LPS é transmitida pelo receptor Toll-like-4 (TLR-4), o primeiro membro da família a ser

caracterizado em mamíferos.

TLR-4 transmite um sinal de ativação onde o domínio intracelular

Toll/Interleucina-1 (TIR) interage com quatro moléculas adaptação do domínio TIR. São elas

o fator de diferenciação mielóide humano 88 (MyD88), a proteína adaptadora contendo o

domínio TIR (TIRAP), a domínio TIR contendo o adaptador do indutor de interferon-β

(TRIF) e a molécula adaptadora relacionada ao TRIF (TRAM). Atualmente está claro que a

MyD88 e TRIF promovem uma plataforma central para a propagação de sinais complexos dos

TLRs via associação direta com quinases e fatores de transcrição (HONDA et al, 2004;

YAMAMOTO et al., 2003;). Nesse sentido com a ativação de quinases situadas na seqüência

do processo de sinalização, ocorre a liberação do fator nuclear-kB (NF-kB) que transloca para

o núcleo e aumenta a expressão gênica de citocinas inflamatórias determinando, por fim, uma

resposta pró-inflamatória (AKIRA; TAKEDA, 2004).

Assim, de um modo geral, após a interação inicial PAMPs-PPRs acontece

ativação da resposta imune inata com a finalidade de coordenar uma resposta defensiva

envolvendo componentes humorais e celulares. Nesse contexto, com tal interação, células

residentes têm um papel chave, liberando uma grande variedade de moléculas sinalizadoras

como prostaglandinas, leucotrienos, citocinas e quimiocinas que desencadeiam a resposta

inflamatória, culminando no recrutamento e ativação de leucócitos para o local da infecção,

representando uma das funções mais importantes da imunidade inata (JANEWAY, 2001,

2002).

1.2.2 Resposta Celular

Conforme descrito anteriormente, o recrutamento leucocitário para o local de

injúria celular é uma das etapas essenciais da defesa do organismo contra um agente agressor.

Nos estágios iniciais de variados processos infecciosos, incluindo infecções por fungos, vírus

e bactérias, o leucócito predominante é o neutrófilo, permanecendo em geral de 12-24 horas

17

no local do dano. Após esse período, o neutrófilo inicia um processo de morte programada

(apoptose) sendo, em seguida, fagocitado por macrófagos. A partir da décima hora surgem

progressivamente os eosinófilos, macrófagos e linfócitos, permanecendo por cerca de uma

semana no local, isto se o agente agressor for removido, caso contrário, ocorre a cronificação

do processo (GALLIN; SNYDERMAN, 1999).

A migração dessas células do compartimento intravascular para o extravascular

ocorre predominantemente nas vênulas pós-capilares, sendo mediadas por uma combinação

de processos mecânicos, químicos e moleculares. Tais eventos distintos estão ligados em uma

sequência temporal (SEELY; PASCUAL, 2003). Inicia-se com a marginação ou movimento

dos neutrófilos do fluxo central para a periferia do vaso. Esse mecanismo ocorre através da

interação molecular entre a superfície celular de neutrófilos e células endoteliais, resultando

no rolamento de neutrófilos ao longo da parede do vaso. Tal interação é dependente de forças

físicas e moleculares sendo mediado por selectinas e seus ligantes (MENG et al., 2004).

Durante o rolamento, os leucócitos passam a interagir com quimiocinas como

interleucina 8 (IL-8) e as quimiocinas da família GRO, que se encontram ancoradas na

superfície das células endoteliais, resultando na ativação dos leucócitos e promovendo

alterações conformacionais nas integrinas presentes nos leucócitos em rolamento, que

aumentam a sua capacidade adesiva. Consequentemente o rolamento é interrompido e os

leucócitos aderem firmemente ao endotélio vascular (HUTTENLOCHER; SANDBORG;

HORVITZ,1995; MENG et al., 2004). O estágio final do recrutamento de neutrófilos é a

passagem através da parede endotelial para o tecido inflamado (HUTTENLOCHER;

SANDBORG; HORVITZ, 1995).

Todos esses eventos que ocorrem são responsáveis, portanto, pelo papel

fundamental dos neutrófilos na circunscrição e controle do foco infeccioso. Uma vez no foco

infeccioso, são capazes de engolfar os patógenos por meio de um processo conhecido como

fagocitose, resultando na formação de vesículas citoplasmáticas formadas pela fusão dos

fagossomas e dos lisossomas (JANEWAY; MEDZHITOV, 2002). Através dessa fusão os

neutrófilos iniciam uma potente defesa antimicrobiana onde pode ser dividida em um

processo dependente e independente de oxigênio (HUTTENLOCHER; SANDBORG;

HORVITZ, 1995).

Os efetores da defesa antimicrobiana de neutrófilos independentes de oxigênio

estão contidos em grânulos no citoplasma dos neutrófilos conhecidos como grânulos

azurófilos ou primários (FAURSCHOU; BORREGAARD, 2003). Essas estruturas contêm

18

uma variedade de proteínas pré-formadas que são liberadas no fagossomo durante o processo

de morte microbiana como defensinas, elastase e lactoferrinas (MARSHALL, 2005)

Mecanismos dependentes de oxigênio envolvem a transformação de oxigênio

molecular em uma família de Espécies Reativas de Oxigênio (EROs) que são liberadas nos

fagossomos ou no ambiente extracelular (HAMPTON; KETTLE; WINTERBOURN, 1998).

Esses intermediários são altamente reativos com moléculas biológicas importantes causando

peroxidação de lipídios, modificações estruturais de proteínas e dano ao DNA, levando a

morte do microorganismo (MARSHALL, 2005).

Portanto, os neutrófilos são conhecidos por exercer um importante papel na

resposta inflamatória por uma série de funções efetoras que representam um mecanismo

central de imunidade contra infecções (APPELBERG, 2007; NATHAN, 2006). Da mesma

forma, estudos mostram que em modelo animal de sepse severa por ligação e perfuração cecal

(CLP) encontra-se a falência da migração de neutrófilos para o foco infeccioso, associado ao

número de bactérias aumentado no exsudato peritoneal e sangue, seguido pela inflamação

sistêmica caracterizada pelo aumento dos níveis de citocinas e quimiocinas circulantes e o

seqüestro de neutrófilos para o pulmão e redução da taxa de sobrevida (ALVES-FILHO et al.,

2006).

Diferentes mecanismos estão envolvidos no desequilíbrio desse sistema. Entre as

investigações no entendimento de tais mecanismos, verifica-se a redução da expressão do

receptor CXCR-2 um dos receptores da quimiocina IL-8 (CHISHTI et al., 2004) a produção

excessiva de citocinas e quimiocinas circulantes, proteínas de fase aguda, aumento da

atividade de óxido nítrico sintase induzível (iNOS), heme oxigenase-1 (HO-1) e a ativação

sistêmica de TLRs são associados a esse fenômeno (ALVES-FILHO et al., 2008). Conforme

mencionado, TLRs são componentes essenciais na resposta imune inata contra a infecção, no

entanto, diferentes evidências indicam que podem desempenhar um papel importante na

fisiopatologia da sepse (MENG et al., 2004). Durante uma infecção polimicrobiana onde

componentes estruturais de diferentes bactérias levam a ativação de vários TLRs, a ativação

de um deles é suficiente para o desencadeamento de uma eficiente resposta inflamatória local.

Por outro lado, a sinalização excessiva de todos os receptores leva à geração de uma resposta

inflamatória sistêmica que é caracterizada pela excessiva produção e liberação de citocinas e

quimiocinas na circulação (ALVES-FILHO et al., 2008).

Nesse contexto, a interação de vários componentes como infecciosos,

imunológicos, hemodinâmicos, bioquímico e até mesmo genéticos (DE MAIO; TORRES;

REEVES, 2005; REMICK, 2007), podem levar a uma resposta exacerbada do organismo com

19

produção excessiva de EROs e mediadores inflamatórios e consequentes alterações

fisiológicas (ANNANE; BELLISSANT; CAVAILLON, 2005; ROCHA; OLIVEIRA;

FARIAS - CORRÊA, 2006).

1.2.3 Radicais livres na progressão da sepse

Estudos indicam que os radicais livres possuem mecanismos coadjuvantes de

dano celular e progressão da sepse além dos citados até o momento (DAL PIZZOL et al,

2010). Um radical livre é qualquer espécie química capaz de existir de forma independente e

que contenha um ou mais elétrons desemparelhados (HALLIWELL, 2006, HALLIWELL,

2001; HALLIWELL; GUTTERIDGE, 2007; SOUTHORN; POWIS, 1988). Como em sua

maioria, são derivados do metabolismo do O2, o termo genérico “Espécies Reativas de

Oxigênio” é usado para incluir não só os radicais formados pela redução de O2, o radical

superóxido (O2•-

) e o radical hidroxil (•OH), mas também alguns não-radicais derivados do

oxigênio, como H2O2, o oxigênio singlet (1O2). Além dessas, existem ainda as espécies

reativas de nitrogênio (ERN), sendo o óxido nítrico (NO•) e o peroxinitrito (ONOO

-) os

principais representantes. (HALLIWELL; GUTTERIDGE, 2007)

Fisiologicamente, essas espécies reativas apresentam diversas funções

(BERGENDI et al, 1999). Assim, um aumento da liberação local de radicais livres pode ser

benéfico, como é o caso da liberação de espécies tóxicas oxidantes pelos neutrófilos, que

podem atuar na defesa do hospedeiro contra uma infecção (DELANTY; DICHTER, 1998;

HALLIWELL; GUTTERIDGE, 2007).

Com relação aos efeitos prejudiciais, quando formadas em excesso, essas espécies

altamente reativas têm potencial de oxidar moléculas (MAXWELL, 1995). Os radicais livres

podem promover lipoperoxidação, causar a oxidação de lipoproteínas de baixa densidade

(LDL), reagir com proteínas levando à sua inativação e consequente alteração de sua função e

reagir com o DNA e RNA, levando a mutações somáticas e a distúrbios de transcrição

(DELANTY; DICHTER, 1998; HALLIWELL; WHITEMAN, 2004).

Assim, usamos o termo estresse oxidativo para referir à situação na qual a geração

de ERO ultrapassa a capacidade de defesas antioxidantes disponíveis. Estudos mostram que o

estresse oxidativo pode resultar tanto de uma diminuição das defesas antioxidantes quanto de

20

uma produção aumentada de oxidantes, bem como da liberação de metais de transição ou a

combinação de quaisquer desses fatores (HALLIWELL, 2006).

O estresse oxidativo tem atraído muita atenção da comunidade científica, uma vez

que tem sido relatado por participar no mecanismo de muitas doenças incluindo o câncer,

aterosclerose, envelhecimento, diabetes tipo-2, de doenças neurodegenerativas como Doença

Alzheimer (DA) e Doença Parkinson (DP) (JEZEK; HLAVATÁ, 2005 apud DAL-PIZZOL et

al., 2010, p. 2). Muitos estudos com modelos animais e humanos já haviam mostrado

elevações nos parâmetros oxidativos durante o curso da sepse e também que o estresse

oxidativo é um dos fatores que levam a dano celular, disfunção orgânica e morte.

(SALVEMINI; CUZZOCREA, 2002; ZIMMERMANN, 1995).

Mais recentemente, têm-se verificado o papel dos radicais livres no Sistema

Nervoso Central (SNC) associado à disfunção do metabolismo energético celular bem como

mediadores inflamatórios em ratos sobreviventes de sepse (COMIM et al., 2011). Tais

mecanismos foram sugeridos por estarem associados a diminuição da memória e aprendizado

em ratos submetidos a sepse. (BARICHELLO et al., 2007b; BARICHELLO et al., 2007a;

COMIM et al., 2010).

1.2.4 Barreira-hematoencefálica (BHE)

Mediadores inflamatórios liberados por leucócitos na sepse podem ter profundos

efeitos sobre as células endoteliais e astrócitos e, danos a essas células, resulta em deficiência

na função neuronal (PAPADOPOULOS et al., 2000). O cérebro é pensado para ser um órgão

privilegiado, uma vez que é anatomicamente isolado do sistema imunológico pela

Barreira Hematoencefálica (BHE), não tem um sistema linfático e tem baixa expressão de

antígenos de histocompatibilidade complexa em seu parênquima celular (SHARSHAR et al.,

2004). Assim BHE é um importante componente da rede de comunicação conectando o SNC

e os tecidos periféricos, além de funcionar como uma interface que limita e regula a troca de

substâncias entre o sangue e o SNC (BANKS, 2010 apud ROJAS; RITTER; DAL PIZZOL,

2011, p. 224).

Além disso, a BHE expressa um número elevado de canais iônicos e

transportadores, tem uma baixa taxa de pinocitose e formas intercelular de complexos multi-

21

protéicos, como as junções apertadas (JA) e junções endoteliais aderentes (JEA) que limitam

a permeabilidade celular (HAWKINS; DAVIS, 2005). É formada pela presença das junções

endoteliais que controlam a abertura e fechamento coordenada das junções célula-célula

(STAMATOVIC; KEEP; ANDJELKOVIC, 2008). As células endoteliais cerebrais são

apoiadas sobre uma lamina basal que contém moléculas da matriz extracelular cobrindo mais

de 90% da superfície das células endoteliais, também estando envolvida na permeabilidade da

BHE (BAUER et al., 2010; ZLOKOVIC, 2008 apud ROJAS; RITTER; DAL PIZZOL, 2011,

p. 223).

Além das funções de permeabilidade seletiva, a BHE possui aspectos importantes

como funções neuroimune, incluindo a secreção de citocinas, prostaglandinas e óxido nítrico.

A BHE pode receber o estimulo de um compartimento (como por exemplo, o sistêmico) e,

simultaneamente, responder com secreções para o outro (por exemplo, SNC), sendo esta

função de papel central na resposta neuroimune (ROJAS; RITTER; DAL PIZZOL, 2011).

A disfunção da BHE, foi descrita há muito tempo como um elemento-chave da

progressão de várias doenças do SNC (WEISS et al., 2009), isso por que alguns estudos vem

demonstrando que o estresse oxidativo e aumento da produção de citocinas e interleucina-2

(IL-2); o fator de necrose tumoral-α (TNF-α) parecem ter um efeito neurotóxico sobre o

cérebro ou estão envolvidos em apoptose neuronal. Assim, o TNF-α aumenta a

permeabilidade de células endoteliais cerebrais em humanos, promovendo pinocitose,

afetando a JA. O TNF-α também reduz o consumo de oxigênio cerebral e fluxo sanguíneo

cerebral e eleva a pressão intracraniana e cérebro-espinhal de lactato de fluidos, como visto

em um modelo de coelho após a injeção subaracnóidea deste mediador. (TUREEN, 1995)

Um outro estudo sugere que interações recíprocas entre o sistema imunológico e

SNC são consideradas como principais componentes da resposta do hospedeiro em estado de

choque séptico (DAL PIZZOL et al., 2010). Além disso, a lesão cerebral parece ocorrer

durante o desenvolvimento sepse e vários mecanismos propostos para a disfunção do SNC

induzida por sepse incluem alteração na BHE, a interrupção de aminoácidos e isquemia

cerebral resultante de uma redução global ou regional no fluxo sanguíneo cerebral (FREUND

et al., 1985; POLLAND et al., 1997 apud DAL PIZZOL et al, 2010, p. 2).

1.3 ENCEFALOPATIA SÉPTICA

22

As interações recíprocas entre o SNC e sistema imunológico são considerados como

os componetes principais da resposta inflamatória à sepse, o que acaba causando alterações

nos sistemas neuroendócrino, autonômico (CHROUSOS, 1995), comportamental (GORDON

et al., 2004) e distúrbios em quaisquer funções adaptáveis como as resposta imuno-

inflamatórias e hemodinâmica (SHARSHAR et al., 2004; SAPER; BREDER, 1994; SPYER,

1989).

Nesse contexto, recentemente foi descrito que sobreviventes de sepse apresentam

déficit cognitivo associado com a diminuição da qualidade de vida e um aumento na

morbidade em longo prazo (WINTERS et al, 2010). Mesmo tal fato ser importante na

fisiopatologia da disfunção do SNC durante a sepse, essas alterações ainda foram pouco

estudadas. A encefalopatia séptica é considerada uma disfunção cerebral devido à sepse

podendo ocorrer em 8-70% dos pacientes sépticos, dependendo dos critérios de inclusão

empregados (SPRUNG et al., 1990; YOUNG et al., 1990), sendo a encefalopatia mais comum

nas UTIs (BLECK et al., 1993).

O conceito de encefalopatia séptica como uma entidade que não possa ser

explicada pela disfunção, hipotensão, ou pela hipóxia hepática ou renal, é relativamente nova,

porém já está claro que a sepse e suas reações podem ser associadas a um largo espectro de

danos e disfunções cerebrais (PAPADOPOULOS et al., 2000). Apesar de a fisiopatologia da

encefalopatia séptica não ser bem determinada, provavelmente deva ter origem multifatorial.

Diversos fatores de risco foram descritos e podem ser categorizados como: a) condição pré-

existente do paciente (como ex. idade, história de depressão, doença hepática, doença renal);

b) condição aguda do paciente (como ex. overdose de drogas, febre), e c) fatores iatrogênicos

ou ambientais (como ex. uso de sedativos, alimentação enteral, cateter venoso central)

(EBERSOLDT; SHARSHAR; ANNANE, 2007).

Em casos fatais, têm-se demonstrado proliferação de astrócitos e microglia no

córtex, infartos cerebrais, púrpura cerebral, múltiplas hemorragias pequenas na substância

branca e disseminação de microabsessos (JACKSON et al., 1985). Nos sobreviventes se tem

demonstrado redução do fluxo sanguíneo cerebral, disfunção da BHE e alteração de

neurotransmissores (BOWTON et al., 1989; DESCAMPS et al., 2003).

Além destas manifestações neurológicas agudas observadas em pacientes

criticamente enfermos, recentemente tem se demonstrado que sobreviventes de UTI,

incluindo pacientes sépticos, apresentam disfunções cognitivas em longo prazo (ANGUS;

WAX, 2001; HOPKINS et al., 1999, 2005; HOUGH; CURTIS, 2005). Assim como para a

encefalopatia, os mecanismos associados a estas alterações não são bem entendidos, mas

23

podem incluir inflamação, estresse oxidativo e disfunção energética cerebral (MESSARIS;

MEMOS; CHATZIGIANNI, 2004).

Semmler e colaboradores (2007) demonstraram em animais sobreviventes de

sepse perda neuronal no hipocampo e sub-regiões do córtex pré-frontal e inervação

colinérgica reduzida de áreas corticais, resultando em relevantes consequências funcionais,

tais como, a perda de memória, uma alteração semelhante à observado em pacientes com DA

(RITTER et al., 2004). Esta similaridade também foi demonstrada por outro grupo usando

rivastigmina para reverter déficit cognitivo a longo-prazo em animais sobreviventes de sepse,

sendo que a rivastigmina tem efeito inibitório de longa duração e é seletiva para a

acetilcolinesterase cerebral e da butirilcolinesterase predominantemente no hipocampo e no

córtex cerebral, áreas associadas à disfunção colinérgicas e habituação de memória (COMIM

et al, 2009b), características que podem ser verificadas em doenças neurodegenerativas

(COMIM et al, 2009a).

1.4 PROTEÍNAS RELACIONADAS A NEURODEGENERAÇÃO

Doenças neurodegenerativas possuem mecanismos comuns que estão ligados à

agregação patológica de proteínas deformadas que se acumulam como depósitos de proteínas

amilóide fibrilares em regiões seletivamente vulneráveis do SNC (TILLEMENT ; LECANU;

PAPADOPOULOS, 2010) como na de DA o acúmulo de filamentos de tau anormal e

depósitos de beta-amiloide (Aβ) (HAAPASALO et al, 2010) e, na DP, demência com corpos

de Lewy, alfa-sinucleína (α-sinucleína) (TAN; WONG; LIM, 2009). Além disso, a proteína

S100B que regula a fosforilação de proteínas que constituem o citoesqueleto e proteínas

associadas ao microtúbulo (DONATO, 2011)

1.4.1 Proteína Tau Fosforilada

Emaranhados neurofibrilares são constituídos primariamente de proteínas tau

associadas à microtúbulos. Em neurônios, tau é normalmente encontrada em axônios, porém

24

em certas taupatias ela se redistribui para o corpo celular e dendritos, em função de seu

desprendimento dos microtúbulos. As proteínas tau estabilizam os microtúbulos do

citoesqueleto neural, sendo esta função regulada por um processo de fosforilação e

desfosforilação. Nos neurônios que sofrem degeneração, as proteínas tau associadas a

microtúbulos tornam-se anormalmente hiperfosforiladas e se acumulam na forma de

filamentos emaranhados helicoidais pareados (NAGY et al., 1995).

O citoesqueleto possui a função chave de manter a forma e a polaridade estrutural

dos neurônios, essenciais para a fisiologia neuronal. Porém, em algumas doenças

neurodegenerativas, como a DA, um desequilíbrio nas atividades cinase/fosfatase parece levar

a hiperfosforilação da proteína tau, a qual nesse estado se desprende dos microtúbulos,

acumula-se no soma, forma filamentos helicoidais pareados e leva à desorganização do

citoesqueleto celular e comprometimento do transporte axonal. A formação dos emaranhados

neurofibrilares, desencadeado pelo acúmulo de peptídeo Aβ1-42 e deposição em placas senis,

podem acelerar a agregação da tau e formação dos emaranhados (LI et al., 2005; GOLDE,

2002). Por sua vez, as placas senis são constituídas da deposição de fragmentos amilóides no

parênquima cerebral.

1.4.2 Proteína β-amilóide (Aβ)

A proteína Aβ é um fragmento proteolítico formado a partir de uma glicoproteína

transmembrânica maior, a Proteína Precursora Amilóide (APP), que sofre a ação das enzimas

proteolíticas β e γ-secretases, resultando na secreção da Aβ em fragmentos amilóides de 38 a

43 aminoácidos (HAASS, 2004). O peptídeo Aβ mais produzido durante esse procedimento é

o peptídeo contendo 40 aminoácidos (Aβ1-40) que não é associado à formação das placas,

enquanto que uma pequena porção contém 42 aminoácidos (Aβ1-42). O peptídeo Aβ1-42 é a

forma mais hidrofóbica e mais propensa a formar fibrilas, além de ser o principal responsável

pela formação das placas senis (LAFERLA; GREEN; ODDO, 2007)

Os mecanismos responsáveis pela neurotoxicidade da Aβ são complexos, mas

parecem envolver a quebra da homeostase intracelular do cálcio e potássio, indução de

estresse oxidativo e ativação do processo de morte celular. Além disso, transtornos da

25

transmissão da acetilcolina e acetiltransferases ocorrem frequentemente nos indivíduos

afetados com DA. (HAASS, 2004; MATTSON, 2004).

Estudos indicam que o aumento dos níveis de Aβ é acompanhado por alterações

na atividade de cinases e fosfatases, levando a hiperfosforilação da proteína tau e formação

dos emaralhados neurofibrilares com consequente dano no transporte axonal. Desse modo, os

eventos da cascata amilóide causam disfunção sináptica e neuronal generalizada, perda

seletiva de neurônios e importante déficit de neurotransmissores que culminam em demência

com placas senis e emaranhados neurofibrilares (HAASS; SELKOE, 2007; HARDY;

SELKOE, 2002; MATTSON; CHAN, 2003)

Em doenças neurodegenerativas, como DA, tem sido proposto que uma fagocitose

ineficiente da proteína Aβ pela microglia, a consequente ativação microglial e liberação de

mediadores inflamatórios e fatores neurotóxicos, contribuiria de maneira decisiva na

progressão da doença, visto que uma vez ativa, a microglia pode também recruta os astrócitos

que ativamente aumentam a resposta inflamatória aos depósitos de Aβ (AKIYAMA et al.,

2000)

1.4.3 Proteína α-sinucleína

A α-sinucleína é outra importante proteína relacionada a progressão da

neurodegeneração pois interage com uma variedade de proteínas dependentes de microtúbulos

(LEE et al., 2006) e, na sua forma agregada, está relacionada à patogênese da DP. A primeira

evidência favorável à associação de um componente genético à etiologia da DP ocorreu a

partir da descoberta, em pacientes com parkinsonismo de herança autossômica dominante, da

mutação A53T no gene da α-sinucleína, a qual é o principal constituinte do corpúsculo de

Lewy. Uma vez que os corpos de Lewy são identificados em formas familiares e esporádicas

da DP, é possível que anormalidades da α-sinucleína façam parte da patogênese desta

enfermidade (POLYMEROPOULOS et al.,1997).

A função exata da α-sinucleína ainda não está bem estabelecida, mas acredita-se

que possa ter algum papel na proteção contra injúria neuronal, uma vez que se associa a uma

chaperona em terminais nervosos, prevenindo a neurodegeneração (KITADA, et al, 1998).

26

Experimentos in vitro demonstraram que tipos selvagem ou mutante da α-

sinucléina são capazes de formar protofibrilas (oligoméricas) ou assumir conformações

fibrilares, mas não conseguiram estabelecer que tipo de formação seria neurotóxica. Algumas

evidências apontam para as formações protofibrilares como principais responsáveis pela

neurotoxicidade. As mutações A53T e A30P na α-sinucleína promovem a formação de

protofibrilas, mas apenas a A53T leva à formação de fibrilas, enquanto a A30P inibe a

formação destas. A formação de protofibrilas é incrementada e estabilizada por quinonas de

dopamina (produtos de oxidação da dopamina), e talvez esta seja a causa de toxicidade maior

da α-sinucleína na substância negra. (GODEIRO JUNIOR, et al., 2007).

Além disso, a disfunção da α-sinucleína tem uma ação indireta e significativa na

função mitocondrial neuronal. O aumento de expressão da α-sinucleína sensibiliza os

neurônios ao estresse oxidativo e ao dano por toxinas como MPP+ e 6- hidroxidopamina e

talves isso seja uma forte evidência associando parkinsonismo e disfunção mitocondrial, com

base em influência genética. (GODEIRO JUNIOR, et al., 2007).

Estudos in vitro e in vivo demonstraram que a proteína promotora da

polimerização da tubulina (TPPP/p25) interage com sistema tubulina/microtúbulo.

(HLAVANDA et al., 2002). A co-agregação α-sinucleína/tubulina parece preceder a

degeneração neurítica (LEE et al., 2006). O microtúbulo é um alvo comum de toxinas e

parkina. Acúmulo de α-sinucleína interfere com parkina e com a solubilidade e distribuição de

α-tubulina, provocando alterações de citoesqueleto e disfunção neuronais (FENG, 2006).

A superexpressão de α-sinucleína reduz a α-tubulina ubiquitinada e isso poderia

provocar o acúmulo de α-tubulina insolúvel. A parkina protege neurônios dopaminérgicos

contra toxinas despolimerizantes de microtúbulos através da atenuação da ativação da

proteína-cinase associada a microtúbulo (REN et al., 2009). A despolarização de microtúbulo

exerce maior toxicidade em neurônios dopaminérgicos, neurônios que têm longos axônios que

se projetam ao estriado (LEE et al., 2006).

1.4.4 Proteína S100B

A proteína S100B é outra importante proteína que foi implicada no

desenvolvimento e manutenção do sistema nervoso. É pertencente a uma família de proteínas

ligantes de cálcio e de baixo peso molecular, possui atividade neurotrófica e gliotrófica e está

27

localizada principalmente no SNC em astrócitos e células de Schawnn, mas pode ser

detectada em menores concentrações em outras células, como melanócitos e adipócitos. De

acordo com experimentos “in vitro”, a proteína S100B foi estudada tanto no que se refere a

suas propriedades funcionais intracelulares quanto extracelulares. Intracelularmente, ela foi

relacionada a funções biológicas, tais como regular a fosforilação de proteínas constituintes

do citoesqueleto (DONATO, 2001; ZIMMER et al., 1995)

Estudos com o objetivo de esclarecer o potencial envolvimento da S100B em

processos neurodegenerativos e os mecanismos pelos quais ela exerce seus efeitos foram

tratados com grande interesse nos últimos anos (AZMITIA et al., 1992; DONATO, 2001;

ZIMMER et al., 1995). O aumento dos níveis cerebrais desta proteína foi implicado na

fisiopatologia das alterações cerebrais presentes na DA e na Síndrome de Down, sendo que

camundongos transgênicos que super expressam a proteína S100B apresentam alterações

morfológicas e comportamentais semelhantes àquelas que ocorrem na DA e síndrome de

Down (AZMITIA et al., 1992; DONATO, 2001; ZIMMER et al., 1995).

Devido aos seus efeitos extracelulares, a proteína S100B é também considerada

uma citocina, e, desta forma, ela pode estar não somente na fisiopatologia das alterações

presentes na DA e síndrome de Down, como também na resposta inflamatória ao dano

cerebral (GRIFFIN et al., 1996).

O efeito neurotóxico da proteína S100B pode ser atribuído à estimulação de uma

enzima iNOS de astrócitos, resultando na morte celular por apoptose, tanto dos neurônios

quanto de astrócitos (DONATO, 2001; HU; VAN ELDIK, 1996; HU; FERREIRA; VAN

ELDIK, 1997) ou também mediados via interação com Receptor de Produtos de Glicação

Avançada (RAGE), levando a um aumento na produção de ERO, liberação de citocromo C e

ativação da cascata das caspases, com posterior indução de apoptose (DONATO, 2001).

1.5 NEURODEGENERAÇÃO E ATIVAÇÃO DE RAGE

O RAGE é expresso em baixa concentração em vários tipos celulares, como

células endoteliais vasculares, musculares lisas, glomerulares, macrófagos e monócitos

(BRETT et al., 1993). Em situações de acúmulo dos seus ligantes, bem como em estresse,

desenvolvimento normal, diabetes, insuficiência renal, DA (HUDSON et al., 2002;

28

NISHIKAWA; EDELSTEIN; BROWNLEE, 2000; SCHMIDT; STERN, 2000; YAN et al.,

1996) ou processos inflamatórios como a sepse (HATTORI et al., 2010). Uma das

peculiaridades da proteína RAGE é a sua capacidade de reconhecer vários ligantes,

permitindo a sua participação em um amplo espectro de eventos fisiopatológicos,

relacionados principalmente à propagação de disfunção celular (SCHMIDT; STERN, 2000).

Os ligantes da proteína RAGE mais conhecidos são os produtos finais de glicação

avançada (AGEs), que constituem um grupo heterogêneo de compostos responsáveis por

efeitos adversos, incluindo redução de atividade enzimática, danos a ácidos nucléicos,

formação de ligações cruzadas (cross-linking) entre proteínas, além de indução de vias

citotóxicas (BROWNLEE, 1994). A formação de AGEs causa alterações fisiopatológicas,

entre elas podemos citar a interação de AGEs com receptores específicos, ativando vias pró-

inflamatórias e pró-trombóticas através de estresse oxidativo e da ativação de fatores de

transcrição, como é o caso da interação AGEs-RAGE (BROWNLEE, 1995).

Além das AGEs, na sepse tem-se verificado que ocorre a ativação de RAGE e a

progressão da resposta inflamatória pela ligação com a proteína HMGB1 secretada por

macrófagos, células dendríticas, tumores, células endoteliais e também liberada com o

processo de necrose sendo detectada no soro de pacientes com sepse em estágios tardios, e

com concentração plasmática inversamente proporcional com a sobrevivência (KARLSSON

et al, 2008).

Outros ligantes de RAGE incluem os polipeptídeos S100/calgranulinas e as

anfoterinas, com efeitos ainda pouco elucidados após a interação com RAGE. No entanto,

sabe-se que ambas desempenham papel durante o desenvolvimento normal e em inflamação

do tecido nervoso (HUDSON et al., 2002). Selkoe (1994) mostrou que a proteína Aβ, formada

através da proteólise da proteína amilóide, também é um dos ligantes de RAGE, sugerindo o

envolvimento deste receptor na DA. Neste mesmo estudo foi demonstrado que RAGE atua

como mediador do transporte da proteína Aβ através da barreira sanguínea do cérebro

contribuindo para o seu depósito na membrana basal de vasos sangüíneos.

Através da ativação de RAGE uma diversificada cascata de sinalização pode ser

estimulada. Por exemplo, MAPK (Proteína quinase ativada por mitógeno) incluindo ERK1/2

(Quinase regulada por sinais extracelulares 1/2), p38 e JNK (Quinase n-terminal c-Jun), vem

sendo mostrado por ser alvo do ligante RAGE em diversos tipos de células, tal como células

tumorais, neurônios, células endoteliais, células epiteliais Caco-2, podócitos e células

microgliais. (ALESHIN et al., 2008; CHANG et al., 2008; TAGUCHI et al., 2000).

29

As MAPKs abrangem um grupo de proteínas sinalizadores utilizadas para

diversos acontecimentos celulares, através de eventos de fosforilação. Elas estão presentes em

todos os eucariotos e controlam processos de proliferação, expressões gênicas, diferenciação e

apoptose (CANO; MAHADEVAM, 1995; COHEN, 1997). Os três grupos principais de

MAPKs: ERK1/2 (ativada principalmente por estímulos mitogênicos), p38 e JNK, são

ativadas principalmente por estímulos de estresse e citocinas inflamatórias (DAVIS, 2000;

KYRIAKIS; AVRUCH, 2001). Quando ativado, ERK1/2 é responsável pela ativação de

fatores de transcrição, como Ativador de Proteina 1 (AP-1), Glicogênio sintase quinase 3β

(GSK-3β) e NF-kB (CAMPBELL et al., 1998; WEINSTEIN-OPPENHEIMER et al., 2000).

Nesse contexto, RAGE pode ser considerado como um mediador da transdução de

sinal. A ativação e translocação nuclear de NF-kB aumentam a expressão de proteínas

envolvidas na adesão de leucócitos ao endotélio, um processo implicado com o início de

lesões ateroscleróticas e de outros distúrbios vasculares (CHAVAKIS; BIERHAUS;

NAWROTH, 2004; COLLINS, 1993). Assim através dessa via, tem se verificado que a

ativação do receptor RAGE gera o aumento nas concentrações de citocinas de resposta pró-

inflamatória, como as interleucinas IL-1β e IL-6 e o TNFα entre outros (HOFMANN et al.,

1999). Logo, a liberação de TNFα promovida pela amilóide sérica, em neutrófilos, requer a

participação de sinalizadores intracelulares como p38, ERK1/2, PI3K e da ativação de fator de

transcrição, NF-kB.(HATANAKA et al., 2004).

Tal aumento da resposta inflamatória no SNC pela liberação adicional de

citocinas pró-inflamatórias com ativação de RAGE pode potencialmente estar associado à

progressão do dano cerebral causado pela quebra da BHE visto que estudos mostram que na

sepse e na SIRS há alteração na permeabilidade da barreira cerebral sanguínea e o processo

inflamatório acaba afetando os sistemas de controle do SNC, causando alterações nas funções

fisiológicas cruciais à homeostase levando a encefalopatia (CHROUSOS; GOLD, 1992)

associado à modificações do débito sanguíneo cerebral e a sua auto-regulação (BOWIE;

O’CONNOR; MAHAJAN, 2003) que são implicadas na patogênese e a hipotensão

relacionada significativamente ao desenvolvimento de dano isquêmico cerebral (BOOKE et

al., 2003).

Nesse sentido, marcadores bioquímicos presentes no cérebro associados a

fisiopatologia de doenças neurodegenerativas podem estar também ligados ao

comprometimento cognitivo a longo prazo observado em modelo animal de sepse ou déficits

cognitivos observados em pacientes que se recuperam de sepse.

30

2 JUSTIFICATIVA

A sepse é a principal causa de mortalidade em UTIs não cardiológicas em todo

mundo, especialmente em decorrência da disfunção de múltiplos órgãos. Alterações

neurológicas precoces e tardias associam-se a a esses desfechos e embora existam grupos de

pesquisadores estudando o dano ao sistema nervoso central associado à sepse, comparando

com a disfunção em outros órgãos, o dano neurológico é um campo pouco explorado e de

extrema importância visto que ocorre a disfunção cognitiva em longo prazo como a perda da

memória e aprendizado comprometendo a capacidade produtiva do paciente diminuindo a sua

qualidade de vida.

Nesse contexto, estudos nos dão suporte de que a disfunção cerebral verificada na

sepse pode possuir mecanismos comuns ligados a fisiopatologia de doenças

neurodegenerativas. Tais mecanismos estão associados ao receptor RAGE que tem sido cada

vez mais implicado na progressão da morte neuronal em muitas doenças neurodegenerativas

como a DA, sendo também um mediador inflamatório importante visto que pode ser ativado

por mediadores inflamatórios em fluidos extracelulares durante a sepse. Sendo assim,

analisamos a presença de proteínas associadas as doenças neurodegenerativas e o seu possível

envolvimento com RAGE em cérebro de ratos sobreviventes de sepse.

Essa abordagem, portanto, poderá nos proporcionar resultados que poderão ser

potencialmente úteis para o melhor entendimento dos mecanismos fisiopatológicos dos danos

cerebrais em pacientes sépticos.

31

3 OBJETIVOS

3.1 OBJETIVO GERAL

Avaliar a presença de marcadores de neurodegeneração e ativação de RAGE no

cérebro de ratos sobreviventes de sepse.

3.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS

- Avaliar o imunoconteúdo das proteínas β-amilóide, isoforma tau de DA, α-sinucleína e

S100B no hipocampo e córtex pré-frontal em ratos 30 dias após a indução de sepse.

- Avaliar o imunoconteúdo protéico do receptor RAGE no hipocampo e córtex pré-frontal

em ratos 30 dias após a indução de sepse.

- Avaliar o imunoconteúdo protéico da quinase ERK 1/2 no hipocampo e córtex pré-

frontal em ratos 30 dias após a indução de sepse.

32

4 MATERIAL E MÉTODOS

4.1 TIPO DE ESTUDO

Estudo experimental com animais.

4.1.1 Bioética

O presente estudo foi aprovado pela Comissão de Ética no Uso de Animais

(CEUA) da Universidade do Extremo Sul Catarinense – UNESC, sob protocolo 56/2011 e

obedeceu aos Princípios de Cuidados de Animais de Laboratório (Principles of Laboratory

Animal Care, Instituto Nacional de Saúde dos Estados Unidos da América, NIH, publicação

número 85-23, revisada em 1996).

4.1.2 Animais

Ratos Wistar machos, entre 2 e 3 meses de idade, pesando aproximadamente 220

a 350g procedentes do Biotério da Universidade do Extremo Sul Catarinense foram divididos

em 2 grupos (1) sham; (2) CLP e mantidos em temperatura controlada (23°C ± 1) e ciclos de

luz artificial (12 horas claro/escuro). Receberam ração comercial padronizada para ratos de

laboratório e água ad libitum. Tiveram os níveis de imunoconteúdo avaliados 30 dias após a

indução da sepse, com n mínimo necessário para dosagem de cada parâmetro, totalizando 20

animais (n = 10 por grupo).

33

4.1.3 Indução de sepse

Sepse intra-abdominal foi produzida usando a técnica de CLP conforme

previamente descrito (RITTER, 2004). Brevemente, os ratos foram anestesiados com

cetamina (80 mg/kg) e xilazina (10 mg/kg), sendo submetidos à laparotomia com incisão

mediana abdominal. O ceco foi ligado logo abaixo da junção íleo-cecal com fio seda 3-0,

mantendo assim a continuidade intestinal. O ceco foi perfurado com uma agulha número 14

na face antimesentérica do ceco, e foi gentilmente comprimido até a extrusão de conteúdo

fecal. Os planos cirúrgicos foram fechados e os ratos foram observados em caixa de

recuperação por 2 horas. Como controle utilizamos animais submetidos a laparotomia, com

manipulação do ceco, mas sem ligação ou perfuração (sham). Os grupos sepse e sham

receberam reposição volêmica, realizada com salina, 50 mL/kg, imediatamente e 12 horas

após a cirurgia e ceftriaxona 30 mg / kg e 25 clindamicina mg / kg por via subcutânea a cada

6 horas por 3 dias. Ainda, após o procedimento cirúrgico os animais receberam 80 mg/kg de

dipirona sódica (i.m) para analgesia (PRADO; PONTES, 2002).

Trinta dias após a cirurgia os animais foram mortos por decaptação e isolados o

hipocampo w córtex pré-frontal. Os tecidos cerebrais foram congelados em freezer a -80°C

para que não ocorrece alterações.

4.1.4 Immunoblotting

Os tecidos cerebrais, hipocampo e córtex pré-frontal foram macerados picados e

imediatamente homogeneizados em tampão de extração. O extrato foi centrifugado a 11.000

rpm e 4°C por 40 min para remover o material insolúvel e o sobrenadante foi utilizado para a

quantificação da proteína, utilizando o método de Bradford (BRADFORD, 1976). As

proteínas foram desnaturadas por fervura (LAEMMLI, 1970) e o tampão contendo a amostra

foi submetido a corrida eletroforética em dodecil sulfato de sódio (SDS-PAGE) e transferidas

para membrana de nitrocelulose. A membrana foi bloqueada, submetida à sonda, conforme

método descrito anteriormente (DE SOUZA et al., 2005). Os anticorpos utilizados para o

immunoblotting foram (anti-RAGE, R5278; anti-isoforma tau de DA, A8855; comercializada

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Prado%20WA%22%5BAuthor%5D


34

por Sigma; anti-S100B, ab41548; anti-α-sinucleína, ab6162; comercializada por Abcam; anti-

β-amilóide, No 2454 e anti-ERK 1/2, No 4376, comercializada por Cell Signaling

Technology) e anti-β-actina como controle. A intensidade das bandas foi quantificada por

densitometria óptica em autorradiografias. .

4.2 ANÁLISE ESTATÍSTICA

Os resultados foram expressos como média ± desvio padrão e o p<0.05 foi

considerado significativo. As diferenças entre os grupos foram determinadas por teste t

Student. Todas as análises estatísticas foram realizadas com o software SPSS 19.0 (SPSS,

Chicago, IL).

35

5 RESULTADOS

Após 30 dias da indução da sepse por CLP, foram analisados os imunoconteúdos

de diferentes marcadores bioquímicos de neurodegeneração no hipocampo e no córtex pré-

frontal dos animais que foram submetidos a sepse.

Inicialmente observamos que no grupo CLP em comparação com animais sham, o

imunoconteúdo de Aβ e α-sinucleína foram ambos significativamente aumentados no

hipocampo (Fig. 1). Ainda, usando um anticorpo desenvolvido para detectar a isoforma da tau

predominante em tecidos cerebrais de pacientes com DA, observamos que o imunoconteúdo

de tau-DA também foi aumentada no hipocampo nos ratos CLP em relação a sham (Fig. 1).

Figura 1 – Imunoconteúdo de Aβ, α-sinucleína e tau-DA no hipocampo dos animais sobreviventes a sepse

comparado ao grupo controle (sham). Imunoblots representativos de amostras individuais de animais

sham e CLP são mostrados, e os gráficos de barras representam os valores médios ± desvio padrão

normalizado por imunoconteúdo de β-actina. Os dados foram analisados pelo teste t (*p<0,05 em relaçao

ao grupo sham).

36

Quando observamos a expressão das mesmas proteínas no córtex pré-frontal,

verificamos que o grupo CLP em comparação com o grupo sham, o imunoconteúdo de Aβ e

tau-DA não apresentaram aumento significativo. No entanto, o imunocontéudo de α-

sinucleína foi significativamente aumentada no grupo CLP (Figura 2).

Figura 2 – Imunoconteúdo de Aβ, α-sinucleína e tau-DA no córtex pré-frontal dos animais sobreviventes a

sepse comparado ao grupo controle (sham). Imunoblots representativo de amostras individuais de animais

sham e CLP são mostrados, e os gráficos de barras representam os valores médios ± desvio padrão

normalizado por imunoconteúdo de β-actina. Os dados foram analisados pelo teste t (*p<0,05 em relaçao

ao grupo sham).

Para as mesmas amostras utilizadas para determinar Aβ, α-sinucleína e tau-DA

verificamos o imunoconteúdo de RAGE e a fosforilação de ERK1/2 no hipocampo. Nesse

sentido, as análises mostraram um aumento na expressão RAGE e ativação de ERK1/2 no

hipocampo dos animais submetidos a CLP em relação ao grupo sham (Fig. 3).

37

Figura 3 – Imunoconteúdo de RAGE, S100B e ERK1/2 fosforilada no hipocampo dos animais

sobreviventes sepse comparado ao grupo controle (sham). Imunoblots representativos de amostras

individuais de animais sham e CLP são mostrados, e os gráficos de barras representam os valores médios

± desvio padrão normalizado por imunoconteúdo β-actina. Níveis de fosforilação de ERK1/2 foram

normalizados pelo imunoconteúdo total de ERK1/2. Os dados foram analisados pelo teste t (*p<0,05 em

relação ao grupo sham).

Quando observamos tais parâmetros no cortex pré-frontal , assim como no hipocampo,

o imunoconteúdo de RAGE também aumentou no grupo CLP em relação a sham, entretanto

não observamos modificações no estado de ativação de ERK1/2 (Fig. 4).

38

Figura 4 – Imunoconteúdo de RAGE, S100B e ERK1/2 fosforilada no cortex pré-frontal dos animais

sobreviventes sepse comparado ao grupo controle (sham). Imunoblots representativosde amostras

individuais de animais sham e CLP são mostrados, e os gráficos de barras representam os valores médios

± desvio padrão normalizado por imunoconteúdo β-actina. Níveis de fosforilação de ERK1/2 foram

normalizados pelo imunoconteúdo total de ERK1/2. Os dados foram analisados pelo teste t (*p<0,05 em

relação ao grupo sham).

Ainda em relação as figuras 3 e 4 verificamos os níveis de S100B no hipocampo e

cortex pré-frontal dos animais sobreviventes de sepse. Encontramos evidências de que o

imunoconteúdo de S100B em animais CLP não foi diferente do grupo sham tanto no

hipocampo quanto no cortex pré-frontal 30 dias após CLP.

39

6 DISCUSSÕES

Na amplitude das manifestações clínicas da sepse, a encefalopatia séptica é uma

das mais comuns, embora pouco diagnosticada, além de ser a causa de maior taxa de

mortalidade. Em modelo animal de sepse polimicrobiana, ocorre a encefalopatia aguda e os

sobreviventes apresentam danos cognitivos no SNC. Além disso, sobreviventes de UTIs,

incluindo pacientes sépticos, podem ter morbidade associada ao cérebro incluindo déficit

cognitivo e desenvolvimento de distúrbios psiquiátricos (DAL PIZZOL et al., 2010).

Nesse sentido, os resultados encontrados no presente estudo sugerem pela

primeira vez, que o estímulo inflamatório sistêmico agudo está associado ao aparecimento de

marcadores bioquímicos de neurodegeneração no cérebro, tais como, Aβ, tau-DA, α-

sinucleína e RAGE que se assemelha a diversos tipos de doenças cerebrais associadas a idade.

Nosso estudo propõe que a ativação da via Aβ-RAGE-ERK1/2 pode ser

importante para o comprometimento cognitivo a longo prazo observado em modelo animal

de sepse, e também pode estar implicado no déficit cognitivo persistente observado em alguns

pacientes que se recuperam de sepse.

Há um número crescente de evidências que relatam que a inflamação e

neurodegeneração são eventos relacionados (SEMMLER et al.; 2005). Procalcitonina (PCT)

no líquido cefalorraquidiano foi encontrado em níveis significativamente aumentados em

pacientes com DA, demência vascular, demência com corpos de Lewy e a demência

frontotemporal, semelhante ao observado em estados agudos neuroinflamatórios, como na

encefalite e meningite (ERNST et al., 2007). Isto indica que a inflamação central pode ter um

papel no desenvolvimento de doenças neurodegenerativas crônicas.

Neurodegeneração também está relacionada à inflamação sistêmica, o que é

exemplificado pela infecção pelo HIV. A patologia geralmente atribuída a DA foi visto em

pacientes HIV+, incluindo deposição aumentada de Aβ no cérebro, formação de placas

amilóides extracelulares e níveis de Aβ diminuído no líquido cefalorraquidiano. A DP pode

ser outra doença particularmente potencial para pacientes idosos HIV+, dada a importância

dos núcleos da base e vias dopaminérgicas em ambas as doenças (VALCOUR; PAUL, 2006).

Além disso, eventos inflamatórios sistêmicos agudos foram associados com um

aumento de 2 vezes na taxa de declínio cognitivo ao longo de um período de 6 meses em

pacientes DA (HOLMES et al., 2009). Neste contexto, foi demonstrado, em modelo animal,

40

que a administração intracerebroventricular de proteína C-reativa está associada à perda de

memória e fase inicial da patogênese da DA (LIN et al., 2009).

Até o momento, consequências a longo prazo da encefalopatia séptica sobre a

função cerebral são pouco compreendidas. Foi demonstrado em modelo animal que o

comprometimento comportamental foi independente dos níveis de glicose cerebral, mas

dependente do gene iNOS, sugerindo uma relação com a ativação microglial sustentada

(WEBERPALS et al., 2009). Além disso, temos relatado anteriormente que as fases iniciais

da sepse são caracterizadas pelo aumento na produção de ERO levando ao estresse oxidativo

(BARICHELLO et al, 2006) e que o tratamento antioxidante durante a disfunção cerebral na

fase aguda induzida por CLP, preveniu o desenvolvimento de déficit cognitivo tardio

(BARICHELLO et al, 2007b).

Uma vez que o estresse oxidativo e a inflamação são eventos relacionados em

doenças neurodegenerativas e na sepse, é possível que tanto o estresse oxidativo e ativação da

microglia colaboram para o dano cognitivo a longo prazo observado em sobreviventes de

sepse. Microglias são fontes comuns de estresse oxidativo e mediadores pró-inflamatório em

DA como mostrado por observações consistentes de resposta inflamatória alto-regulada em

regiões cerebrais que expoem altos níveis de marcadores patológicos na DA, tais como, o

córtex frontal e região límbica (CRAS et al., 1990 e GOOD et al., 1996). Por outro lado, esses

marcadores de inflamação ou estresse oxidativo estão ausentes ou mínimos em regiões do

cérebro que normalmente são menos suscetíveis a eventos neurotóxicos relacionados à

patologia, como o cerebelo (AKIYAMA et al, 2000).

Foi sugerido que tanto a inflamação como estresse oxidativo aumentam antes de

um diagnóstico da DA (ou pelo menos no início de DA), devido à super-ativação de certas

respostas pró-inflamatórias por fagócitos mononucleares, reforçando a nossa sugestão de que

a inflamação cerebral precoce e estresse oxidativo pode estar relacionado com a ocorrência de

marcadores tardios de neurodegeneração (FAGIOLO et al., 1993; NUNOMURA et al., 2001).

Além disso, mediadores inflamatórios liberados por leucócitos resultam na deficiência

neuronal (PAPADOPOULOS et al., 2000), causando a disfunção da BHE que aumenta a

progressão de várias doenças do SNC (WEISS et al., 2009).

Os receptores TLRs desempenham um papel importante na resposta inflamatória

inata na sepse (FULOP et al., 2004). Esses receptores podem estar associados com o

envelhecimento normal e doenças neurodegenerativas, interligando a inflamação com

patologia cerebral. A expressão de TLR4 é encontrada em neutrófilos não estimulados de

indivíduos idosos, quando comparados com indivíduos jovens, sugerindo uma inflamação de

41

baixo grau no envelhecimento humano (FULOP et al., 2004). Contudo, foi demonstrado que o

polimorfismo pró-inflamatório do gene TLR4 é um fator de risco independente para o

desenvolvimento de DA (MINORETTI et al., 2006).

Observamos também que há evidências farmacológicas ligadas ao dano cognitivo

a longo prazo associado a sepse e doenças neurodegenerativas (CASSOL JUNIOR et al.,

2010; COMIM et al., 2009a; COMIM et al., 2009b). Essas mudanças também são

temporalmente correlacionadas com a ocorrência de déficits cognitivos em tarefas

dependentes dos circuitos hipocampais (TUON et al., 2008), sugerindo uma relação entre

esses dois fenômenos. Portanto, uma vez que essas modificações são comumente associados a

doenças neurodegenerativas e/ou processos neurotóxicos agudos, nossos resultados indicaram

uma alteração nos níveis de proteínas no cérebro associadas a neurodegeneração em sepse.

Dessa forma, como a Aβ desempenha um papel central nos eventos neurotóxicos

celulares relacionados a doenças neurodegenerativas, como AD, nós também investigamos

uma via relacionada com a neurotoxicidade de Aβ nestes animais. Nossos resultados

apresentaram que a Aβ está aumentada no hipocampo de ratos sobreviventes a sepse, isso

porque RAGE atua como um sitio de ligação na superfície celular para Aβ, que resulta na

ativação de vias controladas por MAPK associadas à apoptose neuronal, produção de espécies

reativas dependentes de NADPH oxidase, disfunção sináptica e declínio cognitivo, bem como

o desenvolvimento de respostas inflamatórias em DA (ARANCIO et al., 2004 e LECLERC et

al., 2009).

Além disso, um dos principais alvos intracelulares da ativação do RAGE é o fator

de transcrição NF-kB, que induz a expressão de fator estimulador de colônia de macrófagos

que ativa a microglia , perpetuando a resposta inflamatória cerebral e o estresse oxidativo (DU

YAN et al., 1997). Como o gene RAGE também contém um elemento de resposta para NF-

kB (p65), a ligação da Aβ a RAGE resulta em um ciclo de feedback positivo de indução de

RAGE, que por sua vez aumenta ainda mais a inflamação no cérebro, o estresse oxidativo e a

produção Aβ (CREAGHT-BROWN et al., 2010; CREAGH-BROWN; QUINLAN; EVANS,

2010).

Nesse sentido, encontramos no presente estudo, um aumento dos níveis de RAGE

nas duas estruturas estudadas, mostrando a relação de ativação de RAGE em sobreviventes de

sepse. Nossos resultados no entanto não demonstraram relação da alta expressão de RAGE

com níveis de S100B visto que trata-se de outro ligante de RAGE, provavelmente por sua

superexpressão se apresentar na fase aguda do desenvolvimento de sepse (LIPCSEY et al.,

2010).

42

Como alvo da ativação de RAGE temos como resultado a ativação das MAPKs

que podem ser expressas nas células neuronais no SNC durante estados dinâmicos em

resposta de vários estímulos externos, tais como, fatores de crescimento, o glutamato e

hormônios, fatores de estresse (por exemplo, estresse oxidativo e hipóxia) e agentes

patogênicos (ORIGLIA et al., 2009). Entre elas, as ERK1/2 são frequentemente descritas

como alvos primários da ativação do RAGE entre as proteínas quinases intracelulares (YANG

et al., 2008) . A ERK1 e ERK 2 são moléculas que desempenham um papel importante na

cascata de sinalização intracelular, nas quais a fosforilação é induzida como parte da resposta

celular a vários estímulos (THOMAS; HUGANIR, 2004). Estudos recentes sobre retardo

mental humano sugerem que ERK1/2 desempenham um papel prejudicial na aprendizagem

(COSTA; SILVA, 2002).

Além disso, resultados tem mostrado que ERKs são envolvidas em diversas

formas de plasticidade sináptica no hipocampo e em outras áreas do cérebro que envolvem o

processo de aprendizagem e memória (THOMAS; HUGANIR, 2004) o que pode estar

associado aos nossos achados com aumento significativo da fosforilação de ERK 1/2 no

hipocampo.

Ainda, recentemente foi demonstrado que a ativação do RAGE induz

hiperfosforilação de tau pela ativação de GSK-3 em modelos animais e celulares, e o bloqueio

desse efeito em ratos restaura o comprometimento do potencial a longo prazo, a diminuição

de proteínas sinápticas e deterioração da memória (LI et al., 2010). Anormalmente tau

fosforilada é o primeiro passo na formação de emaranhados neurofibrilares, causando

deterioração neurítica e formando depósitos de proteínas hidrofóbicas anormais observadas

em AD e outras doenças neurodegenerativas. (LI et al., 2005)

O polimorfismo RAGE G82S (associado com afinidade de ligantes de RAGE

aumentado) também foi associado com o início precoce em DA, e com aumento significativo

na imunorreatividade de RAGE (LI et al., 2010). Além desta quantidade cada vez maior de

dados apontando para este receptor, como um dos principais mediadores da sinalização

neurotóxica no cérebro, também foi demonstrado um papel significativo para RAGE na

progressão da neurodegeneração, como esta proteína foi identificado para mediar o transporte

de Aβ através da BHE, sendo assim a principal causa de translocação de Aβ sistêmica para o

SNC (CANDELA et al., 2010).

Nesse sentido, por tudo o que foi mencionado até o momento, nossos achados

sugerem que o cérebro de sobreviventes de sepse é caracterizado por um aumento de

marcadores potenciais de neurodegeneração associados a alteração do receptor RAGE.

43

7 CONCLUSÕES

O hipocampo dos ratos sobreviventes de sepse apresentou níveis aumentados de

Aβ, α-sinucleína e tau-DA enquanto o córtex pré-frontal apresentou resultados aumentados

para α-sinucleína, ambas estruturas parecem estar associados a alterações de vias secundárias

a ativação de RAGE.

44

8 PERSPECTIVAS

Nosso propósito como continuidade para o estudo até agora apresentado, está

relacionado à investigação da ação de RAGE em sobreviventes de sepse sob modelo animal

de CLP. Portanto pretendemos verificar o dano cerebral a longo prazo em camundongos

knockot de RAGE além da ação de inibidores de RAGE em animais submetidos ao modelo de

sepse por CLP.

Essa abordagem nos proporcionará resultados mais refinados que poderão ser

potencialmente úteis para o desenvolvimento de novas estratégias terapêuticas para a sepse.

45

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60

APÊNDICE

61

APÊNDICE A – Artigo da Dissertação

Brain markers of neurodegeneration in sepsis survivor rats

Samantha Pereira Miguel BSc; Matheus Pasquali MSc; Daniel Pens Gelain PhD; Francieli

Vuolo BSc, João Quevedo MD, PhD; José Cláudio Fonseca Moreira PhD Felipe Dal-Pizzol

MD, PhD; Fabricia Petronilho PhD

Artigo científico a submetido para publicação ao periódico

SHOCK: Injury, Inflammation, and Sepsis: Laboratory and Clinical Approaches

62

Brain markers of neurodegeneration in sepsis survivor rats

Samantha Pereira Miguel BSc1; Matheus Pasquali MSc

2; Daniel Pens Gelain PhD

2; Francieli

Vuolo BSc3, João Quevedo MD, PhD

4; José Cláudio Fonseca Moreira PhD

2 Felipe Dal-Pizzol

MD, PhD3; Fabricia Petronilho PhD

1

1 Postgraduate Program in Health Sciences, University of Southern Santa Catarina, Tubarão,

Santa Catarina, Brazil.

2Center of Oxidative Stress Research, Professor Tuiskon Dick Department of Biochemistry,

Institute of Health Basic Sciences, Federal University of the Rio Grande do Sul (UFRGS),

Porto Alegre, Rio Grande do Sul, Brazil.

3Experimental Physiopathology Laboratory and National Institute of Translational Science

and Technology in Medicine, Postgraduate Program in Health Sciences, University of the

Extreme-South Catarinense, Criciúma, Santa Catarina, Brazil.

4Laboratory of Neurosciences and National Institute of Translational Science and Technology

in Medicine, Postgraduate Program in Health Sciences, University of the Extreme-South

Catarinense, Criciúma, Santa Catarina, Brazil.

Address requests for reprints to: Prof. Dra. Fabricia Petronilho. Programa de Pós-graduaçao

em Ciências da Saúde, Universidade do Sul de Santa Catarina, Avenida José Acácio Moreira,

787, Bairro Dehon, Tubarão, SC, Brazil, 88704-900. E-mail address:

[email protected]. Phone / fax: 55 48 3621-3363

Running head: Neurodegeneration and sepsis

mailto:[email protected]

63

Abstract

Survivors from sepsis presented cognitive deficits associated with decreased quality of

life and increased long-term morbidity. Some of these alterations resembled the

pathophysiological mechanisms of neurodegenerative diseases. The receptor for advanced

glycation (RAGE) has been increasingly implicated in the progression of neuronal death in

many neurodegenerative diseases, such as Alzheimer’s Disease (AD), and is also an important

pro-inflammatory mediator. For this reason, we analyzed biochemical parameters related to

neurodegeneration in rats that survived sepsis, and their possible involvement with RAGE.

Rats were subjected to sepsis by cecal ligation and puncture (CLP), and thirty days after

surgery the hippocampus and pre-frontal cortex have been isolated. The immunocontent of β-

amyloid peptide (Aβ), α-synuclein and AD-like tau were analyzed by western blot. Besides,

we analyzed the immunocontent of RAGE, the activation state of its downstream signaling

kinase ERK 1/2 and the presence of the RAGE agonist S100B. Alpha-synuclein, Aβ and AD-

like tau were increased in the hippocampus, but not in the pre-frontal cortex. RAGE was

upregulated in both structures, but activated ERK 1/2 was observed only in hippocampus. The

immunocontent of S100B was not different from control at both structures. In conclusion,

brain from sepsis survivor animals presented several markers of neurodegeneration suggesting

that the RAGE-MAPK pathway could be responsible to long-term cognitive deficits in sepsis

survivors.

KEY WORDS: sepsis; neurodegeneration; RAGE; brain dysfunction; long-term deficits

64

INTRODUCTION

The brain may be one of the first organs affected in sepsis. In fact, sepsis-associated

delirium is a frequent feature associated with increased morbidity and mortality [1]. Recently,

cognitive deficits associated with decreased quality of life and increased long-term morbidity

were observed in sepsis survivors [2]. Despite its clinical impact, the pathophysiology of

central nervous system (CNS) dysfunction during sepsis remains poorly understood.

In animal models, acute encephalopathy is observed in the course of sepsis [3], and

survivors were described to present long-term cognitive impairment [4]. Such models

represent an important tool to study the mechanisms associated with CNS dysfunction during

and after sepsis. Central cholinergic deficiency is the leading hypothesized mechanism for

delirium [5], a finding that overlaps the pathophysiological mechanisms for delirium,

Alzheimer’s Disease (AD) and neurodegeneration [6]. Thus, delirium and dementia may

represent different points along a continuum of cognitive disorders. Recently, Semmler et al.

demonstrated neuronal loss in hippocampal subregions and in the prefrontal cortex, and

reduced cholinergic innervation of postrolandic cortical areas in sepsis survivor animals - a

feature similar to that observed in AD patients [7]. This similarity was also demonstrated by

our group using rivastigmine to reverse long-term cognitive deficits in sepsis survivor animals

[8].

Neurodegenerative disorders share common mechanisms directly associated to the

pathological aggregation of misfolded proteins. These accumulate as fibrillar amyloid

deposits in selectively vulnerable regions of the CNS [9]. In AD, abnormally phosphorylated

tau proteins form neurofibrillary tangles, and beta-amyloid peptide (Aβ) accumulates in the

extracellular environment and forms amyloid plaques, which cause neuronal cell death as

65

consequence of hydrophobic misfolded protein aggregation [10]. Beta-amyloid peptide is also

able to trigger the activation of the receptor for advanced glycation endproducts (RAGE).

RAGE activation induces the phosphorylation of MAP kinases (MAPKs), stimulates the NF-

kB-dependent production of pro-inflammatory cytokines and enhances the production of

reactive oxygen species by NADPH oxidase [11]. These are all important cellular events in

the progression of neurodegeneration [12]. Furthermore, RAGE may be activated by

HMGB1, which is increased in extracellular fluids during sepsis, and also by S100B, which is

a relevant protein to brain dysfunction [13].

These evidences point to a major role of RAGE in the mechanisms underlying the pro-

inflammatory-neurocytotoxic axis in both sepsis-induced encephalopathy and some

neurodegenereative diseases. Thus, the aim of the present work was to study the presence of

biochemical markers of neurodegeneration in the brain of sepsis survivor rats and their

possible relationship with the regulation of RAGE immunocontent.

MATERIALS AND METHODS

Animals

Adult male Wistar rats (220 to 300 g) were obtained from our breeding colony. They

were housed five to a cage with food and water available ad libitum and were maintained on a

12-hour light/dark cycle (lights on at 7 a.m.). All experimental procedures involving animals

were performed in accordance with the National Institutes of Health Guide for the Care and

Use of Laboratory Animals and approved by the local Ethic Board in Research.

Cecal ligation and perforation (CLP) surgery

66

Animals were subjected to CLP as described [14] with adaptations [15]. Briefly, rats

were anesthetized with a mixture of ketamine (80 mg/kg) and xylazine (10 mg/kg) given

intraperitoneally. Under aseptic conditions, a 3-cm midline laparotomy was performed to

allow exposure of the cecum with the adjoining intestine. The cecum was tightly ligated with

a 3.0 silk suture at its base, below the ileocecal valve, and was perforated once with a 14-

gauge needle. The cecum was then gently squeezed to extrude a small amount of feces from

the perforation site returned to the peritoneal cavity, and the laparotomy was closed with 4.0

silk sutures. Animals were resuscitated with normal saline (50 mL/kg subcutaneously)

immediately and 12 hours after CLP. All animals were returned to their cages with free access

to food and water. In the sham-operated group, the rats were submitted to all surgical

procedures but the cecum was neither ligated nor perforated. After surgery, animals received

30 mg/kg ceftriaxone and 25 mg/kg clindamycin subcutaneously every 6 hours for a total of 3

days. Survival rates were 100% in the sham group and 43% in the sepsis group, which were in

accordance with our previous reports [15]. Animals were randomly distributed to sham and

CLP groups. Thirty days after surgery the animals were killed, and hippocampus and pre-

frontal cortex isolated. We choose this period of time since we previously demonstrated

several cognitive dysfunctions in sepsis survival animals 30 days after CLP [4, 16-19].

Western Blot Analyses

Hippocampus and frontal cortex samples were homogenized in Laemmli-sample

buffer (62.5mM Tris-HCl, pH 6.8, 1% (w/v) SDS, 10% (v/v) glycerol) and equal amounts of

cell protein (30 µg/well) were fractionated by SDS-PAGE and electro-blotted onto

nitrocellulose membranes. Protein loading and electro-blotting efficiency were verified

through Ponceau S staining, and the membrane was blocked in Tween-Tris buffered saline

(TTBS: 100mM Tris-HCl, pH 7.5, containing 0.9% NaCl and 0.1% Tween-20) containing 5%

67

albumin. Membranes were incubated overnight at 4ºC with primary antibody diluted at

1:1000 in TTBS (1:1000) (anti-RAGE, R5278; anti-Alzheimer’s disease isoform tau, A8855;

were purchased from Sigma; anti-S100B, ab41548; anti-α-synuclein, ab6162; were purchased

from Abcam; anti-Aβ, No 2454; anti-ERK1/2, No 4376 and anti-phospho-ERK1/2 N. 4370,

were purchased from Cell Signaling Technology) and then washed with TTBS. Anti-IgG

from mouse or rabbit (according the species that originated the primary antibody) linked to a

peroxidase was then incubated with the membrane for additional 2 h at room temperature

(1:5000 dilution range), the membrane was washed again and the immunoreactivity was

detected by enhanced chemiluminescence using Pierce WestPico Chemiluminescence kit.

Densitometric analysis of the films was performed with ImageQuant software. Blots were

developed to be linear in the range used for densitometry.

Statistical analyses

The results are expressed as means ± SE in all figures. Differences among groups were

compared by t-test. All statistical analysis were performed with SPSS® 12.0 for Windows and

statistical significance was assigned to P<0.05.

RESULTS

After 30 days of sepsis induction by CLP, we analyzed the immunocontent of different

biochemical markers of neurodegeneration in the hippocampus and prefrontal cortex of septic

animals. Compared to sham animals, the immunocontent of both Aβ and α-synuclein were

significantly increased in the hippocampus (Fig. 1A). Using an antibody developed to detect

the isoform of tau predominant in brain tissues of Alzheimer’s disease patients, we observed

that the immunocontent of this pathogenic tau (“AD-like tau”) was also enhanced (Fig. 1A).

68

In the prefrontal cortex, only α-synuclein immunocontent was increased (Fig. 1B). Since these

modifications are commonly associated to neurodegenerative conditions and/or acute

neurotoxic processes, this result indicates a persistent biochemical dysfunction in brain. These

changes are also temporally correlated with the occurrence of cognitive deficits in tasks

dependent on hippocampus circuits [20], suggesting a relationship between these two

phenomena. Since Aβ plays a central role in cellular neurotoxic events related to

neurodegenerative disorders such as AD, we also investigated a pathway related to Aβ

neurotoxicity in these animals.

Overexpression and activation of RAGE in CNS have been increasingly implicated in

the progression of neurodegeneration observed in AD and other neurodegenerative disorders

[11]. The neurotoxicity related to RAGE signaling in brain is believed to be related both to

mechanisms that enhance RAGE expression and/or the production and secretion of RAGE

ligands, such as Aβ, S100B and AGEs [21]. Once activated by its ligands, RAGE induces the

phosphorylation of MAPKs such as ERK1/2, which triggers a phosphorylation cascade that

results in increased expression of pro-inflammatory cytokines and NADPH oxidase [11].

These events, in turn, are described to induce free radical production, recruitment and

activation of microglia which enhance Aβ production and tau hyperphosphorylation, thus

leading to a positive feedback cycle of neurotoxicity. We then analyzed the immunocontent of

RAGE and the phosphorylation state (i.e. activation) of ERK1/2 in the hippocampus and pre-

frontal cortex of septic animals 30 days of CLP. We also analyzed the immunocontent of

S100B, which is another RAGE ligand and was previously demonstrated to be overexpressed

in the acute phase of sepsis development [22]. Western blot analysis of the same samples used

to determine Aβ, α-synuclein and phosphorylated tau showed increased RAGE expression

and ERK1/2 activation in hippocampus of septic animals (Fig 2A). The immunocontent of

RAGE was also increased in pre-frontal cortex, but there were no modifications in the

69

activation state of ERK1/2 (Fig. 2B). Finally, the immunocontent of S100B in septic animals

was not different from sham group in both structures (Fig. 2A and B).

DISCUSSION

The findings of the present study suggest, for the first time, that the acute systemic

inflammatory stimulus is associated to the appearance of biochemical markers of

neurodegeneration in the brain that resembles several kinds of age-related brain diseases, such

as Aβ, AD-like tau, α-synuclein and RAGE. We propose that the activation of Aβ-RAGE-

ERK1/2 pathway could be important to the long-term cognitive impairment observed in this

animal model, and it also may be implicated in the persistent cognitive deficits observed in

some patients that recover from sepsis.

There is increasing evidence that inflammation and neurodegeneration are related

events. Procalcitonin (PCT) in cerebrospinal fluid was found to be significantly increased in

patients with AD, vascular dementia, dementia with Lewy bodies and frontotemporal

dementia in pattern similar to that observed in acute neuroinflammatory states, such as in

encephalitis and meningitis [23]. This indicates that central inflammation could have a role in

the development of chronic neurodegenerative diseases. Neurodegeneration is also related to

systemic inflammation, which is exemplified by HIV infection. The pathology typically

attributed to AD has now been reported in HIV+ patients, including increased brain Aβ

deposition, extracellular amyloid plaques formation and decreased CSF Aβ levels [24] .

Parkinson disease may be another particularly potential disease for older HIV+ patients, given

the importance of the basal ganglia and dopaminergic pathways in both diseases [24]. In

addition, acute systemic inflammatory events were associated with a 2-fold increase in the

70

rate of cognitive decline over a 6-month period in AD patients [25]. In this context, it was

demonstrated, in an animal model, that the intracerebroventricular administration of C-

reactive protein was associated to memory loss and early phase of AD pathogenesis [26].

Toll-like transmembrane receptors (TLRs) play an important role in innate

inflammatory response in sepsis [27]. These receptors could be associated with normal aging

and neurodegenerative disorders, linking inflammation to brain pathology. Expression of

TLR4 is enhanced in lipid rafts and non-raft membrane fractions in non-stimulated

neutrophils from elderly individuals compared to young subjects, suggesting a low-grade

inflammation in human ageing [27]. In addition, it was demonstrated that the pro-

inflammatory polymorphism of TLR4 gene is an independent risk factor for developing AD

[28].

To date, long-term consequences of septic encephalopathy on cerebral function are

poorly understood. It was demonstrated in a murine model that the behavioral impairment

was independent of the cerebral glucose levels, but dependent on the inducible nitric oxide

synthase gene, thus suggesting a relation with sustained microglial activation [29].

Furthermore, we have previously reported that early phases of sepsis are characterized by

enhanced reactive species production leading to oxidative stress [30]. Antioxidant treatment

during this CLP-induced acute phase of brain dysfunction prevented the development of late

cognitive deficits in an animal model of sepsis [31].

Since oxidative stress and inflammation are related events in both neurodegenerative

disorders and in sepsis, it is possible that both oxidative stress and microglia activation

collaborate to the long-term cognitive impairments observed in sepsis survivors. Microglia

are the common source of pro-inflammatory and oxidative stress in AD as shown by

consistent gross observations of upregulated inflammatory responses in brain regions that

71

exhibit high levels of AD pathological markers such as the frontal and limbic cortices [32,

33]. Conversely, these markers of inflammation or oxidative stress are absent or minimal in

brain regions which are typically less susceptible to neurotoxic events related to AD

pathology, such as cerebellum [34]. It was suggested that inflammation and oxidative stress

both increase prior to a diagnosis of AD (or at least early in AD) due to over-activation of

certain pro-inflammatory responses by mononuclear phagocytes, reinforcing our suggestion

that early brain inflammation and oxidative stress could be related to the occurrence of late

markers of neurodegeneration [35, 36]. We also observed that pharmacological evidences

linked sepsis-associated long-term cognitive impairment to neurodegenerative diseases [8, 19,

37, 38].

RAGE, a multiligand receptor in the immunoglobulin superfamily, acts as a cell

surface binding site for Aβ, which results in the activation of MAPK-controlled pathways

associated to neuronal apoptosis, NADPH oxidase-dependent reactive species production,

synaptic dysfunction and cognitive decline, as well as development of inflammatory

responses in AD [39, 40]. Besides, one of the main intracellular targets of RAGE activation is

the transcription factor NF-κB, which induces expression of macrophage-colony stimulating

factor that activates microglia, thus perpetuating the brain inflammatory response and

oxidative stress [41]. Since the RAGE gene also contains a response element for NF- κB

(p65), binding of Aβ to RAGE results in a positive feedback cycle of RAGE induction, which

in turn further increases brain inflammation, oxidative stress and Aβ production [42, 43].

Phosphorylation of MAPK is one of the main consequences of RAGE activation by

Aβ and other ligands, such as AGEs, HMGB1 and S100B. ERK1/2 are frequently described

as the primary targets of RAGE activation among intracellular protein kinases [44]. Recently,

it was demonstrated that RAGE activation induces tau hyperphosphorylation by activation of

GSK-3 in animal and cellular models, and blockade of this effect in rats restores the

72

impairment of LTP and memory deterioration [45]. Abnormally phosphorylated tau is the

first step in the formation of neurofibrillary tangles, causing neurite deterioration and forming

hydrophobic deposits of misfolded proteins observed in AD and other neurodegenerative

conditions.

It has been recently demonstrated that the RAGE G82S polymorphism (associated

with increased ligand affinity of RAGE) is associated with early onset AD , and significant

increase in RAGE immunoreactivity was observed in early AD-like pathology [46]. Besides

this increasingly amount of data pointing this receptor as one of the major mediators of

neurotoxic signaling in brain, it was also demonstrated a striking role for RAGE in the

progression of neurodegeneration, as this protein was identified to mediate the transport of Aβ

across the blood-brain barrier, thus being the major cause of translocation of systemic Aβ to

the CNS [47]. In this context, our results suggest that the brain of sepsis survivors are

characterized by a persistent increased of several potential mediators of neurodegeneration of

the RAGE pathway.

In conclusion, we demonstrated that brain from sepsis survivors animals presented

several markers of neurodegeneration and suggested that the Aβ-RAGE-MAPK pathway

could be a major pathway responsible to long-term cognitive deficits in sepsis survivors.

Further studies will address the relationship among the persistence of cognitive impairment in

sepsis survivors with RAGE expression, activation and the systemic and cerebral production

of RAGE ligands.

ACKNOWLEDGEMENTS

Supported by grants from the National Council for Scientific and Technological Development

(CNPq), FAPERGS PqG 2010 (1008860) and Universidade do Extremo Sul Catarinense.

73

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FIGURE LEGENDS

Figure 1 – Immunocontent of neurodegeneration markers in the hippocampus and pre-

frontal cortex of sepsis survivor animals compared to control (sham). Sepsis was induced

by CLP and after thirty days the imunnocontent of beta-amyloid peptide (Aβ), α-synuclein

and an isoform of tau related to Alzheimer’s disease (AD-like tau) was evaluated in samples

from the hippocampus (A) and pre-frontal cortex (B). Representative immunoblots of

individual samples from different animals from Sham and Sepsis groups are shown, and the

bar graphs represent mean values ± SE normalized by β–actin immunocontent. Data were

analyzed by t test and * denotes difference from sham group (p < 0.05).

Figure 2 – Immunocontent of RAGE, S100B and phosphorylated ERK1/2 in the

hippocampus and pre-frontal cortex of sepsis survivor animals compared to control

(sham). Sepsis was induced by CLP and after thirty days the imunnocontent of RAGE,

S100B and phosphorylated ERK1/2 was evaluated in samples from the hippocampus (A) and

pre-frontal cortex (B). Representative immunoblots of individual samples from different

animals from Sham and Sepsis groups are shown, and the bar graphs represent mean values ±

SE normalized by β–actin immunocontent. Levels of phosphorylated ERK1/2 were

normalized by the total immunocontent of ERK1/2. Data were analyzed by t test and *

denotes difference from sham group (p < 0.05).

80

Figure 1

Figure 2

presenÇa de marcadores de neurodegeneraÇÃo e...

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