Přenos jaderPřenos jaderNe příliš úspěšné, přesto popsány intra- a interdruhové přenosy

19851985 získány důkazy o funkci genů přeneseného jádra

Přenos mikrojaderPřenos mikrojader jádra obsahující jen část jaderného materiáluZískání: synchronizovaná kultura + mitotický jed, který ovlivňuje funkci vřeténka --- neorganizovaný přechod chromozomů do dceřiných buněk – část obsahuje jen např. 1-2 chromozomy

Přenos chromozomůPřenos chromozomů Izolace chromozomů - po synchronizaci - nejlépe v metafáziPřímá vazba na protoplasty pomocí fuzogenů (PEG – nízká frekvence přenosu)

Mikroinjekce – vyšší frekvence – lepší regenerace při mikroinjekci do celistvých buněk?? Osud přeneseného chromozomu, doba trvání v cytoplazmě, fáze buněčného cyklu recipientní buňky

Přenos chloroplastůPřenos chloroplastů 1969 - přenos špenátových chloroplastů do živočišných buněk1971 – přenos do slepičích vajíček - přežívání, metabolická aktivita, dělení1973 – komplementace protoplastů – fúze zelených protoplastů a mutantních s nevyvinutými plastidy – zelenání deficientních chloroplastů

Přenos mitochondriíPřenos mitochondriípřímá vazba nebyla popsánapřenos pomocí fúze protoplastů cytoplazmatičtí hybridi - znuvuuspořádání mt DNA – rekombinace

Přenos částí buněk

Přenos izolované DNA (direct gene transfer)

19771977 mnoho pokusů, chyběl důkaz integrace do recipientního chromozomu

Množství způsobů přenosu DNA:

Nevýhoda : vyšší frekvence přeorganizování transgenu a vyšší počet kopií

Elektroporací

Přenos pomocí působení PEG

Mikroinjekcí

Mikrobombardováním

Chemický „helper“Chemický „helper“

Poly L- ornitin – zpomaluje degradaci plazmidové DNA DNázami, stimuluje vazbu (neutralizací povrchového náboje) a expresi DNA v protoplastech

PEG, Ca 2+ zvyšuje vazbu DNA na povrch protoplastu

Krystalky fosforečnanu vápenatého- + fuzogen + pH – endocytóza krystalků

LipozomyLipozomy- fosfolipidy dispergované ve vodní fázi, podle podmínek a typu

fosfolipidu různé uspořádání i náboj. Chrání DNA, nejlepší fosfatidylserin

Přenos pomocí působení PEG

Elektroporace Elektroporace

250-350 V, ms, 2000 V, µs

– narušení buněčné membrány, vytvoření pórů umožňujících vstup DNA do buňky (narušení membrány laserem) - buňky, pletiva, SE

• lépe mikroinjekce do jádra (karyoplasty) – degradace

• Koncentrace DNA - vyšší koncentrace zvýšení frekvence transformace, ale pozor !! koncentrace toxické

• Forma DNA – lineární x nadšrobovicové (supercoil): lineární – vyšší frekvence transformace

• DNA lze přenášet mikroinjekcí i do mikrospor, celých buněk, semen lepší přežívání a regenerace

DNA

MikroinjekceMikroinjekce

Imobilizace buněk: skelný povrch pokrytý polylyzinem, přidržovací pipeta

Biolistická metodaBiolistická metoda (particle gun, particle bombardment) (1987)

ostřelování rostlinné buňky projektily: DNA navázaná na inertní kov (wolfram, zlato)

• Co ovlivňuje výsledek ?

• Frekvence přežití buněk po transformačním působení

• Frekvence rekombinace + frekvence exprese

• Frekvence regenerace buněk za daných podmínek

Vektorový přenos DNA

Virové vektoryVirové vektory

Dochází k rozšíření, zmnožení a expresi vloženého genu. Kromě patogenicity (např. nahrazení genu pro plášťový protein genem X) rekombinantní virus napodobuje svůj přirozený protějšek v ostatních aspektech

možnost koexistence mnohočetných genů, je-li zachována schopnost autonomní replikace

Řešení otázek :

Mechanismu infekce

 Vliv na expresi jaderných genů

Interakce mezi různými viry

Rezistence k virům

Lze použít k přenosu cizorodé DNA, neintegrující

• virové vektoryvirové vektory

• systém systém AgrobacteriaAgrobacteria

Systém Agrobacteria

Agrobacterium běžná půdní bakterie

Dvouděložné po poranění a infekci – proliferační schopnost --- tvorba dediferencovaného tumorového pletiva nebo modifikovaných kořenů

• Agrobacterium tumefaciens – cown gall- halka

• Agrobacterium rhizogenes - hairy roots

Izolace tumorových pletiv a přenesení do podmínek in vitro

• růst na médiu bez růstových regulátorů

• produkce nových látek – opinů a agropinů

Čeleď Rhizobiaceae – všichni příslušníci ovlivňují morfologii rostlin, ale jen

Agrobacterium mění genetickou výbavu rostlinných buněk

• 19741974 objeven plazmid, prokázána souvislost s virulencí

Dělení podle produkovaných látek na jednotlivé typy:

oktopinový nopalinový manopinový agropinový agrocinopinový leucopinový

• 19771977 důkaz vnášení části genetické informace plazmidu do

rostlinného genomu.

Opiny - deriváty aminokyselin -- zdroj C a N pro bakterie -- konjugace mezi bakteriemi

nejprostudovanější: oktopinový a nopalinový typ (deriváty argininu)

Agropiny - deriváty cukrů -- zdroj C pro bakterie

(stabilní, rostlinou nemetabolizovatelné)

Agrobacterium tumefaciensAgrobacterium tumefaciens

Ti plazmidTi plazmid (150-200kb)

T-DNAT-DNA - oblast ohraničená specifickými sekvencemi, přenášená do jádra rostlinné buňky

Vir Vir oblastoblast

T-DNA – nopalinový typ :

• geny kontrolující syntézu auxinů

• -“- cytokininů

• geny ovlivňující rychlost růstu tumorů

• geny pro syntézu nopalinů

• geny pro syntézu nosičových proteinů

nopalinový typ T- DNA 1 segment (23kb)

oktopinový typ T-DNA 2 segmenty (13,6; 7kb)

T-DNA – oktopinový typ

TR - syntéza oktopinů

TL - tumorový růst

T-DNAT-DNA

Z infikovaných buněk nelze regenerovat rostlinu

Replikační Replikační počátekpočátek Katabolizmus Katabolizmus

opinůopinů

Konjugativní Konjugativní přenospřenos

Vir-oblastVir-oblast

Funkce nutné pro vystřižení, přenos a integraci T- DNA (vir oblast nopalinového a oktopinového typu mohou komplementovat)

Vir-oblast není přenášena, zahrnuje několik operonů (vir A (1 protein); vir B (11); vir C (2); vir D (4) vir E (2) Vir G (1), (u některých kmenů vir F, vir H, vir J)

ACGD

E

B konstitutivně

Fenolická látka

Poraněná rostlinná buňka

Chv A Chv BPsc A

Syntéza a transport extracelulárních polysacharidů

Vir oblast

Ti plazmid

Agrobacterium tumefaciens připojené k rostlinné buňce

Sled dějů při přenosu T-DNA do rostlinné Sled dějů při přenosu T-DNA do rostlinné buňky buňky

Rozpoznání přítomnosti poraněné rostliny, signál: fenolické látky chemotaxe Připoutání bakteriální buňky k rostlinné b. - produkty chromozomálních genů (chvB tvorba -1,2 glukanu; chvA – transportní protein – doprava do periplazmatického prostoru, pscA produkce sukcinoglykanu Vazba signálních molekul na receptorové proteiny (vir A) změna konformace proteinu vir A aktivace vir G Produkt genu vir G aktivace genů vir oblasti

Vytvoření zlomu pro uvolnění T-DNA , vir D1, vir D2

odvíjení jednovláknové T-DNA vir D1, vir D2, Vir C1

Vytvoření přenosového komplexu

Vir E2

Vir D2

Přenos komplexu přes bakteriální a rostlinné stěny (geny vir B) Vnesení T-DNA do buněčného jádra vir D2 , vir E2

Integrace do jaderné DNA, přenos do náhodných míst rostlinného genomu

Agrobacterium rhizogenes

choroba – „hairy roots“--- zodpovědný Ri plazmidRi plazmid (root inducing)

manopinový typ T DNA … jeden segment T-DNA

agropinový typ T-DNA …. dva segmenty T-DNA

Homologie Ti a Ri plazmidů

Vnesené geny jsou nejaktivnější v dediferencovaných pletivech, z „hairy roots“ tumorů lze regenerovat rostliny, které jsou ovšem abnormální

Téměř všechny kmeny A . rhizogenes mají 3 komponenty plazmidu Ri.

malý plazmid: geny pro utilizaci opinů;

střední plazmid: T-DNA a jiné geny pro utilizaci opinů

velký plazmid: kointegrát obou předchozích

T-DNA : geny pro syntézu auxinu, + rolB a rol C – interferující s metabolizmem r. hormonů citlivost k endogenním auxinům.

Vektorový přenos při transgenozi Vektorový přenos při transgenozi

a) onkogenníb) neonkogenní

a) omezené využití, produkce tumorového pletiva u infekce Ti plazmidovou T-DNA

nelze regenerovat dospělé rostliny

T- DNAT- DNA T- DNAT- DNA vnášený vnášený gengen

b) nevytváří se tumor – možná regenerace rostliny

hraniční hraniční sekvence T- DNA sekvence T- DNA vnášený vnášený

gengen

hraniční hraniční sekvence T- DNA sekvence T- DNA

klonovací plazmid: replikační počátek

T-DNA hraniční sekvence přenášený genselektovatelný marker

binární vektor

Ti plazmid zbavený T-DNA

Transformační systémTransformační systém

• Společná kultivace protoplastů s Agrobacteriem

• Infekce listových disků Agrobacteriem

• Infekce rány na rostlině in vivo Agrobacteriem

• Ponoření vyvíjejících se květů do bakteriální kultury – selekce semen

Přenesení vytvořeného kalusu na médium

odstranění Agrobacteria antibiotikem

růst tkáňové kultury regenerace

Přenos a exprese cizorodé DNAPřenos a exprese cizorodé DNA

Možný přenos jakékoli DNA (přeneseny až segmenty o 50kb)

?? Exprese genů - zachování regulátorových sekvencí genů;

nutné iniciační a terminační sekvence funkční v rostlinné buňce Nevýhoda: nehodí se pro všechny rostliny a všechna pletiva (přednostně funguje u

dvouděložných), jednoděložné výběr vhodného kmene, supervirulentní kmeny s více

kopiemi některých Vir genů.

Stabilita genů T-DNA:

• přenosné přes meiosi

• exprese genů se postupně snižuje - specifická vlastnost, která se projevuje jen při zachování T- DNA ( X transgenoze)

• zjištěna závislost mezi metylací a potlačením exprese

Možnost vytvoření stabilních mutantů – využití ke šlechtění rostlin

Budoucnost a rizika

Využití technik biotechnologie rostlinVyužití technik biotechnologie rostlin

pro rozvoj znalostí fyziologie rostlin

k praktickému využití

? Biotech

nologie a životní p

rostředí

Množení rostlin

Komerčně významné rostliny

Ohrožené rostliny

Ozdravování rostlin

? Genetická uniformita

? Somaklonální variabilita

Mutageneze in vitro ? Genetická uniformita ? Somaklonální variabilita

Produkce sekundárních metabolitů, biotransformace

Je snaha vnášet znaky související sJe snaha vnášet znaky související s

1. rezistencí k chorobám (k virům (pouzdrové proteiny); bakteriím; houbám)

2. rezistencí k parazitům (geny pro toxiny působící na škůdce, Bacillus thuringiensis)

3. rezistencí k herbicidům (modifikovaný cílový protein; nadprodukce cílového proteinu; detoxifikace herbicidu)

4. rezistencí k chladu, osmotickému stresu etc. (změny v obsahu osmoticky aktivních látek, stresových proteinů…)

5. zlepšením kvality produktů (změny v zastoupení a obsahu zásobních látek)

6. produkcí látek (farmaka, protilátky, vakcíny, technické látky, „molecular farming“)

? Biotechnologie a životní prostředí

? Transgenní rostliny a životní prostředí

Rizika využívání transgenních rostlinRizika využívání transgenních rostlin

Nebezpečí 1:Nebezpečí 1: transgenní rostlina se stává nekontrolovatelným plevelem (díky ovlivnění

schopnosti přežití)

typy rostlin : na lidech závislé

lidmi dobře kontrolovatelné

na lidech nezávislé

Nebezpečí 2:Nebezpečí 2: přenos genu na divoké příbuzné rostliny

možnost křížení

překryv kvetení

výskyt divokých příbuzných v dané lokalitě

Nebezpečí 3:Nebezpečí 3: přenos genu na nepříbuzné rostliny (? viry, Agrobacterium)

Nebezpečí 4:Nebezpečí 4: zvýšení používání herbicidů

GMO in USA

Nebezpečí 7Nebezpečí 7: porušení rovnováhy - vliv na divokou faunu, floru

Nutnost

pečlivého výběru genu i recipientní rostliny

testování transgenních rostlin v uzavřených prostorách (skleníky)

sledování v polních pokusech za přísných bezpečnostních opatření

! Hodnocení každého

jednotlivého případu

zvlášť !

Nebezpečí 6:Nebezpečí 6: ovlivnění metabolizmu transgenní rostliny nežádoucím směrem

Nebezpečí 5:Nebezpečí 5: hromadění látek v rostlinách, které mohou být toxické pro lidi nebo zvířata (herbicidy, toxiny, nové látky)

Nebezpečí 7Nebezpečí 7: porušení rovnováhy - vliv na divokou faunu, floru

Nutnost

pečlivého výběru genu i recipientní rostliny

testování transgenních rostlin v uzavřených prostorách (skleníky)

sledování v polních pokusech za přísných bezpečnostních opatření

! Hodnocení každého

jednotlivého případu

zvlášť !

Nebezpečí 6:Nebezpečí 6: ovlivnění metabolizmu transgenní rostliny nežádoucím směrem

Nebezpečí 5:Nebezpečí 5: hromadění látek v rostlinách, které mohou být toxické pro lidi nebo zvířata (herbicidy, toxiny, nové látky)

Díky za pozornost