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Praktikum: Genomforschung 2

Protokoll

–

Gewinnung und Analyse von genomischer DNA

Madis [email protected]

Matrikelnummer: 1731488

Gruppe: 02

30. Mai 2006

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Dieses Praktikumsprotokoll stellt die Versuche 41 & 52, die im Rahmen desPraktikums der Genomforschung 2 im WS 2005/06 durchgefuhrt wurden, darund erlautert die dabei gewonnenen Ergebnisse. Es werden nicht alle Vorge-hensweisen erlautert, sondern lediglich auf Abweichungen zum Praktikumsskripthingewiesen. Methoden und Materialien, die in diesem Protokoll nicht erwahntwerden, sind dem Praktikumsskript zu entnehmen.3

0.1 Motivation

Es soll mittels CTAB-Methode4 reine, hoch molekulare genomische DNA ausPflanzenzellen gewonnen werden, die dann anschließend per PCR amplifiziertwerden soll. Das Amplifikat soll sequenziert und mit Hilfe von Bioinformatik-tools analysiert werden. Ein Teil der Ergebnisse wird graphisch dargestellt wer-den.

1Isolierung von genomischer DNA aus Pflanzen2Detektion von DNA-Sequenzpolymorphismen (SNPs)3BIG-Praktikum: Genomforschung2 - Sagasser, M., Stracke, R. - Universitat Bielefeld -

20064nach Roger und Bendich, Plant Mol. Biol. Manual A6:1-10, 1988

Inhaltsverzeichnis

0.1 Motivation . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1

1 Isolierung von genomischer DNA aus Pflanzen 31.1 Einleitung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 31.2 Veranderungen zum Skript . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 31.3 Ergebnisauswertung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4

1.3.1 Gelanalyse . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 41.3.2 Photometermessung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4

1.4 Ergebnisbewertung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5

2 Detektion von DNA-Sequenzpolymorphismen (SNPs) 62.1 Einleitung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 62.2 Veranderungen / Abweichungen zum Skript . . . . . . . . . . . . 62.3 Durchfuhrung der PCR . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 62.4 Validierung der PCR-Reaktionsprodukte . . . . . . . . . . . . . . 72.5 Auswertung / Bewertung der Sequenzierungsergebnisse . . . . . . 8

2.5.1 Vergleich: Strang – Gegenstrang . . . . . . . . . . . . . . 82.5.2 Erstellung einer Konsensussequenz . . . . . . . . . . . . . 82.5.3 Multiples Alignment & SNP . . . . . . . . . . . . . . . . . 102.5.4 Restriktionsschnittstellen . . . . . . . . . . . . . . . . . . 102.5.5 Translation . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 13

3 Resumee 14

A Programme 15

B Internettools 16

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Kapitel 1

Isolierung von genomischerDNA aus Pflanzen

1.1 Einleitung

Die CTAB-Prap. ist eine Methode, mit der reine, hoch molekulare DNA ausPflanzen gewonnen werden kann. In unserem Fall soll DNA von vier Acker-schmalwand (Arabidopsis thaliana) Kulturen isoliert werden: Col-0, Ler, C24und Ws. Die Qualiitat der isolierten DNA wird durch Gelelektrophorese undMessung am Photometer ermittelt.

1.2 Veranderungen zum Skript

Punkt 15 Vorsichtig mischen, uN-Lagerung bei -20◦C.

Gelelektrophorese Da wir anfangs von einer niedrigen DNA-Konzentrationausgegangen sind, wurde die aufgetragene Menge des Aliquots von 5µlDNA, 3µl Ladepuffer auf 10µl DNA und 5µl Ladepuffer erhoht.

Photometermessung Es werden anstatt 2, 5µl DNA 5µl zur Messung ver-wendet. Die Wassermenge wird ebenfalls erhoht auf 1000µl. Der Leerwertwurde einmalig bestimmt und fur alle Messungen der einzelnen Gruppenverwendet.

3

KAPITEL 1. ISOLIERUNG VON GENOMISCHER DNA AUS PFLANZEN4

1.3 Ergebnisauswertung

1.3.1 Gelanalyse

Da vier Banden deutlich zu erkennen sind, kann man feststellen, dass DNAerfolgreich gewonnen wurde. Die Banden befinden sich oberhalb der 10.0 kb-Markerbande. Die DNA ist hoch molekular und 30 kb groß. Nachdem die Großeder einzelnen Fragmente geschatzt wurde, geht es darum, die Menge zu bestim-men. Dafur werden die einzelnen Leuchtintensitaten mit der 3.0 kb-Bande der1 kb-Leiter verglichen.

Alle unsere 4 Banden leuchten heller, als die 3.0 kb Bande der 1 kb-Leiter.Die Bande der C24-Kultur leuchtet am intensivsten, die Ws-Kultur wiederumam geringsten. Anhand der Leuchtintensitat kann ausgesagt werden, dass dieersten beiden Banden ungefahr doppelt so hell wie die 3.0 kb-Vergleichsbandeleuchten. Also sind in den pippetierten 5µl DNA-Proben der Col-0 und Ler Linie250ng DNA enthalten. In der C24 Probe sind ungefahr 300-325ng enthalten. Dieletzte Probe, WS, enthalt am wenigstens DNA - 200ng. Hierbei muss allerdingsbeachtet werden, dass 5µl aufgetragen wurden, man aber die Konzentration von1µl fur den Verlauf des Nachfolgeexperimentes benotigt.

Durch Herunterrechnen ergibt sich folgende Wertetabelle

Col-0 Ler C24 Wsng/5µl DNA 250 250 325 200ng/µl DNA 50 50 75 40

Eine Kontamination durch RNA oder Proteine fand nicht statt, da bei Pro-teinen die Taschen leuchten mussten und RNA Schlieren im Gel hinterlassenwurde.

1.3.2 Photometermessung

Die Photometermessung der gewonnenen DNA soll Klarheit daruber schaffen,wie viel DNA wirklich in 1µl der Losung enthalten ist. Jede einzelne Probe mussanalysiert werden.

DNA absorbiert Licht bei OD260 am besten. Das Verhaltnis von OD260 undµg/ml DNA ist 1OD260 = 50µg/ml = 50µg/1000µl = 0, 05µg/µl. Da wir aber

KAPITEL 1. ISOLIERUNG VON GENOMISCHER DNA AUS PFLANZEN5

in unserem Fall mit einer Verdunnung von 1:200 gearbeitet haben, ist die Kon-zentration der Ausgangslosung 200x hoher. Daraus folgt: 1OD260 = 10µg/µl.Auf 1µl bezogen ergibt sich 0, 1OD260 = 1µg/µl. Anhand des OD-Wertes kanndie exakte DNA-Menge pro µl bestimmt werden.

Die Messwerte fur unsere Proben sind der folgenden Tabelle zu entnehmen.Hier bei gilt allerdings zu beachten, dass die Werte gerundet wurden.

Col-0 Ler C24 WsOD260 0,024 0,025 0,035 0,020

µg/µl DNA 0,240 0,250 0,350 0,200

Hierbei fallt auf, dass die Menge an gewonnener DNA sehr unterschiedlichsein kann. Die meiste Menge wurde aus der C24-Kultur isoliert, am wenigstenaus Ws. Col-0 und Ler liegen mit 2,4µg/µl bzw. 2,5µg/µl im Mittel.

1.4 Ergebnisbewertung

Die Gelfotoanalyse und Photometermessung haben sehr unterschiedliche Ergeb-nisse bezuglich der DNA-Menge geliefert.

Col-0 Ler C24 WsGelfotoanalyse - µg/µl DNA 0,050 0,050 0,075 0,040

Photometermessung - µg/µl DNA 0,240 0,250 0,350 0,200∆µg/µl DNA 0,190 0,200 0,275 0,160

Diese Unterschiede lassen sich dadurch erklarem, dass die Gelfotoanalyselediglich auf Schatzwerten beruht. Außerdem muss man davon ausgehen, dassbei der Herstellung des Agarosegels, Farbung des Gels sowie Qualitat der 1 kb-Leiter Fehler unterlaufen sein konnen oder eine der Komponenten beschadigtwar. Es kann auch eine Messungenauigkeit wahrend der Photometermessungden Ausschlag zu dieser doch sehr großen Differenz gegeben haben. Auch einZusammenspiel aller Faktoren kann dieses Ergebnis hervorrufen. Letztendlichliegt es wohl eher daran, dass die Gelfotoanalyse, wie bereits mehrfach erwahnt,eine Schatzung ist und zur exakten quantitativen Einschatzung nicht herange-zogen werden sollte.

Bezogen auf die Qualitat der DNA lasst sich feststellen, dass die Gelfotoana-lyse bis zu diesem Zeitpunkt das Mittel der Wahl ist. Wir konnen auf einfacheArt und Weise die Fragmentlangen visualisieren und miteinander vergleichen.Die Helligkeit einer Bande kann lediglich als Ansatz dafur verwendet werden,wie viel DNA in einer Bande im Vergleich zu einer anderen enthalten ist.

Abschließend lasst sich sagen, dass aus jeder Kultur eindeutig DNA gewon-nen wurde, die hoch molekular und rein ist. Sie ist hoch molekular, weil alleBanden oberhalb der 10.0 kb-Bande liegen. Rein, ist sie, weil sie frei von jeg-licher Kontamination ist. Proteine wurden die Taschen zum leuchten bringen,Primer und RNA Wolken bzw. Schlieren entstehen lassen.

Kapitel 2

Detektion von DNA-Sequenzpolymorphismen(SNPs)

2.1 Einleitung

Die in Versuch 41 gewonnene DNA soll in diesem Praktikumsteil naher un-tersucht werden. Dazu wurde eine Amplifikation mittels PCR, Kontrolle derAmplifikate durch Gelelektrophorese und abschließende Sequenzierung durch-gefuhrt. Im Letzten Abschnitt werden die Ergebnisse anhand von einigen Bei-spielen erlautert.

2.2 Veranderungen / Abweichungen zum Skript

Positivkontrolle Als Positivkontrolle wurde in diesen Experimenten die A.thaliana-Kultur Lezou (Lz) verwendet.

Negativkontrolle Als Negativkontrolle wurde der normale Ansatz ohne Tem-plate benutzt.

verwendete Primer Als Primer wurden RS300 bzw. RS301 verwendet.

Abweichnung wahrend PCR Da die Menge an DNA in den Templatelosungvariierte, mussten die Losungen im PCR-Trager pipettiert werden. Dabeikam es bei einigen Ansatzen wegen ungenauer Pipettierung zu ubermaßigerBlaschenbildung.

2.3 Durchfuhrung der PCR

Um eine erfolgreiche Sequenzierung durchfuhren zu konnen, benotigt man eineentsprechende Menge DNA. Diese wurde mit Hilfe der PCR hergestellt. Ein op-timales Ergebnis erhalt man, wenn man 1µg DNA der Reaktion zufuhren kann.

1Isolierung von genomischer DNA aus Pflanzen

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KAPITEL 2. DETEKTION VON DNA-SEQUENZPOLYMORPHISMEN (SNPS)7

Im vorherigen Versuch haben wir bereits die Menge an DNA pro µl bestimmt.Wir verwenden dabei fur die PCR die Messwerte der Photometermessung, daman sie als relativ exakt ansehen kann, sofern kein Messfehler unterlaufen ist.

Zur PCR-Reaktion sollten folgende Mengen an Losungen pro Reaktionsan-satz zugefuhrt werden:

PCR-Ansatz(Einzelansatz, 20µl):3µl H202µl 10x Puffer1µl MgCl2 (25mM)4µl dNTP-Losung (2,5mM)2µl Primer1 (GTOx; 5µM)2µl Primer2 (GTOy; 5µM)1µl Taq-Polymerase5µl Template (genom. DNA aus Versuch 4)

Dieser Ansatz gilt dann, wenn in 1µl 0, 2µg DNA enthalten ist. Wir mus-sten also das Volumen der Template-DNA-Losung variieren und mit Wasserausgleichen. Dadurch ergab sich folgendes Mischverhaltnis:

Col-0 Ler C24 Ws Pos.-Kontrolle Neg.-KontrolleTemplate-DNA µl 4,17 4 2,86 5 5 0

H2O 3,83 4 5,14 3 3 8

2.4 Validierung der PCR-Reaktionsprodukte

Um fehlerhafte PCR-Reaktionen ausschließen zu konnen, wurden die Amplifika-te auf ein 1%ges Agarosegel aufgetragen. Dies soll helfen fehlerhafte Reaktionenim Vorfeld ausschließen zu konnen.

Auf dem Gelfoto ist eindeutig zu erkennen, dass etwas amplifiziert wurde.Was die Schleier im Vorfeld sind, kann nicht genau gesagt werden. Dies konntenPrimerwolken sein, was aber eher unwahrscheinlich ist, weil sie eine Lange von20-30 Neukleotiden besitzen - ergo mussten sie unterhalb unserer Banden sein.


Dass die Reaktion erfolgreich verlief, kann man an dem amplifizierten Positiv-marker erkennen und den ungefahr gleichpositionierten Banden der selbst her-gestellten Proben. Der Negativmarker hat keine Reaktion hervorgerufen. Dasheißt, man kann eine Kontamination der PCR-Zusatze ausschließen.

Die Lange der Fragmente betragt ungefahr 700-750bp. Die Menge lasst sichrelativ schlecht abschatzen, weil die linke 1 kb-Leiter schlecht aufgetragen, ein-gefarbt oder abfotografiert wurde. Die Heligkeit nimmt zur rechten Seite hin zu.Man kann aber definitiv feststellen, dass die amplifizierte Menge uber 125ng/µlliegt, da die Bande deutlich heller als die 3.0 kb-Bande leuchtet.

Alle funf Proben mit DNA wurden per Exo-SAP-ITTM 2 Methode durch diePraktikumsbetreuer gereinigt und waren daraufhin zum Sequenzieren bereit.

2.5 Auswertung / Bewertung der Sequenzierungs-ergebnisse

2.5.1 Vergleich: Strang – Gegenstrang

Um einen Vergleich zwischen Strang und Gegenstrang durchzufuhren, aligniertman die Ausgangssequenz gegen das reverse Komplement der Sequenz des Ge-genprimers. In unserem Fall jeweils RS300 vs rev−compl−RS301 bzw. RS301vs rev − compl −RS300.

Bei den untersuchten Sequenzierungsergebnissen gab es keine Widerspruche,die schwer ins Gewicht fallen wurden. Es gibt in zwei Sequenzen jeweils eine Ab-weichung in einer Base zwischen Strang und Gegenstrang. Diese sind aber immeram Ende bzw. am Anfang eines Stranges positioniert. Das deutet darauf hin,dass der Basecaller die Basen nicht korrekt erkennen konnte. Das ruhrt daher,dass die eingesetze Taq-Polymerase nicht proof-reading ist, also das Transkriptnicht noch ein mal auf Fehler uberpruft wird. Dieses Phanomen lasst sich durchErstellen einer Konsensussequenz auflosen. Als weitere Sequenzen nimmt manVergleichsequenzen aus Sequenzierreaktionen desselben Templates.

Beispiel eines Mismatches:

T C T T T t A G C AT C T T T c A G C A* * * * * * * * ** * * * * * * * ** * * * * * * * ** * * * * * * * ** * * * * * * * *

2.5.2 Erstellung einer Konsensussequenz

Zur Erstellung einer Konsensussequenz werden Sequenzen aus den Sequenzie-rungen mit dem gleichen Primer anderer Gruppen der gleichen Kultur herange-zogen. Ich habe dafur alle Reaktionen mit Primer RS300 verwendet.

2Amersham Biosciences


Daraus ergeben sich folgende Konsensussequenzen:

[Col-0] – ATGAAAACTATTAATAATTCATATGsTGACAAAAAAATAAT-GACTCCsTTATAAATATTCTTATAAATATTTTATTTTTGTTATTTGATA-TAATTATTCTTATTATTGTGGATCTTGTATTATTAAAATGTTTGGGGAC-ATATAAATATTCGTAGGTTGTTGGTGAGAATGGTGAAAAGTAAAGGAAC-GAAAAACTGGACATCAATCGCAAAAATGTTCCAAGGACGAGTAGGAAAA-CAATGTCGAGAGAGGTGGCATAACCATCTTCGACCAAACATCAsGGTAG-ATTTGTTTTAATCTTTCGATTTAAGTATATATGTGACATGTGAGAAATA-TTTACTAAATGCATCTsGCTATATATAAAATGAATGTGTGTTTTCAGAA-AAATGATTGGAGTGAAGAAGAAGATCAAATACTTATTGAAGTCCACAAG-ATAGTTGGCAACAAATGGACCGAAATTGCTuAAAGACTTCCTGGACGAA-GTGAAAATATTGTTAAAAATCATTGGAATGCTACAAAACGTCGACTACA-CTCCGTAAGGACTAAuAGAAGTGATGCTTTTTCCCCTCGCAACAATG

[Ler] –TsTuATsATTssTATTssTussGsTsssusAsTssTAAsus-uTT.ususAsAssTsuuTsTTCGssGGssGssGuTsusAuTGGsGssAs-ssuuAuGAACsuAsAACsu.GsCsssAATsGssuuAAsusTCssAsuAC-GAGsAuGsssAsAAsussGu

[C24] – TGAAAACTATTAATAATTCATATGTTGACAAAAAAATAAT-GACTCCsTTATAAAAATTCTTATAAATATTTTATTTTTGTTATTTGATA-TAATTATTCTTATTATTGTGGATCTTGTATTGTTAAAATGTTTGGGGAC-ATATAAATATTCGTAGGTTGTTGGTGAGAATGGTGAAAAGTAAAGGAAC-GAAAAACTGGACATCAATCGCAAAAATGTTCCAAGGACGAGTAGGTAAA-CAATGTCGAGAGAGGTGGCATAACCATCTTCGACCAAACATCAsGGTAG-ATTTGTTTTAATCTTTCGATTTAAGTATATATGTGACuTGTGAGAAATA-TTTACTAAATGCATCTsGCTATATATAAAATGAATGTGTGTTTTCAGAA-AAATGATTGGA

[Ws - ohne Gruppe 8] – TCCAAGGACGAGTAGGTAAACAATG-TCGAGAGAGGTGGCATAACCATCTTCsACCAAACATTAAGGTAGATTTG-TTTTAATCTTTCsATTTAACTATATATGTGACATGTGAGAAATATTTAC-TAAATGCATCTsGCTATATATAAAATGAATGTGTGTTTTCAGAAAAATG-ATTGGAGTGAAGAAGAAGATCAsATACTTATTGAAGTCCACAAGATAGT-TGGCAACAAATGGACCGAAATTGCTAAAAGACTTCCTGGACGAAGTGAA-AATATTGTTAAAAATCATTGGAATGGTACAAAACGT

Die abgebildeten Sequenzen geben den Konsensus aller vier Sequenzen außerLz an. Es wurden die Konsensussequenzen mit 100% Ubereinstimmung ange-geben. Vor allem bei Ler fallt auf, dass sich aufgrund von fehlerhaften Datennur eine luckenbehaftete Konsensussequenz erstellt werden konnte. Die Sequenzfur Ws konnte nur erstellt werden, wenn man die Sequenz von Gruppe 8 ganzentfernt hat. Dieser Konsensus beruht also auf den Daten von unserer und dreiweiteren Gruppen.


2.5.3 Multiples Alignment & SNP

Nach Erstellung des mutliplen Alignments sieht man, dass ein SNP vorkommt.

Base 141 in der 23er Sequenz (C24) ist ein SNP. Normalerweise befindetsich an der Stelle ein A, in der SNP-beieinflussten Sequenz befindet sich ein Ganstelle des As. Indels sind in der Sequenz nicht zu finden.

2.5.4 Restriktionsschnittstellen

In absteigender Reihenfolge alle Restriktionsschnittstellen fur Col-0, Ler, C24und Ws.


Col-0 Schnittstellen

Ler Schnittstellen


C24 Schnittstellen

Ws Schnittstellen

Um zu uberprufen, ob das SNP eine Restriktionsschnittstelle betrifft, wur-de dieser Teilbereich gesondert untersucht. Die folgende Abbildung zeigt dieSequenz ohne SNP, also mit A an der entsprechenden Stelle.


Nun ware es Interessant zu erfahren, ob sich durch eine Anderung der Basein G sich eine neue Schnittstelle bildet oder eine bereits bestehende verandertwird.

Wie man sehen kann, verandert sich nichts, sodass der SNP in diesem Fallkonserviert ist.

2.5.5 Translation

Der sequenzierte Bereich der einzelnen Arabidopsis thaliana Kulturen codiertfur das Protein MYB115, das auf dem 5. Chromosom in A. thaliana liegt. Diefolgende Abbildung zeigt die Sequenz von Col-O mit hervorgehobenem SNP undden codierenden Bereichen. Zu beachten ist hierbei, dass ein Frameshift vorliegt.

Es wurde zu einem Aminosaureaustausch kommen, sofern der SNP im co-dierenden Bereich liegen wurde. Da er das aber nicht tut, ist es irrelevant, obein Stoppcodon generiert wird. Weil die Aminosauren im codierenden Bereichnicht verandert werden, kann man sagen, dass dies ein konservierter Austauschist.

Kapitel 3

Resumee

Dieser Praktiukumsteil hat uns gezeigt, wie man aus einem Organismus DNAisolieren und analysieren kann. In unserem Fall haben wir pflanzliche DNA ausBlattern isoliert und weiterverarbeitet.

Das erste Gelelektrophoresefoto hat uns darin bestatigt, dass irgendeineDNA gewonnen wurde. Die Menge konnte durch die Photometermessung be-stimmt werden. Was das fur eine DNA war, wofur sie kodiert, wurde im darauf-folgenden Experiment geklart.

Dass die PCR mit unseren selbst hergestellten Templates erfolgreich verlau-fen ist, wurde nochmals durch ein Gelfoto bestatigt. Die anschließende Sequen-zierung und Auswertung der Sequenzierungsergebnisse entsprach den Vorstel-lungen, da eindeutig Sequenzen aus Arabidopsis thaliana nachgewiesen wurden.Durch den Einsatz der spezifischen Primer RS300 & RS3011 konnte DNA am-plifiziert werden, die fur das Gen MYB115 kodierte. Man muss seine Primergeschickt wahlen, so dass man Strang und Gegenstrang entsprechend den zuuntersuchenden Bereich auf der DNA in ausreichendem Maße abdeckt, so dassman beide Sequenzen einander zuordnen kann.

Abschließend vielen Dank an Martin Sagasser, Ralf Stracke, die herzallerlie-be Melli (deren Nachname uns bis zum heutigen Tage unbekannt geblieben ist)sowie alle weiteren Praktikumsbetreuer.

Hals und BEINbruch...

1Nicht im Handel kauflich unter diesem Namen zu erwerben, da sich der Name vomEinkaufer Ralf Stracke ableitet.

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Anhang A

Programme

FinchTV Simpler Viewer fur *.ABI, *.SCF und *.FTV-Dateien. Ansichtenvon RAW-Data, Angabe vom reversen Komplement, direkte Verlinkungzu Blast der/-s markierten Sequenz-/bereiches. Zu beziehen unter:http://www.geospiza.com/

Adobe Photoshop CS2 Muss man dazu noch was sagen?!http://www.adobe.com/de/products/photoshop/

Windows Editor Simpler plaintext-Editor, der gerade mal den minimalstenAnspruchen genugt. Kurz in FASTA stobern und nicht mehr. Nicht zuempfehlen...

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Anhang B

Internettools

DIALIGN Kongeniales Tool zum Erstellen multipler Alignments.http://bibiserv.techfak.uni-bielefeld.de/dialign/

Consensus Einfach zu bedienendes Webtool zum Erstellen von Konsensus-sequenzen. Ausgabe der Konsensussequenz nach beliebig auswahlbarenprozentualen Ubereinstimmungen. Eingabe allerdings nur im CLUSTAL-Format!http://coot.embl.de/Alignment/consensus.html

ClustalW Webtool zum Erstellen von multiplen Alignments im CLUSTAL-Format. Es konnen viele bekannte Dateiformate eingegeben werden.http://www.ebi.ac.uk/clustalw/index.html

EMBOSS Coole Sammlung von Webtools fur Sequenzanalyse. Sehr zu emp-fehlen, wenn man von den ersten paar Programmen mit Namen ACDCabsieht...http://inn.weizmann.ac.il/EMBOSS/

NEB Cutter Tool zum automatischen Erkennen aller bekannten Restriktions-schnittstellen in einer Sequenz.http://tools.neb.com/NEBcutter2/index.php

BLAST Last but not least... THADA: BLAST – Beschreibung nicht notig ;)http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/

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