PRÁCTICA 10: NMP DE COLIFORMES TOTALES Y Escherichia coli, FLUOROCULT LMX El caldo Fluorocult LMX descrito por Manafi y Kneifel (1989) es modificado por el sustrato utilizado. La alta calidad nutricional se debe a la incorporación de un buffer fosfatado en el caldo, garantizando un alto índice de crecimiento de los coliformes presentes mientras que el lauril sulfato inhibe el crecimiento de bacterias Gram positivos en un alto grado. Por la adición del sustrato cromogénico 5-bromo-4-cloro-3-indol-β-D-galactopiranosida (X-GAL), el cual es destruido por los coliformes y el sustrato fluorogénico 4-metil-umbeliferil-β-D-glucoronidasa (MUG), el cual es altamente específico para Escherichia coli, es posible la detección simultánea de coliformes totales y Escherichia coli. La presencia de coliformes se indica por un color azul verdoso en el caldo y Escherichia coli por un azul fluorescente bajo longitud de onda larga UV. Después la reacción positiva de indol confirma la presencia de Escherichia coli aumentada por la concentración de triptofano en el caldo. La síntesis de la enzima es ampliada por el 1-isopropil-β-D-1-tiogalactopiranosida (IPTG) e incrementa la actividad de β-D-galactosidasa. Materiales 15 tubos con 10 mL de caldo Fluorocult por cada muestra (aguas no potables) 10 tubos con 10 mL de caldo Fluorocult por cada muestra (aguas potables)

Pipetas de 1 mL estériles Pipeta automática de 10 µl Puntas estériles Incubadora a 35°C Lámpara UV Reactivo de Kovacs Nota: Si la muestra es tratada con cloro, por cada 100 mL de muestra añadir 0.1 mL de tiosulfato de sodio al 10% Procedimiento Homogenizar la muestra (agua no potable) -A los primeros 5 tubos con 10 mL de caldo Fluorocult añadir 10 mL de muestra -A los 5 siguientes tubos añadir 1 mL de muestra -A los 5 últimos tubos añadir 0.1 mL de muestra -Incubar a 35ºC por 24 horas -Interpretar los resultados. Homogenizar la muestra (agua potable) -A los primeros 10 tubos con 10 mL de caldo Fluorocult añadir 10 mL de muestra -Incubar a 35ºC por 24 horas -Interpretar los resultados.

Interpretación de resultados: Coliformes Totales: El caldo se torna azul verdoso (reacción de X-GAL) Escherichia coli: Leve fluorescencia en el caldo (reacción MUG), visible bajo la luz UV (366 nanómetros). Confirmar la presencia de Escherichia coli, con el reactivo de KOVACS , mediante la reacción de Indol. El sobrenadante se torna rojo en dos minutos si la reacción es positiva. Si la fluorescencia es negativa después de 24 horas de incubación, no se debe añadir el reactivo de KOVACS, pues este reactivo alcohólico destruye las condiciones de crecimiento del medio. Continuar la incubación por 24 horas adicionales. Chequear los resultados por fluorescencia y reacción de Indol. Leer en la tabla de NMP para 5 tubos x 3. TABLA 9221: IV Leer en la tabla de NMP para 10 tubos TABLA 9221: II

Cepa Control Cambio de color a azul verdoso

Fluorescencia Indol

Escherichia coli ATCC 25922

+ + +

Klebsiella pneumoniae ATCC 13883

+ -

Enterobacter cloacae ATCC 13047

+ - -

Citrobacter freundii ATCC 8090

+ -

Citrobacter freundii ATCC 6750

+ -

Shigella flexneri ATCC 12022

-

-

Salmonella typhimurium ATCC 14028

-

-

TABLA 9221: IV. MPN INDEX AND 95% CONFIDENCE LIMITS FOR VARIOUS COMBINATION OF POSITIVE RESULT WHEN FIVE TUBES ARE USED PER DILUTION

Combinación de tubos positivos

NMP/ 100mL

Límites de 95% de confianza

Combinación de tubos positivos

NMP/ 100mL

Límites de 95% de confianza

Inferior Superior Inferior Superior

0 0 0 < 1.8 - 6.8 4 0 3 25 9.8 70

0 0 1 1.8 0.090 6.8 4 1 0 17 6.0 40

0 1 0 1.8 0.090 6.9 4 1 1 21 6.8 42

0 1 1 3.6 0.70 10 4 1 2 26 9.8 70

0 2 0 3.7 0.70 10 4 1 3 31 10 70

0 2 1 5.5 1.8 15 4 2 0 22 6.8 50

0 3 0 5.6 1.8 15 4 2 1 26 9.8 70

1 0 0 2.0 0.10 10 4 2 2 32 10 70

1 0 1 4.0 0.70 10 4 2 3 38 14 100

1 0 2 6.0 1.8 15 4 3 0 27 9.9 70

1 1 0 4.0 0.71 12 4 3 1 33 10 70

1 1 1 6.1 1.8 15 4 3 2 39 14 100

1 1 2 8.1 3.4 22 4 4 0 34 14 100

1 2 0 6.1 1.8 15 4 4 1 40 14 100

1 2 1 8.2 3.4 22 4 4 2 47 15 120

1 3 0 8.3 3.4 22 4 5 0 41 14 100

1 3 1 10 3.5 22 4 5 1 48 15 120

1 4 0 10 3.5 22 5 0 0 23 6.8 70

2 0 0 4.5 0.79 15 5 0 1 31 10 70

2 0 1 6.8 1.8 15 5 0 2 43 14 100

2 0 2 9.1 3.4 22 5 0 3 58 22 150

2 1 0 6.8 1.8 17 5 1 0 33 10 100

2 1 1 9.2 3.4 22 5 1 1 46 14 120

2 1 2 12 4.1 26 5 1 2 63 22 150

2 2 0 9.3 3.4 22 5 1 3 84 34 220

2 2 1 12 4.1 26 5 2 0 49 15 150

2 2 2 14 5.9 36 5 2 1 70 22 170

2 3 0 12 4.1 26 5 2 2 94 34 230

2 3 1 14 5.9 36 5 2 3 120 36 250

2 4 0 15 5.9 36 5 2 4 150 58 400

3 0 0 7.8 2.1 22 5 3 0 79 22 220

3 0 1 11 3.5 23 5 3 1 110 34 250

3 0 2 13 5.6 35 5 3 2 140 52 400

3 1 0 11 3.5 26 5 3 3 170 70 400

3 1 1 14 5.6 36 5 3 4 210 70 400

3 1 2 17 6.0 36 5 4 0 130 36 400

3 2 0 14 5.7 36 5 4 1 170 58 400

3 2 1 17 6.8 40 5 4 2 220 70 440

3 2 2 20 6.8 40 5 4 3 280 100 710

3 3 0 17 6.8 40 5 4 4 350 100 710

3 3 1 21 6.8 40 5 4 5 430 150 1100

3 3 2 24 9.8 70 5 5 0 240 70 710

3 4 0 21 6.8 40 5 5 1 350 100 1100

3 4 1 24 9.8 70 5 5 2 540 150 1700

3 5 0 25 9.8 70 5 5 3 920 220 2600

4 0 0 13 4.1 35 5 5 4 1600 400 4600

4 0 1 17 5.9 36 5 5 5 > 1600 700 -

4 0 2 21 6.8 40

Tomado de Standard Methods (Edición 21) Standard Methods for the Examination of Water and Waste Water (2005) TABLA 9221: II MPN Index and 95% Confidence Limits for All Combinations of Positive and Negative Result when ten 10 ml portions are used.

No. Of tubes giving positive reaction out

of 10 (10 ml each)

MPN Index/100ml 95% Confidence Limits (Exact)

Lower Uper

0 <1.1 - 3.4

1 1.1 0.051 5.9

2 2.2 0.37 8.2

3 3.6 0.91 9.7

4 5.1 1.6 13

5 6.9 2.5 15

6 9.2 3.3 19

7 12 4.8 24

8 16 5.8 34

9 23 8.1 53

10 >23 13 -