基因工程Gene Engineering

彭银祥等编著

华中科技大学出版社 2008年 2 月第二次印刷

第 5 章 基因工程载体Vectors in Gene

Engineering

高等学校生物工程、生物科学及生物技术专业教材

5-2

在基因工程操作中，外源 DNA 片段运送进宿主细胞进行扩增或表达的运载工具称为载体，它也是一个 DNA 分子。

1 载体 （ Vectors ）

2 根据功能，把载体分为： 克隆载体和表达载体

5-3

基因工程中常用的载体有 5 类： 3. 载体的种类

质粒（ plasmid ）单链 DNA 噬菌体M13

噬菌体的衍生物柯斯质粒（ cosmid ）动物病毒（ virus ）

5-4

（（ 11 ））复制子复制子，在宿主细胞内能独立复制；，在宿主细胞内能独立复制；（（ 22 ））有选择性标记有选择性标记，有一个或多个鉴于检测的遗，有一个或多个鉴于检测的遗

传标记；传标记；（（ 33 ）有一段）有一段多克隆位点多克隆位点。位于非必需区内的。位于非必需区内的

DNADNA 序列内含有多个单一的酶切位点；外源序列内含有多个单一的酶切位点；外源DNADNA 插入其中不影响载体的复制。插入其中不影响载体的复制。

（（ 44 ）分子量小，）分子量小，拷贝数多拷贝数多。具有较高的。具有较高的遗传稳定遗传稳定性；性；

（（ 55 ）容易从宿主细胞中）容易从宿主细胞中分离纯化分离纯化。。

4. 基因工程载体的必备条件

5-5

5.1 质粒载体 质粒（ plasmid ）是独立于染色体以外的能自主复制的双链闭合环状 DNA 分子。一般为 1-200kb 。

存在于细菌、霉菌、蓝藻、酵母等细胞中。

5-6

大肠杆菌的质粒

5-7

（ 1 ）分子小：5.1.1 质粒的一般生物学特性

1—200 kb

（ 2 ）编码基因少： 2—3 个中等大小的蛋白质。

（ 3 ）环形状：双链环状 DNA 。（酵母的“杀伤质粒”是 RNA ）。

如抗菌素抗性、代谢特征等，赋予细菌一些额外的特性（非必须）。

5-8

（ 4 ）质粒的空间构型：① 共价闭合环状 DNA（ cccDNA)

呈超螺旋（ SC ）（ super coil ）Covalent close circular DNA

5-9

③ 线形 DNA （ linear ， lDNA ）

一条链上有一至数个缺口。② 开环 DNA （ open circular ， ocDNA ）

5-10

（ 5 ）质粒空间构型与电泳速率同一质粒尽管分子量相同，不同的构型电泳迁移率不同：scDNA 最快、 l DNA 次之、 ocDNA 最慢。

SC

OCL

5-11

在大肠杆菌中的质粒，可以分为：接合型质粒 : 能自我转移非接合型质粒 : 不能自我转移

2. 质粒的类型

5-12

除了带有自我复制所必需的遗传信息外还带有一套控制细菌配对和质粒接合转移的基因。如： F 质粒（性质粒、或 F 因子）：

甚至能使寄主染色体上的基因随其一道转移到原先不存在该质粒的受体菌中。

又叫自我转移型质粒。1. 接合型质粒：

不符合基因工程的安全要求。

5-13

2. 非接合型质粒：虽然带有自我复制所必需的遗传信息，但失去了控制细菌配对和质粒接合转移的基因，因此不能从一个细胞转移到另一个细胞。

（ 1） R 质粒（抗性质粒）：带有一种或数种抗生素抗性基因，使寄主获得同样的抗生素抗性性状（ resistance ）。

符合基因工程的安全要求。

5-14

5-15

带有控制大肠杆菌素（ colicin ）合成的基因。

（ 2） Col 质粒：

大肠杆菌素对不带 Col 质粒的大肠杆菌有毒。Col 质粒或 R 质粒如果带有转移基因，也可以成为接合型质粒。

5-16

质粒的复制类型1. 严紧型质粒（ stringent plasmid ）

拷贝数少，只有 1—3 份拷贝。

2. 松弛型质粒（ relaxed plasmid ）拷贝数多，有 10—60 份拷贝。

（接合型质粒分子量大，一般属严紧型 DNA polymerase III ）。

（非接合型质粒分子量小，一般属松弛型DNA polymerase I ）。

5-17

（ 1 ）去掉非必需的 DNA 区，保留质粒必需区，降低分子量；

5.1.2 构建质粒克隆载体的基本策略

（ 3 ）加入易检出的筛选标记；（ 2 ）减少质粒本身内切酶位点的数目；

（ 4 ）关于质粒安全性的改造，不发生重组和转移，不能离体扩增；（ 5 ）改造或增加表达基因的调控序列；如启动子、增强子等。

5-18

1. pBR322 ：

（ 1 ）元件来源F. Bolivar和 R.L. Rodriguez人工构建载体。

① 复制起点 ori： pMB1系列（来源于 ColE1 ）的高拷贝型复制起点② Ampr 基因： pSP2124 质粒的 Ampr 基因③ Tetr 基因： pSC101的 Tet r 基因。

5.1.3 质粒克隆载体的构建

5-19

（ 2 ）长度 4363bp

（ 3 ）选择标记氨苄青霉素和四环素抗性。

（ 4 ）克隆位点其中 9 个会导致 Tetr 基因失活（如BamH I 、 Hind Ⅲ、 Sal I ）；3 个会导致 Ampr 基因失活（ Sca I 、PvuI 、 Pst I ）。

24 个克隆位点。

5-20

4363bp

5-21

（ 5） pBR322 的优点① 双抗菌素抗性选择标记插入失活，分两次先后选择：没有获得载体的寄主细胞在 Amp或 Tet 中都死亡。获得载体的寄主细胞在 Amp或 Tet 其中之一中死亡。

5-22

外源基因 BamH I

Amp 中存活但在 Tet 中死亡

外源基因 Pst I

Tet 中存活但在 Amp 中死亡

?

5-23

氯霉素扩增之后，每个细胞可达1000~3000copy

④ 安全失去了转移蛋白基因 mob（mobilization ）。不能通过接合转移。

③ 高拷贝数

② 分子小，克隆能力大载体越小越好。>10kb 的 DNA 在纯化过程中容易断裂。

5-24

保留了转移蛋白（ mob ）的作用位点。（ 6） pBR322 的缺点

能够被 ColK 质粒编码的 mob 蛋白识别，如果再有 F 质粒的参与，就有可能转移！

5-25

① 删除 mob识别位点（如质粒 pBR327、 pAT153 等）。pAT153 ：从 pBR322 上切去 HaeII 片断，既除去了 mob识别位点，又增加质粒的拷贝数。

（ 7） pBR322 的改进

5-26

pBR325 ：

在 pBR322 位点上接入一段来自噬菌体 PICm的 HaeII 酶切片断（带有氯霉素抗性基因 cmlr ）。cmlr 上也带一个 EcoRI 位点。

使 EcoRI 也成为插入失活型位点。

② 改造 EcoR I 位点

5-27

2. pUC系列University of California的 J. Messing和J. Vieria于 1978年，在 pBR322 的基础上改造而成。属正选择载体。pUC7、 pUC8、 pUC9、 pUC10、pUC11、 pUC18、 pUC19

5-28

① 复制起点 : pBR322 的 ori

② Ampr 基因 : pBR322的 Ampr 基因

（ 1 ）元件来源

③ lacZ 的启动子 : 来自于大肠杆菌④ lacZ’ 基因 : 大肠杆菌 LacZ 的 -肽链序列， 是 LacZ 的氨基端片断。

5-29

（ 2 ）长度：约 2.7kb

（ 3 ）克隆位点： 10 个连续的单一限制酶切位点，位于 lacZ’ 基因的 5’端。

5-30

pUC18/19

β-galactosidase coding sequence (26aa)

EcoRI SacI KpnI SmalI BamHI XbaI SalI PstI SphI Hind IIIATGACCATGATTACGAATTCGAGCTCGGTACCCGGGGATCCTCTAGAGTCGACCTGCAGGCATGCAAGCTTGGCACTG

TACTGGTACTAATGCTTAAGCTCGAGCCATGGGCCCCTAGGAGATCTCAGCTGGACGTCCGTAGCTTCGAACCGTGACGAATTCGAGCTCGGTACCCGGGGATCCTCTAGAGTCGACCTGCAGGCATGCAAGCTT5’ 3’

EcoRI SacI KpnI SmaIXmaI

BamHI XbaI SalIAccIHincII

PstI SphI HindⅢ

pUC18lacZ’

5-31

Ampicillin 抗性和 lacZ 的肽互补（蓝白斑）相结合。（ 4 ）选择标记

蓝白斑选择原理： ① Xgal

（ 5-Bromo-4-chloro-3-indolyl--D-galactoside ）

5-32

-半乳糖苷酶能把无色的化合物Xgal 分解成半乳糖和一个深蓝色的物质 5-溴 -4-氯靛蓝。

Xgal半乳糖

5-溴 -4-氯靛蓝-半乳糖苷酶

② -半乳糖苷酶 Xgal显色反应：

5-33

③ lacZ 的肽互补1 ） -肽（ lacZ’ ）：

-半乳糖苷酶 N端的一段氨基酸片断（ 11-41氨基酸）。

lacZ 只有在 4 聚体的状态下才有功能 .

C端大部分N端的 11-41aa

C端大部分N端的 11-41aa

C端大部分N端的 11-41aa

C端大部分N端的 11-41aa

4聚体

5-34

2 ）受体菌 lacZ突变（ lacZ∆M15 ）受体菌基因组的 -半乳糖苷酶基因的氨基端有缺失（缺失肽），不能形成4聚体的活性酶，不能分解 Xgal

受体菌株： JM系列、 TG1、 TG2、 XL1-blue、 XS127、XS101、 KK2186、MV1184、 DH5a

5-35

pUC 质粒载体上的 lacZ’ 编码肽与这个缺失突变的 -半乳糖苷酶“互补”，使它能形成 4聚体。又能分解 Xgal 。产生蓝色物质。C端大部分N端的 11-41aa

pUC lacZ’ 受体菌 lacZ∆

3 ）载体 lacZ’ 与互补

5-36

4 ）互补的插入失活pUC 载体上 LacZ’的 5‘端有一段多克隆位点 (MCS) 区，本身虽不干扰 LacZ’的合成，但插入外源基因就会阻止

LacZ’ 的合成。不能互补。

肽移码突变肽不互补互补

lacZ’5’ 3’MCS lacZ’5’ 3’外源 DNA

5-37

④ IPTG 的诱导作用IPTG 是乳糖的类似物。能诱导 lac 操纵子的启动转录，使受体菌基因组中的 lacZ 的 C端部分和载体的 lacZ’肽都表达。从而互补。但载体 MCS上插入外源 DNA后，不能产生肽！

IPTG

5-38

通过看培养皿上的菌斑的颜色就能直接知道是否有 DNA插入。

MCS无插入时，互补，蓝菌斑。MCS 有插入时，不互补，白菌斑。

IPTG诱导的结果：

5-39

无质粒的受体菌

- 半乳糖苷酶部分缺失，不能分解Xgal ；无抗菌素抗性

在含抗菌素和 Xgal 的培养基上培养

无菌斑生长

质粒转化的受体菌- 半乳糖苷酶的缺失被载体产物互补，能分解 Xgal 。且有抗菌素抗性

在含抗菌素和 Xgal 的培养基上培养

有蓝色菌斑生长

带外源 DNA插入的质粒转化的受体菌

载体产物失活，不能互补 -半乳糖苷酶的缺失。不能分解 Xgal ，但有抗菌素抗性

在含抗菌素和 Xgal 的培养基上培养

有白色菌斑生长

5-40

5-41

（ 5） pUC系列载体的优点① 更小的分子量：如 pUC18为 2682bp， pUC8为2750bp 。② 选择方便Xgal显色、抗菌素双重直接选择。

③ 克隆便利具有多克隆位点（ MCS ），使有两个不同粘性末端的外源 DNA方便地插入。④ 测序方便

5-42

pUC的MCS与M13 噬菌体载体的 MCS完全相同，便于把外源 DNA 转移到 M13载体上测序。GAATTCGAGCTCGGTACCCGGGGATCCTCTAGAGTCGACCTGCAGGCATGCAAGCTT

5’ 3’

EcoRI SacI KpnI SmaIXmaI

BamHI XbaI SalIAccIHincII

PstI SphI HindⅢ

pUC18lacZ’

M13mp18 的多克隆位点

5-43

3. pUC 的衍生质粒载体1. pGEM-3Z

由 pUC派生而来。与 pUC 的主要区别是在MCS 的两侧分别加了一个噬菌体启动子 T7和 SP6 。

T7启动子SP6启动子MCS

lacZ’Ampr

ori

可被 T7 和 SP6 的 RNA 聚合酶识别转录。

5-44

① 如果加入纯化的 T7或 SP6 RNA聚合酶，在试管里就可以转录mRNA② 外源基因正接反接都可以转录。 ③MCS与 pUC18 的完全一样。

2. pGEM-4Z ：与 pGEM-3Z 相同，只是 T7启动子和SP6启动子的位置互换。

pGEM-3Z 的特点：

5-45

single linear DNA (about 182,000 bp)

T2 Genomic DNA

5-46

5.2 噬菌体载体

噬菌体是一类细菌病毒（ Bacteriophage ）。结构：蛋白质外壳内包裹着 DNA （双链、单链、线性、环状等）。

1. 噬菌体的一般特性

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（ 1 ）长度为 48502 bp ；（ 2 ）双链线性 DNA ；（ 3 ）但在两端有 cos 位点，可以环化。

DNA两端各有 12bp 的粘性末端，粘性末端形成的双链区域称为 cos 位点。

2. 噬菌体 DNA 分子的特点

cos 位点（ cohensive-end site ）：

5-48

DNA 进入细菌体内后，可形成双链环状DNA 复制型（ RF DNA ）。

5-49

噬菌体和其 DNA

5-50

DNA 上有至少 61 个基因，有一半是必须的，与自身的活动有关，成簇排列。其他约 1/3 是非必须基因（位于尾部合成至阻遏之间的区段）。

3. 噬菌体的基因组特点

19.6kb 头尾蛋白合成 12-24kb 重组 整合剪切 9-11kb DNA 复制 溶原

5-51

1 ）溶源化周期：感染细菌后， DNA 环化，将自己的 DNA整合到细菌的染色体 DNA 中。形成这一过程称为溶源化（ lysogenization) 。

整合到细菌染色体的噬菌体 DNA 称为原噬菌体，噬菌体 DNA随细菌的染色体复制而复制。原噬菌体（ prophage) ：

4. 噬菌体的生活周期分为两种：

5-52

5-53

2 ） 溶菌周期：感染细菌后立即在菌体内复制和合成蛋白质外壳，重新组装成噬菌体颗粒，并导致细菌细胞解体，释放出大量子代噬菌体。

5-54

5-55

5-56

噬菌体感染细菌的早期：双链进行型复制。

3 ） DNA 的复制 模型（ 1 ） 型复制

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（ 2 ）滚环复制 感染的晚期：启动滚环复制机制。形成多联体 DAN 分子。

5-58

这种多联体分子必须在 cos 位点被切断成单体分子才能被包装起来。

5-59

（ 1 ）构建原理：5. 噬菌体载体的构建

（ 2 ）构建过程① 在这个非必须区内制造限制酶切点②引进某些突变表型，作为选择标记③突变某些基因，使它成为安全载体④删除 DNA 必须区段上常用的限制酶切点 噬菌体 DNA 上本身有 5 个 EcoR I 和7 个 Hind III 切点！

删除噬菌体的非必需区，留出插入空间。

5-60

（ 3 ）人工构建的噬菌体载体有两种类型：① 插入型载体（ insertion vectors) ：

如 gt10 、 gt11 、 BV2 、 NM540 、 NM1590 、 NM607

1 ）免疫功能失活型：插入位点位于载体合成活性阻遏物区域（ cI 基因）内。

EcoR I

cIgt10

5-61

没有外源 DNA 插入的载体感染受体菌形成混浊噬菌斑。插入导致载体不能合成阻遏物，载体 DNA 不能进入溶源期，受体菌全部裂解，形成清晰的噬菌斑。

选择标记 :

如 gt10 载体的两个克隆位点（ EcoR I 和Hind III ）都是位于 cI 基因内部。

5-62

2 ） -半乳糖苷酶失活型载体：在基因组中引入了 LacZ’ 序列。（其上含有一个 EcoR I 克隆位点）。

感染 LacZ突变的大肠杆菌，经 IPTG 的诱导，利用 Xgal 的显色反应作选择标记。

LacZ’

EcoR ICharon16A

选择标记 :

5-63

② 替换型载体（ substitution vectors)

两个多克隆位点区以反向重复形式分别位于 DNA 的非必须区两端。

用酶切后，可以将中间的区段切下来，与用同样酶切成的外源 DNA片断置换。

可置换区MCS MCS

如： EMBL3、 Charon40 等。

5-64

1 ） EMBL3

EMBL3 的可置换片断内部还有 Sal I 酶切位点。

以便于进一步消化中间片断，防止自我连接。

左臂 可置换区 右臂E

coR

IB

amH

ISa

l I

Sal I

Bam

H I

Eco

R I

Sal I

Sal I

EMBL3

5-65

2） Charon40Charon40 的可置换片断是由 DNA短片重复构成，片断之间有 Hae I 切点。

在克隆的时候，可以用 Hae I 酶进一步将可置换片断切成小片断，以防止重新与载体连接。

左臂 可置换区 右臂MCS MCS

Charon40

Hae I

5-66

可取代片断中如果包含 LacZ’ ，可用Xgal显色作筛选标记。

（ 4 ）载体的筛选标记

② 插入型载体根据插入所引起的表型突变。

① 置换型载体

5-67

载体克隆策略置换型载体

5-68

DNA象质粒载体那样直接转化细菌时效率远比质粒低。6. 噬菌体的体外包装

在试管中与噬菌体的头部和尾部蛋白人工装配成噬菌体颗粒，才能高效地感染细菌，把重组 DNA注入受体菌中。

必须利用噬菌体外壳的作用！（ 1 ）体外包装：

5-69

5-70

的 D 基因的产物也是头部蛋白，但主要与 DNA 进入头部和头部的成熟有关（只占 20% ）。

（ 2 ）体外包装过程① 噬菌体外壳蛋白的合成

E 基因的 E 基因编码头部蛋白的主要成分（占头部总蛋白的 70% ）。

D 基因

5-71

E 基因突变只合成尾部蛋白和包装识别蛋白

D 基因突变 合成头部蛋白和尾部蛋白，但不能聚合和包装DNA

提取尾部蛋白

提取头部和尾部蛋白重组的载体DNA

体外包装成活性噬菌体

5-72

外源的重组 DNA 载体被诱发与内源性原 DNA发生重组。

（ 3 ）体外包装存在的问题：① 包装错误：既能包装用于生产头部蛋白的内源性原 DNA ，也能包装重组的 DNA 载体。

② 重组：

5-73

③ 体外包装的容量限制：必须在正常野生型容量的 75%—105%（ 36—51kb ）之间。既不能超过正常野生型容量的 5%；又不能低于正常野生型容量的 75%

野生型 DNA 的必须区是 28kb ，所以载体的最大克隆容量是 23kb 。（实际上为 15kb ）。

5-74

比一般的质粒载体的容量大的多。（ 4 ） DNA 载体的优点

用在真核生物基因组文库的建立。

Sau3ABamHI

5-75

5-76

噬菌体感染细菌形成的噬菌斑

5-77

1978年 J. Collins和 B. Hohn 等人发展出cosmid vector（ cos site-carrying plasmid)

DNA ： cos 序列和控制包装的的序列。

5—7kb（ 1 ）大小 （ 2 ）组成

5.2.2 cosmid 载体（粘粒）

pBR322 ：质粒的复制子抗药性基因几个限制性酶的单一位点

5-78

pHC79

5-79

① 具有噬菌体的特性；（ 3） cosmid vector 的特点

克隆外源 DNA后，可以体外包装成噬菌体颗粒。

在寄主细胞内形成环化 DNA （但不能形成新的噬菌体颗粒而溶菌 ）。

② 具有质粒载体的特性；大多带有 pMB1或 ColE1 的复制子，能象质粒一样复制。

5-80

有抗菌素抗性基因，和插入失活的克隆位点。③方便的选择；

④具有高容量的克隆能力；45kb （最少不能低于 30kb ）。

51kb-5kb=45kb

⑤具有与含同源序列的质粒进行重组的能力；

5-81

部分 cosmid vectorCosmid载体

复制子 大小（ kb)

选择标记 克隆位点 克隆能力（ kb)

c2XB pMB1 6.8 Ampr,Kanr

BamHI, ClaI, EcoRI, HindIII, PstI, SmaI

32~45

pHC79 pMB1 6.4 Ampr ,Tetr

EcoRI, HindIII, SalI, BamHI, PstI, CalI

29~46

pHS262 ColE1 2.8 Kanr BamHI, EcoRI, HincII 34~50

pJC74 ColE1 15.8 Ampr EcoRI, BamHI, BglII, SalI 21~37

pJC75-58

ColE1 11.4 Ampr EcoRI, BamHI, BglII 16~42

pJC74m ColE1 21 Ampr,Kanr

BamHI 16~32

pJC720 ColE1 7.1 Elimm,Rifr

HindIII, XmaI 11~28

5-82

Cosmid载体

复制子 大小（ kb)

选择标记 克隆位点 克隆能力（ kb)

pJC81 pMB1 7.1 Ampr,Tetr

KpnI,BamHI,HindIII,SalI

30~46

pJB8 ColE1 5.4 Ampr BamHI,HindIII,SalI 31~47

MuA-3 pMB1 4.8 Tetr PstI,EcoRI,BalI,PvuI,PvuII

32~48

MuA-10 pMB1 4.8 Tetr EcoRI,BalI,PvuI,PvuI

32~48

pTL5 pMB1 5.6 Tetr BglII,BalI,HpaI 31~47pMF7 pMB1 5.4 Ampr EcoRI,SalI 32~48

5-83

应用 cosmid 载体在大肠杆菌中克隆大片端的真核基因组 DNA 技术，叫“柯斯克隆”（ cosmid cloning ）。

（ 4） cosmid cloning

①理论依据：cos 位点 :

噬菌体的生命周期中，会产生数百个 DNA通过 cos 位点连接的“多联体”分子。

“多联体”复制：包装识别。

5-84

在包装的时候， 噬菌体具有位点特异的末端酶（ terminase ）体系（ Ter 体系），识别 cos 位点，把多联体切成单个 DNA长度。

两个 cos 位点之间，必须保持 38—45kb的 DNA， Ter 体系才能识别。

Ter 体系：

包装限制：

5-85

① 用特定的核酸内切酶消化真核生物 DNA 。（ 5） cosmid 克隆的一般过程

② 用同样的内切酶消化 cosmid 载体。

产物中将有一定比例的分子是两端各有一个 cos 位点、长度 40kb左右的真核 DNA 与载体的连接物。

③连接

5-86

切割合适长度的杂种 DNA连接物，并包装入噬菌体头部。

注入到细菌体内的杂种 DNA 分子环化，并按质粒的方式复制。⑤感染大肠杆菌

④ Ter 体系识别并切割

5-87

5-88

5-89

大质粒！

5-90

① 载体片断自我连接。② 外源 DNA 片断自我连接。③ 多个本来不在一起的外源 DNA 片断连接起来同时插入载体。

（ 7） cosmid 载体克隆的缺点

用碱性磷酸酶除去线性质粒片断 5’端的磷酸，可防止载体自体连接。克服载体自体连接的改良方案：

5-91

① Ish-Horowice—Burke改良方案

1981年， D. Ish-Horowice和 J.F. Burke 。

（ 7） cosmid 载体的改良

在 BamH I 位点两侧各有一个 EcoR I 切点。1 ）突出的特点：

pJB8 cosmid 载体

使克隆在 BamH I 上的外源 DNA 可被EcoR I 切下来。

5-92

2） Ish-Horowice—Burke方案克隆过程

HindIII SalI

SalIHindIII

T4 ligase

5-93

a. 需要脱磷酸化处理。

b. 电泳纯化载体两臂。

c. 载体两臂的最终得率少的可怜！

2） Ish-Horowice—Burke方案的缺点

防止载体自我连接

第二次酶切后。

5-94

1983年 P.F. Bates和 R.A. Swift

② Bates---Swift 改良方案

a. 具有两个 cos 位点。SmaI 平端的连接效率低，阻止了载体臂的自我连接，增加了外源DNA 的连接效率。

1 ）特点：b. 一个 SmaI 切点把两个 cos 位点分开。

c. BamHI 克隆位点。

c2XB cosmid 载体

5-95

Bates---Swift 克隆过程：

5-96

5.2.3 M13 噬菌体克隆载体

RF dsDNA 在寄主细胞内以高拷贝形式存在。成熟的噬菌体里只包装有 + DNA ，也容易提取。

M13 噬菌体属于丝状噬菌体，无论是双链还是单链 DNA均可感染大肠杆菌。+ 单链 DNA ， 6407 bp 。（ 2） DNA长度

（ 3） DNA提纯

（ 1 ） M13 噬菌体的生物特性

5-97

M13 序列

5-98

+DNA

-DNA

mRNA

M13 外壳蛋白 组装成子代M13

+DNAM13通过雄性细菌的 F 性须注入其 +DNA

复制

转录翻译

+DNA指导合成

+DNA 形成 RF dsDNA 200个 RF DNA

每个细胞可以放出约 1000个 M13颗粒！

（ 4）M13 的生活周期

5-99

M13 的包装过程：RF dsDNA指导合成的 +DNA

M13 基因 V 编码单链 DNA结合蛋白

DNA- 蛋白质复合物转移到寄主的细胞膜

M13 外壳蛋白 基因 V 蛋白脱落+DNA溢出细胞膜包装

（ 5 ）没有包装限制

5-100

3. M13 载体的构建：

M13 基因组中只有基因 II 与基因 IV 之间存在一段 507bp 的基因间隔区。

（ 1 ）克隆区域的选定① 基因间隔区（ intergenic region, IG区）

IG 区内只有一个 BsuI 切点。其余 9 个 BsuI 限制性位点分布在其它部位。

② 酶切位点

5-101

M13

J. Messing证明， IG 区存在 M13 的复制起点，但可以插入外源 DNA而不影响M13 噬菌体的活力。

5-102

在 IG 区内插入一个大肠杆菌的LacZ’ （ -肽序列 ) 。利用 -肽序列中的三个单一酶切位点（ Bgl II、 Ava II 和 Pvu I ）。

（ 2 ）加入酶切位点① 在 IG 区内加入单一内切酶位点第一个 M13 载体： M13mp1 ：

5-103

M13 RF

BsuI 不完全消化各种长度的线性片断

（其中应有只在IG上切开的线性全长 M13）

E.coli lac 基因的HindII 片断(lacI、 lacP、 lacO、lacZ’ ）

连接M13mp1

JM101 宿主只有在 IG 区插入 lacZ’才能存活并在 Xgal 上出现互补的蓝噬菌斑

5-104

（ 3）M13 载体系列

加上常用的酶切位点。

①M13 载体系列的命名M13mpn n代表系列数字

② 对M13mp1 的改进

B. Gronenborn和 J. Messing1978年把LacZ’ 5’端的第 13 个核苷酸 G突变成A ，产生了一个 EcoR I 切点。

M13mp2 ：

5-105

5’ATGACCATGATTACGGATTCA-

Me用 N-甲基 -N-亚硝基脲 把 G甲基化

5’ATGACCATGATTACGGATTCA-转染 E.coli。 mG与 T 配对，复制两次后5’ATGACCATGATTACGAATTCA-

EcoRI 切点用 EcoRI 切

M13mp1

M13mp2

选择能切开的 线性分子再环化

M13mp1

5-106

③ 对M13mp2 的进一步改进在M13mp2的 LacZ’的 5’端加上一段人工合成的多克隆位点（ MCS ）。

M13mp7、M13mp8、M13mp9、M13mp10、M13mp11、M13mp18、M13mp19

对应有相同 MCS 的 pUC 系列载体：pUC7、 pUC8、 pUC9、 pUC10、 pUC11、 pUC18、 pUC19

成为 M13mp系列载体：

5-107

5-108

5-109

与 pUC18 相同

M13mp18 的多克隆位点

5-110

4. M13系列载体的优点（ 1 ）有 MCS ，便于克隆不同的酶切片段（ 2 ） Xgal显色反应，可供直接选择（ 3 ）无包装限制，克隆能力大（ 4 ）可以克隆双链 DNA 分子中的每一条链

子代 M13 噬菌体中包含的是单连 +DNA 。

5-111

MCS+-

+-+-

编码链非编码链 外源 DNA

不同的酶切

不同的酶切

插入

M13 vector

5-112

M13 RF + -

+ - + -外源 DNA

转染 E. coli

成熟的子代M13 中+ +

5-113

① 插入外源 DNA后，遗传稳定性显著下降② 实际克隆能力小于 1500bp 。

5. M13 载体的缺点

5-114

噬菌粒载体（ phagemid vectors ）由质粒载体与单链噬菌体载体的复制起点结合而成的新型载体系列。

MCS

噬菌体 ori

质粒 ori

Ampr

lacZ’ lacI

5-115

约 3000bp （比M13 小）② 克隆能力大能插入 10kb 的外源 DNA 。③两种复制形式

① 分子量小（ 1 ）噬菌粒载体的特点

既具有质粒的复制起点，又具有噬菌体的复制起点。既能在大肠杆菌中以质粒的形式双链复制，又能在噬菌体内进行单链复制。

5-116

（ 2 ）常见的噬菌粒载体噬菌粒载体 质粒部分 单链噬菌体部分 辅助噬菌体 大肠杆菌寄主pEMBL8 pUC8 f1 IR1 71/18

pRSA101 VX M13 M13变异株 XS127，XS101

pUC118/pUC119

pUC18/pUC19

M13 M13K07 MV1184

pBS pUC f1 M13K07 XL1-Blue

辅助噬菌体用来复制和包装噬菌粒载体。

5-117

（ 3） pUC118/pUC119

① 构成1）M13 的基因间隔区（ IG ）

2） pUC18/pUC19 质粒载体：带有 M13 复制起点。

质粒复制起点Ampr

lacZ’MCS

5-118

MCS

pUC18/pUC19 ori

Ampr

lacZ’ lacIM13 ori

3.2kb

pUC118/119

5-119

② pUC118/119 的复制模式两种不同的复制模式1 ）双链质粒复制模式受 pUC 本身的复制起点（来源于ColE1 ）的控制。

每个细胞能达到 500个拷贝。

5-120

来源于 M13 的复制起点被辅助噬菌体的基因 II产物控制。

2 ）单链滚环噬菌体复制模式

外壳蛋白

复制蛋白

辅助M13包装

当寄主细胞被辅助噬菌体 M13感染后。

5-121

③ 噬菌粒载体的包装1 ）辅助噬菌体：

自身的复制起点发生了突变，复制效率低下，但感染细菌后能表达出外壳蛋白和复制蛋白，帮助噬菌粒载体复制。

如M13K07 等。

2 ）包装：辅助噬菌体 外壳蛋白和复制蛋白

噬菌粒载体 ssDNA

噬菌体

5-122

（ 4） pBluescript 噬菌粒载体（ pBS ）

Stratagene公司发展的一类噬菌粒载体。由 pUC 质粒载体、 f1 噬菌体的复制起点和 T3、 T7 噬菌体的启动子组成。

② 特点

① 组成

MCS两侧分别加上 T3和 T7 噬菌体的启动子。加入适当的噬菌体 RNA聚合酶，就可以定向体外转录。

1 ）定向体外转录

5-123

2 ）两种复制模式既能以质粒的形式复制，又能以噬菌体的形式复制包装。

3 ）选择方便有 Ampr和 lacZ’ ，可以进行 Amp 抗性选择和 Xgal-IPTG蓝白斑选择。

4 ）插入方便18 个单一酶切位点的 MCS

5-124

SK ：表示 lacZ’ 的转录方向是沿MCS 上的 SacI KpnI

+（ f1+ ）：单链复制起始方向背离 lacZ’ ，能回收 lacZ’ 的编码链（ + ）

pBluescript SK（ +/-） /pBluescript KS（ +/- ）

KS ：反向（ KpnI SacI ，MCS 相反）

-（ f1- ）：能回收 lacZ’ 的非编码链（ - ）

1） pBluescript SK/KS（ +/- ）区分：

③ 常用的 pBluescript 载体

5-125

pBS SK+

5-126

pBS KS-

5-127

5-128

5-129

PCR产物克隆载体—— T 载体pCR系列载体Invitrogen公司开发的线性噬菌粒载体。

① 结构pUC 的质粒部分、 fi 噬菌体ori、 Kanr和 Ampr 抗性。MCS 的中部已经切开，各有一个 3’端突出的 T 。

② 特点

PCR 产物往往在 3’ 端突出一个 A ，所以能与这个载体直接连接。

5-130

pCR2.1

5-131

pCR2.1的MCS

克隆的 PCR产物能被两侧的 EcoRI 切下来回收。

5-132

Promega 公司的 T载体系列pGEM-T vector

5-133

pTarget vector

G418 抗性 可在真核生物表达外显子捕捉

5-134

H. Shizuya等 1992年在大肠杆菌 F 因子的基础上构建的。

5.3.1 细菌人工染色体（ BAC ）1. F 质粒的特点：（ 1 ）单拷贝复制。（ 2 ）克隆容量可达 300kb 。（ 3 ）比较稳定。每细胞只有一个拷贝，不会重组。（ 4 ）便于提纯；像提取质粒一样直接提纯。

5.3 大分子 DNA 克隆载体

5-135

（ 1） OriS和 repE 控制质粒的单向复制。（ 2） parA和 parB维持低水平质粒拷贝数。（ 3） CosN 是噬菌体末端酶专一性切割位点。（ 4） loxP是 P1 Cre 蛋白作用位点。（ 5） HindIII和 BamHI 是插入位点。（ 6 ）两侧的 NotI 可用于切下外源 DNA 。（ 7 ）氯霉素抗性基因 CMR

2. BAC 的组成结构

5-136

5-137

A.W.Murray 1983年形成基础理论 , D.T.Burke等 1987年变为现实。

5.3.2 酵母人工染色体

1. YAC 的特点：（ 1 ）只能在酵母细胞中扩增。（ 2 ）克隆容量大，为 230kb-1700kb 。（ 3 ）构建原理，按染色体结构构建。

（（ yyeast east aartificial rtificial cchromosome, YAC)hromosome, YAC)

5-138

（ 1） DNA 复制起始点（ ARS ）（ 2 ）着丝粒（ centromere， cen ）（ 3 ）两个端粒（ telomeres， tel ）

2. 染色体复制和遗传的三个基本组件：

TEL TELCENARS

5-139

（ 1 ）着丝粒区（ CEN ）3. YAC 的组成结构

酵母染色体着丝粒区的保守序列 :

A AGTCACGTG

TTGTTTCTGNTTTCCGAAA78-86bp

I II III

由三个区组成

5-140

酵母第 3、 4、 6、 11号染色体的着丝粒区序列：

5-141

酵母端粒保守序列是 (G4T2)n 重复序列。

（ 3 ）复制起点（ ORI ）

约 100bp 的自主复制序列（ ARS ）。

（ 2 ）端粒（ TEL ）

人是 TTAGGG 重复序列 ; 四膜虫是 GGGTTG 重复序列。

（真核生物中只有酵母菌有 ARS ）

两个端粒序列 Tel 。

5-142

位于 SUP4 基因内部。（ 4 ）克隆位点插入失活选择：

与 YAC 载体配套的宿主酵母菌（如 AB1380 ）的胸腺嘧啶合成基因带有一个赭石突变 ade 2-1 。有这个突变的酵母菌在基本培养基上形成红色菌落，当带有赭石突变抑制基因 sup4 的载体存在于细胞中时，就抑制 ade 2-1 基因的突变效应，形成白色菌落。利用这一菌落颜色转变的现象，来筛选载体中含有外源 DNA 片段插入的重组子。

SUP4 酶失活的酵母菌落呈红色；不失活的菌落是白色。

5-143

TRP1、 URA3（分别位于两臂）。

细菌的复制起点 ori 和抗生素标记 Ampr

（ 5 ）在酵母中的标记基因

（ 6 ）在细菌中操作

5-144

4. YAC 克隆外源DNA

5-145

（ 1 ）宿主酵母菌：

只有同时得到 YAC 的两个臂，才能在基本培养基（不加 TRP和 URA ）上生长。（ 2 ）选择方式

5. YAC 转化过程AB1380 trp- 和 ura-

centrp1 ura3

5-146

5-147

（ 1 ）存在插入子的稳定性问题。6. YAC 的缺点：

（ 2 ）同一酵母细胞内多个 YAC引起交换（ 3 ）转化效率低。（ 4 ）难以制备纯的 YAC-DNA 。

5-148

花椰菜花叶病病毒（ CaMV ）环状双链 DNA分子的植物病毒。 1. 基因： CaMV DNA 分子大小： ~8kb

2. 结构：在病毒颗粒中呈开环形式，负链有一缺口，正链有两缺口。进入植物细胞后单链部分被酶解，缺口自行闭合，成为环状 DNA 分子。

5.41 CaMV 克隆载体5.4 病毒载体

5-149

5-150

CaMV 基因区• 8 个阅读框（ ORF ）和 3 个间隔区（ IR1～ 3 ）

IR1－ ORF VI与 ORF VII 之间IR2－ ORF VII与 ORF I 之间IR3－ ORF V与 ORF VI 之间

IR1 和 IR3 区各有一个启动子结构，分别启动同方向转录 35S RNA和 19S RNA ，而两者的终止子都在 IR1 区。35S启动子——组成型强启动子。组装了

35S启动子的外源基因可在植物细胞高效表达，在蓝藻细胞内也有效表达。

5-151

CaMV 的增殖和感染　 1 、增殖途径：

Ca MV颗粒→蚜虫→病毒 DNA 进入植物细胞核→转录 19S RNA→翻译

35S RNA 　翻译　　　 反转录　　　　“ -”链 DNA → 复制出“ +” 链2、 Ca MV-DNA 可转染植物细胞在 ORF II和 ORF VII 区插入外源 DNA后仍能转染植物细胞

包装成新的Ca MV颗粒

5-152

3. 构建 Ca MV 克隆载体的基本策略和途径 • 设计思路： CaMV-DNA 能侵入植物细胞而将目的基因导入，并且清除 CaMV 对植物的致病性基因。• 途径（ 1 ）构建互补克隆载体 : 辅助病毒载体系统 + 有缺陷的 CaMV 病毒分子→彼此获得对方产物→感染能力（ 2 ）构建混合型克隆载体 CaMV-DNA → 合适的限制性酶切→组入 Ti的 T-

DNA 区→完成构建（ 3 ）构建 CaMV35S启动子融合基因克隆载体系统将 35S启动子与目的基因融合，高效表达目的基因。

5-153

5-154

• 基因组：烟草花叶病毒（ TMV ）的是一种单链的正义 RNA， 6395nt 。• 特点：至少编码四种多肽 :两种复制酶亚单位， 130kD和 180kD; 一种 30kD 外壳蛋白和一种与细胞间运动有关的重要蛋白。• 外壳蛋白表达量高，寄主范围广，能在整株植物上快速扩散• TMV 载体构建策略

5.4.2 烟草花叶病毒（ TMV ）克隆载体

5-155

构建 TMV 载体的策略表面展示

插入型

替换型

互补型 运动蛋白缺失突变型外壳蛋白缺失突变型

复制酶缺失突变型

5-156

1. SV40 基因组：双链环状 DNA：5243bp早期转录区：一个基因（ 2 个蛋白质 t， T）

调控区（ 400bp ）：复制起始点，启动子，增强子晚期转录区：先转录出一个多顺反子 mRNA

VP1 mRNAVP2 mRNAVP3 mRNA VP3比 VP2N 端少 1/3

AUG 位于 VP2 和 VP3内

5.4.3 SV40 克隆载体

5-157

T - 抗原和 t- 抗原mRNA前体的不同剪接方式UAA

内含子 1

内含子 2

前体 mRNA

剪接方式 1 ：去除内含子 1剪接方式 2 ：去除内含子2

T-mRNA

T- 抗原 t- 抗原分布于核内： 100 KD 分布于胞浆内： 18 KD

t -mRNAUAA

5-158

1.SV40 载体 SV40 病毒的基因组是环状双链 DNA, 大小仅为 5243bp,与质粒大小相似 , 适于基因操作 .

SV40 在感染敏感宿主细胞后，其基因组 DNA 进入细胞核 , 首先启动早期基因转录 , 在细胞质中表达出早期基因 t抗原和 T 抗原 , 当这 2 种蛋白质积累到一定程度时 DNA 开始复制 , 同时开始驱动病毒晚期基因转录 , 翻译产生VP1,VP2和 VP3 等病毒衣壳蛋白 , 并开始进行病毒粒子的装配 . 当病毒粒子数量积累到一定量时 , 细胞裂解释放出子代病毒粒子 .

5-159

● SV40 病毒不能包装大于 SV40 基因组的 DNA 分子 , 因此 ,外源基因只能通过取代病毒本身的 DNA 片段进行克隆 .

● 以 SV40 病毒为基础的克隆载体主要有 2 种不同类型 : (1)置换行重组病毒载体 外源 DNA 是直接插入在缺陷性的病毒基因组中 . 根据置换位置不同分为 : ① 早期置换型 ② 晚期置换型 (2)重组的病毒 - 质粒载体 载体只保留复制序列 , 无衣壳蛋白 , 不能产生病毒粒子 , 但可进行复制并产生很多拷贝 , 所以依然可以高水平表达外源基因 .

5-160

2.SV40-DNA 复制与增殖猿猴细胞——受纳细胞嚙齿动物（小鼠、仓鼠）——非受纳细胞，导致细胞转化人： 1～ 2% 细胞产生病毒颗粒，不会插入染色体，相对安全

3. 构建策略和途径包装严格，不能包装大于 SV40-DNA 的分子，只能构建取代型载体或 SV40-DNA 与质粒 DNA 的重组型载体

（ 1 ）取代型载体被取代的 DNA 序列不能超过 SV40-DNA的 30%1 ）晚期转录区取代型：需辅助载体共同转染受体细胞2 ）早期转录区取代型：辅助细胞系（将 SV40 早期转录区 DNA 序列整合到敏感细胞基因组上）

5-161

（ 2 ）穿梭质粒载体 质粒载体的衍生物，利用 SV40元件和质粒载体的元件构建的适合在真核细胞表达的载体。病毒 - 质粒重组克隆载体（穿梭质粒） ：含 SV40完整早期转录区和 DNA 复制起始点，及质粒 DNA 的复制起始点和选择性标记。

5-162

5.4.5 反转录病毒载体1.反转录病毒（ ritrovirus ）属于正链 RNA 病毒，显著的特点是具有2倍体基因组。两个相同的 RNA 分子在 5’端附近经氢键连接形成 70S RNA ，这种结构可能在逆转录过程中起调节作用。

5-163

反转录病毒结构

5-164

Influenza virusHIV

5-165

类似于真核细胞 mRNA

2. 反转录病毒的基因组结构envpolgag U3U3 U5U5cap polyA 3’

5’LTR LTR

R R+

Moloney murine leukemia virus (Moloney MLV)

长末端重复序列。在病毒基因组整合中至关重要。整合时，整合酶在 U5-U3 连接处切开双链 DNA ，随机插入到宿主基因组里。LTR 本身还具有启动子和 polyA 加尾信号的功能。

LTR ：

5-166

+ ：组装时必需的非编码序列。env ：外壳蛋白。pol ：反转录酶和整合酶。gag ：核心蛋白。

envpolgag U3U3 U5U5cap polyA 3’5’

LTR LTR

R R+

U5、 U3： 5’ 段或 3’端独特序列。

5-167

3. 反转录病毒载体构建（ 1 ）删除 pol、 env和 gag 基因。（ 2 ）插入标记基因（如 neor ）。（ 3 ）外源基因和启动子插入到 +下游。

5’LTR + 外源基因 neor 3’LTR启动子

5-168

4.反转录病毒载体的包装

反转录病毒 DNA 转化细胞的效率很低，必须包装成病毒颗粒转染细胞。用两个缺失了 + 的反转录病毒染色体转化细胞，以制造病毒外壳蛋白。

（ 1 ）包装细胞系的构建

5’LTR gag 3’LTR

pol env 3’LTR5’LTR

5-169

5’LTR gag 3’LTR

pol env 3’LTR5’LTR

病毒外壳蛋白

包装细胞

5-170

（ 2 ）载体 RNA 的包装① 用载体 DNA 转化包装细胞系转入的载体 DNA 上带有 + ，转录成的载体 RNA就会被包装细胞中原有的病毒外壳蛋白识别包装成重组病毒颗粒。

5’LTR + 外源基因 neor 3’LTR

高效转染靶细胞

5-171

5. 反转录病毒载体的优点（ 1 ）将 DNA 插入宿主基因组的随机位点上。（ 2 ）侵染范围广、感染率高。（ 3 ）整合的原病毒在宿主基因中比较稳定， 拷贝数目较低。（ 4 ）包装的外源 DNA 可达 10kb 。（ 5 ）反转录病毒感染哺乳动物细胞，对宿主 细胞没有毒性。反转录病毒一般只感染处在分裂状态的细胞。

5-172

1. 1. 腺病毒的基因组腺病毒的基因组线状双链 DNA 病毒，基因组中有 14 个基因。共同特点是都带有倒置的末端重复（ ITR ），在病毒的复制过程中起非常重要的作用。

5.4.6 腺病毒载体（ adenovirus ）

5-173

（ 1 ）比较安全，无致病、致癌、致畸作用。（ 2 ）宿主范围广

2. 腺病毒的优点

不仅能感染有分裂能力的细胞，也能感染不能分裂的细胞（如神经细胞）。

（ 4 ）载体中的插入片断可达 7.5kb （有包装容量限制）。（ 5 ）腺病毒容易制备、纯化。（ 6 ）基因组结构和功能了解得清楚。

（ 3 ）可以在呼吸道和肠道中繁殖，可以通过口服或喷雾的方式感染。

5-174

3. 腺病毒载体是目前最常用的基因治疗载体之一。

（ 1 ）腺病毒载体的构建• 在人腺病毒 C亚群的 Ad2 和 Ad5 的基础上构建。• E1 区为病毒复制必需区，缺失则成为复制缺陷型载体。• E3 区是病毒复制非必需区，可用于外源基因的插入。

5-175

（ 1 ）腺病毒载体的构建用同源重组的方法插入外源基因。

①删除腺病毒 DNA 一些非必需区如 E1或 E3 区，增加插入能力。

ITR E1 ITRE3

E1或 E3 缺失病毒。

5-176

含有 E1或 E3 区两侧的同源序列。

在同源序列之间插入外源基因和选择标记基因。

② 构建质粒载体

5-177

③ 把质粒切成线性

④共转染细胞

在细胞中发生同源重组，把外源 DNA加到病毒基因组中，并包装成重组病毒颗粒。

质粒与病毒DNA （缺失E1或 E3 ）

5-178

4. 重组腺病毒 DNA 在细胞中的生存（ 1 ）以游离的附加体形式存在于细胞中

不能整合到细胞基因组中。基因表达时间短。（ 2） E1 是腺病毒繁殖的必需区

缺失 E1 的重组腺病毒必须在已经被腺病毒（辅助病毒）感染的细胞中繁殖。（ 3） E3 区对腺病毒的繁殖不是必需的

缺失 E3 的重组腺病毒不需要辅助病毒。

5-179

5-180

5-181

①腺病毒粒子相对稳定 ,病毒基因组重排频率低 ,外源基因片段插入片段在病毒复制几个周期后仍可保持不变 , 易于用重组 DNA 技术操作 ; ② 安全性较好 ,腺病毒无需整合进宿主细胞基因组中 , 目的基因在宿主细胞基因组外游离状态下表达 ,整合突变致癌可能性小 ,基因毒性低 ;③腺病毒基因组较大 (36 kb) ,绝大多数基因组 (约 35 kb)均能被外源基因取代 ,插入大片段外源性基因的潜力大 ;④有较大的宿主范围 ,可以感染肝细胞、血管内皮细胞等多种人体细胞 ,对于受体细胞是否处于分裂期要求不严格 ;⑤腺病毒载体容易将外源基因直接转移到靶细胞中 ,并有效表达成活性蛋白。

5. 腺病毒载体的优点

5-182

• 在美国近三分之一的基因治疗临床试验中采用腺病毒载体，其中 5 型腺病毒的使用最为广泛。具有基因治疗的安全性和有效性。• 根据美国国家卫生院的生物技术活动办公室统计，在过去的 20年里，已进行了将近 144例使用腺病毒载体的基因治疗临床试验，近 1/5引入了腺病毒载体。• 2004年 1月 20日 , 我国拥有自主知识产权的重组腺病毒 p53注射液（深圳赛百诺基因技术有限公司）获得国家食品药品监督管理局的生产文号。

6. 腺病毒载体应用于基因治疗

5-183

双链线性 DNA 病毒，基因组大小在 180kb左右，其中有30kb左右为非必需区，可以被约 25kb 的外源 DNA 片段取代而不影响病毒的复制与增殖 .

5-184

• 为最大的一类 DNA 病毒，结构复杂。• 病毒粒呈砖形或椭圆形，大小 (30

0～ 450)×(170～ 260) 纳米，有核心、侧体和包膜，核心含有与蛋白结合的病毒 DNA 。• 病毒粒中有 30 种以上的结构蛋白和几种酶，核心蛋白中含依赖于 DNA的 RNA 多聚酶。

• 病毒在细胞质内增殖，形成包涵体，病毒粒，由细胞裂解而释放。

1. 1. 痘病毒概况痘病毒概况5.4.7 痘苗病毒载体（ Vaccinia virus ）

5-185

• 双链线性 DNA 病毒，• 基因组大小在 180kb左右，其中有 30kb左右为非必需区，可以被约 25kb 的外源 DNA片段取代而不影响病毒的复制与增殖。• 在每个 DNA 分子末端有一个发夹环结构。

2.2. 痘苗病毒的基因组痘苗病毒的基因组

5-186

• 根据脊椎动物和昆虫宿主范围，将痘病毒科分为两个亚科：脊椎动物痘病毒亚科和昆虫痘病毒亚科。• 迄今为止，还未见任何昆虫痘病毒载体的报道。• 脊椎动物痘病毒亚科包括 8 个属 : 禽痘病毒属、羊痘病毒属、野兔痘病毒属、拟软体动物痘病毒属、正痘病毒属、副痘病毒属、猪痘病毒属和亚塔痘病毒属。

3. 3. 痘病毒分类痘病毒分类

5-187

* 容易培养，相当稳定，能在大多数哺乳动物细胞中复制繁殖。 *由于其基因组很大，因此只能通过先将目的基因克隆到转移载体上，然后将充足转移载体与野生性痘苗病毒 DNA 工转染哺乳动物细胞，在细胞内发生同源重组而获得重组痘苗病毒。 * 高效，能同时预防集中病原微生物引起的传染病。

4. 4. 痘病毒载体的特点：痘病毒载体的特点：

5-188

• 痘病毒是研究最早最成功的载体病毒之一(1) 痘病毒分子生物学领域的研究；(2) 体外生产和蛋白质功能化研究；(3) 作为活的疫苗或工具用于疫苗研究。• 1982年 ,研究人员将外源基因插入痘苗病毒的

TK 基因中 , 首次成功地构建了在哺乳动物细胞中表达外源基因的重组痘苗病毒。

5. 5. 痘病毒载体及其应用痘病毒载体及其应用

5-189

5.5 基因打靶载体（ Targeting vector ）

通过 DNA 同源重组，使细胞特定的内源基因被破坏而造成其功能丧失或在基因组特定的位点插入外源基因。

1. 基因打靶（ gene targeting ）

基因敲出（ knock-out ）基因敲入（ knock-in ）

5-190

2. 基因打靶载体的要求

1. 要求能整合到染色体上特定的位置。2. 整合的位置尽量选在基因组内编码非必需产物的地方。3. 必需整合在基因组中可以转录的区域。

定点整合

5-191

1. 两段同源 DNA 序列（ HB1和 HB2 ）2. 目的基因

3. 基因打靶载体组成

3. 编码抗 G418 的基因（ neor ）4. 胸苷激酶基因（ HSV-tk1和 HSV-tk2 ）

与靶位点两端的区域同源

新霉素（ neomycin ）磷酸转移酶基因分别来自 I 型和 II 型单纯疱疹病毒（ HSV ）。载体 tk1 HB1 neor 目的基因 HB2 tk2 载体

5-192

4. 载体的整合方式

染色体 DNA HB1 染色体 DNA HB2 染色体 DNA

载体 tk1 HB1 neor 目的基因 HB2 tk2 载体

染色体 tk1 HB1 neor 目的基因 HB2 tk2 染色体两个 tk 基因至少有一个可能整合到基因组里。细胞被 tk 基因杀死。

1. 非特异整合——非同源重组

5-193

2. 特异位点整合——同源重组载体 tk1 HB1 neor 目的基因 HB2 tk2 载体

HB1 neor 目的基因 HB2

染色体 DNA HB1 染色体 DNA HB2 染色体 DNA

染色体 DNA 染色体 DNA

只有目的基因和 neor 基因整合进去， tk 基因不会整合。细胞在 G418 中存活。

5-194

五、转染细胞的选择正 -负选择法：

1. 正选择（ positive selection ）：用 G418 进行选择。没有整合进 neor 基因的细胞都被杀死。

2. 负选择（ negative selection ）：用 9-鸟嘌呤（ ganciclovir， GCV ）。表达胸苷激酶（ tk ）的细胞都被杀死（ Tk 能把 GCV 转化成有毒的化合物）。

5-195

5-196