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Genética Molecular
Ricardo Fujita, Ph.D.
Centro de Genética y Biología Molecular
Instituto de Investigación
Facultad de Medicina USMP
La Información GenéticaDetermina lo que somos
(características de la especie e individual)
Cigotos => unión de gametos
2 X 102 X 1014 14 células adultocélulas adulto2X102X102323 60 años 60 años
FertilizaciónFertilizaciónInformación Genética
Antecedentes caracterización del material hereditario
• Teoría celular• Teoría cromosómica de la herencia• Composición química del núcleo• Transformación de bacterias• Transducciòn de fagos• Proporcion de bases nitrogenadas• Difracción de rayos X
Composición química del núcleo
• F.Miescher, 1869: nucleos y esperma de salmon: sustancia fosfórica no proteica.
• P.A. Levene, 1920’s– [P] = [D-ribosa] = [4 bases nitrogenadas]– P:D-ribosa:base => nucleotido– Extraccion fibrilar => cadena.
• R. Feulgen, 1920, tinción nuclear específica, cuantitativa= gametos 1/2 de otras células.
Carbonos de la desoxi/oxi ribosa
• 1’ Base nitrogenada1’ Base nitrogenada• 2’ H (ADN) / OH (ARN)2’ H (ADN) / OH (ARN)• 3’ OH-Interaccion con P 3’ OH-Interaccion con P
(5’) de otro nucleótido(5’) de otro nucleótido• 4’4’• 5’ – PPP- interaccion 5’ – PPP- interaccion
con OH (3’) de otro con OH (3’) de otro nucleótidonucleótido
La formación de nucleótidos de DNA
fosfato + desoxirribosa + base nitrogenada = Deoxinucleótido
5’
1’
3’
R. Franklin y M. Wilkins, 1953Estudios de Difraccion de rayos X
- Hélice- bases perpendiculares al eje- 0.34 nanometros (nm)/base-peldaño- 1 vuelta completa ~ 3.4 nm => 10 bases / vuelta- 2 nm (20 Amstrong) de ancho
FOTO 51
• Química del ADN• Distancias (rayos X)• Helice (1, 2, 3?)• Esqueleto ribosa-fosfato• Bases perpendiculares• Chargaff [A]=[T], [C]=[G]
Modelos moleculares(Rompecabezas con fierros y cartulinas) doble cadena
Para tener 2 nm de ancho solo se puede arreglar de una forma: antiparalela
A frente a T (2 enlaces de Hidrógeno)G frente a C (3 enlaces de hidrógeno)
DOBLE CADENA ANTIPARALELA
Las 2 bases complementarias soncoplanares: pares de bases
Los esqueletos azucar-fosfato estanal exterior-”barandas”- (ácido) y las bases al interior-”peldaños”.
Las cadenas complementarias, antiparalelas forman la doble hélice
Cada cromosoma cientos de millones de pares de bases. “Barandas” repeticiones idénticas, secuencia de bases: información genética
El DNA es doble cadena antiparalelaEl DNA es doble cadena antiparalelaSi se conoce una hebra se conoce la otraSi se conoce una hebra se conoce la otra
Toda la información genética se escribe en una secuencia 4 letras de DNA:
• Inicio de replicación
• Estructura del cromosoma: telómero, centrómero
• Gen:– Exones/intrones – Inicio y final de trascripción– Regiones promotoras– Regiones reguladoras
Propiedades fisicoquímicas del DNA
• Doble cadena complementaria antiparalela• A:T 2 enlaces de hidrógeno, G:C 3 (mas
fuerte)• Denaturación: apertura de doble cadena• Renaturación: cierre de doble cadena• Hibridación: una hebra se aparea con otra
complementaria
Denaturación
Agentes químicos (hidróxidos), alta temperatura (> 90°C), baja salinidad
Secuencias ricas en AT (doble enlace) más fáciles de denaturar que las ricas en GC (triple enlace)
Se rompen los enlaces de hidrógeno y se separan las cadenas
5`3’
5’ 3’
Dos cadenas se aparean por reconocimiento de bases y vuelven a formar enlaces de hidrógeno
Renaturación
RENATURACIÓN
Hibridación: renaturación o apareamiento con otras moléculas complementarias de DNA
Hay competencia dependiendo de la cantidad de moléculas
Apareamiento 1 vs. ?
5’ ACCCTAATTTAACAAAC 3’
5’ GGCCACCACGGCCC 3’
5’ GTTTGTTAAATTAGGGT 3’
5’ TGGGATTAAATTGTTTG 3’
1
2
3
3’CAAACAATTTAATCCCA 5’
5’ GTTTGTTAAATTAGGGT 3’
5’ GTTTGTTAAATTACAGC 3’
5’ GTTTGTTACATTAGGGT 3’
Apareamientos perfectos e imperfectos
Diagnóstico genDiagnóstico genéético glaucoma familia Andahuaylastico glaucoma familia Andahuaylas
Guevara-Fujita, Perez-Grosman, Estrada, Pawar, Vargas, Richards & Fujita (2008). Journal of Glaucoma 17:1 67-72
Normal (perfecto)
Afectado (imperfecto)
CSGE-Conformational Sensitive Gel electroforesisdetecta mutaciones apareamiento imperfecto
A
C
Replicación• Principio Universal todas especies • Reproducción individuo, preservación especie • Objetivo: 2 copias exactas para 2 células hijas. De cigoto a
indivíduo (1014) vida (1023). Provisión genética a las siguientes generaciones.
• Fase S ciclo celular Semiconservativa, bidireccional• Maquinaria enzimática compleja y precisa• Alta fidelidad, verificación y reparación: estabilidad genética
individuo y especie• Dirección siempre: 5’ a 3’• Una cadena continua y la otra discontinua• Fallas en replicación: enfermedades degenerativas, cáncer• http://www.ucm.es/info/genetica/grupod/Replicacion/Replicacion.htm
Replicación necesita:
• Deoxinucleótidos trifosfato (dNTPs): dATP, dCTP, dGTP, dTTP
• Origen de replicación (secuencia específica). Reconocimiento 200-300 bp una cadena rica en A yTs.
• DNA polimerasa: siempre sintetiza 5’ -> 3’, necesita 3’OH libre para continuar
• RNA cebador (Primer): pequeño segmento de RNA, donador de extremo 3’OH iniciador para DNA pol
• Complejo con otras proteínas: helicasa, SSB, primasa, topoisomerasa, etc.
Características de la replicación del DNA
Semiconservativa (una hebra antigua con una nueva)
Bidireccional a ambos lados del origen de replicación)
E. Coli 4.5 Mb, 30’
Esquema de las burbujas de replicación en eucariotas
(E. coli) 1 sola horquilla de replicación 30’ Genoma 4.5 millones bp (4.5 Mb)Genoma humano (3, 200 millones de pares de bases), cuanto tiempo? 500 horas (20 días?). Linfocitos en cultivo 20 horas => varios puntos a la vez, 20,000 puntos, 150 kb c/u
A B C D
A BC D
A B C D
Problemas de la DNA polim. en una horquilla de replicación:
?
tira continua, líder
Replicación siempre 3’a 5’DNA pol necesita 3’OH
tira descontinua, retardada
primer RNASSB (RP-A)
topoisomerasas
helicasas
Dirección deldesenrrollamiento
Esquema general de la replicación
(cadena contínua)
(cadena discontínua)
Antibióticos y replicación
• Inhibición topoisomerasas: quinolonas bacterianas, ciprofloxacina, norfloxacina. Irinotecán cáncer.
• Sulfonamidas: inhibe ácido fólico bacteriano: cofactor indispensable para fabricar nucleótidos
• Arabinósidos: reemplaza ribosa (no tiene 3’OH) en nucleótido. Citarabina (antileucémicos), ara A (antiviral). Primasa y DNA Polimerasa afectados
Tipos de mutaciones a nivel molecular
AACGTTGACCC
Sustituciones: AACGTCGACCC
Deleciones: AACGTACCC
Inserciones: AACGTTAAGTGACCC
Repeticiones AACGTTGTTGTTGACCC
TG
Causas de Mutaciones
• Internas (espontáneas): oxidación, metilación,
desaminación, depurinación, depirimidinación.
• Externas (inducidas): radiación: X, , UV,policíclicos
aromáticos (benzopireno, humo, brea, naftalina)
Reparación
• Integridad de la información genética– Funcionamiento normal– Transmisión de los caracteres
• Chequeo:– Replicación: DNA polimerasa
3’endonucleassa– Reparación de daño
• Problemas de reparación: enfermedades degenerativas (envejecimiento celular) y cáncer
Principales tipos de reparación
• BER (Escisión de 1 base)
• MMR (Reparación de mal apareamiento)
• NER (Escisión de nucleótidos)
• HR/NHREJ (Reparación homóloga/no homóloga)
• Emergencia demasiadas mutaciones: Respuesta
SOS (emergencia) procariotes / p53 (paro ciclo
celular – apoptosis)
Sistema de reparación
• Más de 150 genes conocidos• Varios complejos proteicos en sistema de
recombinación (sensores moleculares)• Homología de genes de reparación
conservada en evolución• Pasos: reconocimiento, endonucleasa,
exonucleasa/helicasa, DNA polimerasa, ligasa
Reparación por desigualdad
Si la nueva hebra está equivocada, cómo reconocemos la correcta, (antigua?)
5’ CCATTGATTATT 3’3’ GGTACCTAATAA 5’
Defecto de apareamiento
hebra antigua es metilado, nueva todavía
(BER) Escisión de 1 base
-Depurinación (rotura de enlace glucosídico) espontánea-Desaminación de A y C yremoción por N-glucosidadasa
(NER) Reparación por escición de nucleótidos
- Daño a varias bases(hasta ~ 30)-UV: dímeros de timina,- Daño con distorsión física - Xeroderma pigmentosa Síndrome de Cockayne
Double strand break
Non homologousEnd joining
Secuencia parecida
Secuencia idéntica
Traslocación, inversión
Recombinación homóloga y NO homóloga
Síndromes debidos a fallas en reparación (2)
BRCA: reconocimiento mutaciones doble hebra y supresor de tumor (paro ciclo celular)