plagiat merupakan tindakan tidak terpuji - core.ac.uk · kata kunci: daun kamboja jepang, glikosida...

PROFIL PERTUMBUHAN DAN KANDUNGAN GLIKOSIDA JANTUNG

KALUS DAUN KAMBOJA JEPANG (Adenium obesum (Forssk.) Roem. &

Schult.) DALAM WOODY PLANT MEDIUM DENGAN VARIASI

KONSENTRASI ASAM 2,4-DIKLOROFENOKSIASETAT DAN

6-FURFURYLAMINOPURINE

SKRIPSI

Diajukan untuk Memenuhi Salah Satu Syarat Memperoleh Gelar Sarjana Farmasi (S.Farm.)

Program Studi Ilmu Farmasi

Oleh :

Lukas Eko Widyasmoro

NIM : 028114024

FAKULTAS FARMASI

UNIVERSITAS SANATA DHARMA

YOGYAKARTA

2007

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

PROFIL PERTUMBUHAN DAN KANDUNGAN GLIKOSIDA JANTUNG

KALUS DAUN KAMBOJA JEPANG (Adenium obesum (Forssk.) Roem. &

Schult.) DALAM WOODY PLANT MEDIUM DENGAN VARIASI

KONSENTRASI ASAM 2,4-DIKLOROFENOKSIASETAT DAN

6-FURFURYLAMINOPURINE

SKRIPSI

Diajukan untuk Memenuhi Salah Satu Syarat Memperoleh Gelar Sarjana Farmasi (S.Farm.)

Program Studi Ilmu Farmasi

Oleh :

Lukas Eko Widyasmoro

NIM : 028114024

FAKULTAS FARMASI

UNIVERSITAS SANATA DHARMA

YOGYAKARTA

2007

ii


iii iii


iv iv


HALAMAN PERSEMBAHAN

“O Marie, conçue sans pêche priez pour nous qui avons recours avous”

(“O Mary, conceived without sin, pray for us who have recourse to thee”)

Karyaku ini kupersembahkan ‘tuk:

My Shepherd Jesus & My Mother Mary;

Keluargaku;

My folks;

dan Almamaterku.

v


KATA PENGANTAR

Syukur kepada Tuhan Yang Maha Esa yang telah melimpahkan rahmat

dan karunia-Nya sehingga penulis dapat menyelesaikan skripsi yang berjudul

“Profil Pertumbuhan dan Kandungan Glikosida Jantung Kalus Daun

Kamboja Jepang (Adenium obesum (Forssk.) Roem. & Schult.) dalam Woody

Plant Medium dengan Variasi Konsentrasi Asam 2,4-diklorofenoksiasetat

dan 6-furfurylaminopurine” dengan baik. Deo Gracias.

Penyusunan skripsi ini dimaksudkan untuk memenuhi salah satu syarat

memperoleh gelar Sarjana Farmasi (S.Farm.) di Fakultas Farmasi Universitas

Sanata Dharma Yogyakarta.

Penulis menyadari bahwa penulisan skripsi ini bukanlah hal yang

mudah. Penulis banyak mendapatkan bantuan dan dukungan dari berbagai pihak

sehingga penulis mampu menyelesaikan skripsi ini. Oleh karena itu, penulis ingin

mengucapkan terima kasih kepada:

1. Kedua orang tuaku, atas pengorbanan, doa, kesabaran, dan dukungan yang

telah diberikan.

2. Ibu Rita Suhadi, M.Si., Apt., selaku Dekan Fakultas Farmasi Universitas

Sanata Dharma Yogyakarta.

3. Bapak Ign. Y. Kristio Budiasmoro, M.Si., selaku dosen pembimbing utama

yang telah meluangkan waktu dan tenaga untuk membimbing dan memotivasi

serta memberikan kritik dan saran dalam penyusunan skripsi ini.

vi


4. Ibu Erna Tri Wulandari, M.Si., Apt., selaku dosen penguji yang telah

memberikan kritik dan saran dalam penyusunan skripsi ini.

5. Bapak Yohanes Dwiatmaka, M.Si., selaku dosen penguji yang telah

memberikan kritik dan saran dalam penyusunan skripsi ini.

6. Romo Drs. P. Sunu Hardiyanta, S.Si., S.J., yang telah memberikan doa dan

dukungan kepada penulis selama penyusunan skripsi.

7. Seluruh dosen Fakultas Farmasi yang telah memberikan dukungan kepada

penulis baik selama kuliah maupun selama penyusunan skripsi ini.

8. Laboran Fakultas Farmasi, khususnya laboran Laboratorium Biologi di lantai

3: Mas Sigit, Mas Wagiran, Mas Andri, dan Mas Sarwanto yang telah

membantu penulis selama mengerjakan skripsi di laboratorium.

9. Teman-teman Fakultas Farmasi angkatan 2002 terutama kelas A, terima kasih

atas semua persahabatan dan kenangannya....

10. Teman-teman Fakultas Farmasi angkatan 2002 kelompok praktikum A, terima

kasih atas semua kerjasama dan kekompakannya.

11. Para pendahulu di Laboratorium Kultur Jaringan: Ratna, Mina, Christin, dan

Vero, terima kasih atas semua bantuan dan wejangannya ya.... Untuk Ratna,

terima kasih atas pinjaman skripsi dan bukunya ya.

12. Kompatriotku di Laboratorium Kultur Jaringan: Melissa, Donny, dan Vicky,

terima kasih atas bantuan dan kerjasamanya selama nge-lab. Thank U very

much, folks!

vii


13. Teman-teman 2003: Ratih, Vian, Rosa, Vera, Irwan. Terima kasih atas

perhatian, dukungan, dan semangatnya! Untuk Ratih, terima kasih sudah jadi

sie konsumsiku saat ujian.

14. Sisa-sisa 2002: Theodorus ‘Gopa’, ‘MasDanu’ Kusuma, Benediktus ‘Suprex’,

‘Kobo’ Hendra, ‘Ancol’. Mari kita susul yang lain!

15. Eks-de Britto 2002: Yusuf ‘Kirmanta’, Yuda ‘TG’, ‘Adhit’ Nugraha Arisadha,

‘BenBen’ Sugientoro, ‘Koh Pingping’ Mahardika, Adhistyawan ‘Kobo’. Viva

‘Man for others’!

16. Teman-teman di kos ‘exGriffindor’: Adrianus ‘Nawamiri’, Vincencius

‘Anno’, Heribertus ‘Kumal’, Adhistyawan ‘Kobo’, Theodorus ‘Gopa’. Terima

kasih atas semua kebersamaan, bantuan (tempat, komputer, printer, dan

tenaga), dan dorongan semangatnya. Thanks bro!!

17. Keluarga besar Squadra Viola, terima kasih atas perhatian dan semangatnya.

18. Semua pihak yang tidak dapat penulis sebutkan satu per satu.

Akhirnya, penulis menyadari bahwa tidak ada yang sempurna di dunia

ini. Skripsi ini pun masih belum sempurna karena adanya keterbatasan waktu,

tenaga, dan pikiran. Oleh karena itu, penulis sangat mengharapkan saran dan

kritik agar skripsi ini makin sempurna dan berguna bagi ilmu pengetahuan.

Yogyakarta, 22 Desember 2007

Penulis

viii


ix ix


INTISARI

Tanaman kamboja jepang (Adenium obesum (Forssk.) Roem. & Schult.) selama ini hanya dikenal sebagai tanaman hias, namun berbagai penelitian menunjukkan bahwa tanaman ini mengandung glikosida jantung. Di berbagai negara, kamboja jepang sudah digunakan dalam pengobatan tradisional. Teknik kultur jaringan dapat digunakan untuk mendapatkan glikosida yang optimum dari tanaman. Penelitian ini bertujuan untuk memperoleh informasi mengenai pola pertumbuhan kalus daun kamboja jepang serta membandingkan profil kromatografi lapis tipis (KLT) ekstrak kalus daun kamboja jepang dengan ekstrak daun kamboja jepang dan standar digitoksin.

Penelitian ini merupakan penelitian eksperimental murni dengan menggunakan rancangan acak lengkap pola searah. Daun tanaman kamboja jepang ditanam pada Woody Plant Medium (WPM) dengan variasi konsentrasi zat pengatur tumbuh asam 2,4-diklorofenoksiasetat (2,4-D) dan 6-furfurylaminopurine (FAP). Penelitian dilakukan dengan mengamati waktu inisiasi kalus, pertambahan bobot kalus basah, susut pengeringan, dan membandingkan profil KLT kalus daun kamboja jepang dengan ekstrak daun kamboja jepang dan standar digitoksin.

Hasil penelitian menunjukkan bahwa waktu inisiasi kalus tercepat adalah pada medium WPM 3, yaitu medium WPM dengan konsentrasi 2,4-D sebesar 2 ppm dan FAP sebesar 1 ppm. Pertumbuhan kalus yang optimum juga terjadi pada medium WPM 3. Fase lag terjadi pada hari ke-4 sampai hari ke-20, fase eksponensial terjadi pada hari ke-20 sampai hari ke-28, dan fase stasioner terjadi setelah hari ke-28. Kalus daun kamboja jepang menunjukkan profil KLT yang mirip dengan ekstrak daun kamboja jepang dan standar digitoksin.

Kata kunci: daun kamboja jepang, glikosida jantung, 2,4-D, FAP, WPM

x


ABSTRACT

So far desert rose (Adenium obesum (Forssk.) Roem. & Schult.) is known as an ornamental plant, but many research shows that this plant contains cardiac glycoside. In many countries, desert rose has been used in traditional medications. Tissue culture technique can be used to obtain optimum glycoside from the plant. This research is intended to find out the information about the growth profile of the callus of desert rose’s leaf and to compare the thin layer chromatography (TLC) profile of the extract of callus of desert rose’s leaf with the extract of desert rose’s leaf and digitoxin standard.

This research is a pure experimental research which uses a complete device of one-way pattern. Desert rose’s leaf was planted in a Woody Plant Medium (WPM) with the variations of plant growth substance 2,4-dichlorophenoxyacetic acid (2,4-D) and 6-furfurylaminopurine (FAP). This research was carried out by observing the callus initiation time, the callus’ wet weight increase, the callus’ dry weight decrease, and comparing the TLC profile of extract of callus of desert rose’s leaf with the extract of desert rose’s leaf and digitoxin standard.

The results of this research show that the fastest callus initiation time was in WPM 3 medium, which contain 2 ppm 2,4-D and 1 ppm FAP. The optimum callus growth also occurs in WPM 3 medium. Lag phase occurs from day 4 until day 20, exponential phase occurs from day 20 until day 28, and stationary phase occurs after day 28. The callus of kamboja jepang’s leaf has the similar TLC profile as the extract of desert rose’s leaf and digitoxin standard.

Key words: desert rose’s leaf, cardiac glycoside, 2,4-D, FAP, WPM

xi


DAFTAR ISI

Halaman

HALAMAN JUDUL ..............................................................................

HALAMAN PERSETUJUAN PEMBIMBING ..................................

HALAMAN PENGESAHAN ................................................................

HALAMAN PERSEMBAHAN ............................................................

KATA PENGANTAR ............................................................................

PERNYATAAN KEASLIAN KARYA ................................................

INTISARI ...............................................................................................

ABSTRACT .............................................................................................

DAFTAR ISI ...........................................................................................

DAFTAR TABEL ..................................................................................

DAFTAR GAMBAR ..............................................................................

DAFTAR LAMPIRAN ..........................................................................

BAB I. PENGANTAR ............................................................................

A. Latar Belakang ...................................................................................

1. Rumusan permasalahan ................................................................

2. Keaslian penelitian .......................................................................

3. Manfaat penelitian ........................................................................

B. Tujuan Penelitian ...............................................................................

BAB II. PENELAAHAN PUSTAKA ...................................................

A. Uraian Tanaman Kamboja Jepang .....................................................

1. Nama daerah ................................................................................

ii

iii

iv

v

vi

ix

x

xi

xii

xvi

xvii

xix

1

1

3

4

4

5

6

6

6

xii


2. Nama ilmiah .................................................................................

3. Morfologi .....................................................................................

4. Khasiat .........................................................................................

5. Kandungan Kimia ........................................................................

B. Kultur Jaringan Tanaman ...................................................................

1. Pengertian .....................................................................................

2. Media kultur .................................................................................

3. Eksplan .........................................................................................

4. Kalus ............................................................................................

5. Sterilisasi ......................................................................................

6. Penanaman eksplan ......................................................................

7. Subkultur ......................................................................................

8. Pertumbuhan kalus .......................................................................

C. Glikosida Jantung ...............................................................................

D. Kromatografi Lapis Tipis ...................................................................

E. Landasan Teori ...................................................................................

F. Hipotesis .............................................................................................

BAB III. METODOLOGI PENELITIAN ...........................................

A. Jenis dan Rancangan Penelitian .........................................................

B. Variabel Penelitian dan Definisi Operasional ....................................

1. Variabel utama .............................................................................

2. Variabel pengacau terkendali .......................................................

3. Variabel pengacau tidak terkendali ..............................................

6

6

7

7

8

8

9

20

22

24

27

27

28

29

31

33

35

36

36

36

36

36

36

xiii


4. Definisi operasional .....................................................................

C. Alat dan Bahan Penelitian ..................................................................

1. Alat penelitian ..............................................................................

2. Bahan penelitian ...........................................................................

D. Tata Cara Penelitian ...........................................................................

1. Determinasi tanaman ....................................................................

2. Pembuatan stok ............................................................................

3. Pembuatan media .........................................................................

4. Sterilisasi alat dan ruangan ..........................................................

5. Sterilisasi dan penanaman eksplan ...............................................

6. Pengamatan waktu inisiasi kalus ..................................................

7. Subkultur ......................................................................................

8. Pemanenan ...................................................................................

9. Analisis pertumbuhan kalus .........................................................

10. Pengeringan dan pembuatan serbuk daun kamboja jepang ..........

11. Uji tabung .....................................................................................

12. Pembuatan ekstrak kalus daun kamboja jepang ...........................

13. Pembuatan ekstrak kalus daun kamboja jepang yang dihidrolisis

14. Pembuatan ekstrak daun kamboja jepang ....................................

15. Pembuatan standar digitoksin ......................................................

16. Uji KLT ekstrak kalus, ekstrak daun kamboja jepang dan

larutan standar digitoksin .............................................................

E. Analisis Hasil .....................................................................................

37

38

38

40

42

42

42

44

45

45

46

46

47

48

48

48

49

50

50

50

50

51

xiv


1. Analisis menggunakan grafik pertumbuhan kalus berdasarkan

data penimbangan bobot kalus basah dengan umur kalus ...........

2. Analisis menggunakan grafik pertumbuhan kalus berdasarkan

data biomassanya .........................................................................

BAB IV. HASIL DAN PEMBAHASAN ..............................................

A. Determinasi Tanaman Kamboja Jepang .............................................

B. Pemilihan dan Penanaman Eksplan ...................................................

C. Waktu Inisiasi Kalus ..........................................................................

D. Subkultur dan Panen ..........................................................................

E. Profil Pertumbuhan Kalus ..................................................................

F. Susut Pengeringan Kalus ...................................................................

G. Analisis Kandungan Kimia Kalus ......................................................

BAB V. KESIMPULAN DAN SARAN ................................................

A. Kesimpulan ........................................................................................

B. Saran ...................................................................................................

DAFTAR PUSTAKA .............................................................................

LAMPIRAN ............................................................................................

BIOGRAFI PENULIS ...........................................................................

51

51

53

53

53

56

58

60

63

65

73

73

73

74

78

92

xv


DAFTAR TABEL

Halaman

Tabel I

Tabel II

Tabel III

Tabel IV

Tabel V

Tabel VI

Tabel VII

Tabel VIII

Waktu inisiasi kalus pada WPM 2 .......................................

Waktu inisiasi kalus pada WPM 3 .......................................

Hasil pengamatan KLT dengan fase diam silika gel GF254

dan fase gerak etil asetat-metanol-air (81 : 11 : 8 v/v ) ..........

Hasil pengamatan KLT ekstrak kalus WPM 2 dan WPM 3

Hasil penimbangan bobot kalus dengan pemanenan pada

WPM 2 .................................................................................

Penentuan susut pengeringan pada WPM 2 .........................

Hasil penimbangan bobot kalus dengan pemanenan pada

WPM 3 .................................................................................

Penentuan susut pengeringan pada WPM 3 .........................

56

57

66

70

87

88

89

90

xvi


DAFTAR GAMBAR

Halaman

Gambar 1

Gambar 2

Gambar 3

Gambar 4

Gambar 5

Gambar 6

Gambar 7

Gambar 8

Gambar 9

Gambar 10

Gambar 11

Gambar 12

Gambar 13

Gambar 14

Struktur dasar bufadienolida dan kardenolida ....................

Eksplan dalam bentuk irisan melintang daun .....................

Inisiasi kalus .......................................................................

Kalus daun kamboja jepang hasil subkultur .......................

Pola Pertumbuhan Kalus pada WPM 2 ..............................

Pola Pertumbuhan Kalus pada WPM 3 ..............................

Perbandingan Pola Pertumbuhan Kalus Kedua Media .......

Perbandingan susut pengeringan kalus pada kedua media .

Kromatogram glikosida jantung kalus daun kamboja

jepang, ekstrak daun kamboja jepang tanaman asal dan

standar digitoksin setelah disemprot dengan pereaksi

Kedde ..................................................................................

Kromatogram glikosida jantung kalus daun kamboja

jepang, ekstrak daun kamboja jepang tanaman asal dan

standar digitoksin setelah disemprot dengan pereaksi

SbCl3 ...................................................................................

Kromatogram ekstrak kalus daun kamboja jepang WPM 2

Kromatogram ekstrak kalus daun kamboja jepang WPM 3

Foto tanaman kamboja jepang (Adenium obesum (Forssk.)

Roem. & Schult.) ................................................................

Foto kalus daun kamboja jepang siap panen ......................

30

55

58

60

61

62

63

64

67

68

70

71

79

79

xvii


Gambar 15

Gambar 16

Gambar 17

Gambar 18

Gambar 19

Gambar 20

Gambar 21

Foto KLT dengan fase diam silika gel GF254, fase gerak

etil asetat-metanol-air (81 : 11 : 8 v/v), pada pengamatan

dengan sinar tampak ...........................................................



dengan sinar UV 254 nm ....................................................



dengan sinar UV 365 nm ....................................................


etil asetat-metanol-air (81 : 11 : 8 v/v), deteksi penampak

bercak penyemprot pereaksi Kedde ....................................


etil asetat-metanol-air (81 : 11 : 8 v/v); deteksi penampak

bercak penyemprot antimon-triklorida (SbCl3), 100˚C

selama 6 menit ....................................................................

Foto KLT WPM 2 dengan fase diam silika gel GF254,

fase gerak etil asetat-metanol-air (81 : 11 : 8 v/v), pada

pengamatan dengan sinar UV 254 nm ................................

Foto KLT WPM 3 dengan fase diam silika gel GF254, fase

gerak etil asetat-metanol-air (81 : 11 : 8 v/v), pada

pengamatan dengan sinar UV 254 nm ................................

80

81

82

83

84

85

86

xviii


DAFTAR LAMPIRAN

Halaman

Lampiran 1

Lampiran 2

Lampiran 3

Lampiran 4

Surat Keterangan Determinasi ...........................................

Foto-foto Hasil Penelitian ..................................................

Data-data Penelitian ...........................................................

Komposisi Woody Plant Medium .......................................

78

79

87

91

xix


BAB I

PENGANTAR

A. Latar Belakang

Kamboja jepang (Adenium obesum (Forssk.) Roem. & Schult.)

merupakan jenis tanaman sukulen atau tanaman yang mengandung banyak air

dengan ciri utama adalah batang tanaman digunakan untuk menyimpan air.

Adenium obesum, termasuk suku Apocynaceae, juga dikenal sebagai mawar gurun

(desert rose) (Beikram dan Andoko, 2003; Ranger, 1996). Selama ini kamboja

jepang digunakan sebagai tanaman hias dan secara tradisional digunakan untuk

membantu proses kelahiran. Penduduk asli Afrika bagian timur menggunakan

tanaman ini sebagai racun ikan dan anak panah (Ranger, 1996) serta digunakan

untuk pengobatan gonorrhoea (Nakamura et al, 2000).

Dalam penelitiannya, Nakamura et al (2000) telah berhasil mengisolasi

dan mengidentifikasi 4 senyawa dari daun Adenium yang diduga berperan dalam

aktivitas sitotoksisnya. Atawodi (2005) dan Freiburghaus et al (1996) telah

meneliti ekstrak akar dan kulit batang kamboja jepang yang ternyata berpotensi

sebagai agen terapeutik untuk pengobatan trypanosomiasis. Penelitian yang

dilakukan oleh Yamauchi dan Abe (1990) menunjukkan bahwa Adenium obesum

mengandung oleandrigenin beta-gentiobiosyl-beta-D-thevetoside sebagai

glikosida yang utama. Selain itu, kamboja jepang juga memiliki kandungan

senyawa glikosida yang mirip digitalis/digitoksin (Melero et al, 2000). Di Afrika

dan Asia banyak ditemukan terjadinya kasus cardiac toxicity yang disebabkan

1


2

oleh kandungan racun panah yang mengandung latex dari tumbuhan

Apocynaceae, yang dikombinasikan dengan iritator untuk memfasilitasi difusi

racun ke dalam jaringan (Brunetton, 1999).

Produk-produk metabolit sekunder kebanyakan diperoleh secara

komersial dengan cara diisolasi dari tanaman, dan ini menimbulkan permasalahan

dengan terbatasnya sumber-sumber bahan baku untuk diisolasi. Oleh karena itu

diperlukan alternatif dalam usaha penyediaan metabolit sekunder tanaman. Salah

satu alternatif tersebut adalah melalui teknik kultur jaringan tanaman. Metode

kultur jaringan dapat dipakai untuk produksi metabolit sekunder yang selanjutnya

dapat disintesis menjadi senyawa murni dalam bidang industri obat (Suryowinoto,

1992).

Penelitian ini merupakan rangkaian dari penelitian yang dilakukan oleh

Wijaya (2007) dan Chandra (2007). Wijaya (2007) telah berhasil menumbuhkan

kalus yang berasal dari daun kamboja jepang dalam medium tumbuh Murashige-

Skoog (MS) dengan penambahan zat pengatur tumbuh (ZPT) 2,4-D sebanyak 4

ppm. Pada penelitian tersebut diperoleh 2 senyawa pada ekstrak kalus daun

kamboja jepang yang mirip dengan senyawa yang terkandung di dalam ekstrak

daun kamboja jepang dan ekstrak daun Nerium olender L. yang diduga sebagai

glikosida jantung. Chandra (2007) juga berhasil menumbuhkan kalus yang berasal

dari daun kamboja jepang meskipun dengan medium tumbuh yang berbeda, yaitu

medium Gamborg, dan dengan penambahan 2 variasi konsentrasi 2,4-D dan FAP.

Pada penelitian tersebut diperoleh 1 senyawa pada ekstrak kalus daun kamboja

jepang yang mirip dengan senyawa yang terkandung di dalam ekstrak daun


3

kamboja jepang dan standar digitoksin yang diduga sebagai glikosida jantung.

Oleh karena itu, penelitian ini diharapkan dapat menumbuhkan kalus yang berasal

dari daun kamboja jepang dan dari kalus yang dihasilkan diperoleh senyawa

glikosida jantung seperti pada tanaman asalnya. Media tumbuh yang digunakan

dalam penelitian ini adalah Woody Plant Medium (WPM) karena menurut

Hendaryono dan Wijayani (1994) media WPM cocok sebagai media kultur untuk

membudidayakan tanaman berkayu. Penelitian ini menggunakan 2 variasi

konsentrasi 2,4-D dan FAP untuk membandingkan pertumbuhan kultur kalus dan

susut pengeringan kalus yang dihasilkan.

Penelitian ini bertujuan untuk mengkulturkan tanaman kamboja jepang

dari bagian daun serta mengidentifikasi metabolit sekunder glikosida jantung yang

dihasilkan oleh kalus yang dibentuk dari hasil budidaya in vitro.

1. Rumusan Permasalahan

Berdasarkan latar belakang yang telah disebutkan di atas, dapat

dirumuskan permasalahan sebagai berikut :

a. Apakah eksplan yang berasal dari daun kamboja jepang dapat

menghasilkan kalus jika dikembangkan secara in vitro dalam media

tumbuh Woody Plant Medium (WPM)?

b. Bagaimana profil pertumbuhan kalus daun kamboja jepang yang

dikulturkan?

c. Apakah kalus daun kamboja jepang hasil budidaya in vitro dapat

menghasilkan glikosida jantung seperti tanaman asalnya?


4

2. Keaslian Penelitian

Sejauh penelusuran pustaka yang dilakukan penulis, penelitian tentang

profil pertumbuhan dan kandungan glikosida jantung kalus daun kamboja jepang

(Adenium obesum (Forssk.) Roem. & Schult.) dalam Woody Plant Medium

dengan variasi konsentrasi asam 2,4-diklorofenoksiasetat dan 6-

furfurylaminopurine belum pernah diteliti.

Penelitian ilmiah menggunakan tanaman kamboja jepang yang pernah

dilakukan antara lain :

a. Wijaya (2007) telah melakukan penelitian tentang profil pertumbuhan dan

kandungan glikosida jantung dari kalus daun kamboja jepang (Adenium

obesum (Forssk.) Roem. & Schult.) dalam media tumbuh Murashige-Skoog.

b. Chandra (2007) telah melakukan penelitian tentang profil pertumbuhan dan

analisis kualitatif glikosida jantung kalus daun kamboja jepang (Adenium

obesum (Forssk.) Roem. & Schult.) dalam media tumbuh Gamborg dengan

variasi konsentrasi asam 2,4-diklorofenoksiasetat dan 6-furfurylaminopurine.

3. Manfaat Penelitian

a. Manfaat teoritis

Penelitian ini diharapkan dapat bermanfaat dalam mengembangkan ilmu

kefarmasian terutama dalam hal teknik penghasilan glikosida jantung dari

tanaman, khususnya tanaman kamboja jepang, secara in vitro menggunakan

medium tumbuh WPM.


5

b. Manfaat praktis

Penelitian ini sebagai penelitian awal tentang produksi glikosida jantung

dari tanaman dengan teknik kultur jaringan sehingga mempunyai kemungkinan

untuk digunakan sebagai alternatif penyediaan obat jantung.

B. Tujuan Penelitian

Tujuan penelitian ini adalah :

a. Menumbuhkan kalus dari eksplan daun kamboja jepang.

b. Mengetahui profil pertumbuhan kalus daun kamboja jepang.

c. Membuktikan bahwa ekstrak kalus daun kamboja jepang hasil budidaya in

vitro dapat menghasilkan glikosida jantung seperti tanaman asalnya.


BAB II

PENELAAHAN PUSTAKA

A. Uraian Tanaman Kamboja Jepang

1. Nama Daerah/Nama Lain

Kamboja jepang, semboja jepang, desert rose, Mock azalea, Pink

Begonia, Sabi Star, Kudu (Anonim, 2006a).

2. Nama Ilmiah

Tanaman kamboja jepang (Adenium obesum (Forssk.) Roem. &

Schult.) termasuk famili Apocynaceae. Sinonim tanaman kamboja jepang ini

adalah Plumeria rubra L.cv. acutifolia (Anonim, 2006b).

3. Morfologi

Kamboja jepang (Adenium obesum (Forssk.) Roem. & Schult.)

merupakan jenis tanaman sukulen atau tanaman yang mengandung banyak air

dengan ciri utama adalah batang tanaman digunakan untuk menyimpan air.

Adenium merupakan tumbuhan asli Afrika dan biasanya ditemukan di gurun

pasir Afrika dan Jazirah Arab, namun juga ditemukan di kawasan Asia

(Ranger, 1996).

Secara morfologis tanaman kamboja jepang (Adenium obesum (Forssk.)

Roem. & Schult. ) memiliki akar yang mampu membesar seperti umbi dan

diselimuti oleh rambut-rambut akar yang sangat banyak; daunnya berbentuk

lanset dengan ujung membulat, tebal dan berserat, berwarna hijau, tampak

mengkilap dan licin; bunganya berwarna merah muda sampai merah tua,

memiliki 5 helai mahkota bunga yang bagian tengahnya berwarna putih;

6


7

buahnya tumbuh secara berpasangan, terletak di ujung tunas, berbentuk pipih

panjang, berwarna hijau waktu masih muda dan kemudian berangsur-angsur

berubah menjadi cokelat; bijinya berada dalam buah, berwarna cokelat.

Tanaman ini dapat tumbuh hingga dua meter (Soenanto, 2005).

4. Khasiat

Selama ini kamboja jepang digunakan sebagai tanaman hias dan secara

tradisional digunakan untuk membantu proses kelahiran. Penduduk asli Afrika

bagian timur menggunakan tanaman ini sebagai racun ikan dan anak panah

(Ranger, 1996) serta digunakan untuk pengobatan gonorrhoea (Nakamura et

al, 2000). Ekstrak kulit batang Adenium obesum berpotensi sebagai acaricidal

(Mgbojikwe dan Okoye, 2001). Ekstrak dari tanaman ini juga menunjukkan

sifat sitotoksis (Nakamura et al, 2000). Atawodi (2005) dan Freiburghaus et al

(1996) telah meneliti ekstrak akar dan kulit batang kamboja jepang yang

ternyata berpotensi sebagai agen terapeutik untuk pengobatan

trypanosomiasis.

5. Kandungan Kimia

Tanaman kamboja jepang mengandung glikosida jantung dengan

kandungan utama berupa oleandrigenin, beta-gentiobiosyl-beta-D-thevetoside,

neridienone A dan 16,17-dihydroneridienone A (Yamauchi dan Abe, 1990).

Kamboja jepang juga memiliki kandungan senyawa glikosida yang mirip

digitalis (Melero et al, 2000), ekugin, kardenolida, honghelosida A, 16-

asetilstrospesida, asam dihidroifflaionik, flavonol, 3-O-metil kaemferol,

flavonol 3,3’-bis(O-metil)quercetin, dan honghelin (Anonim, 2006b).


8

B. Kultur Jaringan Tanaman

1. Pengertian

Kultur jaringan adalah teknik budidaya tanaman dengan menggunakan

potongan kecil sel, jaringan atau organ yang dipelihara dalam satu medium

dan dalam kondisi aseptik atau bebas mikroorganisme (Katuuk, 1989; Santoso

dan Nursandi, 2002). Usaha pengembangan tanaman dengan teknik kultur

jaringan merupakan usaha perbanyakan tanaman secara vegetatif. Di bidang

farmasi, teknik kultur jaringan sangat menguntungkan karena dapat

menghasilkan metabolit sekunder untuk keperluan obat-obatan dalam jumlah

yang besar dan dalam waktu yang singkat (Hendaryono dan Wijayani, 1994).

Ide memperbanyak tanaman dengan cara mengulturkan bagian kecil

jaringan atau organ ini berdasarkan teori sel yang dikemukakan oleh Schleiden

dan Schwann, yaitu bahwa sel merupakan satuan struktur, fungsional, dan

hereditas terkecil dari makhluk hidup sehingga dapat tumbuh dan berkembang

menjadi suatu individu yang normal. Sel juga mempunyai kemampuan

totipotensi, yaitu kemampuan setiap sel, dari mana saja sel tersebut diambil,

yang apabila ditumbuhkan pada lingkungan yang sesuai akan tumbuh dan

berkembang menjadi tanaman lengkap yang baru (Hendaryono dan Wijayani,

1994; Santoso dan Nursandi, 2002).

Ada beberapa keuntungan dari teknik kultur jaringan, antara lain:

a. Kandungan–kandungan zat yang berguna dapat diproduksi di bawah kondisi

yang terkontrol, terbebas dari perubahan iklim dan keadaan tanah.

b. Hasil kultur akan terbebas dari mikroba dan serangga.


9

c. Sel-sel kebanyakan tumbuhan mudah untuk berkembangbiak dalam

menghasilkan metabolit-metabolit yang spesifik.

d. Kontrol automatis dari pertumbuhan sel dan proses pengaturan metabolit yang

rasional dalam bioreaktor akan mengurangi biaya tenaga kerja dan

meningkatkan produktivitas.

e. Substansi organik dapat diekstrak dari kultur kalus. (Dicosmo dan Misawa,

1995)

Teknik kultur jaringan dapat berhasil dengan baik apabila syarat-syarat

yang diperlukan terpenuhi, yaitu meliputi pemilihan eksplan sebagai bahan

dasar untuk pembentukan kalus, penggunaan medium yang cocok, keadaan

yang aseptik, dan pengaturan udara yang baik terutama untuk kultur cair.

Kultur kalus adalah teknik budidaya kalus tanaman dalam suatu

lingkungan terkendali dan dalam keadaan aseptik atau bebas mikroorganisme.

Kultur kalus ini bertujuan untuk memperoleh kalus dari eksplan yang diisolasi

dan ditumbuhkan dalam lingkungan terkendali (Santoso dan Nursandi, 2002).

2. Media kultur

Media kultur merupakan salah satu faktor penentu keberhasilan

perbanyakan tanaman secara kultur jaringan. Berbagai komposisi media kultur

telah diformulasikan untuk mengoptimalkan pertumbuhan dan perkembangan

tanaman yang dikulturkan. Murashige dan Skoog memublikasikan formulasi

media MS (singkatan dari Murashige dan Skoog) yang sampai sekarang

terbukti cocok untuk kultur jaringan banyak tanaman dan banyak digunakan di

laboratorium kultur jaringan di seluruh dunia (Yusnita, 2003).


10

Media kultur dapat berbentuk cair atau padat. Media cair merupakan

campuran komponen-komponen zat kimia dengan air suling (Hendaryono dan

Wijayani, 1994), sedangkan media berbentuk padat merupakan media cair

dengan penambahan pemadat media seperti agar-agar (Yusnita, 2003).

Jaringan yang dikulturkan memerlukan unsur hara makro dan unsur

hara mikro dari dalam media tumbuh. Media kultur juga harus mengandung

bahan-bahan lain yang berguna untuk merangsang pertumbuhan serta

perkembangan sel jaringan yang dikulturkan. Pemisahan eksplan dari tanaman

induk menyebabkan perubahan biosintesis di dalam eksplan tersebut, sehingga

perlu diberikan unsur hara ke dalam media kultur untuk membantu eksplan

supaya dapat tumbuh dan berkembang. Bahan-bahan itu adalah bahan-bahan

organik yang meliputi karbohidrat, vitamin, asam amino, serta zat pengatur

pertumbuhan (Katuuk, 1989).

a. Air

Air memegang peranan yang sangat penting dalam proses pengulturan

karena 95% dari media kultur terdiri dari air. Air yang digunakan adalah air

distilata (akuades) atau air distilata ganda (akuabides). Air ledeng atau air

sumur sebaiknya tidak digunakan karena mengandung sejumlah kontaminan

(substansi atau mikroorganisme) yang dapat merusak proses perkembangan

kultur eksplan. Air suling disimpan dalam kondisi steril dengan tidak memberi

peluang pada bakteri untuk hidup dan berkembang (Katuuk, 1989; Yusnita,

2003).


11

b. Garam-garam anorganik

Kebutuhan nutrisi mineral untuk tanaman yang dikulturkan secara in

vitro pada dasarnya sama dengan kebutuhan nutrisi tanaman yang

ditumbuhkan di tanah. Kebutuhan nutrisi yang berupa unsur makro dan mikro

diberikan melalui akar, yaitu dengan menambahkan unsur-unsur tersebut pada

medium agar. Unsur makro adalah unsur yang dibutuhkan tanaman dalam

jumlah banyak, sedangkan unsur mikro dibutuhkan tanaman dalam jumlah

sedikit. Fungsi dari unsur-unsur mikro belum diketahui secara pasti, namun

ketidakhadiran unsur mikro dapat menyebabkan kelainan pertumbuhan

(Katuuk, 1989).

Unsur-unsur yang termasuk unsur makro antara lain:

1) Nitrogen (N)

Kegunaan nitrogen pada tanaman adalah untuk meningkatkan daya

tumbuh tanaman karena unsur N dapat membentuk protein, lemak,

klorofil, alkaloid, hormon tanaman, dan asam amino. Kekurangan N akan

menyebabkan daun berwarna kuning dan pertumbuhan terganggu.

Sebaliknya, terlalu banyak N akan mengakibatkan perkembangan vegetatif

lebih besar daripada perkembangan buah (Katuuk, 1989; Hendaryono dan

Wijayani, 1994).

2) Fosfor (P)

Fosfor dibutuhkan tanaman untuk pembentukan karbohidrat dengan

cara mengikat fosfat. Terlalu banyak fosfor dalam media akan

menghambat pertumbuhan eksplan karena adanya persaingan penyerapan


12

unsur lainnya seperti seng, besi, dan tembaga (Katuuk, 1989; Hendaryono

dan Wijayani, 1994; Santoso dan Nursandi, 2002).

3) Kalium (K)

Kalium berfungsi memperkuat tubuh tanaman karena kalium dapat

menguatkan serabut-serabut akar sehingga daun, bunga, dan buah tidak

mudah gugur. Di samping itu, kalium juga berfungsi dalam pembelahan

sel, memperlancar metabolisme, dan mempengaruhi penyerapan makanan

(Hendaryono dan Wijayani, 1994).

4) Kalsium (Ca)

Kalsium terdapat dalam batang dan daun tanaman. Kalsium bertugas

dalam merangsang pembentukan bulu-bulu akar, mengeraskan batang, dan

merangsang pembentukan biji karena kalsium bersama-sama dengan

magnesium akan memproduksi cadangan makanan (Hendaryono dan

Wijayani, 1994).

5) Magnesium (Mg)

Magnesium merupakan elemen utama dalam molekul klorofil.

Penambahan magnesium dalam tanaman akan meningkatkan kandungan

fosfat dalam tanaman. Fosfat digunakan sebagai bahan mentah dalam

pembentukan sejumlah protein yang akan menyempurnakan pertumbuhan

daun dan membentuk karbohidrat, lemak, serta minyak-minyak



13

6) Sulfur (S)

Sulfur merupakan unsur yang penting untuk pembentukan beberapa

jenis protein, seperti asam amino dan vitamin B1. Sulfur juga berperan

dalam pembentukan bintil-bintil akar dan membantu pembentukan anakan

sehingga pertumbuhan dan ketahanan tanaman terjamin (Hendaryono dan

Wijayani, 1994).

Unsur-unsur yang termasuk unsur mikro antara lain:

1) Besi (Fe)

Besi dibutuhkan lebih banyak daripada unsur mikro lainnya. Dalam

media kultur, besi diberikan dalam bentuk FeSO4 dan dicampurkan

terlebih dahulu dengan garam ethylene diamine tetraasetic acid (EDTA).

Besi tidak boleh dicampurkan langsung ke dalam media karena besi

bersifat tidak larut dalam air sehingga dapat menimbulkan endapan yang

menyebabkan besi tidak dapat digunakan oleh jaringan atau kultur. Cara

untuk mengatasi hal ini adalah dengan menambahkan chelating agent yang

akan membungkus ion Fe sehingga dapat bercampur rata dengan larutan

(Katuuk, 1989; Hendaryono dan Wijayani, 1994).

Pemberian besi dalam media kultur jaringan adalah sebagai

penyangga kestabilan pH media selama digunakan untuk menumbuhkan

jaringan tanaman. Pada tanaman, besi berfungsi dalam pernafasan dan

pembentukan hijau daun (Hendaryono dan Wijayani, 1994).


14

2) Tembaga (Cu)

Tembaga berperan sebagai bagian dari enzim, ikut ambil bagian

dalam proses fotosintesis dan pembentukan klorofil, ikut pula dalam

aktivitas reduksi nitrit (Santoso dan Nursandi, 2002).

3) Mangan (Mn)

Mangan berperan sebagai aktivator enzim dengan bertindak sebagai

perantara, pembentuk klorofil, dan aktif dalam fotosintesis, metabolisme

protein serta pembentukan vitamin C (Santoso dan Nursandi, 2002).

4) Seng (Zn)

Seng adalah unsur yang berperan penting dalam pembentukan

protoplas. Tanaman yang cukup seng mampu memproduksi auksin IAA

(indole asetic acid) endogenus, sehingga tidak memerlukan penambahan

auksin sintetik dalam media (Katuuk, 1989).

5) Boron (B)

Boron berperan dalam metabolisme karbohidrat. Kekurangan boron

pada tanaman tertentu akan mengakibatkan kerusakan jaringan, sebaliknya

terlalu banyak boron akan mengakibatkan tanaman mati. Media kultur

yang kekurangan boron akan menyebabkan sintesis sitokinin dalam media

terganggu (Katuuk, 1989; Santoso dan Nursandi, 2002).

6) Molibdenum (Mo)

Molibdenum berguna dalam proses pengikatan nitrogen dari

atmosfer menjadi nitrat dengan bantuan bakteri pengikat nitrogen. Selain

itu, molibdenum berperan dalam pembentukan klorofil. Bila molibdenum


15

diberikan berlebihan dapat menyebabkan kerusakan jaringan tanaman

(Katuuk, 1989).

7) Kobalt (Co)

Kobalt berguna untuk mengikat nitrogen. Dalam kultur jaringan,

kobalt digunakan untuk pembentukan asam inti (Katuuk, 1989).

8) Iodium (I)

Iodium ditambahkan dalam media sebagai KI. Unsur iodium tidak

terlalu diperlukan dalam media namun sering juga digunakan. Beberapa

asam amino juga mengandung iodium (Katuuk, 1989).

Unsur-unsur makro dan mikro diberikan dalam bentuk garamnya

supaya lebih mudah larut dalam air (Yusnita, 2003). Unsur-unsur makro

biasanya diberikan dalam bentuk NH4NO3, KNO3, CaCl2.2H20, MgSO4.7H2O

dan KH2PO4. Sedangkan unsur-unsur mikro biasa diberikan dalam bentuk

MnSO4.4H2O, ZnSO4.4H2O, H3BO3, KI, NaMo4.2H2O, CuSO4.5H2O dan

CoCl2.6H2O (Hendaryono dan Wijayani, 1994).

Media tumbuh pada kultur jaringan sangat besar pengaruhnya terhadap

pertumbuhan dan perkembangan eksplan serta bibit yang dihasilkannya.

Macam-macam media kultur jaringan telah ditemukan sehingga jumlahnya

cukup banyak. Media tumbuh untuk eksplan berisi kualitatif komponen bahan

media yang hampir sama, hanya agak berbeda dalam besarnya kadar untuk

tiap-tiap senyawa. Medium yang biasa digunakan untuk budidaya tanaman

berkayu adalah medium standar WPM (Woody Plant Medium). Kesulitan yang

sering timbul dalam kultur jaringan tanaman berkayu adalah keluarnya


16

‘phenolic compound’ sehingga kalus atau eksplan menjadi berwarna coklat

yang akhirnya tidak tumbuh. Hal ini disebut ‘browning’ (Hendaryono dan

Wijayani, 1994).

c. Vitamin dan Myo-inositol

Vitamin merupakan komponen media yang berpengaruh terhadap

pertumbuhan kalus. Vitamin yang sering digunakan dari kelompok vitamin B,

yaitu tiamin-HCl (vitamin B1), piridoksin-HCl (vitamin B6), asam nikotinat,

dan riboflavin (vitamin B2). Tiamin adalah vitamin yang terpenting untuk

hampir semua kultur jaringan tanaman. Tiamin berfungsi untuk mempercepat

pembelahan sel pada meristem akar, juga berperan sebagai koenzim dalam

reaksi yang menghasilkan energi dari karbohidrat dan memindahkan energi.

Fungsi dari vitamin B6 adalah sebagai ko-enzim yang membantu reaksi kimia

dalam proses metabolisme (Katuuk, 1989). Asam nikotinat juga penting dalam

reaksi-reaksi enzimatik, di samping berperan sebagai prekursor dari beberapa

alkaloid. Vitamin C, seperti asam sitrat dan asam askorbat, kadang-kadang

digunakan sebagai antioksidan untuk mencegah atau mengurangi pencoklatan

atau penghitaman pada permukaan irisan jaringan eksplan (Hendaryono dan

Wijayani, 1994; Yusnita, 2003). Vitamin E berperan untuk memperkuat

pembentukan sel-sel kalus pada tanaman tertentu (Katuuk, 1989).

Myo-inositol merupakan heksitol dan sering digunakan sebagai salah

satu komponen media yang penting karena terbukti merangsang pertumbuhan

jaringan yang dikulturkan dan membantu proses diferensiasi. Bila myo-

inositol diberikan bersama dengan auksin, kinetin, dan vitamin, dapat


17

mendorong pertumbuhan jaringan kalus (Hendaryono dan Wijayani, 1994;

Yusnita, 2003).

d. Asam amino

Asam-asam amino berperanan penting untuk pertumbuhan dan

diferensiasi kalus. Kebutuhan asam amino untuk setiap tanaman berbeda-beda.

Asparagin dan Glutamin berperan dalam metabolisme asam amino, karena

dapat menjadi pembawa dan sumber amonia untuk sintesis asam-asam amino

baru dalam jaringan (Hendaryono dan Wijayani, 1994).

e. Sumber energi

Pada umumnya, tidak semua sel tanaman yang terisolasi dalam kultur

in vitro bersifat autotrof sehingga tidak dapat menyediakan energi untuk

proses fotosintesis. Kebutuhan akan energi menyebabkan perlunya

penambahan karbohidrat sebagai sumber energi dalam media kultur (Yusnita,

2003). Karbohidrat adalah kimia karbon yang meliputi gula, pati, dan selulosa.

Ada banyak jenis karbohidrat yang dipakai dalam kultur jaringan, namun yang

paling banyak digunakan adalah sukrosa atau D-glukosa (Katuuk, 1989).

f. Zat pengatur tumbuh

Keberadaan hormon dan zat pengatur tumbuh dalam kegiatan kultur

jaringan adalah mutlak karena kegiatan kultur jaringan umumnya

menggunakan bahan tanam yang tidak lazim (sel, jaringan, atau organ) dan

budidayanya adalah budidaya terkendali (Santoso dan Nursandi, 2002).

Hormon adalah zat yang diproduksi dalam tumbuhan itu sendiri dan aktif

dalam konsentrasi kecil. Zat itu disebut juga zat endogenus. Untuk keperluan


18

kultur jaringan, telah dibuat hormon tumbuhan buatan secara sintetik maupun

melalui fermentasi. Hormon atau zat tersebut dinamakan zat pengatur tumbuh

(Katuuk, 1989). Zat pengatur tumbuh (ZPT) pada tanaman adalah senyawa

organik bukan hara, yang dalam jumlah sedikit dapat mendukung,

menghambat dan dapat mengubah proses fisiologi tumbuhan. ZPT diperlukan

sebagai komponen medium bagi pertumbuhan dan diferensiasi. Tanpa

penambahan ZPT dalam medium, pertumbuhan akan terhambat atau mungkin

tidak tumbuh sama sekali (Hendaryono dan Wijayani, 1994).

Penentuan macam dan konsentrasi hormon dan zat pengatur tumbuh

untuk tujuan kultur tertentu tidak mudah. Diperlukan pengetahuan yang lebih

luas tentang kedua zat tersebut, dan melihat serta mempelajari contoh-contoh

penggunaannya (Santoso dan Nursandi, 2002). Zat pengatur tumbuh yang

sudah dikenal antara lain auksin, sitokinin, adenin, giberelin, etilen, dan

abscicin. Dari semua jenis ZPT tersebut, auksin dan sitokinin adalah yang

paling banyak digunakan (Katuuk, 1989).

1) Auksin

Auksin adalah hormon tanaman yang diproduksi secara alamiah

dalam tubuh tanaman dan juga dapat secara sintesis. Dalam media, auksin

berfungsi untuk merangsang pertumbuhan kalus, perbesaran sel,

pertumbuhan akar, dan mengatur morfogenesis (Katuuk, 1989).

Auksin alamiah yang paling banyak dikenal adalah IAA (3-

indoleasetic acid). Selain IAA dikenal juga auksin sintetik, yaitu NAA (a-

naphtalene asetic acid), 2,4-D (2,4-dichlorophenoxyacetic acid), IBA (3-


19

indole butyric acid), dan PCPA (P-chlorophenoxy asetic acid) (Katuuk,

1989).

Pengaruh rangsangan auksin terhadap jaringan berbeda-beda. Pada

kadar yang tinggi, auksin lebih bersifat menghambat daripada merangsang

pertumbuhan dan menyebabkan diferensiasi kalus cenderung ke arah

pembentukan primordia akar. Pengaruh auksin terhadap perkembangan sel

menunjukan adanya indikasi bahwa auksin dapat menaikkan tekanan

osmotik, meningkatkan sintesa protein, meningkatkan permeabilitas sel

terhadap air, dan melunakkan dinding sel yang diikuti menurunnya

tekanan dinding sel sehingga air dapat masuk ke dalam sel yang disertai

dengan kenaikan volume sel (Hendaryono dan Wijayani, 1994).

2) Sitokinin

Dalam kultur jaringan, sitokinin berfungsi untuk mengatur

pertumbuhan serta morfogenesis. Sitokinin juga merupakan hormon yang

diproduksi secara alamiah (endogenus), dan juga dapat dibuat secara

sintesis (Katuuk, 1989).

Sitokinin alami ditemukan lebih dari 30 jenis dan terdapat dalam

bentuk sitokinin bebas, maupun sebagai glukosa atau ribosa. Dua sitokinin

alami yang paling banyak digunakan dalam kultur jaringan adalah zeatin

(4-hydroxy-3-methyl-trans-2-butenylaminopurine) dan 2-iP (N6-(2-

ispentyl)adenin). Sitokinin sintetik yang digunakan dalam kultur jaringan

antara lain kinetin atau FAP (6-furfurylaminopurine), BAP atau BA (6-

benzylaminopurine/6-benzyladenine), 2Cl-4PU (N-(2-chloro-4-pyridyl)-


20

N’-phenylurea), PBA (SD 8339) ((6-benzylamino)-9-(2-

tetrahydropyranyl)-9H-purine), thidiazuron (N-phenyl-N’-1,2,3-

thiadiazol-5-phenylurea), dan 2,6Cl-4PU (N-(2,6-dichloro-4-pyridyl)-N’-

phenylurea) (Santoso dan Nursandi, 2002).

Dalam pertumbuhan jaringan, sitokinin berpengaruh pada

pembelahan sel. Sitokinin bersama-sama dengan auksin mempengaruhi

diferensiasi jaringan. Pemberian sitokinin yang relatif tinggi akan

menyebabkan kalus ke arah pembentukan primordia batang atau tunas


3. Eksplan

Eksplan adalah bagian kecil jaringan atau organ yang dikeluarkan atau

dipisahkan dari tanaman induk kemudian dikulturkan (Katuuk, 1989). Pada

pemilihan eksplan, sebaiknya dipilih bagian atau jaringan tanaman yang masih

muda dan mudah tumbuh, yaitu jaringan meristem. Jaringan meristem terdiri

dari sel-sel yang selalu membelah, berdinding tipis, belum mempunyai

penebelan zat pektin, plasmanya penuh, dan vakuolanya kecil-kecil.

Penggunaan jaringan meristem dalam kultur jaringan dikarenakan jaringan

meristem selalu membelah, sehingga diperkirakan mempunyai hormon yang

mengatur pertumbuhan (Hendaryono dan Wijayani, 1994).

Berhasil tidaknya pengulturan eksplan tergantung pada faktor yang

dimiliki oleh eksplan itu sendiri. Faktor-faktor tersebut meliputi ukuran, umur

fisiologi, sumber, serta genotip eksplan (Katuuk, 1989).

a. Ukuran eksplan.


21

Ukuran eksplan sangat menentukan proses pengkulturan. Bagian

tanaman yang dipotong masih mengandung suplai makanan serta hormon

untuk potongan itu sendiri, sehingga makin besar potongan, makin besar

kemampuan potongan ini untuk dirangsang tumbuh dan beregenerasi.

Namun, semakin besar eksplan maka semakin besar kemungkinan

mendapatkan jaringan yang terkontaminasi. Eksplan yang kecil mempunyai

daya tahan yang kurang. Ukuran eksplan yang paling baik adalah 0,5 sampai

1,0 cm, namun ukuran ini dapat bervariasi, tergantung pada material

tanaman yang dipakai serta jenis tanaman (Katuuk, 1989).

b.Umur eksplan.

Umur eksplan sangat mempengaruhi tipe serta daya morfogenesis.

Jaringan yang masih muda serta belum banyak berdiferensiasi terdapat pada

bagian meristematik. Bagian inilah yang paling banyak berhasil dari semua

jenis tanaman. Sel atau jaringan yang masih muda (juvenile) akan tetap

muda dalam pengkulturan sehingga daya untuk beregenerasi tetap ada,

sedangkan sel-sel tua (mature), kesanggupan untuk beregenarasi sudah

berkurang. Selain dari kandungan jaringan meristematik yang berkurang,

jaringan yang sudah tua kemungkinan sudah mengandung patogen (Katuuk,

1989).

c. Sumber eksplan.

Sumber eksplan adalah tanaman induk tempat eksplan diambil.

Tanaman yang dijadikan sumber eksplan hendaknya dari tanaman yang

sehat, yang bertumbuh baik/normal. Pengaruh perubahan suhu, cahaya,


22

musim, serta kelembaban terhadap tanaman induk sangat mempengaruhi

perkembangan eksplan. Tanaman induk dituntut untuk berkecukupan zat

hara, lama penyinaran, intensitas cahaya serta hormon tumbuh. Dengan kata

lain, pertumbuhannya harus optimum (Katuuk, 1989).

Kemampuan bagian tanaman dalam pengulturan juga dipengaruhi oleh

jenis tanaman. Secara umum tanaman berkayu lebih sulit untuk

ditumbuhkankan dibanding herbaseus, monokotil lebih mudah dari dikotil.

Kesulitan membentuk kalus tidak hanya berdasarkan hal-hal tersebut, tetapi

lebih berdasar pada aspek fisiologi dan biokimia bahan tanam (Santoso dan

Nursandi, 2002).

d.Genotip eksplan.

Genotip adalah faktor endogen yang paling utama mempengaruhi

perkembangan jaringan eksplan, dibandingkan faktor-faktor lain. Perbedaan

kemampuan untuk beregenerasi disebabkan oleh genotip jelas dapat dilihat

pada tanaman monokotil, dikotil dan gymnospermae. Dari ketiga kelompok

ini, kemampuan untuk beregenerasi yang paling rendah adalah tanaman

gymnospermae, kemudian diikuti oleh tanaman monokotil, dan terakhir oleh

tanaman dikotil. Selanjutnya dikatakan bahwa apabila satu jenis tanaman

dengan mudah beregenerasi in vivo maka sifat ini berlaku juga pada in vitro

(Katuuk, 1989).

4. Kalus

Jika suatu eksplan ditanam pada medium padat atau dalam medium

cair yang sesuai, dalam waktu 2 – 4 minggu, tergantung spesiesnya akan


23

terbentuk massa kalus (Yuwono, 2006). Kalus adalah jaringan yang tak

berbentuk dan tak terorganisasi. Jaringan ini merupakan hasil pembelahan sel

yang berpotensi tinggi untuk terus-menerus membelah diri. Kalus adalah satu

fase yang harus dilalui selama pengulturan organ, jaringan, maupun

pengulturan sel-sel yang mendahului (Katuuk, 1989). Wetherell (1982)

mendefinisikan kalus sebagai pertumbuhan sel yang belum berdiferensiasi,

membentuk tumor sebagai akibat dari pengaruh auksin dan sitokinin yang

tinggi.

Secara alami, tanaman juga dapat membentuk kalus sebagai upaya

perlindungan tanaman karena tanaman mengalami perlukaan (infeksi bakteri,

gigitan serangga atau nematoda) dan juga karena tanaman mengalami stress

(Santoso dan Nursandi, 2002). Dalam kultur jaringan, kalus terbentuk karena

luka/irisan pada eksplan sebagai respon terhadap hormon baik eksogenus

maupun endogenus. Adanya rangsangan ini menyebabkan sel berubah dari

bentuk inaktif menjadi aktif (Katuuk, 1989).

Sel-sel penyusun kalus adalah sel-sel parenkim yang mempunyai

ikatan yang renggang dengan sel-sel lainnya (Santoso dan Nursandi, 2002).

Pembelahan sel tidak terjadi pada seluruh permukaan eksplan, tetapi hanya

pada bagian meristematik, yaitu lapisan yang terletak pada bagian luar sel

perifer. Lapisan bagian dalam merupakan jaringan yang sudah tua dan tidak

membelah lagi. Setelah pembelahan sel bagian luar berkurang, kalus akan

terlihat membulat atau kompak, dan selanjutnya akan berlangsung proses

organoganesis atau embriogenesis (Katuuk, 1989).


24

5. Sterilisasi

Menciptakan dan memelihara kondisi aseptik merupakan pekerjaan

yang paling berat dalam kultur jaringan. Spora dari bakteri dan jamur yang ada

di sekitar kita dapat jatuh atau terbawa sampai pada eksplan karena adanya

pergerakan udara. Akhirnya spora dan jamur akan tumbuh dan berkembang,

dan dalam beberapa hari akan tumbuh menjadi koloni mikrobial sehingga

objek kultur dikatakan terkontaminasi (Katuuk, 1989).

Media kultur jaringan merupakan sumber makanan yang baik untuk

bakteri dan fungi, dan semua prosedur in vitro harus memuat pencegahan

terhadap kontaminasi mikroba (Wetherell, 1982). Ada beberapa teknik

sterilisasi yang biasa digunakan dalam kultur jaringan tanaman, yaitu:

a. Sterilisasi panas basah

Cara sterilisasi panas basah adalah dengan menggunakan uap air. Alat

yang digunakan untuk sterilisasi ini adalah autoklaf. Hampir semua

mikroba akan mati setelah diberi uap air dengan suhu 121˚C selama 10-15

menit. Cara sterilisasi ini dapat digunakan untuk mensterilkan media

kultur, air, alat/instrumen, peralatan gelas serta peralatan plastik yang

tahan akan suhu panas. Lama sterilisasi ada aturannya, untuk mensterilkan

media 20-75 ml dibutuhkan waktu 15-20 menit, media 75-500 ml

dibutuhkan waktu 20-25 menit, media 500-5000 ml dibutuhkan waktu 25-

35 menit, yang semuanya dilakukan pada suhu 121˚C; sedangkan untuk

mensterilkan peralatan gelas dibutuhkan waktu 30 menit dengan suhu

130˚C (Katuuk, 1989).


25

b. Sterilisasi panas kering

Cara sterilisasi panas kering adalah dengan menggunakan suhu tinggi

dan dalam kondisi kering. Alat yang digunakan untuk sterilisasi ini adalah

oven. Oven digunakan untuk mensterilkan alat-alat yang tidak mudah

terbakar, antara lain: alat-alat gelas dan alat-alat dari logam. Namun dalam

keadaan tertentu dimana suhu tidak terlalu panas, alat dapat dibungkus

dengan kertas kemudian disterilkan. Namun bukan berarti semua alat dari

bahan logam harus disterilkan dengan cara ini. Alat-alat seperti pisau serta

scalpel tidak dapat disterilkan dengan cara ini sebab dapat merusak

ketajaman pisau /alat (Katuuk, 1989).

Lama pemanasan tergantung pada suhu. Biasanya sterilisasi untuk

suhu 160˚C, memerlukan waktu 45 menit; 170˚C selama 18 menit; 180˚C

selama 7,5 menit, dan 190˚C selama 1,5 menit. Suhu harus terus dikontrol,

sebab pada suhu 170˚C, kertas mulai hancur. Setelah selesai proses

sterilisasi, alat/instrumen dikeluarkan dan dibawa ke ruang transfer, dan

dapat disterilkan lagi dengan menggunakan sinar ultraviolet (Katuuk,

1989).

c. Sterilisasi dengan memakai nyala

Alat/instrumen yang sudah disterilkan dengan oven, dikeluarkan dari

bungkusnya, dicelupkan dalam etanol 70% dan dilewatkan pada nyala

lampu spiritus. Setiap beberapa saat instrument harus dicelupkan ke dalam

etanol kemudian dibakar. Perlakuan ini berjalan terus selama kegiatan

inokulasi yang berlangsung di dalam kotak transfer (LAF) (Katuuk,1989).


26

d. Sterilisasi dengan bahan kimia

Sterilisasi dengan bahan kimia merupakan pembasmian mikroba

dengan memakai bahan kimia. Biasanya bahan kimia dipakai untuk

mensterilkan permukaan saja, yang meliputi material tanaman dapat

disterilkan dengan menggunakan natrium hipoklorit, perak nitrat atau air

brom; sedangkan instrumen, tangan pekerja, serta ruang atau kotak transfer

dapat disterilkan dengan menggunakan alkohol 70% (Katuuk, 1989).

Banyak jenis bahan pencuci yang bisa digunakan untuk sterilisasi

material tanaman. Jenis dan lama sterilisasi tergantung pada kepekaan

material tanaman. Terlalu lamanya proses sterilisasi dengan konsentrasi

bahan pencuci yang tinggi, akan mematikan mikroba sekaligus merusak

jaringan tanaman yang disterilkan. Di samping itu, bahan pencuci

hendaknya bersifat lebih mudah larut. Bila tidak demikian, sisa zat pencuci

ini akan tetap pada material tanaman, yang dapat mengganggu

pertumbuhan eksplan (Katuuk, 1989).

e. Sterilisasi dengan cahaya

Ruang dan kotak transfer sulit disterilkan hanya dengan menggosok

dengan alkohol atau bahan kimia pada permukaan. Untuk itu digunakan

lampu germisidal dengan sinar ultraviolet. Ada laboratorium yang sudah

memasangnya di langit-langit atau pada tempat lain dengan tujuan semua

bagian terkena cahaya. Kelemahan menggunakan sinar ultraviolet adalah

pada tempat-tempat yang tidak terkena cahaya, proses sterilisasi tidak


27

terjadi. Selain itu, sinar ultraviolet hanya mampu mematikan bentuk

fertilisasi bakteri dan jamur, bukan bentuk spora (Katuuk, 1989).

6. Penanaman eksplan

Penanaman eksplan dilakukan di dalam laminar air flow (LAF)

dengan kondisi aseptis. Sebelum bekerja di dalam LAF, semua perhiasan

tangan harus dilepas dan tangan dibasuh dengan alkohol 70%. Saat menanam

eksplan, pekerja harus menggunakan masker penutup mulut dan hidung


Eksplan ditanam ke dalam media dengan sedikit ditekan agar eksplan

bersinggungan dengan media. Selanjutnya wadah ditutup dengan alumunium

foil atau parafin untuk mencegah penguapan. Media yang berisi eksplan

diinkubasikan dalam ruangan dengan suhu 25˚C (Dixon, 1985).

7. Subkultur

Subkultur adalah usaha untuk mengganti media tanam kultur jaringan

dengan media yang baru, sehingga kebutuhan nutrisi untuk pertumbuhan kalus

dapat terpenuhi (Hendaryono dan Wijayani, 1994).

Subkultur pada media padat dilakukan dengan meletakkan kalus yang

sudah terbentuk di atas cawan petri dan membelah-belahnya lagi menjadi

bagian-bagian kecil dengan menggunakan skalpel dan pinset. Potongan-

potongan kalus tersebut segera dimasukkan kembali ke dalam wadah yang

berisi media baru dengan komposisi media yang sama dengan media lama dan

diinkubasikan kembali. Seluruh proses ini dilakukan dalam kondisi aseptis



28

8. Pertumbuhan kalus

Ada 3 tahapan perkembangan dan pertumbuhan kalus, mulai dari

waktu subkultur atau penaburan inokulum, yaitu induksi pembelahan sel,

pembelahan sel aktif dan tahap pembelahan sel lambat atau sel berhenti

membelah. Laju pertumbuhan kalus umumnya ditetapkan secara kuantitatif

dengan parameter indeks pertumbuhan bobot kalus basah. Pertambahan bobot

kalus basah merupakan selisih antara bobot kalus basah pada periode tertentu

dikurangi bobot kalus mula-mula atau bobot inokulum. Selanjutnya dari kurva

pertumbuhan kalus yang menyatakan hubungan antara pertumbuhan bobot

kalus basah dengan umur dapat diketahui fase-fase pertumbuhan kalus antara

lain:

a. Fase lag, yaitu fase belum terjadinya pertumbuhan secara nyata, keadaan

ini terjadi selama beberapa waktu setelah kalus disubkultur, serta

merupakan waktu adaptasi kalus dengan media yang baru. Pada fase ini

pertambahan bobot kalus hanya sedikit dan terlihat hampir mendatar pada

kurva.

b. Fase eksponensial, yaitu fase mulai terjadinya pertumbuhan kalus.

Pertambahan bobot kalus mulai terlihat nyata dan diikuti fase linier

dimana pertumbuhan kalus terus menaik secara eksponensial seperti garis

lurus ke atas dan berhenti.

c. Fase stasioner, yaitu fase saat pertumbuhan kalus sama dengan kematian

sel-sel kalus. Pada fase ini, kalus tidak dapat bertahan hidup dalam waktu

yang lama. Sel-sel mulai mati, media pertumbuhan kelebihan muatan dan


29

nutrien telah habis digunakan, sehingga kematian sel menjadi lebih cepat

(George dan Sherrington, 1984).

C. Glikosida Jantung

Glikosida jantung banyak ditemukan dalam keluarga tumbuhan yang

tidak berkaitan satu sama lain seperti Apocynaceae, Liliaceae, Moraceae, dan

Ranunculaceae (Robinson, 1995); juga banyak ditemukan pada anggota suku

Scrophulariaceae, Digitalis, Nerium, Asclepiadaceae, dan Asclepis (Harborne,

1987). Tumbuhan yang mengandung senyawa ini biasanya digunakan sebagai

racun panah dan siksaan pada zaman prasejarah. Contoh glikosida yang

bermanfaat dalam pengobatan misalnya glisirizin, glikosida asam gliserisat,

yang terkandung dalam akar Glycyrrhiza glabra sebagai komponen aktif

utama (Robinson, 1995).

Sumber utama kardenolida ialah genus Digitalis dan Strophantus.

Digitalis mempunyai efek langsung pada jantung yaitu memberi kekuatan bila

jantung melemah. Glikosida jantung biasanya mempunyai sifat peluruh air

seni (diuretik) yang berakibat menurunkan tekanan darah dan mengobati

bengkak. Keberadaan senyawa ini dalam tumbuhan mungkin memberi

perlindungan kepada tumbuhan tersebut dari gangguan beberapa serangga

(Robinson, 1995).

Isolasi glikosida jantung murni dalam tanaman sulit dilakukan karena

glikosida jantung merupakan suatu glikosida yang memiliki kepolaran yang

tinggi. Berdasarkan polaritasnya, glikosida jantung dapat diekstrak dengan


30

menggunakan pelarut yang polar antara lain: etanol, etil asetat, campuran

etanol dan air serta campuran etanol dan kloroform (Samuelsson, 1999).

Glikosida jantung diklasifikasikan sebagai steroid (sterol), karena

memiliki inti cyclopentanoperhydrophenanthrene, sebuah cincin lakton α-β

yang tidak jenuh (dengan sisi 5 atau 6) pada C17, sebuah β-oriented hydroxyl

pada C14, sebuah penggabungan cis dari cincin C dan D pada C13-C14 dan

tambahan satu atau lebih gula pada C3, biasanya deoksiheksometilosa. Cincin

lakton tidak jenuh bersisi 5 (pentagonal) pada C17 menggolongkan glikosida

tersebut sebagai kardenolida, sedangkan cincin lakton tidak jenuh bersisi 6

(heksagonal) pada posisi yang sama menggolongkan glikosida tersebut

sebagai bufadienolida (Farnsworth, 1966).

H

H

H

OH

CH3

CH3

HO

O

O

H

O

O

H

H

OH

CH3

CH3

HO

bufadienolida kardenolida

Gambar 1. Struktur dasar bufadienolida dan kardenolida

Identifikasi glikosida jantung dapat dilakukan dengan menggunakan

Kromatografi Lapis Tipis (KLT) secara kualitatif. Reaksi identifikasi terhadap

glikosida jantung dapat dilakukan menggunakan uji dengan pereaksi Baljet

(2,4,6-trinitrophenol), uji dengan pereaksi Kedde (3,5-dinitrobenzoic acid), uji

dengan pereaksi Raymond (m-dinitrobenzene), uji dengan pereaksi Legal


31

(sodium nitroprusside) dimana pereaksi tersebut akan bereaksi dengan grup

metilen aktif yang ditemukan dalam cincin lakton tidak jenuh. Pereaksi ini

akan memberikan warna oranye, ungu, biru, dan violet, yang menunjukkan

adanya glikosida jantung (Farnsworth, 1966).

D. Kromatografi Lapis Tipis

Kromatografi lapis tipis (KLT) merupakan metode pemisahan

fisikokimia (Stahl, 1969). Pada dasarnya semua kromatografi menggunakan

dua fase yaitu fase diam dan fase gerak. Pemisahan-pemisahan tergantung

pada gerakan relatif dari dua fase ini. Kromatografi dapat digolongkan

berdasarkan sifat-sifat fase diam, yang dapat berupa zat padat atau zat cair.

Apabila fase diam berupa zat padat maka cara tersebut dikenal sebagai

kromatografi serapan, sedangkan untuk fase diam yang berupa cairan dikenal

sebagai kromatografi partisi (Sastrohamidjojo, 2001).

Kromatografi lapis tipis termasuk ke dalam kromatografi serapan.

Prinsip dari kromatografi serapan adalah kecepatan bergerak dari suatu

komponen tergantung pada berapa besarnya komponen tersebut tertahan oleh

fase diam (Sastrohamidjojo, 2001).

Fase diam yang digunakan dalam kromatografi lapis tipis adalah bahan

penyerap atau adsorben (Stahl, 1969). Fase diam dapat berupa serbuk halus

yang berfungsi sebagai permukaan penjerap (kromatografi cair-padat) atau

berfungsi sebagai penyangga untuk lapisan zat cair (kromatografi cair-cair)

(Gritter et al, 1991). Dua sifat penting yang perlu diperhatikan dalam


32

pemilihan bahan penyerap adalah ukuran partikel dan homogenitas partikel

penyerap. Kedua sifat ini sangat berpengaruh pada gaya adhesi. Besar partikel

yang biasa digunakan adalah 1-25 mikron. Fase diam yang umum dan paling

banyak digunakan adalah silika gel yang dicampur dengan CaSO4 untuk

menambah daya lengket partikel silika gel pada pendukung (pelat). Adsorben

lain yang juga biasa digunakan adalah alumina, kieselguhr, celite, serbuk

selulosa, serbuk poliamida, kanji dan sephadex (Mulja dan Suharman, 1995).

Fase diam yang digunakan untuk analisis secara kromatografi lapis tipis untuk

glikosida jantung adalah silika gel GF 254 (Wagner, 1984).

Fase gerak adalah medium angkut dan terdiri atas satu atau beberapa

pelarut. Fase ini bergerak dalam fase diam karena adanya gaya kapiler. Fase

gerak yang digunakan adalah pelarut bertingkat mutu analitik dan bila

diperlukan sistem pelarut multi-komponen harus berupa campuran

sesederhana mungkin terdiri atas maksimum tiga komponen (Stahl, 1969).

Ada beberapa macam pilihan fase gerak untuk glikosida jantung, yaitu etil

asetat-metanol-air (100:13,5:10 v/v); etil asetat-metanol-etanol-air (81:11:4:8

v/v); metiletil keton-toluena-air-asam asetat glasial (40:5:3:2,5:1 v/v); dan

kloroform-metanol-air (65:35:10 v/v) (Wagner, 1984).

Campuran yang dipisahkan berupa larutan yang ditotolkan berupa

bercak. Setelah itu pelat atau lapisan dimasukkan ke dalam bejana tertutup

rapat yang berisi larutan pengembang yang cocok (fase gerak). Pemisahan

terjadi selama pengembangan. Selanjutnya senyawa yang tidak berwarna

harus dideteksi (Stahl, 1969).


33

Identifikasi dari senyawa yang terpisah (bercak/noda) pada lapisan

tipis dapat dilakukan dengan tanpa pereaksi kimia dan disemprot dengan

reagen. Identifikasi senyawa glikosida jantung dapat dilakukan dengan tanpa

pereaksi kimia yaitu dengan menggunakan sinar ultraviolet 254 dan 365 nm,

sedangkan reagen penyemprot yang digunakan untuk identifikasi senyawa

glikosida jantung adalah reagen Kedde, Legal, Baljet, Raymond, antimony

(III) chloride, chloramine-trichloroacetic acid/CTA, sulphuric acid (Wagner,

1984) dan vanillin-phosporic acid (Jork et al., 1990).

Jarak pengembangan senyawa pada kromatogram biasanya dinyatakan

dengan angka Rf atau hRf. Harga Rf didefinisikan sebagai perbandingan jarak

antara senyawa dari titik awal dengan jarak tepi muka pelarut dari awal.

Rf = anpengembangjarak

anpengembangawaldaribercakjarak

Harga Rf yang diperoleh pada KLT tidak tetap jika dibandingkan dengan

kromatografi kertas sehingga perlu dibuat kromatogram zat pembanding

kimia, lebih baik dengan kadar yang berbeda-beda. Perkiraan identifikasi

diperoleh dengan pengamatan dua bercak dengan harga Rf dan ukuran yang

hampir sama. Angka Rf berkisar antara 0,01 – 1,00 dan hanya dapat

ditentukan dengan dua desimal. hRf adalah angka Rf dikalikan faktor 100 (h),

menghasilkan nilai berkisar antara 0 – 100 (Harborne, 1984; Stahl, 1969).

E. Landasan Teori

Selama ini kamboja jepang digunakan sebagai tanaman hias dan secara

tradisional digunakan untuk membantu proses kelahiran. Berdasarkan


34

penelitian yang dilakukan Melero et al (2000), kamboja jepang mempunyai

kandungan senyawa glikosida yang mirip digitalis sehingga mempunyai

kemungkinan dapat digunakan sebagai obat jantung.

Pelaksanaan teknik kultur jaringan ini berdasarkan teori sel seperti

yang dikemukaan oleh Schleiden dan Schwann, yaitu bahwa sel merupakan

satuan struktural, fungsional, dan hereditas terkecil dari makhluk hidup

sehingga dapat tumbuh dan berkembang menjadi suatu individu yang normal.

Sel juga mempunyai kemampuan totipotensi, yaitu kemampuan setiap sel, dari

mana saja sel tersebut diambil, yang apabila ditumbuhkan pada lingkungan

yang sesuai akan tumbuh dan berkembang menjadi tanaman lengkap yang

baru yang mempunyai kandungan kimia yang sama dengan tanaman asalnya.

Media kultur merupakan salah satu faktor penentu keberhasilan

perbanyakan tanaman secara kultur jaringan. Apabila eksplan ditanam dalam

media cocok, pertumbuhannya pun akan optimum. Media tumbuh yang

digunakan dalam penelitian ini adalah Woody Plant Medium (WPM) karena

menurut Hendaryono dan Wijayani (1994) media WPM cocok sebagai media

kultur untuk membudidayakan tanaman berkayu.

Laju pertumbuhan kalus umumnya ditetapkan secara kuantitatif

dengan parameter indeks pertumbuhan bobot kalus basah. Kurva pertumbuhan

kalus dapat menunjukkan fase-fase pertumbuhan kalus, yaitu fase lag (fase

penyesuaian), fase eksponensial (fase pertumbuhan optimum), dan fase

stasioner (fase penurunan).


35

Teknik kultur jaringan ini diharapkan dapat menghasilkan metabolit

sekunder, yaitu glikosida jantung, dari tanaman kamboja jepang yang

mempunyai profil KLT yang mirip dengan profil KLT pada tanaman induknya

dan kultur kalusnya memiliki profil pertumbuhan sigmoidal yang fase

stasionernya menghasilkan kandungan glikosida jantung yang optimum.

F. Hipotesis

1. Daun tanaman kamboja jepang dapat membentuk kalus dengan variasi

penambahan zat pengatur tumbuh asam 2,4-Diklorofenoksiasetat dan 6-

furfurylaminopurine pada media WPM.

2. Kultur kalus yang dihasilkan melalui teknik kultur jaringan ini memiliki

pertumbuhan sigmoidal yang fase stasionernya menghasilkan kandungan

glikosida jantung yang optimum.

3. Ekstrak kalus daun tanaman kamboja jepang memiliki profil KLT yang

mirip dengan ekstrak daun kamboja jepang tanaman asal.


BAB III

METODOLOGI PENELITIAN

A. Jenis dan Rancangan Penelitian

Penelitian ini termasuk jenis penelitian eksperimental murni dengan

rancangan acak lengkap pola searah.

B. Variabel Penelitian dan Definisi Operasional

1. Variabel utama

a. Variabel bebas : waktu pemanenan (hari ke-) dan variasi konsentrasi 2,4-D

dan FAP.

b. Variabel tergantung: profil pertumbuhan kultur kalus dan susut

pengeringan kalus (%).

2. Variabel pengacau terkendali

a. Subyek uji : daun yang digunakan sebagai eksplan adalah daun segar dan

sehat yang terletak pada nomor 3-5 dari ujung batang atau cabang dengan

ukuran eksplan 0,5 - 1,0 cm.

b. Bahan uji dan cara kerja penanaman berupa:

i. Media agar jenis WPM dengan sterilisasi tetap terjaga.

ii. Sterilitas, suhu, kelembaban dan intesitas cahaya dalam ruang

inkubator.

3. Variabel pengacau tidak terkendali

a. Keadaan patologis pada daun tanaman yang tidak tampak.

36


37

b. Kandungan senyawa kimia lain yang terkandung dalam kamboja jepang

yang dapat mempengaruhi hasil kromatogram.

4. Definisi Operasional

a. Daun yang digunakan sebagai eksplan dalam penelitian ini adalah daun

yang segar dan sehat, terletak pada nomor 3-5 dari ujung batang atau

cabang.

b. Waktu inisiasi adalah waktu yang dibutuhkan oleh eksplan untuk

membentuk kalus dihitung mulai dari saat penanaman eksplan sampai hari

pertama kalus mulai terbentuk berupa bintik putih dari tepi irisan daun

eksplan.

c. Subkultur adalah suatu kegiatan pemeliharaan kalus dengan memindahkan

kalus ke dalam media baru sehingga kalus tidak kekurangan nutrisi.

d. Bobot kalus basah awal adalah hasil pengurangan antara bobot botol +

media + kalus dengan bobot botol + media pada saat subkultur.

e. Bobot kalus basah akhir adalah bobot kalus yang ditimbang pada saat

pemanenan.

f. Bobot kalus kering adalah bobot kalus pada saat pemanenan dan sesudah

mengalami proses pengeringan dengan menggunakan oven pada suhu 40-

500C, sampai diperoleh kalus dengan bobot konstan yaitu antara

penimbangan yang pertama dan berikutnya selama 1 jam tidak berbeda 0,5

mg.


38

g. Laju pertumbuhan kalus adalah laju pertumbuhan kalus yang ditandai

adanya pertambahan berat kalus dari waktu ke waktu dengan memanen

setiap 4 hari sekali sebanyak 3 botol selama 36 hari.

h. Profil pertumbuhan kalus adalah rasio antara pertumbuhan kalus (bobot

kalus basah akhir- bobot kalus basah awal) dengan waktu pemanenan serta

rasio antara bobot kalus kering dengan waktu pemanenan.

i. Persen susut pengeringan adalah rerata bobot kalus basah dikurangi

dengan rerata bobot kalus kering lalu dibagi dengan rerata bobot kalus

basah dikali dengan 100%.

j. Konsentrasi zat pengatur tumbuh, yaitu asam 2,4-Diklorofenoksiasetat

yang digunakan adalah 4 ppm dan 2 ppm yang terkandung dalam satu liter

media. Sedangkan konsentrasi 6-furfurylaminopurine yang digunakan

adalah 1 ppm.

C. Alat dan Bahan Penelitian

1. Alat penelitian

a. Alat yang digunakan dalam kultur jaringan tanaman:

1) Alat-alat gelas, Pyrex

2) Autoklaf, YX 400Z Shanghai Sanshen, Medical Inst, Co, LTD.

3) Oven, Marius Instrument, German.

4) Pemanas listrik, Ika Combimag, RCT, German.

5) Timbangan analitik, Scaltec.

6) Glassfirn.


39

7) Magnetic stirrer.

8) Pinset.

9) Skapel.

10) Kertas indikator pH.

11) Kertas saring.

12) Laminar air flow.

13) Lampu UV.

14) Inkubator, Heraeus Tamson, Holland.

15) Botol kultur.

16) Aluminium foil, Heavy-Duty, Diamond-Wrap.

17) Refrigerator, Sharp.

18) Sprayer.

19) Mortir & stamper.

b. Alat untuk penyarian : alat gelas (pyrex), kertas saring, dan waterbath

c. Alat untuk Kromatografi Lapis Tipis:

1) Bejana gelas.

2) Lempeng kaca.

3) Lemari asam.

4) Pipa kapiler.

5) Penyemprot bercak.

6) Lampu TL Day Light” 20 watt.

7) Lampu UV 254 dan 365 nm.


40

2. Bahan Penelitian

a. Bahan eksplan : daun yang segar dan sehat terletak no. 3-5 dari ujung

batang atau cabang tanaman kamboja jepang.

b. Bahan kimia

Bahan-bahan kimia yang digunakan dalam penelitian ini adalah :

1) Agar, Mkr Chemicals.

2) Garam anorganik (makronutrien) yang terdiri dari :

a) Kalsium nitrat-tetrahidrat (Ca(NO3)2.4H2O), Merck, Germany,

1.02121.0500.

b) Ammonium nitrat (NH4NO3), GPR, BDH, 1.01188.0500.

c) Kalsium klorida-dihidrat (CaCl2.2H2O), Merck, Germany, 1.02381.1000

d) Magnesium sulfat-heptahidrat (MgSO4.7H2O), Merck, Germany,

1.05886.0500

e) Kalium dihidrogen fosfat (KH2PO4), Merck, Germany, 1.04873.0250.

3) Garam anorganik (mikronutrien) yang terdiri dari :

a) Mangan (II) sulfat tetrahidrat (MnSO4.4H2O), BDH limited Poole,

England, 10153.

b) Seng sulfat heptahidrat (ZnSO4.7H2O), Merck, Germany, 1.08883.0500

c) Asam borat (H3BO3), Merck, Germany, 1.00165.1000

d) Besi (II) sulfat heptahidrat (FeSO4.7H2O), Merck, Germany, 1.03965.0500

e) Natrium etilen diamin tetra asetat dihidrat (NaEDTA.2H2O), Merck,

Germany, 1.08418

4) Vitamin dan asam amino yang terdiri dari:


41

a) Myo-inositol, Merck, Germany, 1.04728.0100

b) Tiamin hidroklorida, Brataco Chemica, Indonesia

c) Asam nikotinat, Calbiochem, US, 481918

d) Piridoksin hidroklorida, Brataco Chemica, Indonesia

5) Sumber karbon : sukrosa, Merck, Germany.

6) Zat pengatur tumbuh :

a) Asam 2,4-Diklorofenoksiasetat (2,4-D), Sigma, US, D-8407

b) Furfuryl Amino Purine (FAP), Merck, Germany, 1.24807.0250

7) Desinfektan

a) Natrium hipoklorida, Bayclin®, Johnson.

b) Alkohol 70% derajat kemurnian teknis.

c) Tween 80, Merck-Shouchard, Germany

8) Akuades

c. Bahan untuk penyarian: Metanol (J.T. Baker, Germany) dan Kloroform

(J.T. Baker, Germany)

d. Kromatografi Lapis Tipis :

a) Metanol, J.T. Baker, Germany

b) Etil asetat, J.T. Baker, Germany.

c) Kedde reagent, Merck, Germany.

d) Asam sulfat, Merck, Germany.

e) Silica-Gel GF 254, Merck, Germany.


42

D. Tata Cara Penelitian

1. Determinasi tanaman

Determinasi tanaman kamboja jepang dilakukan di laboratorium Biologi

Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma berdasarkan pustaka acuan

(Anonim, 2006).

2. Pembuatan stok

a. Pembuatan larutan stok hara mikro

Disiapkan gelas piala dengan volume 500 ml yang telah diisi akuades

300 ml. Mangan (II) sulfat tetrahidrat sebanyak 2,23 mg, seng sulfat

heptahidrat sebanyak 860 mg, asam borat sebanyak 620 mg, dimasukkan

satu per satu ke dalam gelas piala tersebut, sambil diaduk dengan

menggunakan magnetic stirer hingga jernih. Kemudian ditambahkan

aquades hingga volume 500 ml. Tiap 1 liter media membutuhkan 5 ml

stok hara mikro.

b. Pembuatan larutan stok besi

Stok untuk bahan ini terpisah dari unsur hara mikro lainnya, karena

komponen natrium etilen diamin tetra asetat dan besi (II) sulfat heptahidrat

sukar larut dalam akuades, maka perlu ditambahkan beberapa tetes HCl,

kemudian dipanaskan. Disiapkan gelas piala dengan volume 500 ml yang

telah diisi akuades 300 ml. Besi (II) sulfat heptahidrat sebanyak 0,278 g

dan natrium etilen diamin tetra asetat dihidrat sebanyak 0,373 g

dimasukkan ke dalam gelas piala tersebut, lalu ditambahkan beberapa tetes

HCl sambil diaduk dengan menggunakan magnetis stirer hingga larut dan


43

agar cepat larut dibantu dengan pemanasan. Kemudian ditambahkan

akuades hingga volume 500 ml. Perlu diperhatikan bahwa satu liter media

dibutuhkan 5 ml larutan stok besi.

c. Pembuatan larutan stok vitamin dan asam amino

Dua ratus milliliter aquades dimasukkan ke dalam gelas piala dengan

volume 500 ml, kemudian asam nikotinat sebanyak 0,05 g, piridoksin

hidroklorida sebanyak 0,05 g, dan tiamin hidroklorida sebanyak 0,1 g

dimasukkan satu per satu ke dalam gelas piala tersebut, sambil diaduk

dengan menggunakan magnetic stirer hingga jernih. Kemudian

ditambahkan aquades hingga volume 500 ml. Tiap satu liter media

dibutuhkan 5 ml larutan stok vitamin dan asam amino.

d. Pembuatan larutan stok myo-inositol

Untuk membuat larutan myoinositol, diperlukan 10 g myo-inositol

yang dilarutkan dalam 500 ml aquades dalam gelas piala sampai larut

kemudian akuades ditambahkan sampai volume 1 liter. Dalam membuat

satu liter media dibutuhkan larutan stok myoinositol sebanyak 10 ml.

e. Pembuatan larutan stok 2,4-D

Untuk membuat larutan stok 2,4-D (4 ppm), larutkan 2,4-D sebanyak

100 mg ke dalam 2-5 ml etanol, panaskan sebentar lalu tambahkan 100 ml

akuades. Dalam membuat satu liter media dengan konsentrasi 2,4D

sebesar 4 ppm dibutuhkan larutan stok sebanyak 4 ml.

f. Pembuatan larutan stok FAP


44

Sebanyak 100 mg bahan ditimbang, kemudian dimasukkan ke dalam

Beaker glass yang berisi 50 ml akuades. Sedikit demi sedikit HCl 1 N

diteteskan ke dalam Beaker glass sambil diaduk hingga zat pengatur

tumbuh larut merata. Akuades ditambahkan hingga volume mendekati 70

ml, diaduk kembali kemudian dituangkan ke dalam labu ukur 100 ml.

Akuades ditambahkan ke dalam labu ukur hingga volume tepat 100 ml.

Untuk 1 liter media yang akan ditambahkan zat pengatur tumbuh sejumlah

1 mg atau 1 ppm, dibutuhkan 1 ml larutran stok.

3. Pembuatan media (untuk 1 liter media)

Sebanyak 300 ml akuades dipanaskan dalam Beaker glass 1000ml.

Bahan-bahan nutrisi makro dimasukkan satu per satu ke dalam Beaker glass

sambil terus diaduk menggunakan strirer hingga larut. Setelah itu dimasukkan

berturut-turut 5 ml larutan stok hara mikro, 5 ml larutan stok besi-EDTA, 5

ml stok vitamin dan asam amino, dan 10 ml stok myo-inositol. Sedikit demi

sedikit dimasukkan campuran sukrosa 30 g dan agar 10 g sambil diaduk

hingga larut. Ditambahkan akuades sedikit demi sedikit untuk membantu

kelarutan hingga volume mencapai 1000 ml. Campuran tersebut dipanaskan

hingga mendidih dan berwarna jernih. Setelah jernih, media dibagi menjadi 2

bagian dan stok zat pengatur tumbuh dimasukkan sesuai konsentrasi yang

diinginkan. Untuk media pertama (selanjutnya akan disebut sebagai WPM 2)

dimasukkan 2 ml (4 ppm) larutan stok 2,4-D. Untuk media kedua (selanjutnya

akan disebut sebagai WPM 3) dimasukkan 1 ml (2 ppm) larutan stok 2,4-D

dan 0,5 ml (1 ppm) larutan stok FAP. pH kedua media diatur pada 5,2 – 5,6.


45

Jika terlalu basa ditambahkan HCl 1 N dan jika terlalu asam ditambahkan

larutan KOH 1 N. Selanjutnya media dituang ke dalam botol kultur dengan

ketebalan media kurang lebih 1 cm. Botol yang berisi media kemudian ditutup

menggunakan alumunium foil dan disterilisasi dengan autoklaf pada suhu

1210 C selama 15 menit. Media yang aman digunakan adalah media yang

telah disimpan dalam inkubator selama kurang lebih 1 minggu dan tidak

tampak adanya pertumbuhan mikroorganisme kontaminan seperti jamur dan

bakteri.

4. Sterilisasi alat dan ruangan

a. Sterilisasi alat

Erlenmeyer yang berisi akuades dan gelas piala kosong ditutup dengan

alumuniumfoil. Cawan petri diisi kertas saring, skalpel, pinset yang

dibungkus dengan kertas payung semuanya dimasukkan dalam autoklaf

dan disterilkan pada temperatur 121˚C selama 20 menit.

b. Sterilisasi ruangan

Dinding- dinding ruangan penanaman eksplan dan Laminar Air Flow

(LAF) disterilkan dengan menggunakan alkohol 70 %. Selanjutnya lampu

UV, baik yang ada di ruangan maupun di LAF, dinyalakan selama ± 1

jam.

5. Sterilisasi dan penanaman eksplan

a. Sterilisasi eksplan

Sebelum dimasukkan ke dalam LAF, eksplan berupa daun yang

diambil dari tanaman induk dicuci di bawah air keran yang mengalir


46

dengan diberi sedikit detergen untuk membersihkan kotoran yang melekat

di permukaan terluar eksplan. Di dalam LAF eksplan juga disterilkan

dengan direndam-dikocok dalam larutan hipoklorit-Tween-80 selama 5

menit. Eksplan dibilas dengan air steril (air yang sudah disterilisasi dengan

autoklaf) hingga tidak berbusa lagi (kira-kira 3 kali pencucian). Eksplan

yang sudah dibilas dengan air steril ini sudah siap untuk ditanam.

b. Penanaman eksplan

Eksplan dipotong-potong (sepanjang 1 x 1 cm) melewati tulang daun.

Potongan eksplan dimasukkan ke dalam media dengan sedikit ditekan

untuk memperbesar sudut kontak eksplan dengan permukaan media klutur.

Media yang telah ditanami, diinkubasikan dalam ruang inkubator dengan

suhu ruangan 18˚C serta disinari dengan lampu TL ”Day Light” 20 watt

dengan ketinggian 40 cm (Wetherell, 1982).

6. Pengamatan waktu inisiasi kalus

Waktu inisiasi kalus dihitung dari saat kalus mulai terbentuk. Karena

pertambahan bobot pertumbuhan kalus tidak dapat diamati, penentuan waktu

inisiasi kalus dilakukan secara visual yaitu mulai terlihatnya bintik putih pada

bagian pelukaan eksplan.

7. Subkultur

Subkultur dilakukan 36 hari setelah penanaman saat tanaman telah

menampakkan gejala kurang nutrisi (mulai berwarna kecoklatan) atau

bobotnya tidak bertambah. Pada proses subkultur, kalus dipecah menjadi

bagian yang lebih kecil kemudian ditanam lagi ke dalam media baru. Proses


47

subkultur ini dilakukan sebagai berikut, semua perlengkapan yang digunakan

yaitu pinset, skapel, bunsen, alat-alat gelas, botol berisi alkohol 70% dan

botol-botol yang berisi media yang telah diketahui beratnya dimasukkan

kedalam laminar air flow dan disterilkan selama ± 1 jam dengan lampu UV.

Media yang berisi kalus kemudian disemprot dengan alkohol 70%

kemudian dimasukkan ke dalam laminar air flow. Ketika botol akan dibuka

dan ditutup, maka dilakukan proses flambir. Kemudian ambil kalus dengan

pinset dan letakkan di atas cawan petri. Bersihkan kalus dari sisa-sisa eksplan

hingga bersih kemudian belah bagian kalus tersebut dan potong-potong

dengan menggunakan pertolongan skapel dan pinset dengan ukuran kalus

awal, yaitu 3–5 mm lalu ditanam dalam media yang baru secara aseptis. Kalus

yang telah ditanam tadi kemudian diinkubasikan di dalam ruang inkubator

dengan suhu ruangan 18˚C serta disinari dengan lampu TL “Day Light” 20

watt dengan ketinggian 40 cm. Sub-kultur ini dibuat sebanyak 27 botol. Untuk

mengetahui bobot kalus maka dilakukan penimbangan pada media baru yang

berisi kalus, selanjutnya bobot yang diperoleh dikurangkan dengan bobot

media awal sebelum ditanami kalus.

8. Pemanenan

Setelah dilakukan subkultur, tiap 4 hari sekali dilakukan pemanenan

sebanyak 3 buah botol yang berisi kalus lalu dibersihkan dari sisa-sisa agar

yang masih melekat. Setelah kalus bersih kemudian dilakukan penimbangan

dan akan mendapatkan bobot kalus basah. Kalus yang telah dipanen kemudian

dikeringkan pada suhu 40-50˚C hingga didapatkan perbedaan bobot sebesar


48

0,5 mg bobot zat dari 2 penimbangan berurutan berselang 1 jam atau dengan

kata lain setelah didapatkan berat kalus kering yang konstan. Catat bobot

kering kalus hasil setiap pemanenan. Kalus kering yang diperoleh kemudian

digerus dengan menggunakan mortir dan stamper . Selanjutnya serbuk kalus

yang diperoleh, disimpan di dalam flakon dan dikumpulkan sebanyak 2 gram

untuk dibuat ekstrak sehingga dapat diketahui metabolit sekunder dalam kalus.

9. Analisis pertumbuhan kalus

Analisis pertumbuhan kalus dalam penelitian ini menggunakan analisis

menggunakan grafik pola pertumbuhan kalus berdasarkan data biomassanya.

Kalus basah yang diperoleh dari setiap pemanenan dikeringkan hingga

bobotnya konstan dan ditimbang. Pertumbuhan kalus dihitung berdasarkan

persentase pertambahan bobot biomassa kalus. Kemudian dibuatkan grafik

pola pertumbuhan kalus, dengan menghubungkan antara pertambahan bobot

kalus kering dan umur kalus.

10. Pengeringan dan pembuatan serbuk daun kamboja jepang

Daun kamboja jepang dikeringkan di dalam oven pada suhu 40-50˚C.

Kemudian daun yang telah dikeringkan tersebut, digerus dengan

menggunakan mortir dan stamper. Serbuk daun yang diperoleh, disimpan di

dalam flakon.

11. Uji tabung

Sepuluh gram serbuk dimaserasi selama 1 jam dengan penyari alkohol

70%. Larutan disaring, dan filtrat yang diperoleh ditambah larutan Pb-asetat

pekat hingga terjadi pengendapan sempurna. Endapan yang terjadi dipisahkan


49

dengan sentrifugasi. Supernatan yang diperoleh ditambah larutan natrium

sulfat 6,3% untuk menghilangkan sisa-sisa Pb. Bila terjadi endapan, endapan

dipisahkan dengan sentrifugasi lalu supernatan diambil. Supernatan kemudian

disari dengan 10 ml kloroform sebanyak 3 kali. Sari kloroform dipekatkan

hingga kira-kira 5 ml.

a. uji Baljet

Sari kloroform diambil secukupnya lalu diencerkan dengan metanol 3-5

kali lipat volume asalnya dan ditambahkan pereaksi Baljet. Perubahan

warna larutan menjadi jingga menunjukkan adanya glikosida dengan

aglikon kardenolida.

b. uji Raymond

Sari kloroform diambil secukupnya lalu diencerkan dengan metanol 3-5

kali lipat volume asalnya dan ditambahkan pereaksi Raymond. Perubahan

warna larutan menjadi ungu menunjukkan adanya glikosida dengan aglikon

kardenolida (Dwiatmaka dan Wulandari, 2005).

12. Pembuatan ekstrak kalus daun kamboja jepang

Satu gram serbuk kalus daun kamboja jepang direfluks menggunakan 10

ml campuran kloroform-metanol (1:10 v/v), selama 10 menit. Larutan

didinginkan dan disaring, filtratnya diuapkan sampai kering. Residu yang

diperoleh dilarutkan dalam 2 ml kloroform-metanol (1:1 v/v) (Dwiatmaka dan

Wulandari, 2005). Ekstrak yang ditotolkan pada plat KLT 30-50μl (Wagner et

al., 1984).


50

13. Pembuatan ekstrak kalus daun kamboja jepang yang dihidrolisis

Satu gram serbuk kalus daun kamboja jepang direfluks menggunakan 10

ml campuran kloroform-metanol (1:10 v/v), selama 10 menit. Larutan

didinginkan dan disaring. Filtrat yang diperoleh kemudian ditambah asam

sulfat 5% (untuk menghidrolisis glikosida jantung menjadi glikon dan

aglikonnya) lalu diuapkan sampai kering. Residu yang diperoleh dilarutkan

dalam 2 ml kloroform-metanol (1:1 v/v) (Dwiatmaka dan Wulandari, 2005).

Ekstrak yang ditotolkan pada plat KLT 30-50μl (Wagner et al., 1984).

14. Pembuatan ekstrak daun kamboja jepang

Satu gram serbuk daun kamboja jepang direfluks menggunakan 10 ml

campuran kloroform-metanol (1:10 v/v), selama 10 menit. Larutan didinginkan

dan disaring, filtratnya diuapkan sampai kering. Residu yang diperoleh

dilarutkan dalam 2 ml kloroform-metanol (1:1 v/v) (Dwiatmaka dan

Wulandari, 2005) . Ekstrak yang ditotolkan pada plat KLT 30-50μl (Wagner

et al., 1984).

15. Pembuatan standar digitoksin

Sepuluh mg serbuk digitoksin dilarutkan dalam sepuluh ml metanol P

(Anonim, 1995).

16. Uji KLT ekstrak kalus, ekstrak daun kamboja jepang dan larutan

standar digitoksin.

Ekstrak kalus, ekstrak daun kamboja jepang dan larutan standar

digitoksin ditotolkan pada lempeng KLT dengan menggunakan fase diam


51

silica gel GF254 dan fase gerak berupa etil asetat-metanol-air (81 : 11 : 8 v/v)

dengan jarak pengembangan 8 cm. Deteksinya menggunakan sinar UV 254

dan 365 nm, serta disemprot dengan pereaksi Kedde dan SbCl3 (bercak

diamati di bawah sinar tampak) (Wagner et al., 1984).

E. Analisis Hasil

Analisis waktu inisiasi kalus dilakukan secara visual sebagai munculnya

titik-titik tumbuh kalus yang berwarna putih kekuningan untuk yang pertama

kalinya pada eksplan dengan menggunakan rata-rata waktu inisiasi kalus.

Analisis pertumbuhan kalus di dalam penelitian ini menggunakan dua

cara, yaitu :

1. Analisis menggunakan grafik pertumbuhan kalus berdasarkan data

penimbangan bobot kalus basah dengan umur kalus.

Pertumbuhan kalus diperoleh berdasarkan pertambahan bobot kalus basah

yakni dengan cara mengurangkan bobot kalus basah akhir dengan bobot kalus

basah awal. Data yang diperoleh digambar dalam grafik hubungan antara hari

pemanenan dan umur kalus serta ditentukan fase-fase pertumbuhannya.

2. Analisis menggunakan grafik pertumbuhan kalus berdasarkan data

biomassanya.

Data penimbangan bobot kalus basah yang diperoleh dari setiap

pemanenan kemudian dikeringkan hingga bobotnya konstan dan ditimbang.

Pertumbuhan kalus dihitung berdasarkan persentase pertambahan bobot

biomassa kalus. Kemudian dibuatkan grafik pertumbuhan kalus, dengan


52

menghubungkan antara pertambahan bobot kalus kering dan umur kalus. Data

profil pertumbuhan kalus berdasarkan biomassa kalus tersebut digunakan

sebagai data pendukung bagi pertumbuhan kalus berdasarkan pertambahan

bobot kalus basah.

Untuk mengetahui apakah dengan adanya penambahan zat pengatur

tumbuh (2,4-D dan FAP) selama dilakukannya proses kultur berpengaruh

terhadap kadar air yang terkandung di dalam kalus maka diperlukan perhitungan

persen susut pengeringan. Persen susut pengeringan kalus dihitung dengan

mengurangkan rerata bobot kalus basah akhir dengan rerata bobot kalus kering

dibagi dengan rerata bobot basah akhir dikali 100%.

Analisis kandungan kimia kalus, dalam hal ini glikosida jantung

dilakukan uji KLT dengan membandingkan bercak KLT ekstrak kalus kamboja

jepang dengan bercak KLT ekstrak daun tanaman asal dan larutan standar

digitoksin.


BAB IV

HASIL DAN PEMBAHASAN

A. Determinasi Tanaman Kamboja Jepang

Determinasi tanaman kamboja jepang dilakukan dengan mencocokkan

tanaman kamboja jepang yang digunakan dalam penelitian dengan ciri-ciri

morfologi tanaman kamboja jepang berdasarkan pustaka acuan Anonim (2006).

Berdasarkan hasil determinasi, diperoleh keterangan bahwa tanaman yang

digunakan dalam penelitian ini adalah tanaman kamboja jepang (Adenium obesum

(Forssk.) Roem. & Schult.) dari famili Apocynaceae.

B. Pemilihan dan Penanaman Eksplan

Bahan yang digunakan sebagai eksplan dalam penelitian ini adalah daun

tanaman kamboja jepang. Pemilihan daun tanaman kamboja jepang sebagai

eksplan karena daun memiliki jaringan parenkim yang akan berdediferensiasi,

yaitu proses perkembangan terbalik dari bagian tanaman atau organ tanaman

menjadi sekelompok sel yang terus-menerus membelah berupa kalus dalam media

tanam yang digunakan. Eksplan daun lebih mudah disterilisasi dalam proses

pengulturan tanaman tersebut.

Dalam penelitian ini, daun yang digunakan sebagai eksplan berasal dari

daun sehat dan segar yang terletak nomor 3 sampai 5 dari ujung batang atau

cabang karena daun pada daerah tersebut masih banyak memiliki jaringan

meristem yang mempunyai sifat totipotensi sehingga dapat tumbuh dan

berkembang. Daun yang terletak pada ujung batang atau cabang sel-selnya masih

53


http://en.wikipedia.org/wiki/Apocynaceae

54

terlalu muda dan tidak tahan dengan sterilisasi secara kimiawi menggunakan

desinfektan (campuran larutan hipoklorit dan Tween 80) sehingga dapat

mengakibatkan rusaknya jaringan dan gagalnya pembentukan kalus atau bahkan

matinya eksplan yang digunakan. Sedangkan pada pangkal batang atau cabang,

sel-sel daunnya sudah tidak aktif membelah karena hanya memiliki sedikit

jaringan meristem sehingga untuk membentuk kalus akan dibutuhkan waktu yang

sangat lama.

Eksplan yang digunakan dalam penelitian ini adalah daun karena

berdasarkan penelitian yang dilakukan oleh Nakamura et al (2000) ekstrak daun

tanaman Adenium obesum mengandung glikosida jantung yang memiliki efek

sitotoksik yang berpotensi sebagai antikanker. Oleh karena itu, diharapkan

penelitian ini menghasilkan kalus dari daun kamboja jepang yang mengandung

glikosida jantung yang sama dengan tanaman asalnya.

Ukuran eksplan sangat menentukan dalam proses pengulturan. Eksplan

yang terlalu besar memiliki resiko kontaminasi yang besar dan penyerapan nutrisi

yang kurang sempurna karena tidak semua bagian eksplan menempel pada media

sehingga kalus yang terbentuk hanya pada sebagian eksplan saja selebihnya

eksplan mulai menguning, menjadi coklat dan akhirnya mati. Sebaliknya, eksplan

yang terlalu kecil memiliki daya tahan yang kurang karena semakin kecil eksplan

semakin besar luka sehingga semakin besar derajat kerusakan eksplan. Percobaan

yang dilakukan peneliti menggunakan eksplan yang kecil menghasilkan kalus

yang lebih merata karena nutrisi dari medium tanam terdistribusi lebih cepat dan

merata. Sedangkan pada eksplan yang lebih besar, tidak semua bagian eksplan


55

tumbuh kalus karena distribusi nutrisi yang lebih lambat. Berdasarkan orientasi,

ukuran eksplan yang paling baik antara 0,5-1,0 cm.

Gambar 2. Eksplan dalam bentuk irisan melintang daun

Eksplan ditanam dalam bentuk irisan melintang daun dengan harapan

permukaan eksplan yang bersentuhan dengan media semakin luas sehingga nutrisi

dapat diserap dengan lebih baik oleh eksplan. Pengirisan dan pemindahan eksplan

ke dalam botol kultur dilakukan menggunakan pisau dan pinset yang telah

disterilkan dengan etanol 70%, dibakar, dan didinginkan untuk meminimalkan

resiko kematian eksplan karena panas. Selanjutnya eksplan diinkubasi dalam

ruang inkubator dengan suhu ruangan 18˚C serta disinari dengan lampu TL day

light 20 watt dengan ketinggian 40 cm. Suhu 18˚C adalah suhu yang ideal bagi

pertumbuhan eksplan dan kalus. Lampu TL day light berfungsi sebagai pengganti

sinar matahari karena eksplan membutuhkan penyinaran selama menumbuhkan

kalusnya dan ketinggiannya diatur (sekitar 40 cm) untuk menjaga agar radiasi

sinar dari lampu tidak menyebabkan kenaikan suhu ruangan yang dapat

mengganggu pertumbuhan kalus serta untuk menjaga supaya aerasi dapat berjalan

dengan baik.


56

C. Waktu Inisiasi Kalus

. Waktu inisiasi kalus adalah waktu yang diperlukan sejak penanaman

eksplan hingga saat kalus mulai terbentuk. Idealnya, waktu inisiasi kalus ditandai

dengan pertambahan bobot eksplan yang telah ditanam dari bobot awalnya.

Namun, berdasarkan pengamatan bobot media dan eksplan dari hari ke hari

menunjukkan terjadinya penurunan bobot eksplan dan media yang berbanding

lurus dengan umur penanaman. Penurunan bobot tersebut terjadi karena laju

pertumbuhan kalus lebih lambat daripada laju pengurangan kadar air media akibat

penguapan dan penyerapan air oleh eksplan. Oleh karena itu, penentuan waktu

inisiasi kalus tidak dapat diamati dengan cara tersebut.

Pada penelitian ini, penentuan waktu inisiasi kalus dilakukan secara

visual, yaitu dengan melihat munculnya titik-titik tumbuh kalus yang berwarna

putih kekuningan untuk yang pertama kalinya pada eksplan.

Tabel I. Waktu inisiasi kalus pada WPM 2

Perbandingan konsentrasi

ZPT (ppm) Jumlah botol

Waktu inisiasi kalus

(hari)

2 9

3 11

5 12

2,4-D : FAP

4 : 0

Rata-rata 11,1


57

Tabel II. Waktu inisiasi kalus pada WPM 3

Perbandingan konsentrasi

ZPT (ppm) Jumlah botol

Waktu inisiasi kalus

(hari)

6 8

3 9

1 11

2,4-D : FAP

2 : 1

Rata-rata 8,6

Ada dua media yang digunakan, yaitu WPM 2 dan WPM 3. WPM 2

adalah media Woody Plant Medium dengan konsentrasi 2,4-D 4 ppm. WPM 3

adalah media Woody Plant Medium dengan perbandingan konsentrasi 2,4-D dan

FAP (2 ppm : 1 ppm). Tabel di atas menunjukkan bahwa waktu inisiasi kalus

WPM 3 lebih cepat dibandingkan WPM 2. Kalus yang terbentuk pada WPM 3

pun lebih optimal dibanding WPM 2. Hal ini berarti variasi konsentrasi pada

WPM 3 adalah konsentrasi yang optimum untuk pertumbuhan kalus.

Kalus yang terbentuk paling cepat adalah pada irisan eksplan dekat ibu

tulang daun. Di antara berkas pengangkut pada ibu tulang daun tersusun jaringan

meristem sehingga mudah membentuk kalus. Selain itu, berkas pengangkut akan

memudahkan difusi zat hara dari medium tumbuh ke dalam jaringan parenkim

eksplan. Perbedaan terjadinya waktu inisiasi kalus disebabkan adanya

penambahan sitokinin dan auksin yang berbeda. Dalam kultur jaringan, auksin

berperan dalam pembesaran sel, sedangkan sitokinin berperan dalam pembelahan

sel (Hendaryono dan Wijayani, 1994; Mauseth, 1998).


58

Gambar 3. Inisiasi kalus

Waktu inisiasi kalus tidak dapat menggambarkan pertumbuhan kalus.

Proses orientasi yang dilakukan oleh peneliti menunjukkan bahwa walaupun

eksplan tanaman diperlakukan pada kondisi percobaan yang sama, namun eksplan

tanaman yang satu dan yang lainnya memiliki kepotensialan yang berbeda untuk

tumbuhnya kalus. Oleh karena itu, selain dilakukan penentuan waktu inisiasi kalus

secara visual perlu dilakukan juga analisis profil pertumbuhan kalus dengan

menimbang berat kalus selama pemanenan.

D. Subkultur dan Panen

Kalus yang dihasilkan dari eksplan harus disubkultur apabila kalus sudah

mulai cokelat yang artinya sebagian besar nutrisi pada media WPM sudah diserap

oleh kalus sehingga kalus membutuhkan media baru untuk pertumbuhannya.

Kalus yang dihasilkan pada penelitian ini berwarna putih kekuningan dan bersifat

freeable, yaitu antara satu sel dengan sel yang lain mudah dipisahkan.

Subkultur dilakukan setelah kalus berumur 36 hari. Apabila subkultur

terlambat dilakukan, massa kalus akan mati kehabisan nutrisi. Tanda-tanda kalus

kehabisan nutrisi dan harus segera dipindah ke dalam media yang baru adalah


59

warna kalus menjadi cokelat, media tumbuh mulai retak, dan selanjutnya sedikit

demi sedikit kalus akan mengering. Waktu 36 hari yang digunakan dalam

penelitian ini didapat dari hasil orientasi. Pada umur 36 hari kalus telah mulai

menunjukkan tanda kekurangan nutrisi.

Pada penelitian ini, kalus hanya disubkultur sekali sebelum dilakukan

pemanenan. Kalus yang dipanen adalah hasil dari subkultur pertama. Hal ini

dilakukan karena pada subkultur yang pertama eksplan sudah membentuk kalus

seluruhnya.

Bagian kalus yang disubkultur adalah bagian yang belum berubah warna

menjadi cokelat (mengalami “browning”) dan memiliki titik tumbuh yang baik

yaitu di bagian kalus terluar. Apabila menanam kalus yang sudah mengalami

“browning”, kalus tersebut tidak dapat tumbuh dan berkembang membentuk kalus

baru. Kalus bagian luar merupakan kalus yang masih tersusun oleh sel-sel

meristem sehingga dapat tumbuh dan berkembang membentuk kalus baru.

Bobot kalus awal sebelum subkultur tidak dapat ditimbang karena

adanya resiko kontaminasi. Oleh karena itu, jumlah kalus awal dikendalikan

dengan menyamakan ukuran kalus awal, yaitu ± 3–5 mm. Ukuran ini ditetapkan

dengan orientasi. Ukuran kalus awal yang lebih kecil menghasilkan pertumbuhan

yang lebih pesat karena difusi nutrisi lebih cepat dan lebih optimal.

Pemanenan dilakukan setiap 4 hari sekali selama 36 hari. Pemanenan ini

bertujuan untuk mengetahui profil pertumbuhan kalus dan untuk mendapatkan

kalus kering yang akan dianalisis kandungan kimianya. Pemanenan dilakukan

sampai hari ke-36, karena pada hari ke-28 hingga hari ke-36 kalus menunjukan


60

fase stasioner. Pada fase tersebut diharapkan kalus memiliki kandungan metabolit

sekunder berupa glikosida jantung yang optimum.

Gambar 4. Kalus daun kamboja jepang hasil subkultur

E. Profil Pertumbuhan Kalus

Pemanenan dilakukan untuk memastikan adanya penambahan bobot

kalus basah. Pada pengamatan bobot media terjadi penurunan bobot media setiap

harinya karena adanya penguapan media yang lebih besar daripada laju

pertumbuhan kalus sehingga sulit untuk melihat pertambahan bobot kalus basah.

Untuk mengatasi hal tersebut, dilakukan pemanenan setiap 4 hari sekali sehingga

didapatkan data pertambahan bobot kalus. Pertumbuhan dihitung sebagai selisih

bobot kalus basah akhir (n hari setelah penanaman) dengan bobot kalus basah

awal (bobot kalus pada saat ditanam). Pola pertumbuhan kalus mengikuti

persamaan kuva sigmoid dengan adanya fase lag, fase eksponensial, dan fase

stasioner.

Pada analisis profil pertumbuhan ini ada dua media yang digunakan.

Kedua media tersebut disebut sebagai WPM 2 dan WPM 3. WPM 2 adalah media

Woody Plant Medium dengan konsentrasi 2,4-D 4 ppm. WPM 3 adalah media

Woody Plant Medium dengan perbandingan konsentrasi 2,4-D dan FAP (2 ppm :

1 ppm).


61

Pola Pertumbuhan Kalus Daun Kamboja Jepang pada WPM 2

0

0.2

0.4

0.6

0.8

1

1.2

0 4 8 12 16 20 24 28 32 36 40

Hari Panen

Pert

umbu

han

Kal

us (g

)

Pertumbuhan Kalus

Gambar 5. Pola Pertumbuhan Kalus pada WPM 2

Pola pertumbuhan kalus hasil subkultur dapat memperlihatkan fase-fase

pertumbuhan kalus yaitu fase lag, fase eksponensial, dan fase stasioner. (i) Fase

lag, yaitu fase penyesuaian. Pada fase ini laju pertumbuhan kalus sangat kecil.

Pada WPM 2, fase lag dimulai pada hari ke-4 sampai hari ke-20. Pada fase lag,

terjadi penyesuaian diri daun kamboja jepang dengan lingkungan sehingga laju

pertumbuhan sangat kecil. Pada fase ini, kalus mulai tumbuh dan ditandai dengan

adanya bintik berwarna putih kekuningan pada bagian pelukaan daun. (ii) Fase

eksponensial, yaitu fase saat laju pertumbuhan kalus sangat besar. Pada fase ini

kalus dapat menyerap nutrisi dengan baik yang diperlukan untuk pembelahan sel.

Fase eksponensial terjadi pada hari ke-20 hingga hari ke-28. (iii) Fase stasioner,

yaitu fase saat laju pertumbuhan kalus mulai konstan. Pada fase ini nutrisi dalam

media mulai berkurang sehingga penyerapan nutrisi juga berkurang dan laju

pertumbuhan kalus sebanding dengan laju kematian. Pada WPM 2, fase stasioner

terjadi setelah hari ke-28. Pada fase stasioner inilah metabolit aktif berupa

glikosida jantung dihasilkan. Oleh karena itu, pemanenan kalus dapat dilakukan

mulai hari ke-28 untuk mendapatkan metabolit dalam jumlah optimum.


62

Pola Pertumbuhan Kalus Daun Kamboja Jepang pada WPM 3

00.20.40.60.8

11.21.41.6

0 4 8 12 16 20 24 28 32 36 40

Hari Panen

Pert

umbu

han

Kal

us (g

)

Pertumbuhan Kalus

Gambar 6. Pola Pertumbuhan Kalus pada WPM 3

Pola pertumbuhan kalus hasil subkultur dapat memperlihatkan fase-fase

pertumbuhan kalus, yaitu fase lag, fase eksponensial, dan fase stasioner. (i) Fase

lag, yaitu fase penyesuaian. Pada fase ini laju pertumbuhan kalus sangat kecil.

Pada WPM 3, fase lag dimulai pada hari ke-4 sampai hari ke-20. Pada fase lag,

terjadi penyesuaian diri daun kamboja jepang dengan lingkungan sehingga laju

pertumbuhan sangat kecil. Pada fase ini, kalus mulai tumbuh dan ditandai dengan

adanya bintik berwarna putih kekuningan pada bagian pelukaan daun. (ii) Fase

eksponensial, yaitu fase saat laju pertumbuhan kalus sangat besar. Pada fase ini

kalus dapat menyerap nutrisi dengan baik yang diperlukan untuk pembelahan sel.

Fase eksponensial terjadi pada hari ke-20 hingga hari ke-28. (iii) Fase stasioner,

yaitu fase saat laju pertumbuhan kalus mulai konstan. Pada fase ini nutrisi dalam

media mulai berkurang sehingga penyerapan nutrisi juga berkurang dan laju

pertumbuhan kalus sebanding dengan laju kematian. Pada WPM 3, fase stasioner

terjadi setelah hari ke-28. Pada fase stasioner inilah metabolit aktif berupa

glikosida jantung dihasilkan. Oleh karena itu, pemanenan kalus dapat dilakukan

mulai hari ke-28 untuk mendapatkan metabolit dalam jumlah optimum.


63

Perbandingan Pola Pertumbuhan Kalus

00.20.40.60.8

11.21.41.6

0 4 8 12 16 20 24 28 32 36 40

hari panen

pertu

mbu

han

(g)

wpm 3 wpm 2

Gambar 7. Perbandingan Pola Pertumbuhan Kalus Kedua Media

Gambar di atas menunjukkan bahwa kalus pada WPM 3 mempunyai

pertumbuhan yang lebih optimum (puncak yang lebih tinggi) dibanding WPM 2.

Hal ini berarti konsentrasi zat pengatur tumbuh yang ada dalam WPM 3 adalah

konsentrasi yang optimum untuk menumbuhkan kalus.

F. Susut Pengeringan Kalus

Kalus basah hasil pemanenan dikeringkan dan ditimbang dengan tujuan

untuk mengetahui banyak sedikitnya kandungan air dari kalus. Kandungan air

kalus dipengaruhi oleh zat pengatur tumbuh auksin yang dapat meningkatkan

permeabilitas sel terhadap air dan melunakkan dinding sel yang diikuti dengan

menurunnya tekanan dinding sel sehingga air dapat masuk ke dalam sel

(Hendaryono dan Wijayani, 1994). Semakin sedikit kandungan air dari kalus,

biomassa kalus semakin besar dan diharapkan kandungan metabolit sekundernya

(dalam hal ini glikosida jantung) semakin banyak. Untuk melihat pengaruh variasi

konsentrasi terhadap kandungan air kalus, dilakukan perbandingan susut

pengeringan dari kalus pada kedua media. Persen susut pengeringan adalah nilai

persen dari pengurangan rerata bobot kalus basah dengan rerata bobot kalus

kering dibagi dengan rerata bobot kalus basah.


64

Persen susut pengeringan kalus yang diperoleh dari hasil penelitian

ditunjukkan pada gambar 8. Persen susut pengeringan kalus meningkat secara

drastis pada hari ke-0 hingga hari ke-4. Hal tersebut menunjukkan bahwa kalus

menyerap lebih banyak air pada fase awal pertumbuhan kalus yaitu pada fase lag

akibat adanya penambahan zat pengatur tumbuh auksin (2,4-D) ke dalam media.

Adanya 2,4-D dapat menurunkan tekanan dinding sel sehingga air dapat masuk ke

dalam disertai dengan kenaikan volume sel, sehingga kalus membesar dan persen

susut pengeringan mengalami kenaikan. Selanjutnya persen susut pengeringan

kalus mulai konstan pada hari ke-4 hingga hari ke-36. Hal tersebut menunjukkan

bahwa kalus lebih banyak melakukan aktivitas pembelahan sel dibanding

menyerap air

Susut Pengeringan Kalus

0

20

40

60

80

100

0 4 8 12 16 20 24 28 32 36 40

Umur Kalus (hari)

Susu

t Pen

geri

ngan

(%)

kalus WPM 2 kalus WPM 3

Gambar 8. Perbandingan susut pengeringan kalus pada kedua media

Gambar di atas menunjukkan bahwa susut pengeringan kedua media

tidak berbeda jauh dan perbedaan konsentrasi ZPT, terutama auksin, pada kedua

media tidak mempengaruhi kandungan air dalam kalus. Hal ini diduga karena

kamboja jepang merupakan tanaman sukulen yang memiliki kemampuan untuk

menyimpan air.


65

G. Analisis Kandungan Kimia Kalus

Analisis ini digunakan untuk membuktikan adanya kandungan glikosida

jantung yang sama antara kalus daun kamboja jepang dengan tanaman asalnya

sehingga dapat dikembangkan untuk memproduksi metabolit sekunder.

Pada penelitian ini, terlebih dahulu dilakukan uji identifikasi fitokimia

kalus dengan menggunakan 2 macam pereaksi, yaitu uji dengan pereaksi Baljet

dan uji dengan pereaksi Raymond. Apabila hasil uji ini memberikan hasil yang

positif, akan terjadi warna jingga dan ungu yang menunjukkan adanya aglikon

kardenolida. Hasil penelitian menunjukkan hasil yang positif dengan kedua

pereaksi tersebut. Hal ini berarti ekstrak kalus daun kamboja jepang mengandung

aglikon kardenolida.

Selanjutnya, dilakukan analisis kandungan kimia kalus dengan metode

kromatografi lapis tipis (KLT). Fase diam yang digunakan pada penelitian ini

adalah silika gel GF254. Silika gel GF254 adalah silika gel yang mengandung bahan

pengikat Gibs dengan indikator yang dapat berfluoresensi pada panjang

gelombang 254 nm. Penggunaan fase diam ini karena glikosida jantung hanya

memiliki sedikit gugus kromofor yang apabila dideteksi di bawah UV 254 nm

pada silika gel tanpa indikator fluoresensi akan memberikan bercak dengan

intensitas warna yang lemah. Oleh karena itu digunakan silika gel GF254 yang

mengandung bahan yang dapat berfluoresensi.

Fase gerak yang digunakan adalah campuran etil asetat-metanol-air

dengan perbandingan 81 : 11 : 8 v/v. Fase gerak ini bersifat lebih non polar

dibandingkan dengan fase diam sehingga kromatografi ini merupakan


66

kromatografi fase normal. Pereaksi semprot yang digunakan dalam penelitian ini

adalah pereaksi Kedde dan pereaksi antimon-triklorida (SbCl3).

Glikosida jantung bersifat polar karena memiliki gugus gula (glikon).

Namun kepolaran fase diam yang digunakan dalam penelitian lebih tinggi

dibandingkan dengan glikosida jantung sehingga diperkirakan bercak (analit) akan

dapat bergerak mengikuti fase gerak. Dari pengamatan bercak hasil KLT,

didapatkan data yang tercantum dalam tabel III.

Tabel III. Hasil pengamatan KLT dengan fase diam silika gel GF254 dan fase gerak etil asetat - metanol - air (81 : 11 : 8 v/v )

Sinar UV 254 nm 365 nm

Pereaksi Kedde Pereaksi SbCl3Totolan Ekstrak

No. Ber-cak Rf Warna Rf Warna Rf Warna Rf Warna

A1 0,54 Ungu 0,54 Biru terang 0,53 Ungu gelap 0,41 Biru tua Standar

Digitok-sin A2 0,78 Ungu 0,78 Merah 0,74 Coklat

muda 0,66 Cokelat tua

BB1 0,21 Ungu - - - - 0,18 Kuning BB2 0,26 Ungu 0,25 0,26 Kuning 0,41 Cokelat BB3 0,50 Hijau muda - - 0,50 Hijau 0,49 Cokelat

BB4 0,55 Hijau muda - - 0,55 Hijau-kuning 0,53 Hijau-kuning

BB5 0,59 Hijau 0,58 Ungu gelap 0,59 Ungu 0,56 Biru BB6 0,73 Hijau 0,73 Ungu gelap 0,73 Kuning 0,69 Cokelat

Daun Kamboja Jepang

BB7 0,80 Hijau tua 0,80 Ungu gelap 0,79 Hijau tua 0,76 Hijau tua

C1 - - 0,15 Ungu gelap 0,14 Cokelat 0,41 Cokelat muda

Kalus Kamboja Jepang WPM 2 C2 - - - - - - 0,66 Cokelat

Kalus Kamboja Jepang

WPM 3

D1 0,68 Ungu 0,68 Kuning muda 0,68 Cokelat 0,68 Cokelat


67

Keterangan gambar : Rf

1

1

7

6

54 3

2

2

1

DCB A

Fase diam : silika gel GF254 1

Fase gerak : etil asetat-metanol-

air (81 : 11 : 8 v/v)

A : Standar Digitoksin

B : Ekstrak daun kamboja jepang

C : Ekstrak kalus daun kamboja

jepang WPM 2

D : Ekstrak kalus daun kamboja

jepang WPM 3

0 Deteksi : pereaksi Kedde

Jarak pengembangan : 8 cm

Gambar 9. Kromatogram ekstrak kalus daun kamboja jepang, ekstrak daun kamboja jepang tanaman asal dan standar digitoksin setelah disemprot

dengan pereaksi Kedde

Dari hasil penelitian di atas, masing-masing ekstrak kalus daun kamboja

jepang menghasilkan 1 bercak, sedangkan ekstrak daun kamboja jepang

menghasilkan 6 bercak, dan standar digitoksin menghasilkan 2 bercak setelah

lempeng disemprot dengan pereaksi Kedde.


68

Rf Keterangan gambar :

12

1

7

6

5 4 3

2

1

2

1

DCB A

1Fase diam : silika gel GF254

Fase gerak : etil asetat-metanol-

air (81 : 11 : 8 v/v)

A : Standar Digitoksin B : Ekstrak daun kamboja jepang C : Ekstrak kalus daun kamboja

jepang WPM 2 D : Ekstrak kalus daun kamboja

jepang WPM 3 0Deteksi : Antimon-triklorida

(SbCl3), pemanasan 100˚ C,

selama 6 menit


Gambar 10. Kromatogram ekstrak kalus daun kamboja jepang, ekstrak daun kamboja jepang tanaman asal dan standar digitoksin setelah disemprot

dengan pereaksi SbCl3

Dari hasil penelitian di atas, ekstrak kalus daun kamboja jepang WPM 2

menghasilkan 2 bercak, sedangkan ekstrak kalus daun kamboja jepang WPM 3

menghasilkan 1 bercak, ekstrak daun kamboja jepang menghasilkan 7 bercak, dan

standar digitoksin menghasilkan 2 bercak setelah lempeng disemprot dengan

pereaksi SbCl3 dan dipanaskan pada 100˚ C selama 6 menit.

Berdasarkan kromatogram hasil KLT di atas, terdapat masing-masing

satu bercak ekstrak kalus daun kamboja jepang, yaitu bercak no. 2 pada WPM 2

dan bercak no. 1 pada WPM 3, yang mempunyai harga Rf yang hampir sama


69

dengan bercak ekstrak daun kamboja jepang, yaitu bercak no. 6, dan bercak

standar digitoksin, yaitu bercak no. 2. Bila dilihat dari warna bercak, bercak

standar digitoksin no. 2 berwarna cokelat tua, sedangkan bercak ekstrak daun

kamboja jepang no. 6 dan ekstrak kalus daun kamboja jepang no. 2 (untuk WPM

2) dan no. 1 (untuk WPM 3) berwarna cokelat. Hal tersebut dikarenakan

konsentrasi kandungan glikosida pada ekstrak kalus daun kamboja jepang dan

ekstrak daun kamboja jepang hasil preparasi lebih kecil dibanding standar

digitoksin.

Dari hasil di atas dapat disimpulkan bahwa dengan sistem KLT yang

digunakan pada penelitian ini, diperoleh 1 senyawa pada ekstrak kalus daun

kamboja jepang yang mirip dengan senyawa yang terkandung di dalam ekstrak

daun kamboja jepang dan standar digitoksin yang diduga sebagai glikosida

jantung.

Selanjutnya dilakukan verifikasi untuk memastikan adanya glikosida

jantung dalam kalus daun kamboja jepang yang dihasilkan. Verifikasi dilakukan

dengan menghidrolisis ekstrak kalus daun kamboja jepang dengan asam sulfat

(H2SO4) 5% sehingga glikosida jantung akan terurai menjadi glikon (gugus gula)

dan aglikon (gugus non gula, dalam hal ini kardenolida). Sistem KLT (fase gerak

dan fase diam) yang digunakan sama dengan digunakan sebelumnya, yaitu dengan

fase diam silika gel GF254 dan fase gerak etil asetat-metanol-air (81 : 11 : 8 v/v).

Hasil yang diperoleh ditampilkan pada gambar 11 dan 12.


70

Tabel IV. Hasil pengamatan KLT ekstrak kalus WPM 2 dan WPM 3

UV 254 Totolan bercak

No. bercak Rf Warna Non-

hidrolisis A1 0,63 Ungu

BB1 0,49 Ungu WPM 2 hidrolisis

BB2 0,61 Ungu Non-

hidrolisis A1 0,65 Ungu

BB1 0,64 Ungu WPM 3 hidrolisis

BB2 0,71 Ungu

Rf

Keterangan gambar : 1

2

1

1

B A

Fase diam : silika gel GF254

Fase gerak : etil asetat-metanol-air

(81 : 11 : 8 v/v)

A : Ekstrak kalus daun kamboja jepang

WPM 2

B : Ekstrak kalus daun kamboja jepang

WPM 2 yang dihidrolisis dengan

H2SO4 5%

0 Pengamatan : UV 254 nm


Gambar 11. Kromatogram ekstrak kalus daun kamboja jepang WPM 2

Dari hasil di atas, ekstrak kalus daun kamboja jepang WPM 2


yang dihidrolisis dengan H2SO4 5% menghasilkan 2 bercak.


71

Rf Keterangan gambar :

1

21

Fase diam : silika gel GF254

Fase gerak : etil asetat-metanol-air

(81 : 11 : 8 v/v) 1

A : Ekstrak kalus daun kamboja jepang

WPM 3

B : Ekstrak kalus daun kamboja jepang

WPM 3 yang dihidrolisis dengan

H2SO4 5%

Pengamatan : UV 254 nm 0A B


Gambar 12. Kromatogram ekstrak kalus daun kamboja jepang WPM 3

Sama seperti pada WPM 2, ekstrak kalus daun kamboja jepang WPM 3


yang dihidrolisis dengan H2SO4 5% menghasilkan 2 bercak.

Bercak yang dihasilkan oleh ekstrak kalus daun kamboja jepang (WPM

2 dan WPM 3) diduga merupakan gikosida jantung. Sedangkan bercak yang

dihasilkan oleh ekstrak kalus daun kamboja jepang yang dihidrolisis dengan

H2SO4 5% diduga merupakan glikosida jantung yang sudah terurai menjadi glikon

dan aglikonnya. Glikon bersifat lebih polar dibanding aglikon. Sistem KLT yang

digunakan adalah fase normal, yaitu fase diam memiliki kepolaran yang lebih

tinggi dibanding fase gerak, akibatnya glikon akan terikat lebih kuat pada fase

diam sehingga Rf yang dihasilkan lebih kecil dibanding aglikon. Berdasarkan hal


72

tersebut, bercak B1 pada kromatogram WPM 2 dan WPM 3 adalah glikon,

sedangkan bercak B2 adalah aglikon.

Berdasarkan hasil-hasil di atas dapat disimpulkan bahwa kamboja jepang

memiliki peluang untuk dikembangkan secara kultur jaringan untuk menghasilkan

kalus yang mengandung senyawa metabolit sekunder, khususnya glikosida

jantung, dengan profil KLT yang mirip tanaman asalnya.


BAB V

KESIMPULAN DAN SARAN

A. Kesimpulan

1. Daun kamboja jepang dapat membentuk kalus dengan teknik kultur

jaringan menggunakan media tumbuh Woody Plant Medium (WPM)

secara optimal dengan zat pengatur tumbuh 2,4-D sebanyak 2 ppm dan

FAP sebanyak 1 ppm.

2. Pertumbuhan kalus daun kamboja jepang pada kedua media (WPM 2 dan

WPM 3) mengikuti pola pertumbuhan kurva sigmoid dengan adanya fase

lag (hari ke-4 sampai hari ke-20), fase eksponensial (hari ke-20 sampai

hari ke-28), dan fase stasioner (setelah hari ke-28).

3. Ekstrak kalus daun kamboja jepang memiliki profil KLT yang mirip

dengan ekstrak daun kamboja jepang tanaman asal sehingga diduga

mengandung glikosida jantung seperti tanaman asalnya.

B. Saran

Dari penelitian ini, perlu dilakukan penelitian lanjutan tentang :

1. Identifikasi jenis glikosida jantung yang terdapat dalam kalus daun

kamboja jepang yang ditumbuhkan dalam media WPM.

2. Analisis kuantitatif kandungan glikosida jantung kalus daun kamboja

jepang yang ditumbuhkan dalam media WPM.

73


74

DAFTAR PUSTAKA

Anonim. 1995. Farmakope Indonesia, edisi IV. Depkes RI : Jakarta, 315

Anonim, 2006a, Adenium, http://en.wikipedia.org/wiki/Adenium, diakses pada tanggal 27 November 2006

Anonim, 2006b, Desert Rose Adenium obesum, http://davesgarden.com/pf, diakses pada tanggal 22 November 2006

Atawodi, S.E. Comparative in vitro trypanocidal activities of petroleum ether, chloroform, methanol and aqueous extracts of some Nigerian savannah plants, Afr.J.Biotechnol. 4(2): 177-182

Beikram, dan A. Andoko. 2003. Mempercantik Penampilan Adenium. Agromedia Pustaka : Solo, 2, 12, 13

Brunetton, J. 1999. Pharmacognosy Phytochemistry Madicinal Plant, 2nd edition, terj. Caroline K. Hatton. Intercept Ltd. : New York, 721-734

Chandra, V.A, 2007, Profil Pertumbuhan dan Kandungan Glikosida Jantung Kalus Daun Kamboja Jepang (Adenium Obesum (Forssk.) Roem. & Schult.) dalam Media Tumbuh Gamborg dengan Variasi Konsentrasi Asam 2,4-Diklorofenoksiasetat dan 6-Furfurylaminopurine, Skripsi, Fakultas Farmasi USD, Yogyakarta, 64

Dicosmo, F., dan M. Misawa. 1995. Plant cell and tissue culture: Alternatives for metabolit production, Biotechnol, Adv.13(3): 425-453

Dixon, R.A. 1985. Plant Cell Culture, A practical Approach, IRL Press : Washington DC, 3-11

Dwiatmaka, Y., dan E. T. Wulandari. 2005. Panduan Praktikum Farmakognosi Fitokimia II. USD : Yogyakarta, 28-30


http://en.wikipedia.org/wiki/Adenium

http://davesgarden.com/pf

75

Farnsworth, N.R. 1966. Biological and Phytochemical Screening of Plants, Journal Of Pharmaceutical Sciencis, Vol. 55, No. 3, 260-262

Freiburghaus F., R. Kaminsky, M.H.N. Nkuna, dan R. Brun. 1996. Evaluation of African medicinal for their in vitro trypanocidal activity, J.Ethnopharmacol. 55: 1-11

George, E.F., dan P.D. Sherrington. 1984. Plant Propagation by Tissue Culture. Eastern Press : Reading, 301-310

Gritter, R.J., J.M. Bobbitt, dan A.E. Schwarting. 1991. Pengantar Kromatografi, edisi 2, terj. Kosasih Padmawinata. ITB : Bandung, 109

Harborne, J.B. 1996. Metode Fitokimia : Penuntun cara modern menganalisis tumbuhan, terbitan kedua. ITB : Bandung, 14-15, 147-156

Hartmann, H.T., D.E. Kester, dan F.T. Davies. 1990. Plant Propagation : Principles and Practices. Prentice-Hall, Inc. : New Jersey, 466, 471, 479-481, 500-503

Hendaryono, D.P.S., dan A. Wijayani. 1994. Teknik Kultur Jaringan. Kanisius : Yogyakarta, 18, 26-29, 59, 89-94

Jork, H., W. Funk, W. Fischer, dan H. Wimmer. 1990. Thin-Layer Chromatography : Reagent and Detection Methods, Vol. 1a, trans.: Frank & Jennifer A. Hampson. VCH Publishers : New York, 430-433

Katuuk, J.R.P. 1989. Teknik Kultur Jaringan dalam Mikropropagasi Tanaman. Depdikbud Direktorat Jendral Pendidikan Tinggi : Jakarta, 2-4, 90-94, 109

Mauseth, J.D. 1998. Botany : An Introduction to Plant Biology. Jones and Bartlett Publishers : Canada, 381-385

Melero, P., M. Medarde, dan Arturo San Feliciano. 2000. A Short Review on Cardiotonic Steroids and Their Aminoguanidine Analogues, Molecules, 5 : 51-81


76

Mgbojikwe, L.O., dan Z.S.C. Okoye. 2001. Acaricidal Efficacy of the Aqueous Stem Bark Extract of Adenium obesum on the Various Life Stages of Cattle Ticks, Nig.J.Exptl.Appl.Biol. Vol. 2, No. 1, 39-43

Misawa, M. 1994. Plant Tissue Culture : An Alternative for Production of Useful Metabolite. Food and Agriculture Organization : Rome, 1-78

Mulja, H.M., dan Suharman. 1995. Analisis Instrumental. Airlangga University Press : Surabaya, 223-227

Nakamura, M., M. Ishibashi, E. Okuyama, T. Koyano, T. Kowithayakorn, M. Hayashi, dan K. Komiyama. 2000. Cytotoxic Pregnanes from Leaves of Adenium obesum, Natural Medicines 54(3): 158-159

Ramachandra Rao, S., dan G.A. Ravishankar. 2002. Plant cell cultures: Chemical factories of secondary metabolites, Biotechnol, Adv 20:101-153

Ranger, E., 1996, Herbal Gram, The Jurnal of The American Botanical Council, http://www.herbalgram.org/youngliving/herbalgram/articleview.asp?a=64&p=Y, I. 36, 34 ,diakses pada tanggal 4 Oktober 2005

Robinson, Trevor. 1995. Kandungan Organik Tumbuhan Tinggi, terjemahan Kosasih Padmawinata, edisi 6. ITB Press : Bandung, 191-193

Salisbury, F.B., dan W.R. Cleon. 1995. Fisiologi Tumbuhan, jilid 3, diterjemahkan oleh Diah R., Lukman, dan Sumaryono. ITB : Bandung, 15, 151-152

Samuelsson, G. 1999. Drugs of Natural Origin, 4th Ed. Swedish Pharmaceutical Press : Sweden, 326

Santoso, U., dan F. Nursandi. 2002. Kultur Jaringan Tanaman, cetakan pertama, edisi pertama. Universitas Muhammadiyah : Malang, 1-2, 9, 115-120

Sastrohamidjojo, H. 2001. Kromatografi. Laboratorium Analisis Kimia Fisika Pusat UGM : Yogyakarta, 26-36


http://www.herbalgram.org/youngliving/herbalgram/articleview.asp?a=64&p=Y

http://www.herbalgram.org/youngliving/herbalgram/articleview.asp?a=64&p=Y

77

Soenanto, H. 2005. Pesona Adenium, Kanisius : Yogyakarta, 3,10-13

Stahl, E. 1969. Thin-Layer Chromatography : A Laboratory Handbook, Springer International Student Edition. Springer-Verlag : New York, 33-34

Suryowinoto, M. 1992. Budidaya In vitro : Terobosan dalam Teknologi. Laboratorium Kultur Jaringan Tanaman Fakultas Biologi UGM : Yogyakarta, 32-39

Wagner, H., S. Bladt, dan E.M. Zgainski. 1984. Plant Drug Analysis: A Thin Layer Chromatography Atlas, transl.: Th.A. Scoot. Springer-Verlag : Berlin, 195-223

Wetherell, D.F. 1982 Pengantar Propagasi Tanaman Secara In Vitro, diterjemahkan oleh dra. Koensoemardiyah. Avery Publishing Group Inc. : USA, 39-44

Wijaya, M., 2007, Profil Pertumbuhan dan Kandungan Glikosida Jantung dari Kalus Daun Kamboja Jepang (Adenium Obesum (Forssk.) Roem. & Schult.) dalam Media Tumbuh MS, Skripsi, Fakultas Farmasi USD, Yogyakarta, 66

Yamauchi, T., dan F. Abe. 1990. Cardiac glycosides and pregnanes from Adenium obesum (studies on constituents of Adenium. I)., Chem Pharm Bull, 38 (3) : 669-72

Yusnita. 2003. Kultur Jaringan : Cara Memperbanyak Tanaman Secara Efisien, cet. 1. Agromedia Pustaka : Jakarta, 1-2, 14

Yuwono, T. 2006. Bioteknologi Pertanian. Gadjah Mada University Press : Yogyakarta, 169


78

Lampiran 1

Surat Keterangan Determinasi


79

Lampiran 2

Foto-foto Hasil Penelitian

Gambar 12. Foto tanaman kamboja jepang (Adenium obesum (Forssk.) Roem. &

Schult.)

Gambar 13. Foto kalus daun kamboja jepang siap panen


80

DCBA

Gambar 14. Foto KLT dengan fase diam silika gel GF254, fase gerak etil asetat-metanol-air (81 : 11 : 8 v/v), pada pengamatan dengan sinar tampak

Keterangan: Bercak : A. Standar digitoksin B. ekstrak daun kamboja jepang C. ekstrak kalus daun kamboja jepang WPM 2 D. ekstrak kalus daun kamboja jepang WPM 3


81

DCBA

Gambar 15. Foto KLT dengan fase diam silika gel GF254, fase gerak etil asetat-metanol-air (81 : 11 : 8 v/v), pada pengamatan dengan sinar UV 254 nm



82

A B C D

Gambar 16. Foto KLT dengan fase diam silika gel GF254, fase gerak etil asetat-metanol-air (81 : 11 : 8 v/v), pada pengamatan dengan sinar UV 365 nm

DCBA



83

DCBA

Gambar 17. Foto KLT dengan fase diam silika gel GF254, fase gerak etil asetat-metanol-air (81 : 11 : 8 v/v), deteksi penampak bercak penyemprot pereaksi Kedde Keterangan: Bercak : A. Standar digitoksin B. ekstrak daun kamboja jepang C. ekstrak kalus daun kamboja jepang WPM 2 D. ekstrak kalus daun kamboja jepang WPM 3


84

DCB A

Gambar 18. Foto KLT dengan fase diam silika gel GF254, fase gerak etil asetat-metanol-air (81 : 11 : 8 v/v); deteksi penampak bercak penyemprot antimon-

triklorida (SbCl3), 100˚C selama 6 menit Keterangan: Bercak : A. Standar digitoksin B. ekstrak daun kamboja jepang C. ekstrak kalus daun kamboja jepang WPM 2

D. ekstrak kalus daun kamboja jepang WPM 3


85

B A

Gambar 19. Foto KLT WPM 2 dengan fase diam silika gel GF254, fase gerak etil asetat-metanol-air (81 : 11 : 8 v/v), pada pengamatan dengan sinar UV 254 nm

Keterangan: Bercak : A. ekstrak kalus daun kamboja jepang WPM 2

B. ekstrak kalus daun kamboja jepang WPM 2 yang dihidrolisis dengan H2SO4 5%


86

A B

Gambar 20. Foto KLT WPM 3 dengan fase diam silika gel GF254, fase gerak etil asetat-metanol-air (81 : 11 : 8 v/v), pada pengamatan dengan sinar UV 254 nm

Keterangan: Bercak : A. ekstrak kalus daun kamboja jepang WPM 3

B. ekstrak kalus daun kamboja jepang WPM 3 yang dihidrolisis dengan H2SO4 5%


87

Lampiran 3

Data-data Penelitian

Tabel IV. Hasil penimbangan bobot kalus dengan pemanenan pada WPM 2

botol no.

hari panen

ke-

bobot media

bobot media+ kalus

bobot kalus basah awal

rata-rata bobot kalus basah awal

bobot wadah

bobot wadah+

kalus basah

bobot kalus basah akhir

rata-rata

bobot basah akhir

Partum-buhan kalus

5 4 82.2342 82.2995 0.0653 15.9726 16.0862 0.1136 13 4 80.3951 80.4599 0.0648 15.4312 15.5446 0.1134 25 4 85.7121 85.7783 0.0662

0.0654 15.6855 15.7997 0.1142

0.1137 0.0483

15 8 85.8813 85.9146 0.0333 15.9729 16.1033 0.1304 9 8 89.1534 89.2053 0.0519 15.4404 15.5277 0.0873

23 8 81.3747 81.4212 0.0465 0.0439

15.6913 15.7661 0.0748 0.0975 0.0536

10 12 80.3646 80.4278 0.0632 15.9725 16.1666 0.1941 1 12 82.7543 82.8189 0.0646 15.4309 15.6305 0.1996

24 12 83.3151 83.3772 0.0621 0.0633

15.6853 15.8747 0.1894 0.1944 0.1311

17 16 79.8187 79.9060 0.0873 15.9726 16.2160 0.2434 12 16 82.4150 82.4862 0.0712 15.4323 15.6433 0.2110

6 16 80.0356 80.1078 0.0722 0.0769

15.6875 15.9414 0.2539 0.2361 0.1592

14 20 84.7639 84.8046 0.0407 15.9727 16.1747 0.2020 26 20 82.2016 82.2447 0.0431 15.4414 15.6586 0.2172

3 20 86.5505 86.5930 0.0425 0.0421

15.6848 15.8968 0.2120 0.2104 0.1683

4 24 89.2675 89.3130 0.0455 15.9724 16.4404 0.4680 27 24 83.3756 83.4351 0.0595 15.4421 15.9494 0.5073 20 24 85.1228 85.1561 0.0333

0.0461 15.6845 16.0970 0.4125

0.4626 0.4165

16 28 83.1944 83.2800 0.0856 15.9725 17.1441 1.1716 21 28 85.2353 85.3170 0.0817 15.4419 16.5504 1.1085

7 28 81.3459 81.4387 0.0928 0.0867

15.6846 16.8101 1.1255 1.1352 1.0485

19 32 81.6969 81.8185 0.1216 15.9731 17.2906 1.3175 8 32 85.1758 85.2756 0.0998 15.4424 16.5565 1.1141

22 32 84.9134 84.9665 0.0531 0.0915

15.6850 16.2090 0.5240 0.9852 0.8937

2 36 87.3150 87.4033 0.0883 15.9737 16.4201 0.4464 18 36 83.4343 83.5478 0.1135 15.4427 16.4553 1.0126 11 36 85.7798 85.8174 0.0376

0.0798 15.6851 16.3921 0.7070

0.7220 0.6422

Keterangan: WPM 2 adalah media tumbuh Woody Plant Medium dengan penambahan 4

ppm 2,4-D


88

Tabel V. Penentuan susut pengeringan pada WPM 2

botol no.

hari panen

ke-

bobot wadah

bobot wadah+

kalus basah


rata-rata bobot kalus basah akhir

bobot wadah+

kalus kering

bobot kalus kering akhir

rata-rata bobot kalus kering akhir

% susut pengering

-an

5 4 15.9726 16.0862 0.1136 15.9809 0.0083 13 4 15.4312 15.5446 0.1134 15.4419 0.0107 25 4 15.6855 15.7997 0.1142

0.1137 15.6953 0.0098

0.0096 91.5592

15 8 15.9729 16.1033 0.1304 15.9828 0.0099 9 8 15.4404 15.5277 0.0873 15.4469 0.0065

23 8 15.6913 15.7661 0.0748 0.0975

15.6965 0.0052 0.0072 92.6154

10 12 15.9725 16.1666 0.1941 15.9897 0.0172 1 12 15.4309 15.6305 0.1996 15.4490 0.0181

24 12 15.6853 15.8747 0.1894 0.1944

15.7018 0.0165 0.0173 91.1164

17 16 15.9726 16.2160 0.2434 15.9922 0.0196 12 16 15.4323 15.6433 0.2110 15.4505 0.0182

6 16 15.6875 15.9414 0.2539 0.2361

15.7076 0.0201 0.0193 91.8255

14 20 15.9727 16.1747 0.2020 15.9887 0.0160 26 20 15.4414 15.6586 0.2172 15.4593 0.0179

3 20 15.6848 15.8968 0.2120 0.2104

15.7020 0.0172 0.0170 91.9043

4 24 15.9724 16.4404 0.4680 16.0249 0.0525 27 24 15.4421 15.9494 0.5073 15.5023 0.0602 20 24 15.6845 16.0970 0.4125

0.4626 15.7362 0.0517

0.0548 88.1539

16 28 15.9725 17.1441 1.1716 16.0392 0.0667 21 28 15.4419 16.5504 1.1085 15.5023 0.0604

7 28 15.6846 16.8101 1.1255 1.1352

15.7484 0.0638 0.0636 94.3945

19 32 15.9731 17.2906 1.3175 16.0785 0.1054 8 32 15.4424 16.5565 1.1141 15.5293 0.0869

22 32 15.6850 16.2090 0.5240 0.9852

15.7264 0.0414 0.0779 92.0930

2 36 15.9737 16.4201 0.4464 16.0094 0.0357 18 36 15.4427 16.4553 1.0126 15.5338 0.0911 11 36 15.6851 16.3921 0.7070

0.7220 15.7424 0.0573

0.0614 91.5005


ppm 2,4-D


89

Tabel VI. Hasil penimbangan bobot kalus dengan pemanenan pada WPM 3

botol no.

hari panen

ke-

bobot media

bobot media+kalus

bobot kalus basah awal

rata-rata bobot kalus basah awal

bobot wadah

bobot wadah+

kalus basah


rata-rata

bobot basah akhir

Partum-buhan kalus

13 4 87.3704 87.4290 0.0586 15.4245 15.5767 0.1522 5 4 85.7341 85.7938 0.0597 15.5342 15.6873 0.1531

19 4 86.2345 86.2929 0.0584 0.0589

15.3101 15.4618 0.1517 0.1523 0.0934

7 8 87.4038 87.4733 0.0695 15.4251 15.5742 0.1491 26 8 84.0312 84.0995 0.0683 15.5411 15.7600 0.2189 14 8 88.1356 88.2084 0.0728

0.0702 15.3250 15.5528 0.2278

0.1986 0.1284

4 12 81.8438 81.9158 0.0720 15.4242 15.6753 0.2511 10 12 83.3756 83.4514 0.0758 15.5341 15.7866 0.2525 17 12 87.2125 87.2810 0.0685

0.0721 15.3113 15.5616 0.2503

0.2513 0.1792

12 16 84.0655 84.0907 0.0252 15.4240 15.5910 0.1670 6 16 87.7751 87.8222 0.0471 15.5457 15.7299 0.1842

20 16 83.0134 83.0973 0.0839 0.0521

15.3226 15.6872 0.3646 0.2386 0.1865

11 20 84.5527 84.6048 0.0521 15.4235 15.6408 0.2173 8 20 85.6123 85.6591 0.0468 15.5339 15.7295 0.1956

21 20 81.4726 81.5282 0.0556 0.0515

15.3221 15.5857 0.2636 0.2255 0.1740

3 24 83.8551 83.9470 0.0919 15.4234 15.5792 0.1558 23 24 80.3157 80.4092 0.0935 15.5340 16.3611 0.8271 18 24 82.0598 82.1546 0.0948

0.0934 15.3235 16.1736 0.8501

0.6110 0.5176

9 28 81.8960 82.0078 0.1118 15.4238 15.7365 0.3127 25 28 87.3059 87.4636 0.1577 15.5341 17.3126 1.7785 27 28 86.1135 86.4296 0.3161

0.1952 15.3237 18.1750 2.8513

1.6475 1.4523

24 32 83.3756 83.6198 0.2442 15.4240 16.9564 1.5324 1 32 85.0453 85.1289 0.0836 15.5347 15.6754 0.1407

16 32 82.1123 82.2558 0.1435 0.1571

15.3229 17.9887 2.6658 1.4463 1.2892

22 36 89.1899 89.3617 0.1718 15.4237 16.4621 1.0384 2 36 80.8751 81.129 0.2539 15.5343 17.2136 1.6793

15 36 81.4433 81.5075 0.0642 0.1633

15.3238 15.8362 0.5124 1.0767 0.9134


ppm 2,4-D dan 1 ppm FAP.


90

Tabel VII. Penentuan susut pengeringan pada WPM 3

botol no.

hari panen

ke-

bobot wadah

bobot wadah+

kalus basah


rata-rata bobot kalus basah akhir

bobot wadah +

kalus kering

bobot kalus kering akhir

rata-rata bobot kalus kering akhir

% susut pengering-

an

13 4 15.4245 15.5767 0.1522 15.4376 0.0131 5 4 15.5342 15.6873 0.1531 15.5484 0.0142

19 4 15.3101 15.4618 0.1517 0.1523

15.3217 0.0116 0.0130 91.4880

7 8 15.4251 15.5742 0.1491 15.4353 0.0102 26 8 15.5411 15.7600 0.2189 15.5559 0.0148 14 8 15.3250 15.5528 0.2278

0.1986 15.3405 0.0155

0.0135 93.2024

4 12 15.4242 15.6753 0.2511 15.4442 0.0200 10 12 15.5341 15.7866 0.2525 15.5553 0.0212 17 12 15.3113 15.5616 0.2503

0.2513 15.3311 0.0198

0.0203 91.9087

12 16 15.4240 15.5910 0.1670 15.4382 0.0142 6 16 15.5457 15.7299 0.1842 15.5616 0.0159

20 16 15.3226 15.6872 0.3646 0.2386

15.3522 0.0296 0.0199 91.6597

11 20 15.4235 15.6408 0.2173 15.4413 0.0178 8 20 15.5339 15.7295 0.1956 15.5504 0.0165

21 20 15.3221 15.5857 0.2636 0.2255

15.3404 0.0183 0.0175 92.2247

3 24 15.4234 15.5792 0.1558 15.4369 0.0135 23 24 15.5340 16.3611 0.8271 15.6035 0.0695 18 24 15.3235 16.1736 0.8501

0.6110 15.4016 0.0781

0.0537 91.2111

9 28 15.4238 15.7365 0.3127 15.4473 0.0235 25 28 15.5341 17.3126 1.7785 15.7187 0.1846 27 28 15.3237 18.1750 2.8513

1.6475 15.4534 0.1297

0.1126 93.1654

24 32 15.4240 16.9564 1.5324 15.5566 0.1326 1 32 15.5347 15.6754 0.1407 15.5460 0.0113

16 32 15.3229 17.9887 2.6658 1.4463

15.5228 0.1999 0.1146 92.0763

22 36 15.4237 16.4621 1.0384 15.5016 0.0779 2 36 15.5343 17.2136 1.6793 15.6619 0.1276

15 36 15.3238 15.8362 0.5124 1.0767

15.3648 0.0410 0.0822 92.3687


ppm 2,4-D dan 1 ppm FAP.


91

Lampiran 4

Komposisi Woody Plant Medium

Makronutrien

Ammonium nitrat (NH4NO3) 400 mg/l

Kalsium nitrat-tetrahidrat (Ca(NO3)2.4H2O) 576 mg/l

Kalsium klorida-dihidrat (CaCl2.2H2O) 96 mg/l

Magnesium sulfat-heptahidrat (MgSO4.7H2O) 370 mg/l

Kalium dihidrogen fosfat (KH2PO4) 170 mg/l

Mikronutrien

Mangan (II) sulfat tetrahidrat (MnSO4.4H2O) 22,3 mg/l

Seng sulfat heptahidrat (ZnSO4.7H2O) 8,6 mg/l

Asam borat (H3BO3) 6,2 mg/l

Besi (II) sulfat heptahidrat (FeSO4.7H2O) 27,8 mg/l

NaFeEDTA 37,3 mg/l

Vitamin

Mio-inositol 100 mg/l

Thiamin HCl 1 mg/l

Asam nikotinat 0,5 mg/l

Piridoksin HCl 0,5 mg/l

(Hendaryono dan Wijayani, 1994)


92

BIOGRAFI PENULIS

pasangan Bapak Petrus Sugi

Penulis skripsi berjudul “Profil Pertumbuhan dan

Kandungan Glikosida Jantung Kalus Daun

Kamboja Jepang (Adenium obesum (Forssk.)

Roem. & Schult.) dalam Woody Plant Medium

dengan Variasi Konsentrasi Asam 2,4-

Diklorofenoksiasetat dan 6-Furfurylaminopurine”

bernama Lukas Eko Widyasmoro. Penulis dilahirkan

di Yogyakarta pada tanggal 29 Maret 1984 dan

merupakan anak pertama dari tiga bersaudara dari

yanto dan Ibu Hilaria Widyaksi. Penulis menempuh

pendidikan di SMP Maria Immaculata Marsudirini Yogyakarta (1996-1999),

SMU Kolese de Britto Yogyakarta (1999-2002), dan melanjutkan pendidikan ke

Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma Yogyakarta pada tahun 2002.

Selama di Fakultas Farmasi, penulis aktif di kegiatan-kegiatan kepanitiaan antara

lain Tiga Hari Temu Akrab Farmasi (Titrasi) tahun 2003 dan 2004, Inisiasi Sanata

Dharma (Insadha) tahun 2005, dan Pekan Ilmiah Mahasiswa Farmasi Indonesia

(PIMFI) tahun 2005. Selain itu, penulis juga pernah mengikuti pelatihan “Safety

in Laboratory” yang diadakan atas kerja sama antara Universitas Sanata Dharma

dan PT. Merck Tbk tahun 2007. Penulis juga aktif dalam UKF Sepak Bola

Fakultas Farmasi “Squadra Viola”.


plagiat merupakan tindakan tidak terpuji - core.ac.uk · kata kunci: daun kamboja jepang, glikosida...

Documents