piroplasmosis pre extremadura

UNIVERSIDAD DE EXTREMADURAFACULTAD DE VETERINARIADepartamento de Medicina y Sanidad Animal Parasitologa y Enfermedades Parasitarias

Epidemiologa de la Piroplasmosis Equina en el Caballo de Pura Raza Espaola de Extremadura

Trabajo financiado por la Consejera de Educacin, Ciencia y Tecnologa Junta de Extremadura (Ref. IPR00A017)

Rafael Gonzlez Sevilla Trabajo de Grado Cceres, 2005

UNIVERSIDAD DE EXTREMADURAFACULTAD DE VETERINARIADepartamento de Medicina y Sanidad Animal Parasitologa y Enfermedades Parasitarias


V B

Fdo. Prof. Dr. Miguel ngel Habela Martnez-Estllez.

Trabajo de Grado presentado por el Licenciado en Veterinaria Rafael Gonzlez Sevilla. Cceres, Octubre de 2005.

D. MIGUEL NGEL HABELA MARTNEZ-ESTLLEZ, Profesor Titular de Parasitologa y Enfermedades Parasitarias, Departamento de Medicina y Sanidad Animal de la Facultad de Veterinaria de la Universidad de Extremadura, Director del presente Trabajo de Grado titulado: "Epidemiologa de la Piroplasmosis Equina en el Caballo de Pura Raza Espaola de Extremadura", del que es autor el Licenciado en Veterinaria D. RAFAEL GONZLEZ SEVILLA, INFORMA Que dicho Trabajo de Investigacin ha sido realizada por el mencionado Licenciado, bajo mi direccin, y que cumple las condiciones exigidas por la normativa vigente para su presentacin y defensa.

Fdo. Prof. Dr. Miguel ngel Habela Martnez-Estllez.

Cceres, a 24 de Octubre de 2005.

A mis padres...

ORDEN APA/3319/2002, de 23 de Diciembre, por la que se establecen las normas zootcnicas del caballo de Pura Raza Espaola.

"El caballo de Pura Raza Espaola es la raza equina autctona ms representativa que ha experimentado en los ltimos aos un gran auge y que se encuentra difundida a nivel mundial, por lo que se hace imprescindible garantizar su preservacin por parte del Estado, como garante de un patrimonio gentico que no puede sufrir deterioro alguno, evitando posibles riesgos de dispersin de criterios que pudieran comprometer su adecuada conservacin." Arias CaeteBOE nm. 313, Martes 31 Diciembre 2002, pg. 46330.

NDICE

NDICE1.- INTRODUCCIN 2.- REVISIN BIBLIOGRFICA 2.1.- EL CABALLO DE PURA RAZA ESPAOLA (PRE) 2.1.1.- La Raza 2.1.1.1.- Historia del PRE 2.1.1.2.- Morfologa del PRE 2.1.1.3.- Aptitud del PRE 2.1.2.- Sobre el PRE en Espaa 2.1.2.1.- Censo del PRE en Espaa 2.1.2.2.- Distribucin del PRE en Espaa 2.1.2.3.- Situacin econmica del PRE en Espaa 2.1.3.- Sobre el PRE en Extremadura 2.1.3.1.- Censo del PRE en Extremadura 2.1.3.2.- Distribucin del PRE en Extremadura 2.1.3.3.- Situacin econmica del PRE en Extremadura 2.2.- LA PIROPLASMOSIS EQUINA (PE) 2.2.1.- Resea Histrica 2.2.2.- Etiologa de la PE 2.2.3.- Clnica de la PE 2.2.4.- Diagnstico de la PE 2.2.4.1.- Diagnstico Clnico 2.2.4.2.- Mtodos directos 2.2.4.3.- Mtodos indirectos 2.2.4.4.- Diagnstico Diferencial 2.2.5.- Tratamiento 2.2.6.- Epidemiologa de la PE en Espaa y situacin actual en Extremadura 2.2.7.- Vectores Potenciales de PE en Espaa 2.2.8.- Vectores Potenciales de PE en Extremadura, dinmica poblacional y periodos de riesgo de infeccin 3.- OBJETIVOS 4.- MATERIAL Y MTODOS 4.1.- DISEO EXPERIMENTAL 4.1.1.- Estudio de la regin: Situacin, extensin y divisin administrativa 4.1.2.- Edafologa, Vegetacin y Climatologa del rea de estudio 4.1.3.- Toma y procesado de las muestras de Ixdidos 4.1.4.- Identificacin de Ixdidos 4.1.5.- Toma y procesado de muestras de sangre y suero 4.1.6.- Diagnstico Directo de la PE: Microscopa ptica 4.1.7.- Diagnstico Serolgico de la PE: Inmunofluorescencia Indirecta (IFI) 4.2.- DISEO Y ELABORACIN DE ENCUESTAS SOBRE EL GRADO DE CONOCIMIENTO DE LA PE Y SUS REPERCUSIONES ECONMICAS ENTRE EL SECTOR PRODUCTOR DE PRE DE EXTREMADURA 4.3.- ANLISIS ESTADSTICO DE LOS RESULTADOS 3 9 9 9 9 11 13 13 13 14 14 15 15 15 15 16 16 16 19 20 20 21 23 24 24 25 26 26 33 37 37 37 37 38 39 40 41 41

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5.- RESULTADOS 5.1.- IXDIDOS RECOLECTADOS 5.1.1.- Ixdidos identificados 5.1.2.- Distribucin de los ixdidos identificados en Extremadura 5.1.3.- Dinmica Poblacional de los ixdidos identificados en Extremadura 5.2.- SEROPREVALENCIA DE LA PE EN EXTREMADURA 5.2.1.- Seroprevalencia de la PE en la regin 5.2.2.- Seroprevalencia de la PE por provincias 5.2.2.1. Seroprevalencia de la PE en la provincia de Cceres 5.2.2.2. Seroprevalencia de la PE en la provincia de Badajoz 5.2.3.- Seroprevalencia de la PE segn el sexo 5.2.4.- Seroprevalencia de la PE segn la capa 5.2.5.- Seroprevalencia de la PE segn la edad 5.3.- ANLISIS DE RESPUESTAS OBTENIDAS A LA ENCUESTA SOBRE LA PE REALIZADA ENTRE EL SECTOR PRODUCTOR DE PRE DE EXTREMADURA 6.- DISCUSIN

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6.1.- SOBRE LOS IXDIDOS IDENTIFICADOS EN EL PRE DE EXTREMADURA 79 6.2.- SOBRE LA SEROPREVALENCIA Y DISTRIBUCIN DE LA PE EN EL PRE DE EXTREMADURA 81 6.3.- SOBRE LA ENCUESTA AL SECTOR PRODUCTOR DE PRE DE EXTREMADURA 84 7.- CONCLUSIONES 8.- RESUMEN 9.- SUMMARY 10.- FUENTES CONSULTADAS 10.1.- BIBLIOGRAFA 10.2.- PGINAS WEB 11.- AGRADECIMIENTOS 12.- ANEXO 12.1.- ABREVIATURAS 12.2.- FICHA DE REMISIN DE MUESTRAS Y FICHA DE CAMPO 12.3.- TABLA - REGISTRO DE MUESTRAS ANALIZADAS Y RESULTADOS 12.4.- CARTAS DE COLABORACIN 12.5.- PUBLICACIONES 12.5.1.- Piroplasmosis equina: Conocimiento y grado de concienciacin de los productores de caballos Pura Raza Espaola 12.5.2.- Aportaciones al conocimiento de las especies de garrapatas de los quidos y su distribucin en Espaa 89 93 97 101 101 109 113 117 117 119 121 141 147 149

1.- INTRODUCCIN

INTRODUCCIN

1.- INTRODUCCIN

El sector productor equino es uno de los ms arraigados y con ms tradicin en nuestro pas,e incluso la imagen que se proyecta de Espaa ms all de nuestras fronteras va ligada a la figura del caballo. En Espaa, la aficin a los caballos ha pasado de ser considerada elitista a ocupar en la actualidad una posibilidad al alcance de casi todos, como se refleja en el nmero de Licencias Deportivas Nacionales para la prctica de la equitacin, que mantiene una tendencia constante al alza desde el ao 2000. La aclamada reapertura del Hipdromo de la Zarzuela en Madrid, demuestra que el sector hpico espaol cuenta con el apoyo de un numeroso pblico que apuesta por el futuro de una actividad ldica tradicional, representativa de nuestro pas. La retransmisin de estos acontecimientos deportivos por parte de los medios de comunicacin beneficia notablemente la diseminacin de nuestra cultura tradicional ecuestre. Por tanto, se constata que junto al creciente inters en torno a la actividad hpica nacional, existe tambin un entramado productivo de gran importancia econmica. Nuestros quidos autctonos gozan de un merecido reconocimiento histrico y mundial, encontrndose en la actualidad en pleno auge tanto en calidad, como en cantidad de efectivos. Los ganaderos, productores de distintas razas puras de equinos en nuestro pas, han alcanzado un alto grado de profesionalizacin en los ltimos aos. En estos momentos, Espaa ocupa un lugar destacado entre los pases de la UE y segn el indicador de cultura ecuestre, basado en el ratio de caballos por cada 1000 habitantes, se sita en sexto lugar con 6,6 c/h, por delante de pases como Blgica, Suecia o Dinamarca (www.europe.eu.int/ comm/eurostat). En Espaa se cran caballos de varias razas puras, siendo la ms importante y abundante, adems de ser nuestra raza autctona, el caballo de Pura Raza Espaol (PRE), que contaba en Diciembre de 2001 con un censo de 75.389 caballos registrados (Annimo, 2003). Es necesario resaltar la falta de ordenacin y caracterizacin que ha sufrido el sector equino espaol por parte de la Administracin Pblica, valga de ejemplo que el ltimo censo equino se realizara en el ao 1986. Posteriormente, el MAPA publica el primer Estudio de Caracterizacin del sector equino, en Diciembre de 2003. Ante esta precaria administracin del inmenso, aunque potencial valor del sector, tanto econmico como socio-cultural, resulta contradictorio afirmar que se ha notado un considerable ascenso de la poblacin caballar nacional en los ltimos aos, en contra de la tendencia a la baja que este censo haba experimentado hasta 1999. La sanidad de nuestros quidos, fuente de recursos econmicos y socio-culturales para nuestra regin y nuestro pas, debe estar igualmente controlada y potenciada. La sanidad animal debe ser objetivo primordial a tener en cuenta en los futuros planes de mejora del sector, tal como se recoge en el Plan Nacional de Ordenacin y Fomento del Sector Equino Espaol. La salud de nuestro ganado se reflejar en la salud de las explotaciones, permitiendo el libre comercio tanto interior, como de exportacin (Annimo, 2003).

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R.G.Sevilla, 2005

Debido a la amplia distribucin de los ixdidos potencialmente vectores de la Piroplasmosis Equina (PE), sta representa un grave problema tanto para el comercio de quidos como para la prctica de los deportes ecuestres a nivel internacional, tal y como ocurri en las olimpiadas de Montreal, donde se impidi la participacin de caballos procedentes de Francia, Italia, Blgica, Suiza, Polonia y Chile, debido a que eran portadores inaparentes de la enfermedad (Dorchies, 1976). La Piroplasmosis Equina (PE), conocida tambin como Babesiosis, es una enfermedad parasitaria transmitida por garrapatas que afecta tanto a caballos y asnos como a sus hbridos (Nuttal, 1908; Catcott, 1972; Quiroz, 1990). Dos especies de protozoos hemticos pertenecientes a los gneros Theileria (Laveran, 1901) y Babesia (Nuttal y cols., 1912), del Phyllum Apicomplexa, son los agentes etiolgicos causantes de PE: Theileria equi (sin. Babesia equi) y Babesia caballi (B. caballi), siendo la primera de ellas ms patgena (Levine, 1973). Theileria equi (T. equi), presenta en su ciclo biolgico una fase previa de multiplicacin en clulas linfoides donde tiene lugar la formacin de esquizontes, similares a los observados en rumiantes (Stagg y cols., 1981). En su desarrollo intraeritrocitario tambin se diferencia de B. caballi tanto por su tamao (2-3 m de longitud frente a los 3-5 m de B. caballi), como por la frecuente aparicin de cuatro merozoitos formando una "Cruz de Malta". Aparte de stas, existen otras caractersticas diferenciales evolutivas, biolgicas y de resistencia o sensibilidad frente a babesicidas, entre ambas especies, que han conducido a que recientemente se aceptara el cambio de encuadre taxonmico, incluyndose actualmente en el gnero Theileria (Holbrook, 1969; Schein y cols., 1981; Katzer y cols., 1998; Mehlhorn y cols., 1998). Enfermedad anemizante de curso febril, la PE se transmite mediante vectores artrpodos de la familia Ixodidae (garrapatas duras). Se caracteriza por la aparicin de sintomatologa digestiva y respiratoria, si bien, su desarrollo y consecuencias varan dependiendo del agente etiolgico causal y del estado inmunitario de la especie hospedadora (quidos). Por lo general, la infeccin por T. equi tiene consecuencias ms graves debido a su mayor patogenicidad y las frecuentes recidivas. Los caballos infectados permanecen como portadores de por vida, ya que no se conoce ningn tratamiento esterilizante. La distribucin geogrfica de la enfermedad est asociada a la de los ixdidos vectores, encontrndose ampliamente distribuida por todo el mundo, pero principalmente en pases con climatologa templada, tropical y subtropical (Schein, 1988). Mientras que pases del Centro y Norte de Europa, as como Japn, Canad, Australia y la mayor parte de Estados Unidos se consideran libres de PE, esta enfermedad se sigue diagnosticando con frecuencia en pases del Sur de Europa y en gran parte de Asia, frica y Sudamrica. En Espaa se han descrito casos de PE provocados por ambas especies por separado y tambin, con cierta frecuencia, asociadas provocando infecciones mixtas. La reglamentacin internacional y ms concretamente el Cdigo Zoosanitario Internacional (CZI), recoge las limitaciones de movimientos a los que se han de someter los quidos enfermos y portadores asintomticos de PE (Annimo, 1987). Esta enfermedad supone por tanto una barrera a la comercializacin de nuestros caballos a pases como Estados Unidos, Canad, Japn, Australia, y tambin a Mxico, Brasil, Chile y Ecuador, donde ltimamente han adoptado medidas sanitarias restrictivas en lo que a este proceso respecta (Dorchies, 1976; Friedhoff, 1982). Algunos pases pueden restringir las importaciones a los periodos de inactividad de garrapatas. Por otra parte, esta reglamentacin internacional, recoge artculos referidos a la importacin temporal de caballos de competicin seropositivos.4

INTRODUCCIN

Para stos exige:

Pasaporte (carta genealgica). Certificado Zoosanitario Internacional (Annimo, 1987), donde se especifique la ausencia de signos clnicos y el tratamiento con ixodicidas 7 das antes del embarque.

La Oficia Internacional de Epizootas incluy a la PE en la lista "B" de enfermedades que deben ser objeto de informes anuales. As, la Ley de Epizootas y el Cdigo Zoosanitario Internacional disponen de articulado especfico para la PE, si bien, es la reglamentacin internacional la ms estricta, pues limita los movimientos de quidos enfermos y portadores asintomticos a determinados pases importadores. En este sentido, el CZI especifica la necesidad de acompaar un Certificado Zoosanitario Internacional donde se indique:

Ausencia de signos clnicos el da del embarque. Seronegatividad 30 das antes del embarque. Realizacin del tratamiento con ixodicidas 7 das antes del embarque.

La autoridad veterinaria del pas de destino, velar por la permanencia de estos animales en reas bajo control de garrapatas y realizar exmenes peridicos para verificar la ausencia de stas. Dados los altos ndices de incidencia y prevalencia de la PE en nuestros quidos, y conscientes de la falta de informacin y recursos para el estudio de esta enfermedad entre los ganaderos del sector equino del pas, nuestro grupo de investigacin solicit ayudas para la realizacin de un Proyecto de Investigacin en el marco de los programas del I Plan Regional de Investigacin y Desarrollo Tecnolgico de Extremadura, cuya convocatoria se hizo pblica en el DOE n 56 del ao 2000. Con la concesin de dichas ayudas obtuvimos la financiacin para ejecutar este proyecto sobre Epidemiologa de la Piroplasmosis Equina en Extremadura: aislamiento de cepas autctonas de T.equi y B.caballi, cultivo in vitro, estandarizacin de tcnicas de diagnstico serolgico, estudio de garrapatas implicadas en la transmisin" (Habela, y cols., 1998), y de este modo, conocer la extensin del problema en nuestra regin. El presente Trabajo de Grado emana directamente de la consecucin de dicho proyecto. Entre los propsitos planteados para la consecucin del presente estudio, estaba el encuestar al sector productor sobre las repercusiones que la PE tiene sobre la rentabilidad de sus explotaciones. Los resultados expuestos en este trabajo emanan directamente de la consecucin de dicho proyecto. Del mismo modo, los resultados obtenidos en la encuesta realizada entre el sector extremeo productor de PRE sobre el grado de conocimiento y afectacin de la PE en sus explotaciones, as como las conclusiones alcanzadas tras el anlisis de los mismos, fueron publicados en la revista Equinus (Anexo 12.5).

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2.- REVISIN BIBLIOGRFICA


R. Gonzlez Sevilla, 2005

2.- REVISIN BIBLIOGRFICA

2.1.- EL CABALLO DE PURA RAZA ESPAOLA 2.1.1.- La Raza Segn la Orden APA/3319/2002 del 23 de Diciembre (Annimo, 2002), por la que se establecen las normas zootcnicas del caballo PRE, ste de debe reunir las siguientes caractersticas: Caractersticas generales: Eumtrico, mesolneo y de perfil subconvexo a recto. De conformacin proporcionada, notable armona general y de gran belleza, con apreciable dimorfismo sexual. Aires brillantes, enrgicos, cadenciosos y elsticos, con apreciables elevaciones y extensiones y acusada facilidad para la reunin. De brioso temperamento, noble, dcil y equilibrado, con gran capacidad de aprendizaje. Para el criador de PRE, ste es un animal polivalente, dcil, sensible, inteligente y vivaz. Las labores de seleccin y conservacin ejercidas durante siglos de crianza de nuestros caballos, quedan demostradas ante las innumerables aptitudes y la extraordinaria belleza de la que est dotado el PRE actual. El caballo espaol, y concretamente el PRE de Extremadura y sus yeguadas, estn siendo reconocidas dentro y fuera de nuestras fronteras, siendo en los ltimos aos frecuentemente laureadas en los concursos morfolgicos y de doma, organizados a nivel nacional e internacional por las ms importantes asociaciones de PRE. En la actualidad, el PRE representa a la raza caballar pura ms importante y con ms efectivos a nivel nacional y regional, en el caso concreto de Extremadura. 2.1.1.1.- Historia del PRE Durante milenios, antes de que el hombre nmada se volviera sedentario, pastor y agricultor, el caballo no fue ms que una pieza de caza que serva de alimento. En la Edad de Bronce, el hombre descubri que el caballo podra convertirse en algo ms que un alimento y comenz a usarlo como herramienta de trabajo. As, el caballo se convirti en un elemento vital de una nueva era. Segn algunos indicios, el caballo no tuvo su origen en Europa, sino que provino de alguna apartada regin oriental para su utilizacin domstica. Est cientficamente demostrado que hubo asentamientos humanos en todo el territorio extremeo desde la prehistoria y ello conlleva la cra y uso del caballo con fines agrcolas, abasto, etc., (Annimo, 1979). Las primeras referencias escritas sobre el caballo hispnico fueron recogidas por clebres escritores de la Antigedad como Tito Livio, Varrn, Columela, etc. Virgilio, refirindose al caballo hispnico, escribe en las Gergicas: Cabeza alta y fina; grupa flexible y ancha; los colores ms apreciados son el castao y el tordo; tiene ancho y musculoso pecho y densa crin que agitada, cae sobre su espalda derecha (www.elpre.com).9

REVISIN BIBLIOGRFICA

EL CABALLO DE PURA RAZA ESPAOLA

Sabemos, desde Czekanowski, que el perfil frontal es el carcter de mayor heredabilidad. Esto debera ser cierto hasta nuestros das, si bien, no es difcil comprobar en algunos PRE actuales que ciertas caractersticas morfolgicas no coinciden con este estereotipo (Aparicio Macarro, 1979). La cra del caballo espaol en nuestras tierras se remonta al pueblo bero, extendindose rpidamente su fama, fuera de los contornos de la Pennsula Ibrica. En el Museo de Arte Romano de Mrida se guardan las esculturas de un caballo en mrmol blanco y otra en bronce de caballos beros, demostrando a muchos hiplogos que desde esa poca estara fijado el prototipo del caballo PRE actual. Los romanos lo utilizaron como "mquinas de guerra" y para sus juegos recreativos. La caballera era el cuerpo militar predominante en los ejrcitos persas y griegos, e incluso en las hordas brbaras anteriores a nuestra era. Es en esta poca cuando aparece el primer caballo famoso de la historia, Bucfalo, el caballo de Alejandro Magno, a lomos del cual conquist todo un imperio (Figura n 1). Ricardo Corazn de Len, en el siglo XII, combate en Tierra Santa y entra en Chipre montando un caballo espaol.

Figura n 1.- Representacin de Alejandro Magno a lomos de Bucfalo

Los califas rabes consideraron a estos caballos el regalo ms preciado que encontraron en la Pennsula, valorndolos ms an que a los suyos, y as lo utilizaron en sus relaciones con otros reinos. Sin embargo, hasta la Edad Media (gracias al desarrollo de las Ordenanzas Reales para la cra de caballos de "casta fina"), no se consideraban como un importante patrimonio nacional. De esta manera, las dehesas extremeas se ven favorecidas y reciben privilegios concedidos por los Reyes Catlicos para la cra de caballos en su jurisdiccin. El Emperador Carlos V concedi otros privilegios y en el reinado de Felipe II se concluy la portada en piedra que daba acceso a la llamada "Dehesa de las Yeguas" de Trujillo. En 1579, Felipe II estableci los primeros Registros de Caballos. Su sucesor, Felipe IV, encomienda en 1659 la direccin del fomento de la Cra Caballar a la Real Junta de Caballeras. Carlos II, en 1695, dispuso la creacin de un Registro General de Caballos y establece el uso obligatorio de la marca de fuego (un hierro distinto para cada ganadero). En 1789, Carlos IV crea la Ordenanza sobre el Rgimen y Gobierno de la Cra de Caballos en Espaa.

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En 1796, separa la Real Junta de Caballeras del Consejo del Reino, agregndole la Direccin de la Escuela de Veterinarios. Bajo el reinado de este mismo monarca, en 1798, se crea el primer Registro Caballar de Extremadura y la Cerca de Potriles. En 1847 se crea la Direccin General de Agricultura, Industria y Comercio para el fomento de la cra caballar y es en 1928 cuando se instaura el Registro Matrcula de Caballos de PRE, siendo desde entonces, la principal fuente de datos del sector. La ganadera de PRE ms antigua segn esta fuente, es la de Granda (Trujillo, Cceres). En 1991, haba 41 ganaderas PRE inscritas en Badajoz y 19 en Cceres (Reyes, 1992). Hasta llegar a nuestros das, el caballo ha seguido siendo protagonista de muchas facetas de la historia de la humanidad, desde las competiciones medievales, hasta llegar a las actuales escuelas de equitacin y sin olvidar a los afanados y sacrificados caballos que todava ayudan en las labores del campo a muchos agricultores, a los ganaderos de lidia, en la Fiesta de los Toros, etc. En resumen, la historia de Espaa va ligada a la figura del caballo, sus cualidades y aptitudes han sido suficientemente valoradas no slo como animal de trabajo (agricultura, ganadera, transporte, blicas, etc.) si no tambin como animal de ocio (silla, deportes, faenas de campo, turismo rural...), y fuente de innumerables recursos tanto econmicos como socioculturales. 2.1.1.2.- Morfologa del PRE La Orden Ministerial reguladora de la raza PRE, que desarrolla el Real Decreto 1133/2002 de 23 de diciembre, establece que los caballos inscritos en el libro genealgico deben reunir los siguientes requisitos (Annimo, 2002),:

Figura n 2.- Ejemplar PRE estndar

A) Caractersticas morfolgicas (Figura n 2): 1.- Cabeza: Proporcionada, de longitud media, enjuta, de perfil fronto-nasal de subconvexo a recto. Orejas de tamao mediano, muy mviles, bien insertadas y paralelas. Frente ligeramente ancha y discretamente abombada. Ojos vivos, triangulares y de mirada expresiva, con arcadas orbitarias que no sobresalgan de su perfil. Cara relativamente larga y moderadamente estrecha (ms en las hembras), subconvexa o recta y descarnada. Nariz acuminada, de suave y curvada proyeccin desde la cara.

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Ollares rasgados y no salientes. Carrillada amplia, descarnada y con borde en largo y discreto arco. 2.- Cuello: De tamao y longitud medios, ligeramente arqueado y musculado (menos, en las hembras). Bien insertado en la cabeza y tronco. Crin abundante y sedosa. 3.- Tronco: Proporcionado y robusto. Cruz discretamente ancha y destacada, en suave prolongacin con la lnea dorsal. Dorso consistente, musculado y cerca de la rectitud. Lomo corto, ancho, musculado y algo arqueado, bien unido al dorso y a la grupa. Grupa de longitud y anchura media, redondeada y ligeramente en declive. Cola de nacimiento bajo y pegada entre isquiones, poblada de abundantes, largas y a menudo onduladas cerdas. Pecho de buena amplitud y profundo. Costillares arqueados, largos y profundos. Ijares extendidos y vientre correcto. 4.- Miembros torcicos o anteriores: Espalda, larga, musculada, oblicua y elstica. Brazo fuerte y de buena inclinacin. Antebrazo potente, de longitud media. Rodilla desarrollada y enjuta. Caa de longitud proporcionada y tendn marcado y amplio. Menudillo enjuto, destacado y con escasa cerneja. Cuartillas de buena conformacin, inclinacin y direccin, de longitud proporcionada. Casco compacto, de dimensiones equilibradas, bien desarrollado. 5.- Miembros pelvianos o posteriores: Muslo musculado, nalga ligeramente arqueada y musculada, pierna larga, corvejn fuerte, amplio y neto. Las regiones situadas por debajo de la articulaciones tarsianas tendrn idnticas caractersticas a las sealadas para las extremidades anteriores. En ambas, los miembros han de ser correctos. B) Caractersticas fanerpticas: Pelo fino y corto, son dominantes las capas tordas y castaas y admisibles otras. Ello supone la admisin de cualquier capa, y en concreto, la readmisin de las capas alazana y la pa, excluidas como propias del caballo PRE por orden ministerial en el ao 1970. C) Defectos: Adems de los generales de la especie, se incluyen: 1) Generales: Falta de desarrollo, carencia de armona y desproporcin entre regiones y dimensiones corporales. Sern considerados defectos graves los perfiles frontonasales cncavos en sus diversas gradaciones y los perfiles ultraconvexos, objetables los convexos. 2) Regionales: Cabeza excesivamente voluminosa o demasiado pequea. Orejas grandes, cadas, convergentes y/o de movimientos anormales. Frente demasiado ancha o plana. Arcadas orbitarias salientes. Ojos saltones o redondos, despigmentados en su entorno. Nariz cuadrada y ancha. Ollares redondos y/o despigmentados. Carrillada gruesa y de perfil acodado. Picn, belfo, labios cados, despigmentaciones. Cuello demasiado corto o excesivamente grueso, de ciervo o invertido, inestable o con tendencia a caerse, de mala insercin con el tronco o empastado en su unin con la cabeza. Tronco estrecho y poco profundo. Cruz baja o no destacada. Dorso plano, ensillado o excesivamente ascendente hacia atrs (alto de palomillas). Lomo hundido, de carpa o poco musculado. Pecho estrecho y sobre todo hundido. Costillares aplanados en su tercio superior o excesivamente arqueados. Grupa excesivamente redondeada, horizontal, doble o partida, en pupitre, derribada y quebrada, de perfil anteroposterior discontinuo.12



Cola de insercin alta, despegada, o en trompa, con melanomas debajo de ella, en ano o perin. Monrquidos o criptrquidos. Miembros mal aplomados, fundamentalmente izquierdo, estevado, trascorbo y zancajoso. Cuartillas demasiados largas o excesivamente cortas y verticales. Cascos pequeos o de mala conformacin. 3) Movimientos: Poco elevados, irregulares, poco extensos y especialmente el campaneo. 4) Defectos descalificantes: La presencia de gato o gatillo (acumulo graso en exceso) cuando est vencido, cuello invertido o de ciervo, monrquidos, criptrquidos y la medida de alzada a la cruz tomada con bastn, que se considerar excluyente para los animales que no alcancen el mnimo de 1,50 metros en las hembras y 1,52 metros en los machos. 2.1.1.3.- Aptitud del PRE Del PRE, se pude decir que es un animal tan noble como bello y sus estilizadas lneas corresponden a su bro y desparpajo. Caracteres comportamentales y temperamento: Animales rsticos, sobrios, equilibrados y resistentes. Sufridos y enrgicos. Nobles y dciles. Facilidad para el aprendizaje y para adaptarse a diversos servicios y situaciones. Caracteres funcionales y aptitudes: Grandes aptitudes para realizar diversas funciones, de fcil respuesta a las ayudas del jinete y de boca agradable, por lo que resultan obedientes, de fcil compenetracin con el jinete y de extraordinaria comodidad. Su principal servicio es para la silla, con gran facilidad para la doma (de alta escuela, clsica y vaquera), para el rejoneo, acoso y derribo, para el enganche, para el manejo de ganado, actividades de campo y otras disciplinas ecuestres. Sus movimientos son giles, elevados, extensos, armnicos y cadenciosos. Especial predisposicin para la reunin y los giros sobre el tercio posterior. Paladio, en el siglo IV, considera como belleza que "de la mayor calma se excite y de la mayor velocidad se pare", caractersticas primordiales del caballo PRE y que an son valoradas en las pruebas de seleccin de reproductores PRE y en la clasificacin de los concursos de doma (Annimo, 2002). 2.1.2.- Sobre el PRE en Espaa 2.1.2.1.- Censo del PRE en Espaa De acuerdo con los datos aportados por las diferentes comunidades autnomas se puede apreciar un notable ascenso de la poblacin equina espaola en los ltimos aos. Segn el Servicio de Produccin Animal de la Junta de Andaluca, por ejemplo, el censo en esta Comunidad se increment en un 31% entre los aos 1995-1999. Para el conjunto del pas, el nmero total de caballos se cifra en unos 260.000, lo cual supone en Espaa un ratio de 6,6 caballos por cada mil habitantes, representando nuestro censo equino el 11,9% del total europeo, segn datos del Instituto Europeo de Estadstica (www.europe.eu.int/comm/eurostat).

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Sin embargo, segn datos el MAPA el censo equino en Espaa se cifr en 424.000 cabezas en el ao 2003 (Annimo, 2003), situndonos en el sexto lugar entre los pases de la UE. El ltimo censo de razas equinas nacionales, realizado por el Servicio de Cra Caballar del Ministerio de Defensa, en diciembre de 2001, sita al PRE como la raza equina pura que cuenta con ms efectivos en nuestro pas, con 73.389 ejemplares inscritos (Annimo, 2001). 2.1.2.2.- Distribucin del PRE en Espaa En Espaa, la cra caballar est gestionada mediante los Libros Genealgicos de Razas Puras, siendo el PRE, como ya hemos dicho, la ms importante. Otras razas como el Pura Sangre Ingls (PSI), Pura Raza rabe (Pra), Trotador Espaol (TE), etc, tambin cuentan con un alto nmero de efectivos. En cuanto a la distribucin del censo equino nacional por comunidades autnomas, Andaluca se coloca en primer lugar con 156.667 cabezas en 2003, seguida de Castilla y Len con una quinta parte del nmero de quidos andaluces: 30.152. Por nmero de explotaciones equinas, es Galicia la que ocupa el primer lugar a nivel nacional, por delante de Andaluca, con 28.386 explotaciones y un total de 29.293 quidos censados en 2003 (Annimo, 2003). 2.1.2.3.- Situacin econmica del PRE en Espaa Debido a la complejidad de estructuras y relaciones econmicas establecidas durante las ltimas pocas en este sector, resulta muy compleja la evaluacin y cuantificacin de las producciones y los gastos derivados de la explotacin equina en nuestro pas. Hemos de tener en cuenta que la produccin equina implica un riesgo aadido a los de cualquier otra empresa, pues se trabaja con un producto vivo, siendo por tanto sumamente necesaria, a juicio del MAPA, una profunda revisin de estos datos a nivel nacional. Con el Plan Nacional de Ordenacin y Fomento del Sector Equino Espaol (Annimo, 2003), el Ministerio de Agricultura ha desarrollado un exhaustivo estudio de caracterizacin del sector en Espaa, con el objetivo de analizar aquellos parmetros que lo definen (censos, producciones, estructura sectorial, aspectos econmicos,...), y poder llegar a realizar un diagnstico certero de sus fortalezas y debilidades. Segn la encuesta realizada en el 2003 por el MAPA a las ganaderas equinas de razas puras, los gastos fijos anuales de estas explotaciones supusieron una media de 39.917 (75,9% de los gastos totales de produccin), mientras que los variables fueron de 12.689 (24,1% de los costes conjuntos), lo cual representa, segn datos de la citada encuesta, un coste unitario por animal de 2.509 .

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2.1.3.- Sobre el PRE en Extremadura 2.1.3.1.- Censo del PRE en Extremadura El censo de caballos de PRE en Extremadura en el ao 1996 estaba cifrado en 3.631 cabezas, colocando a nuestra regin entre las primeras de Espaa. Sin embargo, al contrario que ocurre en el resto de Espaa y segn el MAPA, en el caso de Extremadura y otras comunidades como Galicia, los censos se han mantenido constantes o incluso han descendido respecto a censos anteriores. Un total de 1.376 yeguas cubiertas y 706 sementales fueron registrados por los servicios de cubricin tanto en paradas oficiales como particulares para el ao 1996. 2.1.3.2.- Distribucin del PRE en Extremadura Extremadura cuenta con 16.607 explotaciones equinas segn el Censo Agrario de 1999. Estas explotaciones, y los 23.520 ejemplares que tienen censados, estn ampliamente distribuidos por toda la geografa regional, si bien, la provincia de Badajoz cuenta con ms del doble de caballos PRE censados. Sin embargo, en la provincia de Cceres, existen ncleos con alta densidad de caballos / habitantes, como es el caso de Trujillo. En 1991, haba 41 ganaderas PRE inscritas en Badajoz y 19 en Cceres. El veterinario equino A. Gragera, hacindose eco de los datos publicados en 1997 por la revista "El Caballo", expuso durante su intervencin en el Congreso Internacional del caballo de PRE celebrado en Trujillo, que los efectivos de PRE de Extremadura se distribuan geogrficamente de la siguiente manera (Tabla n 1), (Gragera, 1998):Tabla n 1: Distribucin provincial por sexos de los efectivos PRE de Extremadura*:

Hembras Cceres: Badajoz: Extremadura:*Datos de 1997

Machos 565 1.224 1.120

Total 1.129 2.502 3.631

564 1.278 1.376

2.1.3.3.- Situacin econmica del PRE en Extremadura Los ganaderos extremeos han mantenido la tradicin de la cra caballar, llegando ahora a su momento de mayor expansin. Segn hemos visto, el censo de PRE de Extremadura corresponde a unos 3.631 ejemplares, entre yeguas y caballos, los cuales suponen una produccin en trminos econmicos de unos seis millones de euros, que sigue siendo una cantidad relativamente pequea, pues la facturacin global directa del sector para Espaa fue de 76,5 millones de Euros en 2001, segn el MAPA (Annimo, 2003). A estos datos, habra que sumarle las ganancias indirectas producidas por el sector. En la actualidad, el turismo rural y en concreto el turismo ecuestre, est siendo cada vez ms solicitado por la sociedad urbana. Los planes de regularizacin y mejora, proyectados por la Administracin para el fomento y desarrollo del sector, as como los programas de conservacin y mejora de razas puras auguran un ptimo desarrollo econmico en el sector productor de PRE de Extremadura.

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LA PIROPLASMOSIS EQUINA

2.2.- LA PIROPLASMOSIS EQUINA 2.2.1.- Resea Histrica Babes, en 1888, describi a este parsito hemtico en el ganado vacuno: Babesia bovis, (Babes, 1888), siendo posteriormente detectado en numerosos vertebrados tanto domsticos como salvajes (Kuttler, 1988). Desde la primera vez que Laveran (1901), describiera una parasitacin por Babesia equi (Theileria equi, Laveran, 1901), en caballos de Sudfrica, la existencia de este protozoo ha sido constatada en quidos de gran cantidad de pases de frica, Asia, Europa y Amrica (Tenter, 1986; Tenter y cols., 1988; Friedhoff y cols., 1990; De Waal, 1992; Barbosa, 1995). En Espaa, el primer caso de babesiosis fue descrito por Salvans Bonet (1928), y del mismo modo, se trataba de una infeccin causada en rumiantes por B. bovis. Son escasos los datos referidos a la deteccin de piroplasmosis en otras especies por esta fecha. Es en 1934 cuando se produce la primera denuncia de un caso de Nuttaliosis equina (T. equi). Almarza Herranz describe este caso en la provincia de Badajoz, donde diez aos despus Bueso Gmez vuelve a diagnosticar otro caso de PE en una mula (1944). Posteriormente, Cordero del Campillo describira el que parece ser el primer caso de PE en la provincia de Len (1974). Martnez Gmez, en ese mismo ao, describe el primer caso detectado en Crdoba. En el ndice Catlogo de Zooparsitos Ibricos de 1980 se constata la presencia de ambas especies (T. equi y B. caballi), en Badajoz, Cceres, Ciudad Real, Crdoba, Len, Navarra y Toledo (Cordero del Campillo, 1980). Un ao despus, Romero Rodrguez y Garca Fernndez describen en la Revista Ibrica de Parasitologa los primeros casos diagnosticados en la provincia de Granada (1981). Desde que en 1984 comenzara a funcionar el Servicio Pblico de Diagnstico de la Unidad de Parasitologa (Dpto. de Medicina y Sanidad Animal), de la Facultad de Veterinaria de la UEx, se ha venido comprobando la presencia tanto de B. caballi como de T. equi en Extremadura, estando ampliamente distribuidas, tal y como se reflej en el estudio epidemiolgico realizado sobre quidos de la regin (Habela y cols., 1989). Estos autores han denunciado tambin la presencia del parsito prcticamente en todo el pas, tras el anlisis de muestras en el servicio de diagnstico mencionado (Habela y cols., 1998). 2.2.2.- Etiologa de la PE Transmitidos mediante la picadura de garrapatas (Thompson, 1969; Catcott y cols., 1972; Quiroz, 1990), los agentes causales de esta patologa son protozoos hemticos pertenecientes a los gneros Babesia y Theileria (B. caballi y T. equi; Levine, 1973). Capaces de infectar a los quidos, estos piroplasmidos pueden actuar aislados o asociados, siendo en cualquier caso T. equi el ms patgeno (Ristic y cols., 1964). El encuadre taxonmico de esta ltima especie ha sido frecuentemente cuestionado. Las diferencias evolutivas y biolgicas descritas entre ambas especies han conducido a que se aceptara entre la comunidad cientfica internacional el cambio en la denominacin de Babesia equi por Theileria equi (Mehlhorn, 1998).

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Morfologa y ciclo biolgico de Theileria equi (Figura n 3):

Figura n 3.- Ciclo biolgico de T. equi : 1) Esporozoito inyectado por la garrapata en el hospedador equino. 2) Esquizonte en linfocito. 3) Esquizonte en fase tardia y formacin de Merozoitos. 4) Merozoito libre. 5) Reproduccin intraeritroctica ("Cruz de Malta"). 6-10) Succin de sangre infectada y desarrollo de microgametos en el intestino de la garrapata. 11-17) Formacin del Cigoto y migracin a las glndulas salivares tras mudar de fase: Larva-Ninfa-Adulto. 18) Esporogonia: formacin de Esporozoitos infectantes que migran a las glndulas salivares, siendo inyectados en el hospedador vertebrado en el que se alimente la garrapata, cerrando as su ciclo biolgico. Tomado de Melhorn y Schein, 1998.

Theileria equi (sin. Babesia equi, Piroplasma equi, Nuttallia equi, Achromaticus equi, etc.), desarrolla en el hospedador vertebrado una fase de multiplicacin en el interior de los linfocitos, con formacin de esquizontes similares a los de Theileria y apreciables en ndulos linfoides a los 12-14 das, despus de fijarse la garrapata infectada (esquizogonia exoeritroctica, Figura n 4). A continuacin tiene lugar la invasin de glbulos rojos inicindose la esquizogonia eritroctica (Schein, 1988).

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Los merozoitos, observables en el interior de los hemates, son pleomrficos y de 2 a 3 m de longitud, predominando las formas ameboides, esfricas, redondeadas y a veces de pera o coma (Figura n 4).

MFigura n 4.- Imagen ultramicroscpica de un linfocito con numerosos merozoitos de T. equi (M), en el citoplasma. Extrado de Mehlhorn y Schein, 1998.

Resulta frecuente evidenciar, en extensiones sanguneas teidas con Giemsa, cuatro merozoitos dispuestos a modo de Cruz de Malta (Figura n 5), derivados de la doble segmentacin de la clula madre (Levine, 1988).

Figura n 5.- Morfologa y presentacin tpica de T. equi en forma de "Cruz de Malta", parasitando hemates de caballo.

En la transmisin de esta especie no existe invasin del ovario de la garrapata, como ocurre con B. caballi, aunque s de las glndulas salivares, formando esporozoitos en el siguiente estadio evolutivo del ixdido. La transmisin, por tanto, siempre ser transestadial o fase a fase (Figura 3), (Mehlhorn, 1984).

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Morfologa y ciclo biolgico de Babesia caballi Babesia caballi (sin. Piroplasma caballi) presenta en el hospedador vertebrado unas formas intraeritrocitarias tpicas del gnero Babesia. Los merozoitos apreciables en extensiones sanguneas teidas por el mtodo de Giemsa, son principalmente piriformes (3-5 m de longitud), presentndose en parejas que llegan a formar un ngulo agudo entre s. Tambin pueden ser observadas formas simples esfricas, ovales o de forma irregular (germinativas). El ciclo se completa en la garrapata vector, en cuyo intestino y tras la succin de sangre infectada, tiene lugar la diferenciacin del parsito en formas sexuadas y la formacin del cigoto (gametogonia). El proceso culmina con la invasin del ovario de la garrapata, garantizando de este modo la infeccin de las generaciones venideras y la transmisin del parsito, preferentemente a travs de nuevas ninfas o adultos, en cuyas glndulas salivares se replicaron asexualmente las Babesias (esporogonia) para dar lugar a las formas infectantes (esporozoitos). La transmisin es de tipo transovrica. 2.2.3.- Clnica de la PE La patognesis de la PE depender de factores propios del hospedador como la edad (los jvenes son ms resistentes), el estado sanitario, nutricional, inmunitario (las corticoterapias prolongadas producen inmunodepresin), y de factores propios de la especie (T. equi ms patgena), cepa, etc. Las manifestaciones clnicas se presentan tras un periodo de incubacin que oscila entre 10 y 15 das, y las ms frecuentes son la aparicin de fiebre (39-42 C), anemia hemoltica, anorexia, depresin, a veces hemoglobinuria, edemas e ictericia (De Waal, 1992). En los casos de evolucin crnica el proceso puede concluir con la muerte del caballo (Schein, 1988). La accin patgena en ambas infecciones se basa en la liberacin de sustancias farmacolgicamente activas (esterasas) que activan la calicrena, sta a su vez provoca disturbios circulatorios (vasodilatacin, incremento de permeabilidad vascular, stasis circulatorio, shock y muerte). Esta accin se ve complementada por la destruccin de eritrocitos (hemlisis). Adicionalmente y durante el inicio de la infeccin, T. equi centra su accin sobre el sistema mononuclear fagoctico (fase linfoproliferativa), para posteriormente provocar una severa anemia, ya que puede alcanzar elevados niveles de parasitemia, prximos al 80% de eritrocitos parasitados. En ambos casos estn presentes los procesos autoinmunes manifestados con fenmenos de eritrofagocitosis (Levine, 1985). Desde el punto de vista clnico, tras un periodo de incubacin de 12-15 das, la PE puede presentarse bajo las siguientes formas clnicas:

Sobreaguda. Muerte en 1-2 das. Aguda. Predominio del sndrome febril y crisis hemoltica, de fcil diagnstico por la clnica y la abundante presencia de parsitos en el interior de los hemates. 7-12 das de duracin. Subaguda. Sntomas atenuados. Crnica. Escasa sintomatologa. 22 das de duracin media. Estas dos ltimas formas pueden pasar inadvertidas al diagnstico clnico o parasitolgico convencional.19



En cualquier caso, el proceso se inicia con hipertermia (39-42C), que puede ser intermitente en infeccin por T. equi y persistente en caso de B. caballi. Se puede apreciar: taquicardia (80-100 p.p.m.), a veces con pulso yugular, disnea, depresin, anorexia, lacrimeo intenso, rinorrea, sialorrea, anemia, hemoglobinuria, ictericia, cojeras, parlisis del tercio posterior, edema palpebral, de cabeza, de partes ventrales (extremidades, genitales, subcutneo en abdomen), siendo igualmente comn la presencia de hemorragias en mucosas (nasal, vaginal, conjuntiva, etc.). La prdida de peso se hace cada vez ms manifiesta, pudindose presentar trastornos gastrointestinales como clicos y diarreas, y graves sntomas bronconeumnicos derivados del edema de pulmn (Figura n 6).

Figura n 6.- Edema de pulmn en infeccin por T. equi con presentacin sobreaguda.

En el caso de infeccin por B. caballi, son frecuentes las cojeras y las afecciones del sistema nervioso central (encefalitis), por oclusin de la luz de los capilares cerebrales. En las infecciones por T. equi pueden presentarse abortos, ya que para esta especie se ha descrito la transmisin intrauterina (Guglielmone, 1995). La mortalidad ocasionada por la PE oscila alrededor del 10-50% en animales procedentes de zonas libres, infectados por T. equi (Yin y cols., 1997). Estas cifras se reducen considerablemente en nuestro pas al ser zona endmica, y estar la mayora de la poblacin equina preinmunizada. El cuadro lesional incluye: edema subcutneo, exudado seroso en cavidades (incluido pericardio), ictericia generalizada, edema de pulmn, hemorragias en endocardio y epicardio, hepatomegalia, esplenomegalia, glomerulopatas, linfoadenopatas, etc. (Mahoney y cols., 1977; Levine, 1985; Kuttler, 1988; Schein, 1988). 2.2.4.- Diagnstico de la PE 2.2.4.1.- Diagnstico Clnico La identificacin de la enfermedad basada en la sintomatologa tpica, presencia de garrapatas, etc., tiene relativa utilidad y slo valor orientativo (Bose y cols., 1995). El diagnstico anatomopatolgico tampoco aporta la suficiente informacin.

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El cuadro lesional puede definirse como de ditesis hemorrgica generalizada, con fenmenos de coagulacin intravascular diseminada y muerte por shock hipovolmico, por tanto, se consideraba inespecfico y poco concluyente (Bruning, 1996). 2.2.4.2.- Mtodos directos La observacin de formas parasitarias intralinfocticas (T. equi) o intraeritrocitarias (ambas especies), tras tincin de improntas ganglionares o extensiones sanguneas, resulta ser un mtodo vlido slo durante la fase aguda de enfermedad. La utilizacin de diferentes mtodos de tincin (solucin de Giemsa, May-Grnwald-Giemsa, Leishman, Panptico rpido, etc.), nos permite poner en evidencia las distintas formas parasitarias presentes, tanto en el hospedador vertebrado como en el invertebrado. La parasitoscopia es especialmente vlida para diagnosticar la enfermedad con presentacin aguda, ya sea de modo individual en colectividades, ya que las mayores parasitemias se alcanzan precisamente durante esta fase. La extensin fina de sangre, tincin y consiguiente observacin de varios campos del microscopio, es suficiente para hallar y determinar el agente etiolgico, basndonos en sus caractersticas morfolgicas y morfomtricas (Figura n 7).

Figura n 7.- Formas intraeritrocitarias de T. equi. Imagen microscpica (100X) de extensiones sanguneas tras tincin con Panptico rpido.

Transcurridos varios das desde el inicio del proceso clnico es fcil que la parasitemia descienda, resultando ms difcil la observacin de parsitos. Sin embargo, transcurridos unos das, en los macrfagos se pueden detectar clulas y/o parsitos fagocitados. En estos casos es recomendable realizar una extensin gruesa o teir una gota gruesa y proceder a una observacin ms minuciosa. En infecciones por T. equi se puede realizar un diagnstico precoz y fiable tras obtener material linfoide mediante biopsias de ganglios infartados. Despus del lavado del material con medio de cultivo RPMI, realizaremos extensiones y tinciones siguiendo los mtodos anteriormente indicados. Trataremos de observar clulas multinucleadas (esquizontes), en el interior de las clulas linfoides. En caso de que tengamos que realizar un diagnstico post mortem, las improntas de rin, bazo e hgado podrn ser teidas y, del mismo modo, observadas al microscopio, pues esta prctica nos proporciona imgenes concluyentes para el diagnstico de PE.21



Debido a la intervencin obligatoria de las garrapatas en el ciclo de estos protozoos, cabe la posibilidad de deteccin de Babesia y Theileria en diferentes tejidos de ixdidos, como ovario, huevos (donde encontraremos esporoquinetos), glndulas salivares (donde se localizan los esporoblastos), intestino (visualizacin de gametos), hemolinfa, etc., aunque sta prctica es ms difcil y menos empleada con fines diagnsticos. Dentro de los mtodos directos, y gracias a los nuevos avances alcanzados en el campo de la biologa molecular, estamos en condiciones de aplicar las tcnicas de amplificacin del ADN en el diagnstico de enfermedades protozoarias transmitidas por garrapatas. La tcnica de Reaccin en Cadena de la Polimerasa (PCR) y Reverse Line Blotting (RLB), permiten la identificacin de parsitos y la diferenciacin entre poblaciones prximas (Posnett, 1991; Posnett y cols., 1991; Bashiruddin y cols., 1999; Nicolaiewsky y cols., 2001; Rampersad y cols., 2003). Su eficacia es superior a la de mtodos convencionales. Mediante esta tcnica se ha logrado determinar la presencia de diversos hemoparsitos (Babesia, Theileria, Anaplasma, Cowdria) en ganado bovino. Por tanto, las ventajas son su elevadsima sensibilidad y especificidad, siendo actualmente los inconvenientes ms destacables el tiempo necesario de ejecucin y los elevados costes. No obstante, pensamos que estas tcnicas pueden tener un futuro prometedor, tanto en diagnsticos individuales como en estudios epidemiolgicos. Su elevada especificidad evita la aparicin de falsos positivos como consecuencia de reacciones cruzadas, tal y como ocurre en ocasiones cuando se emplean tcnicas serolgicas, salvando otras dificultades que pudieran presentarse, como el descenso de los anticuerpos a niveles imperceptibles por los mtodos habitualmente empleados. La elevada sensibilidad de la PCR nos permite detectar parasitemias de hasta 0,000001%, en caso de B.bovis. Tambin se han empleado mtodos de purificacin y anlisis de protenas para el diagnstico de la PE, como el Western blotting (Figura n 8, Samuel, y cols., 1999).

Figura n 8.- Purificacin de una fraccin antignica de 28kDa de T. equi, por Western Blotting. Samuel, 1999.

Por todo ello, la PCR es especialmente til en el diagnstico precoz de infecciones por Theileria y Babesia empleando como muestra material linfoide obtenido por biopsia o sangre. Es recomendable su uso para detectar portadores crnicos, en los que la parasitemia es tan escasa que difcilmente puedan observarse los parsitos, y, por supuesto, tiene utilidad para detectar ADN del parsito en los tejidos de los ixdidos vectores. Aunque de momento no est disponible para el diagnstico sistemtico de piroplasmosis equina, parece ser una tcnica que se impondr en un futuro prximo.

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2.2.4.3.- Mtodos indirectos Los mtodos serolgicos por reaccin de fijacin de complemento o de inmunofluorescencia indirecta son los principales medios de diagnstico de la PE. Ambos son mtodos aceptados internacionalmente en el CZI (Annimo, 1987), si bien, el segundo es ms sensible y especfico. Poseen mxima aplicabilidad para la deteccin de casos latentes. El mtodo ELISA, dada su posibilidad de automatizacin resulta interesante para la realizacin de amplios estudios epidemiolgicos. Sin embargo, de momento no est conseguida la correcta purificacin antignica, considerndose por tanto, un mtodo algo inespecfico (Weiland, 1986; Kumar y cols., 2003; Kumar y cols., 2004). Los mtodos indirectos de inmunodiagnstico son empleados para medir la respuesta inmune en casos de babesiosis natural o experimental. Estos mtodos son tiles tanto para el diagnstico individual como de colectividades con el fin de determinar prevalencia y distribucin en reas geogrficas ms o menos extensas y poder planificar un posible plan de control (Tenter, 1986). La cintica de anticuerpos detectables por cualquiera de estos mtodos en la infeccin por Babesia, queda representada grficamente por una curva gausiana, ya que aparecen a los 15-20 das de la primoinfeccin, incrementndose posteriormente. Tras mantenerse en meseta durante 6-10 meses, comienzan a decrecer hasta llegar a niveles basales indetectables, en muchas ocasiones, por estos mtodos serolgicos (Madden, 1968; Callow y cols., 1979). Han sido numerosos los esfuerzos destinados a desarrollar mtodos que permitan medir la respuesta inmune a la infeccin por Babesia, pero a pesar de todo, no existe una tcnica totalmente satisfactoria, al menos para el diagnstico de las formas latentes. Cada test tiene sus ventajas e inconvenientes dependiendo del nivel de sensibilidad, especificidad, simplicidad y coste. Muchos investigadores proponen la combinacin de al menos dos tcnicas, con el fin de incrementar los niveles de confianza del serodiagnstico. 1) Reaccin de fijacin de complemento (RFC): Fue el primer test desarrollado para la deteccin de anticuerpos anti-Babesia. Esta tcnica fue aceptada oficialmente por el Departamento de Agricultura de Estados Unidos como prueba de referencia en el diagnstico de PE. En general, esta tcnica es considerada altamente especfica para el diagnstico de babesiosis; sin embargo, tiene limitaciones derivadas de su pobre sensibilidad si se compara con la Inmunofluorescencia indirecta (IFI) (Soule y cols., 1984), (Tenter, 1986). Respecto a los casos crnicos, la RFC detecta la persistencia de la infeccin, pero resultan un nmero relativamente alto de falsos negativos, posiblemente debido a la corta vida de los anticuerpos detectables. No se recomienda su uso para evaluar resultados de vacunacin o tratamiento (Musoke y cols., 1997). 2) Inmunofluorescencia Indirecta (IFI): Esta tcnica ha sido utilizada con los mismos objetivos en prcticamente todas las especies animales (bovinos, ovinos, cnidos, etc.), e incluso el hombre (Madden, 1968). Parece existir una opinin unnime sobre su mayor especificidad y sensibilidad frente a la RFC. Algunos autores describen ciertas reacciones cruzadas entre especies, otros, refuerzan sus argumentos en favor de esta tcnica respecto a la RFC. Los anticuerpos fluorescentes son detectados a los 10-20 das despus de establecida la infeccin, persistiendo periodos ms prolongados (hasta 420 das postinfeccin en B. ovata). No obstante, estas caractersticas pueden variar segn el antgeno empleado, el porcentaje de parasitemia, etc. La IFI permite el diagnstico de babesiosis agudas y crnicas, sirve para la identificacin de especies de Babesia incluso en infecciones mixtas y resulta til para la realizacin de estudios seroepidemiolgicos, deteccin de portadores crnicos, ensayos de inmunizacin (Ristic y cols., 1964), etc.23



3) Tcnica Inmunoenzimtica (Enzyme-Linked Inmunosorbent Assay ELISA): Esta tcnica es muy sensible y econmica, siempre que se consiga una correcta purificacin de los antgenos. Diversos autores han descrito problemas de reacciones cruzadas derivados de la utilizacin de extractos de antgenos somticos o metablicos poco purificados, en diferentes especies de Babesia. Sin embargo, otros consideran que este test presenta una sensibilidad comparable a la IFI y resulta til para el diagnstico de casos clnicos y asintomticos, demostrndose reacciones positivas hasta 250 das posinfeccin y 70 das despus del tratamiento con aceturato de diminaceno. Mediante esta tcnica no se observaron reacciones cruzadas entre Babesia, Theileria y Anaplasma. El test de ELISA es, en definitiva, til para el diagnstico, sin embargo, debido a las reacciones cruzadas no es posible identificar especies en infecciones mixtas. Su empleo, de momento, debe limitarse a chequeos seroepidemiolgicos dadas sus posibilidades de automatizacin. Es recomendable aumentar su especificidad, la capacidad de reproduccin de protocolos y los anlisis de costo/eficacia (Weiland, 1986; Knowles y cols., 1991; Kumar y cols., 2003). La preparacin de antgenos definidos y el uso de antgenos de cultivos purificados, harn de esta tcnica una adecuada herramienta en el serodiagnstico de las babesiosis. 2.2.4.4.- Diagnstico Diferencial

Ehrlichiosis / Anaplasmosis (Anaplasma / Ehrlichia equi) Anemia Infecciosa Equina Peste Equina Tripanosomosis Leptospirosis Intoxicaciones, etc.

2.2.5.- Tratamiento En la terapia farmacolgica empleada actualmente para tratar la PE, se incluyen los siguientes babesicidas: - Aceturato de diminaceno a dosis diaria de 4-5 mg/kg p.v. hasta desaparicin de la sintomatologa, o a dosis de 11 mg/kg p.v. en nica inyeccin, es eficaz para tratar la infeccin por B. caballi. En caso de infecciones por T. equi, puede ser requerida la repeticin del tratamiento, si llegar en cualquier caso a la completa esterilizacin del animal. - Amicarbalidas: una simple inyeccin de 9-10 mg/kg p.v. es suficiente para el tratamiento de ambas infecciones. Dosis superiores causan graves efectos secundarios, sin conseguir la total eliminacin de T. equi del hospedador. - Dipropionato de imidocarb: una nica dosis de 2-3 mg/kg p.v. recupera al animal de la infeccin por B. caballi, siendo necesaria la repeticin a las 24 horas para lograr la eliminacin total del parsito. En infecciones por T. equi, esta segunda inyeccin teraputica a la misma dosis o superior, es necesario repetirla a las 48 horas, sin conseguir la esterilizacin, sino tan slo un descenso transitorio de los ttulos de anticuerpos fijadores de complemento (aunque no de los fluorescentes). La aplicacin de dosis altas como 4 inyecciones de 4 mg/kg p.v. cada 72 horas puede tener graves problemas de intoxicacin (para los que el antdoto de eleccin sera el sulfato de atropina), sin alcanzar tampoco la eliminacin total del parsito.24



La esterilizacin frente a B. caballi segn Kuttler (1980), puede obtenerse mediante los siguientes tratamientos:

Aceturato de diminaceno Amicarbalida Imidocarb

11 mg/kg p.v., 2 veces, 24h de intervalo 8,8 mg/kg p.v., 2 veces, 24h de intervalo 2,2 mg/kg p.v., 2 veces, 24h de intervalo

Sin embargo, para otros autores, esto supone el empleo de dosis de babesicidas en el lmite de la toxicidad, por lo que no se puede hablar, hasta el momento, de terapia esterilizante efectiva e inocua para el animal afectado. T. equi es ms refractaria al tratamiento y la erradicacin total de los estados de portadores inaparentes es ms difcil, por no decir imposible. Recientemente se ensayaron drogas con poder theilericida en el tratamiento de la babesiosis ocasionada por T. equi como la parvaquona o la buparvaquona. Respecto a la primera, la inyeccin intramuscular a la dosis de 20 mg/kg p.v. parece ser eficaz, aunque no se consigue la esterilizacin. Del mismo modo, la buparvaquona resulta ser teraputicamente efectiva a la dosis de 4-6 mg/kg p.v. va intramuscular o endovenosa, siendo ineficaz en la eliminacin del estado portador. En un estudio (Kumar y cols., 2003), en el cual se realizaron ensayos teraputicos con buparvaquona sobre 40 caballos, tan slo un animal consigui quedar completamente libre de la infeccin por T. equi. La dosis empleada del producto fue de 2,5 mg/kg p.v. y la va de inoculacin fue intramuscular, inyectando 4 veces con 96 horas de intervalo. En este mismo trabajo en el que se ensayan diferentes dosis de buparvaquona y distintas vas y pautas de administracin, se llega a la conclusin que la dosis de 2,5 mg/kg p.v. es suficiente, siendo la va endovenosa la de eleccin, al evitarse efectos secundarios tales como laminitis, pobre absorcin o dolor en el punto de inoculacin cuando se administra va intramuscular. 2.2.6.- Epidemiologa de la PE en Espaa y situacin actual en Extremadura Se estima que la PE en Espaa es transmitida en condiciones naturales por garrapatas de los gneros Dermacentor, Hyalomma y Rhipicephalus, es decir, ixdidos con ciclo biolgico de dos o tres hospedadores, teniendo lugar la inoculacin de los esporozoitos a los 2-5 das de fijarse el vector (Friedhoff, 1982; Habela y cols., 1998). En las zonas endmicas, los potros mantienen contactos con las garrapatas, momento durante la cual estn protegidos pasivamente por la inmunidad transferida va calostro, siendo los casos de PE clnica relativamente raros. La transmisin de anticuerpos de madre a potro va calostro la hemos podido constatar serolgicamente por medio del test de inmunofluorescencia indirecta, si bien la seropositividad desaparece aproximadamente a los 3 meses posteriores al nacimiento (Coleto, 1999). T. equi tiene capacidad de persistir en el quido durante aos y quizs durante toda la vida del animal, constituyendo stos los reservorios de la enfermedad. Sin embargo, B. caballi tiene garantizada su supervivencia a travs de generaciones de garrapatas, al poderse transmitir transovricamente.

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Otras formas de contagio que han sido citadas son a travs de jeringas contaminadas, transfusiones sanguneas o en el caso de T. equi va transplacentaria (Correa, 1974; Phipps y cols., 2004). En el Servicio de Diagnstico de la Unidad de Parasitologa integrado en el Hospital Clnico de la Facultad de Veterinaria de la Universidad de Extremadura, hemos diagnosticado la enfermedad en todo el territorio peninsular e islas. Las cifras de seropositividad para el conjunto del pas, segn nuestros resultados, estaran en torno al 52,5% frente a T. equi y al 21,3% para B. caballi, predominando la primera en el centro, oeste, este y sur peninsular e islas y la segunda en la cornisa cantbrica (Habela, y cols., 1989; Habela y cols., 1995; Habela, y cols., 1998). Cabe destacar por ltimo, que aproximadamente 120 millones de quidos se encuentran expuestos a la PE y slo el 10% de la poblacin mundial habita zonas libres de enfermedad. Los deportes ecuestres, el comercio de quidos y la rapidez de los transportes, propician la difusin y establecimiento de los vectores infectados en zonas distantes. La situacin epidemiolgica de la babesiosis equina en nuestro pas podra calificarse de endmica inestable, ya que la relacin entre hospedador, agente causal, vector y medio ambiente es incompleta, lo que provoca la aparicin clnica de la enfermedad. Esta situacin se convierte en ms estable a medida que se avanza hacia el sur, alcanzndose una relacin parsitos-hospedador-medio ms estrecha, que permite una virtual ausencia de la enfermedad clnica. Por tanto, la situacin epidemiolgica de la PE en Extremadura puede definirse igualmente como de endmica inestable (Habela, y cols., 1995). 2.2.7.- Vectores Potenciales de PE en Espaa Los ixdidos (comunmente denominados como "garrapatas duras"), son los principales transmisores de la PE en Espaa. Artrpodos pertenecientes al orden Acari, los ixdidos son arcnidos, y como tales, presentan cuatro pares de patas como caracterstica morfolgica evidente. Estn recubiertos de un cuerpo quitinoso con un escudo dorsal completo en los machos y ocupando la regin anterior del dorso en las hembras, que los diferencia de las especies pertenecientes a la familia Argasidae (Superfamilia Ixodoidea), denominadas "garrapatas blandas". 2.2.8.- Vectores Potenciales de PE en Extremadura, dinmica poblacional y periodos de riesgo de infeccin Concretamente en Extremadura, es posible que sean Dermacentor marginatus, Rhipicephalus bursa, Hyalomma lusitanicum o Hyalomma marginatum marginatum los ixdidos que intervienen en la transmisin (Habela, y cols., 1989). En el presente trabajo, hemos descrito la dinmica poblacional de tres de estas cuatro especies, tal como se refleja en el captulo 5.1 de los Resultados, si bien, a continuacin detallamos las caracterstica biolgicas ms importantes de cada una de ellas (Tabla n 2):

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Tabla n 2.- Encuadre Taxonmico de los ixdidos transmisores potenciales de PE en Extremadura.Phylum: Arthropoda Clase: Arachnida Orden: Acari Suborden: Metastigmata Superfamilia: Ixodoidea Familia: Ixodidae Subfamilia: Rhipicephalinae Gnero: Dermacentor Especie: D. marginatus Especie: D. reticulatus Subfamilia: Rhipicephalinae Gnero: Rhipicephalus Especie: R. bursa Subfamilia: Hyalomminae Gnero: Hyalomma Especie: H. marginatum marginatum Especie: H. lusitanicum (Siebold y Stanius, 1845) (Lamark, 1817) (Nitzsch, 1818) (Leach, 1815) (Banks, 1894) (Murray, 1877) (Salmon-Stiles, 1901) (Koch, 1844) (Sulzer, 1776) (Neumann, 1897) (Salmon-Stiles, 1901) (Koch, 1844) (Canestrini-Fanzago, 1877) (Hoogstral, 1956) (Koch, 1844) (Koch, 1844) (Koch, 1844)

Dermacentor marginatus Esta especie ixdida se encuentra ampliamente distribuida por toda la Pennsula Ibrica, aunque su presencia es mayor en el Norte y Cornisa Cantbrica. Su papel vectorial se relaciona con la transmisin de B. caballi, B.canis y T. equi. Se ha descrito su capacidad para transmitir Turalemia (Francisella turalensis), y algunas enfermedades rickettsiales (Rickettsia conorii y Coxiella burnetii). Entre los hospedadores con riesgo de parasitacin por esta garrapata, se encuentran pequeos mamferos (roedores, lagomorfos, carnvoros, etc), donde se alimentan las formas juveniles. Los adultos, completan su ciclo parasitando mamferos de la familia Bovidae (bovinos, ovinos y caprinos), as como sudos y quidos. Los lugares de fijacin al hospedador descritos para las formas inmaduras comprenden zonas faciales, ceflicas y auriculares de pequeos mamferos. Los adultos, se fijan principalmente en la base de los cuernos en bvidos y espalda en otras especies. En el jabal, D.marginatus presenta especial tropismo por la cola. Por tanto, sobre sus caracteres biolgicos podemos afirmar que se trata de una especie trifsica (ciclo de tres hospedadores, donde sobre cada uno se alimentar un estadio evolutivo distinto de la garrapata: larva, ninfa o adulto). Se considera tambin una especie ditrpica, ya que mientras los estadios juveniles parasitan principalmente micromamferos, los adultos lo hacen sobre Artiodctilos (bvidos, suidos, quidos). Respecto a su hbitat, D. marginatus se considera una especie endo/exoflica, pudindose encontrar tanto en espacios cerrados (cuadras, heniles, etc.,), como abiertos (praderas, pastos, etc.). En cuanto a su fenologa, las fases inmaduras muestran actividad primaveral (adelantndose 1-2 meses en las zonas Centro y Sur, respecto a la zona Norte), mientras que los adultos de la zona meridional presentan fenologa otoo-invernal y primaveral los adultos que pueblan zonas ms fras (ninguna forma evolutiva muestra actividad durante el periodo estival).

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Entre los caracteres morfolgicos diferenciales destacar de D. marginatus que posee:

respecto a otras garrapatas, podemos

Escudo quitinizado bicolor con marcados surcos dorsales. Ornamentacin del escudo mal definida. Ausencia de espolones dirigidos hacia atrs en los palpos. Cornuas pequeas. Coxa IV de los machos mucho mayor que las restantes.

Rhipicephalus bursa Como caracteres morfolgicos generales de inters a la hora de identificar a estos ectoparsitos del ganado, sealaremos que R. bursa posee un escudo dorsal con festones apreciables, unos palpos cortos y triangulares, base del captulo dorsal y ventralmente hexagonal, la coxa I profundamente hendida y adems, los machos cuentan con placas anales grandes, triangulares, bien queratinizadas y definidas (Figura n 9).

Figura n 9.- Rhipicephalus bursa: 1=Palpos, 2=Base del Captulo, 3=Escudo, 4=Festones.

Otros caracteres diferenciales son el punteado abundante del escudo dorsal (homogneo y grueso), las anchas placas adanales de los machos y la abertura genital de las hembras en forma de "V". Ambos sexos poseen ojos prominentes redondeados y situados a cierta distancia del borde del escudo (Figura n 10), (Gil Collado y cols., 1979; Estrada-Pea, 1994; Habela y cols, 2002). En cuanto a los caracteres biolgicos de este ixdido, podemos decir que se trata de una especie difsica (con ciclo biolgico de dos hospedadores para alimentar la fase de larvas a ninfas el primero y de ninfas a adultos el segundo), monotrpica (pues presenta afinidad por las mismas especies hospedadoras en todas sus fases evolutivas) y exoflica (se desarrolla en espacios abiertos). Los inmaduros presentan fenologa otoo-invernal mientras que los adultos son primavero-estivales. Esta especie se encuentra ampliamente distribuida por toda la geografa peninsular, abundando en el Sur (Habela, y cols., 1998).28



R. bursa encuentra como hospedadores idneos, para completar su ciclo biolgico, gran variedad de artiodctilos domsticos, silvestres y perisodctilos, si bien, demuestra especial afinidad por los rumiantes. Sobre el hospedador, los lugares de fijacin donde ms frecuentemente se localizan son la zona perineal e inguinal. Los inmaduros en el cuello, cara, espalda, dorso y extremidades.

Figura 10.- y Rhipicephalus bursa. Vista dorsal.

Adems de PE, R. bursa puede potencialmente transmitir otros parsitos hemticos a los bvidos como Babesia bigemina, Anaplasma marginale y otros microorganismos patgenos como Borrelia theileri (Rickettsia) o Coxiella burnetii (Zoonosis: provoca Fiebre Q en humanos (Punda-Polic y cols., 2002). Hyalomma lusitanicum Especie ixdida trifsica, ditrpica y endo/exoflica, presente en las zonas Centro y Sur peninsular, as como en territorio insular (Canarias y Baleares). Los inmaduros pueden ser hallados desde Abril a Octubre. Las ninfas, una vez que se encuentran suficientemente alimentadas, pueden retrasar su capacidad de metamorfosis (diapausa morfogentica) en condiciones ambientales desfavorables, hasta la siguiente primavera. Los adultos se encuentran activos desde Abril a Noviembre, con dos picos de mxima presencia observables en primavera y otoo. Las formas inmaduras de H. lusitanicum se alimentan sobre pequeos mamferos salvajes (conejos, ratones, etc.), mientras que los adultos presentan afinidad por los mamferos domsticos y especialmente por los de vida libre, incluyendo en este conjunto a los bovinos, sudos, quidos, etc. En stos hospedadores, los lugares de fijacin incluyen la regin inguinal (mamaria y escrotal), y zonas perineal y pubiana. Como caracteres morfolgicos diferenciales de H. lusitanicum respecto de otras garrapatas, podemos destacar:

Presencia de ojos prominentes. Escudo quitinoso color caf, no uniforme, con punteado grueso y disperso. Ausencia de surcos laterales. Patas jaspeadas (bandas claras y oscuras alternantes).

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Esta garrapata est implicada en la transmisin de organismos patgenos como Babesia, Theileria, Coxiella, e incluso el virus de la Fiebre Hemorrgica Congo-Crimeana (Habela y cols. 2002). Hyalomma marginatum marginatum Al igual que su congnere H. lusitanicum, H. m. marginatum se encuentra distribuida por todo el territorio espaol, tanto peninsular como insular. Por el contrario, encontramos varios caracteres morfolgicos que la diferencian de H. lusitanicum (Figura n 11):

Presencia de surcos laterales largos y marcados. Escudo color caoba con punteado fino y escaso. Sector caudal deprimido y punteado.

Figura n 11.- y H. m. marginatum. Vista dorsal.

Sus caracteres biolgicos hacen que catalogue como especie difsica, mono/ditrpica y endo/exoflica, con fenologa estival y otoal para las formas juveniles y primavero-estival para los adultos, si bien, con menor presencia en verano. Larvas y ninfas se alimentan sobre pequeos mamferos, anfibios, aves y reptiles silvestres, mientras que los adultos lo hacen sobre bvidos, quidos y ocasionalmente carnvoros, siendo, sus lugares de fijacin los descritos para H.lusitanicum. Est demostrado el papel vectorial de este ixdido en la transmisin de Theileria annulata al ganado bovino y posiblemente est relacionada con la transmisin de PE a los quidos.

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3.- OBJETIVOS

OBJETIVOS

3.- OBJETIVOSLos dos principales objetivos marcados para la realizacin de este trabajo de investigacin fueron: a) Conocer la prevalencia, distribucin y riesgos de infeccin de PE en el caballo PRE de Extremadura y; b) Estimar las consecuencias econmicas que de ella derivan. Estos dos objetivos principales pueden ser considerados a su vez como un conjunto de varios objetivos, tal como a continuacin se detalla: a) Para lograr el primer propsito (conocer la epidemiologa de la PE en los caballos PRE de Extremadura), debamos superar los siguientes objetivos: 1) Aislamiento de cepas autctonas de T.equi y B.caballi, a partir de muestras de sangre de quidos infectados remitidas al servicio de anlisis de la Unidad de Parasitologa. 2) Establecimiento y cultivo in vitro de los aislados locales. 3) Planificacin y realizacin de un chequeo seroepidemiolgico de los caballos PRE de la regin. 4) Recoleccin e Identificacin de ixdidos vectores de PE en nuestra regin. 5) Estudio de la dinmica poblacional de las especies ixdidas identificadas. b) El otro propsito planteado, fue el de encuestar al sector productor acerca del grado de conocimiento de la enfermedad y de las repercusiones que la PE tiene sobre la rentabilidad de sus explotaciones. El propsito principal de esta parte del trabajo consista en la elaboracin y el reparto entre los criadores de PRE de Extremadura, de una encuesta que nos permitiera: 1) Llegar a conocer el grado de concienciacin del sector productor regional acerca de la PE. 2) Llegar a una estimacin aproximada de las repercusiones econmicas derivadas de esta enfermedad (gastos de diagnstico, tratamientos, muerte de efectivos, etc.), en las yeguadas de PRE de Extremadura. 3) La diseminacin de los resultados obtenidos entre el sector productor de PRE de Extremadura, a fin de concienciar al mismo sobre la importancia tanto sanitaria como econmica y social, de la presencia de PE en nuestros quidos.

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4.- MATERIAL Y MTODOS



4.- MATERIAL Y MTODOS

4.1.- DISEO EXPERIMENTAL 4.1.1.- Estudio de la regin: Situacin, extensin y divisin administrativa Nuestra comunidad autnoma, Extremadura, se encuentra situada al Oeste de la Pennsula Ibrica, entre la Meseta Castellana, Portugal y Andaluca Occidental. Las dos provincias que la constituyen, Cceres y Badajoz, son las mayores de Espaa en cuanto a extensin se refiere, ocupando Badajoz 21.704 km2 (4,29% del territorio nacional total), y 19.945 km2 (3,94%), en el caso de Cceres. 4.1.2.- Edafologa, Vegetacin y Climatologa del rea de estudio Con ms de 2000 metros de altitud sobre el nivel del Mar en Gredos y apenas 180 m. en los valles de los ros Tajo y Guadiana, el resto de altitudes varan sensiblemente de unos lugares a otros en torno a los 400-600 m. Tanto la situacin geogrfica como la altitud, determinan la existencia de una enorme variedad de climas locales y paisajes en nuestra regin, lo que a su vez condiciona la distribucin de una variada poblacin de flora y fauna (Rol,1996). La provincia de Cceres, al norte, ocupando el borde occidental de la Meseta Sur de la Pennsula, presenta una orografa bastante accidentada. La Meseta se interrumpe hacia el Oeste y hacia el Norte por las Sierras de Gata y Gredos respectivamente, as como por las estribaciones de los Montes de Toledo al Este. Segn la divisin comarcal realizada por el MAPA, la provincia de Cceres (constituida por 219 municipios), consta de 10 comarcas agrarias: Cceres, Trujillo, Brozas, Valencia de Alcntara, Logrosn, Navalmoral de la Mata, Jaraz de la Vera, Plasencia, Hervs y Coria. La provincia de Badajoz, dividida en 8 comarcas, es mucho ms uniforme en cuanto a su orografa, alcanzando una altitud media de 500 m sobre el nivel del mar. Su flora y fauna difieren sensiblemente, por tanto, de la que habita la provincia de Cceres. La vegetacin en Extremadura presenta una importante variabilidad, derivada de su situacin geogrfica, diversidad climtica, relieve y contrastes lticos y edficos. La accin humana en la modelizacin del paisaje extremeo (tala de rboles para la siembra de cereales y pastoreo), completa el marco de influencias que han contribuido a la enorme complejidad del paisaje vegetal, crendose gran variedad de hbitats. Estas variables cobran una gran importancia a la hora de investigar la dinmica poblacional y las reas de presentacin de las garrapatas transmisoras de PE en la regin. Entre las explotaciones donde hemos realizado el chequeo serolgico de sus PRE, o donde hemos recogido ixdidos, podemos diferenciar dos tipos distintos de flora: el pastizal, principalmente de gramneas (con o sin arbolado, tpico de la dehesas extremeas) y el matorral o monte bajo (retamas y jaras, principalmente).

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MATERIAL Y MTODOS

El clima en Extremadura viene determinado por dos factores: el carcter mediterrneo y la continentalidad. El clima mediterrneo se caracteriza por la alternancia del periodo seco, coincidiendo con las mximas temperaturas, que abarcan desde Mayo hasta Octubre (slo interrumpido por tormentas ocasionales), y otro periodo lluvioso el resto del ao. La intensidad de las precipitaciones determina el ombroclima. El rgimen de lluvias, en Extremadura, es muy irregular, aunque de forma general, se pone de manifiesto en el periodo otoo-invernal, descendiendo en primavera. Fajardo (1993), define el clima de la regin como "mediterrneo continental templado". 4.1.3.- Toma y procesado de las muestras de Ixdidos Uno de los objetivos de esta investigacin era el de estudiar las garrapatas que parasitan a los quidos de Extremadura, identificarlas, y llegar a determinar su Dinmica Poblacional. Para ello, se efectu la recogida de ixdidos que estaban fijados, alimentndose en algunos de los quidos de estudio, mientras que otros, fueron recogidos directamente del medio donde stos ltimos habitan. Para la realizacin del presente trabajo nos hemos desplazado hasta explotaciones de PRE de Extremadura situadas en todos los puntos cardinales de la regin, abarcando as la gran mayora de hbitats y paisajes (Figura n 12). En adicin a las muestras recogidas por nosotros mismos, otras nos fueron remitidas desde explotaciones, picaderos, clubes hpicos, etc., por veterinarios de equinos, propietarios de yeguadas y otros colaboradores. En el momento de la recogida eran referenciados el lugar, la fecha y otras caractersticas de la zona que resultaran de inters epidemiolgico (lugar de recogida de las muestras, datos propios de animal y la explotacin a la que pertenece, etc.).Figura n12.- Municipios muestreados de Extremadura: Albal (1), Aliseda (2), Badajoz (3), Cceres (4), Jerez de los Caballeros (5), Monroy (6), Nava de Santiago (7), Navalmoral de la Mata (8), Olivenza (9), Plasenzuela (10), Robledillo de Gata (11), Sierra de Fuentes (12), Trujillo (14) y Valencia de Alcntara (15).

El sistema empleado para la extraccin de garrapatas directamente de los animales parasitados fue el de "Torsin y Traccin", que consiste en que una vez tengamos localizada y sujeta la garrapata, esta se presiona con los dedos y se realiza un giro de mueca de 180. Cuidadosamente, la garrapata se retira del caballo por traccin. Las garrapatas encontradas, desprendidas con el mayor cuidado a fin de no romper ninguna de sus estructuras corporales, fueron introducidas en viales de plstico bien cerrados pero con posibilidad de transpiracin, perfectamente identificados.

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La recogida de ixdidos sobre el medio se llev a cabo mediante la tcnica de arrastre, que consiste en el barrido de suelo habitado o transitado por quidos, con una manta de "felpa" (2x2m). La tela, impregnada de sudor (olor a cido butrico), tras ser frotada concienzudamente sobre el cuerpo de un animal recin ejercitado, se arrastra manualmente por las zonas a muestrear. Tanto la atraccin provocada por el sudor, como el resto de estmulos provocados por el arrastre y la facilidad de fijacin de los ixdidos a la "felpa", supusieron una poderosa herramienta en nuestro estudio. Tras la recogida o la recepcin de las muestras de ixdidos de la regin, stos fueron debidamente referenciados (fecha, nmero de machos y hembras, lugar de captura, etc.), en los registros de la Unidad de Parasitologa. Acompaando a la muestra, exigimos la anotacin de datos sobre la zona de recogida, sobre el quido hospedador, antecedentes en la explotacin, etc, que nos sirvieron para el estudio ecolgico y de la dinmica poblacional de las especies identificadas.Este muestreo se realiz durante los aos 2000 a 2002 (Anexo 12.3.Tabla -Registro de muestras analizadas y resultados). 4.3.4.- Identificacin de Ixdidos La identificacin se efectu en el los laboratorios de Parasitologa, siguiendo las claves referidas en la Bibliografa: - Nosek, 1972 - Gil Collado y cols., 1979 - Estrada-Pea, 2000 - Habela y cols., 2002 Para la identificacin de las garrapatas, trabajamos con el estereomicroscopio iluminado por luz fra bifocal. Los ixdidos fueron inmovilizados sobre portaobjetos cubiertos de una sustancia opaca, flexible y maleable (plastilina color negro). El material de macrofotografa estuvo constituido por: cmaras fotogrficas (Cannon T-70 y Yashica FX-3/2000), filtros polarizadores y lentes de aproximacin (Figura n 13).

Figura n 13.- Estereomicroscopio utilizado para la identificacin de los ixdidos

Por ltimo, una vez anotada toda la informacin resultante de la identificacin, los ixdidos fueron introducidos en viales de vidrio con etanol al 70%, para ser conservados y formar parte de nuestra Coleccin de Referencia.39

MATERIAL Y MTODOS

4.3.5.- Toma y procesado de muestras de sangre y suero Las muestras de sangre analizadas por medios parasitoscpicos, as como las de suero equino testadas serolgicamente, nos fueron remitidas a los laboratorios de la Unidad de Parasitologa directamente por criadores y veterinarios colaboradores, durante los aos 2000-2002, si bien, en muchas ocasiones fuimos nosotros mismos los que trasladamos nuestro equipo hasta las explotaciones con el fin de extraer sangre de los PRE. El muestreo aleatorio de sueros de equinos se efectu por toda la regin, abarcando localidades situadas en reas con orografa y caractersticas climticas muy diferenciadas. En la siguiente figura (n 14), representamos los Municipios chequeados:

* Santibnez

*Rosalejo *Navalmoral de la Mata *JaraicejoHerrra de Alcntara *

* Monroy *Aliseda *CCERES * Trujillo * Sierra de Fuentes *Plasenzuela * Albal *Zorita * Miajadas

Valencia de Alcntara*

*Herrera del Duque

BADAJOZ * Olivenza * Fuente del Maestre*

Conquista del Guadiana * *Mirandilla * Santa Amalia * Villanueva de la Serena * MRIDA * Don Benito *Montijo *Almendralejo

* Zalamea de la Serena *Campillo de Llerena

*Burguillos del Cerro *Jerez de los Caballeros * MonesterioFigura n 14.- Municipios extremeos muestreados.

La poblacin muestreada (579 efectivos), represent el 16% de la cabaa PRE extremea. Para la realizacin de este trabajo no discriminamos ninguna muestra remitida por sexo, capa o edad de los animales de los que procedan. Por tanto, contamos con una amplia variedad de parmetros del hospedador que nos permitan realizar estudios estadsticos comparativos entre estos parmetros y las prevalencias detectadas.

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4.1.6.- Diagnstico Directo de la PE: Microscopa ptica Las extensiones de sangre se realizaron inmediatamente despus de la recepcin de las muestras (casi la totalidad de muestras se recibieron en tubos tipo Venojet (Vacutainer Becton Dickinson) , con o sin aditivos anticoagulantes (Figura n 15). Estas muestras se fijaron sobre portaobjetos convencionales con May-Grumwald y se tieron mediante el mtodo Giemsa (Figura n 16).

Figura n 15.- Agitacin de muestras de sangre antes de proceder al anlisis.

Figura n 16.- Extensiones de sangre teidas.

De cada extensin se observaron 10 campos y se anot el nmero total de eritrocitos y piroplasmas observados por campo de microscopio. Entre los medios instrumentales utilizados se encuentran los de microscopa ptica (Nikon Labophot, Nikon Optiphot) y otros como, frigorficos, congeladores y centrfugas, etc. 4.1.7.- Diagnstico Serolgico de la PE: Inmunofluorescencia Indirecta (IFI) Desde el Servicio de Diagnstico de PE que ofrecemos en el Hospital Clnico de la UEx, siempre nos hemos planteado la utilizacin de diferentes tcnicas de diagnstico en funcin de su sensibilidad o especificidad (Habela y cols., 1989). Es cierto que cuando las muestras nos son remitidas, el clnico o el propietario en su caso, quiere saber si su animal est infectado en ese momento y si la patologa que padece es debida a la infeccin. En el caso de animales para la exportacin, lo que se necesita conocer es si presenta anticuerpos, ya que si as fuera, estos seran rechazados en la frontera del pas de destino con el coste aadido que ello supondra. La situacin es relativamente fcil en el caso de infeccines por B. caballi, ya que el curso de la infeccin termina, o bien con la muerte del animal, o bien con su curacin completa (con o sin esterilizacin). Sin embargo, en el caso de la infeccin por T. equi es muy distinto, porque una vez infectado, el animal conserva acantonada la infeccin de por vida y slo manifestar sntomas ms o menos graves ante situaciones de inmunocompromiso. La IFI detecta la presencia de los anticuerpos que los hospedadores producen tras el primer contacto con el parsito. Un caballo infectado puede llegar a ser seropositivo a esta tcnica a lo largo de toda su vida.41

MATERIAL Y MTODOS

Para la deteccin de anticuerpos frente a Theileria equi y Babesia caballi en suero sanguneo, hemos utilizado esta tcnica segn el mtodo descrito por Brocklesby (1971), ligeramente modificado por Uilenberg (1980). Entre los medios instrumentales utilizados para realizar la tcnica de IFI se encuentran los instrumentos de microscopa ptica y epifluorescencia (Nikon Labophot, Nikon Optiphot, fuente de iluminacin HBBO-100 WZ), y otros medios de laboratorio como balanzas electrnicas, frigorficos, congeladores, peachmetro, centrfugas, agitador orbital, cmara de incubacin, etc. El listado de materiales necesarios para la realizacin de todas las tcnicas y metodologas descritas en este captulo se encuentra detallado al final de ste en las tablas n 3 y n 4. El antgeno usado para la realizacin del presente trabajo, fijado sobre portaobjetos formando dos columnas de cinco gotas de antgeno cada una, provino de dos fuentes distintas: 1) Se utilizaron los portaobjetos previamente elaborados por el Servicio de Diagnstico de PE de la Unidad de Parasitologa (UEx), con antgeno de ambas especies. 2) Antes de acabar con el remanente, procedimos a la elaboracin de un nuevo stock a partir de antgeno criopreservado desde 1994, y del cultivo de cepas autctonas de B. caballi y T. equi (sangre con el 3% de eritrocitos parasitados). Para el cultivo in vitro de las cepas autctonas aisladas de B. caballi y T. equi, hemos modificado sensiblemente las condiciones del medio de cultivo previamente descrito por varios autores como Holman (1994) y Zweygarth (1995), con el fin de estandarizar un protocolo de cultivo ptimo para nuestros aislados. Los diferentes medios de cultivo ensayados fueron los siguientes: Holman, y cols., 1994; Zweygarth, y cols., 1995; Zweygarth, y cols., 1997; Holman, y cols., 1998. A continuacin, se describen los protocolos de cultivo y la tcnica empleada en la elaboracin de los antgenos: Protocolo para el cultivo in vitro de Babesia caballi El cultivo in vitro de B. caballi se inici a partir de una muestra de sangre procedente de un animal naturalmente infectado. Posteriores ensayos, realizados con otras muestras positivas remitidas desde distintas procedencias, dieron tambin resultados satisfactorios. Despus de experimentar con diferentes medios, complementos y concentraciones, conseguimos estandarizar el cultivo de los aislados autctonos de B. caballi, siendo el medio idneo en nuestras condiciones experimentales el siguiente: 1- Medio de cultivo completo:

20 ml Suero donante equino seronegativo, descongelado centrifugado y filtrado 2 horas antes de preparar el medio 500 l L-Glutamina. (Preparado en alcuotas de 50 ml). Descongelado 2 horas antes de preparar el medio 50 l Gentamicina RPMI hasta completar un volumen total de 50 ml

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2- Eritrocitos de donante seronegativo: Previo al inicio del cultivo, se extrae sangre del caballo donante, la cual se lava por centrifugacin 3 veces con buffer Vega y Martnez a 2500 rpm. Despus de cada centrifugacin se retira el sobrenadante y se aade nuevo buffer lentamente por las paredes.

Composicin del buffer Vega y Martnez para un volumen de 2000 ml:

CaCl2 2H2O KCl KH2PO4 MgSO4 7H2O Na2HPO4 Anhdrido

0.036 g 0.920 g 3.240 g 0.352 g 1.755 g

Agua desionizada hasta enrasar a 2000 ml y esterilizar el contenido en autoclave a 120C durante 30 minutos.

3- Inculo (Eritrocitos parasitados): Tomamos sangre fresca parasitada, o descongelamos criotubos con este material infectivo, mantenidos hasta entonces en nitrgeno lquido (desconge

piroplasmosis pre extremadura

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