pipeteo.conver de centrifuga y mas gc07_chap_09_es.pdf

Appendix

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Índice

Datos válidos en la fecha de impresión y salvo error tipográfico.

Descripción Pagina

I. Información general para el laboratorio

�. Abreviaturas, símbolos y unidades

1.1. Conversiones y unidades �63

1.1.1. Volumen y peso �63

1.1.2. Intervalos de tiempo �63

1.1.3. Unidades �63

1.2. Factores de conversión a unidades actuales �63

1.3. Prefijos métricos �63

1.4. Alfabeto griego �63

�. Elementos, reactivos, productos químicos e isótopos

2.1. Números atómicos y pesos atómicos de los elementos �64

2.2. Ácidos y bases �65

2.3. Isótopos – propiedades físico-químicas de los isótopos usados comunmente �65

3. Normas básicas de la dispensación

3.1. Principio de cámara de aire (desplazamiento de aire) �66

3.2. Principio de desplazamiento positivo �68

4. Técnicas de dispensación

4.1. Pipetas de cámara de aire �69

4.2. Manejo óptimo de pipetas manuales �70

4.3. Posibilidad y prevención de la contaminación �7�

5. Calibración

5.1. Procedimiento de ensayo gravimétrico �7�

6. Pautas de aplicación en la manipulación de líquidos

6.1. Descontaminación y limpieza de pipetas de cámara de aire �73

6.2. Posibles fuentes de error para el pipeteo con pipetas de cámara de aire �74

6.3. Conversión de diferentes unidades de presión �74

6.4. Datos físicos de los líquidos (ejemplos relevantes) �75

6.5. Resistencia química de desechables �76

6.6. Límites de error según EN ISO 8655 �77

6.7. Declaración de conformidad �78

7. Recomendaciones para la centrifugación

7.1. Tabla de conversión rpm/rcf (nomogramo) �79

7.2. Factores K y tiempos de centrifugación �80

II. Practical information for Molecular Biology: data, facts, tips and tricks �8�

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eneral information for the lab

1. Abreviaturas, símbolos y unidades

�.�. Conversiones y unidades

�.�.�. Volumen y peso

Volumen: Peso:

1 nl 1 µg

1 µl 1 mg

1 ml 1 g

1 l 1.000 g (1 kg)

�.4. Alfabeto griego

a A Alfa

b B Beta

g G Gamma

d D Delta

e E Épsilon

z Z Zeta

h H Eta

J Q Theta

i I Iota

k K Kappa

l L Lambda

m M My

n N Ny

x X Xi

o O Ómicron

p P Pi

r R Rho

s S Sigma

t T Tau

u U Ípsilon

j F Phi

c C Ji

y Y Psi

w W Omega

�.�.�. Intervalos de tiempo

Factores de conversión:

1 día = 1,44 x 103 min = 8,64 x 104 sec

1 año = 5,26 x 105 min = 3,16 x 107 sec

�.�.3. Unidades

Longitudes:

1 inch (in) = 2,54 cm

1 foot (ft) = 12 in = 30,48 cm

Volúmenes (GB):

1 pint (pt) = 0,5679 litros

1 quart (qt) = 2 pints = 1,1359 litros

1 gallon (gal) = 4 quarts = 4,5435 litros

Volúmenes (US):

1 pint (pt) = 0,4729 litros

1 quart (qt) = 2 pints = 0,9458 litros

1 gallon (gal) = 4 quarts = 3,7832 litros

Temperatura:

1° Kelvin (K) = °C + 273,15

1° Fahrenheit (F) = [(°C - 32) x 10] ÷ 18

�.�. Factores de conversión a unidades actuales

Tamaño: Unidad antigua: Unidad actual:

Presión 1 at 0,980665 bar

1 Atm (=760 Torr) 1,01325 bar

1 Torr 1,3332 mbar

1 mWS 0,0980665 bar

1 mmWS 0,0980665 mbar

Energía 1 mkp 9,80665 J

1 kcal 4,1868 kJ

1 erg 10-7 J

Unidad radioactividad

1 dpm 60 Bq

1 Ci = 2,22 x 1012 dpm 3,7 x 1010 Bq

1 mCi = 2,22 x 109 dpm 3,7 x 107 Bq

1 µCi = 2,22 x 106 dpm 4,7 x 104 Bq

E-Mail: [email protected] · Internet: www.eppendorf.es

�.3. Prefijos métricos

E = exa = 1018

P = peta = 1015

T = terra = 1012

G = giga = 109

M = mega = 106

k = kilo = 103

h = hecto = 102

da = deca = 101

d = deci = 10-1

c = centi = 10-2

m = milli = 10-3

µ = micro = 10-6

n = nano = 10-9

p = pico = 10-12

f = femto = 10-15

a = atto = 10-18

z = zepto = 10-21

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2. Elementos, reactivos, productos químicos e isótopos


�.�. Números atómicos y pesos atómicos de los elementos

Elemento Símbolo Número atómico Peso atómico

Actinio Ac 89 227,03

Aluminio Al 13 26,98

Americio Am 95 243,06

Antimonio Sb 51 121,75

Argón Ar 18 39,95

Arsénico As 33 74,92

Astato At 85 210,99

Azufre S 16 32,06

Bario Ba 56 137,34

Berilio Be 4 9,01

Berquelio Bk 97 247,07

Bismuto Bi 83 208,98

Boro B 5 10,81

Bromo Br 35 79,9

Cadmio Cd 48 112,4

Calcio Ca 20 40,08

Californio Cf 98 249,07

Carbono C 6 12,01

Cerio Ce 58 140,12

Cesio Cs 55 132,91

Cinc Zn 30 65,37

Circonio Zr 40 91,22

Cloro Cl 17 35,45

Cobalto Co 27 58,93

Cobre Cu 29 63,55

Criptón Kr 36 83,8

Cromo Cr 24 52

Curio Cm 96 245,07

Disprosio Dy 66 162,5

Einstenio Es 99 254,09

Erbio Er 68 167,26

Escandio Sc 21 44,96

Estaño Sn 50 118,69

Estroncio Sr 38 87,62

Europio Eu 63 151,96

Fermio Fm 100 252,08

Fluor F 9 18,99

Fósforo P 15 30,97

Francio Fr 87 223,02

Gadolinio Gd 64 157,25

Galio Ga 31 69,72

Germanio Ge 32 72,59

Hafnio Hf 72 178,49

Helio He 2 4

Hidrógeno H 1 1,01

Hierro Fe 26 55,58

Holmio Ho 67 164,93

Indio In 49 114,82

Iridio Ir 77 192,22

Iterbio Yb 70 173,04

Itrio Y 39 88,91

Khurchatovio Kh 104 260

�.�. Números atómicos y pesos atómicos de los elementos

Elemento Símbolo Número atómico Peso atómico

Lantano La 57 138,91

Laurencio Lr 103 256

Litio Li 3 6,94

Lutecio Lu 71 174,97

Magnesio Mg 12 24,31

Manganeso Mn 25 54,94

Mendelevio Md 101 255,09

Mercurio Hg 80 200,59

Molibdeno Mo 42 95,94

Neodimio Nd 60 20,183

Neón Ne 10 20,18

Neptunio Np 93 237,05

Niobio Nb 41 92,91

Niquel Ni 28 58,71

Nitrógeno N 7 14,01

Nobelio No 102 255

Oro Au 79 196,97

Osmio Os 76 190,2

Oxígeno O 8 16

Paladio Pd 46 106,4

Plata Ag 47 107,87

Platino Pt 78 195,09

Plomo Pb 82 207,2

Plutonio Pu 94 242,06

Polonio Po 84 208,98

Potasio K 19 39,1

Praseodimio Pr 59 140,91

Promecio Pm 61 145

Protactinio Pa 91 231,04

Radio Ra 88 226,03

Radón Rn 86 222,02

Renio Re 75 186,2

Rodio Rh 45 102,91

Rubidio Rb 37 85,47

Rutenio Ru 44 101,07

Samario Sm 62 150,4

Selenio Se 34 78,96

Silicio Si 14 28,09

Sodio Na 11 22,99

Talio Tl 81 204,37

Tantalio Ta 73 180,95

Tecnetio Tc 43 98,91

Teluro Te 52 127,6

Terbio Tb 65 158,93

Titanio Ti 22 47,9

Torio Th 90 232,04

Tulio Tm 69 168,93

Uranio U 92 238,03

Vanadio V 23 50,94

Volframio W 74 183,85

Xénon Xe 54 131,3

Yodo I 53 126,9

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2. Elementos, reactivos, productos químicos e isótopos

�.�. Ácidos y bases

Peso molecular % de peso Molaridad (aprox.) � M de solución (ml/litro) Densidad específica

Ácidos

Ácido acético (glacial) 60,05 99,6 17,4 57,5 1,05

Ácido fórmico 46,03 90 23,6 42,4 1,205

98 25,9 38,5 1,22

Ácido hidroclórico 36,46 36 11,6 85,9 1,18

Ácido nítrico 63,01 70 15,7 63,7 1,42

Ácido perclórico 100,46 60 9,2 108,8 1,54

72 12,2 82,1 1,70

Ácido fosfórico 98,00 85 14,7 67,8 1,70

Ácido sulfurico 98,07 98 18,3 54,5 1,835

Bases

Hidróxido de amonio 35,0 28 14,8 67,6 0,90

Hidróxido de potasio 56,11 45 11,6 82,2 1,447

Hidróxido de sodio 40,0 50 19,1 52,4 1,53

�.3. Isótopos – propiedades físicoas de los isótopos usados comunmente

Nuclidos Vida media Emisión Energía, máx. (MeV)

Rango de emisión, máx.

Material recomendado

3H 12,43 años b 0,0186 0,42 cm (aire) –14C 5.370 años b 0,156 21,8 cm (aire) –32P 14,3 días b 1,71 610 cm (aire) Vidrio acrílico (1 cm)

0,8 cm (agua) –

0,76 cm (acrílico) –33P 25,4 días b 0,249 49 cm Vidrio acrílico (1 cm)35S 87,4 días b 0,167 24,4 cm (aire) –125I 60 días g 0,27–0,035 0,2 mm (plomo) Plomo (0,02 mm)


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3.�. Principio de cámara de aire (desplazamiento de aire)

Los sistemas de dispensación funcionan de acuerdo con dos principios físicos diferentes: la dispensación de líquido tiene lugar o bien a través de una cámara de aire o mediante un desplazamiento positivo. Estos dos principios diferentes de dispensación serán

analizados a continuación, tomando como ejemplo las pipetas de émbolo y teniendo en cuenta los aspectos ergonómicos tan importantes hoy en día para los usuarios.

Las pipetas con cámara de aire constan de un émbolo y un clindro que lleva a cabo la medición real (Fig. 1). Una cámara de aire separa la muestra aspirada en una punta de plástico del émbolo que se encuentra en el interior de la pipeta. Un movimiento ascendente del émbolo produce un vacío parcial en la punta, lo que arrastra el líquido dentro de la punta. La cámara de aire desplazada por el émbolo actúa como un resorte elástico del que está sus-pendido el volumen de líquido en la punta. Gracias a la expansión

de este volumen de aire, el volumen desplazado por el émbolo es aprox. de un 2% a un 4% superior al volumen aspirado del líquido requerido. Dicha expansión se compensa mediante un factor que tiene en cuenta el volumen correcto y la altura de la elevación en la punta de la pipeta. Las variaciones de temperatura, presión de aire y humedad deben minimizarse con las pipetas de cámara de aire a través de medidas diseñadas para que la precisión de la dispensa-ción no se deteriore.

Pulsador

Indicador digital (pipeta variable)

Émbolo (cerámica)

Cierre del émbolo

Cámara de aire

Resorte de eyección de puntas

Manguito de eyección

Cono de la pipeta

Fig.�: Modelo de pipeta de cámara de aire por dentro (eppendorf Reference®)

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La figura 2 muestra el principio de diseño funcionamiento de una pipeta de cámara de aire en la posición de reposo (1). Para preparar la aspiración del líquido (2) se presiona el pulsador hasta el primer tope (recorrido de medición). El émbolo desciende, des-plazando un volumen de aire que se corresponde con el volumen de aspiración seleccionado del líquido. Para aspirar líquido (3) se sumerge en él la punta de la pipeta verticalmente. A medida que el pulsador vuelve lentamente a su posición, se crea un vacío parcial en la punta de la pipeta, aspirando el volumen requerido a través de la apertura de la punta.

Para dispensar líquido (4), se presiona lentamente el pulsador hasta el primer tope (recorrido de medición). El émbolo desciende, vaciando la punta. Para vaciar la punta completamente (“expulsión”, 5), se presiona el pulsador hasta el segundo tope (expulsión), y la pipeta se eleva con el pulsador sin presionar y se limpia contra la pared del recipiente. Cuando el pulsador vuelve atrás, el émbolo vuelve a la posición de reposo (6).La profundidad de inmersión de la punta de la pipeta tiene un efecto significativo en el resultado. Si la punta está demasiado sumergida en el líquido, se forman gotas en el exterior, falseando posiblemente el volumen de dispensación. Si la punta no está suficientemente sumergida en el líquido, se produce una turbulencia y se aspira un volumen incorrecto.

Fig. �: Funcionamiento de una pipeta de cámara de aire (Eppendorf Research®)

Rest position

Preparation for liquid aspiration

Liquid aspiration

Rest position

1. Stop (Measureing stroke)

Piston moves down

Liquid dispensing

Blow-out Tip ejection

Rest position


Piston moves down

2. Stop (Blow-out)

Blow-out

Tip ejector moves down

Tip ejector is pressed

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3.�. Principio de desplazamiento positivo

Estos sistemas que funcionan de acuerdo con el principio de des-plazamiento positivo están sujetos a influencias físicas diferentes a aquellas que se producen con los sistemas por cámara de aire descritos anteriormente. Los efectos de las cámaras de aire no son aplicables en este caso, por ello estos dispositivos son adecuados también para la dispensación de líquidos y para aplicaciones muy importantes junto con los sistemas de cámara de aire. Dichas aplicaciones incluyen: líquidos con una elevada presión de vapor, una elevada viscosidad o una elevada densidad y aplicaciones en biología molecular tales como la reacción en cadena de polime-rasa, que requiere la ausencia de aerosoles.La precisión de los sistemas de dispensación de desplazamiento positivo depende de la punta de plástico desechable en mayor medida que con los sistemas por cámara de aire. Al contrario que las puntas de plástico de los sistemas de cámara de aire, las puntas de los sistemas de desplazamiento positivo tienen un émbolo integrado que está acoplado a la varilla del émbolo del dispositivo de dispensación durante el pipeteo (Fig. 3) y que lleva a

cabo el proceso de dispensación real. Las puntas están diseñadas especialmente para utilizar sistemas de desplazamiento positivo, y no pueden sustituirse por puntas extrañas para el sistema.

La figure 4 muestra el funcionamiento de un sistemas de desplaz-amiento positivo. Para prepararse para la aspiración del líquido (1), se presiona el pulsador hasta el primer tope y el émbolo desciende hasta la posición correspondiente. Para aspirar el líquido (2), se sumerge la punta de la pipeta unos milímetros en el líquido de forma vertical; el pulsador puede entonces deslizarse hacia atrás lentamente, el émbolo asciende y se aspira el volumen requerido de líquido dentro de la punta a través del vacío parcial que se produce. Para dispensar el líquido en un recipiente (3), el puls-ador se presiona lentamente hasta el primer tope (recorrido de medición). El émbolo en la punta desciende gracias a la varilla del émbolo de la pipeta, desplazando así el líquido de la punta. El pulsador se mantiene presionado y la punta contra la pared del recipiente. Para expulsar la punta (4), se presiona el pulsador hasta el final.

Fig. 4: Funcionamiento de una pipeta de desplazamiento positivo (Eppendorf Biomaster®)

Fig. 3: Acoplamiento de una pipeta de desplazamiento positivo a una punta de pipeta compatible:

La punta tiene un émbolo integrado (2) que está conectado de forma segura durante el pipeteo con la varilla del émbolo de la pipeta (1). El líquido en la punta sólo llega al borde del sellado hermético (3), con lo que se excluye la formación de aerosoles.

Preparation for liquid

aspiration

Liquid aspiration

Liquid dispensing

Tip ejection

Rest position


Tip ejection

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4.�. Pipetas de cámara de aire

Las técnicas de dispensación utilizadas con más frecuencia son el pipeteo positivo, el pipeteo inverso, la dispensación, la dispen-sación secuencial y la dilución. Mientras que las pipetas manuales sólo son adecuadas para el pipeteo positivo y el pipeteo inverso, los sistemas electrónicos de dispensación cubren generalmente todas las funciones mencionadas. La selección de la técnica de dispensación adecuada en cada caso puede tener un impacto significativo en losl resultados del análisis.La técnica de pipeteo positivo es adecuada para soluciones acuosas que pueden contener bajas concentraciones de proteína o detergentes. Humectar previamente la punta mejora el resultado del análisis. Con líquidos viscosos o espumosos o si se dispensan vólumenes de muestras muy pequeños, pueden mejorarse mucho los resultados con el pipeteo inverso. En este caso, el líquido es aspirado con expulsión y dispensado sin expulsión. Un residuo de líquido permanece en la punta de plástico, y después es descarta-do o devuelto a un recipiente de aspiración.

Durante el proceso de dispensación, el líquido aspirado se dispensa en etapas definidas. Esta técnica se utiliza con frecuencia para el procesamiento de series largas de ensayo o relleno de placas microtest. Con dispensación secuencial, se dispensan una tras otra diferentes volúmenes de una solución en una secuencia específica. Esta técnica se utiliza con frecuencia en procesos serológicos o aplicaciones similares.

Al diluir líquidos, primero se aspira un volumen inicial, seguido de una burbuja de aire y el segundo volumen. Entonces se dispen-san ambos volúmenes en un paso. Esta técnica de dispensación aumenta el rendimiento y, en comparación con la realización de la aspiración y la dispensación, reduce la fatiga a la mitad con pipetas manuales – en particular en el caso de volúmenes considerables y pipetas multicanal.

Fig. 5: Pipeteo positivo

Aplicación recomendada para soluciones estándar como el agua, los tampones, las soluci-ones salinas diluidas, los ácidos diluidos y las lejías

�: Presionar el pulsador hasta el primer tope. Sumergir la punta unos mílimetros en el líquido.

�: Soltar despacio el pulsador. Se inicia el llenado de la punta.

3: Dispensar presionando el pulsador hasta el primer tope, y expulsar el líquido restante presionando el pulsador hasta el segundo tope.

Fig. 6: Pipeteo inverso

Aplicación recomendada para soluciones viscosas, solu-ciones con una elevada presión de vapor, disolventes muy humectantes.

�: Presionar el pulsador hasta el segundo tope. Sumergir la punta unos milímetros en el líquido.

�: Soltar despacio el pulsador. Se inicia el llenado de la punta.

3: Dispensar el líquido presionando el pulsador hasta el primer tope, en la punta permanece resto de líquido.


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4.�. Manejo óptimo de pipetas manuales

Tabla. �: Profundidad óptima de inmersión para diferentes volúmenes de pipeteo

Volumen (µl) Profundidad óptima de inmersión (mm)

0,1–1 1

1–500 2–3

101–1.000 2–4

1.001–10.000 3–6

La pipeta debe sostenerse en vertical durante la aspiración. Al aspirar el líquido, la presión hidrostática de la columna de líquido en la punta cae, pues el ángulo de inclinación de la pipeta aumenta. Como consecuencia, se produce un aumento del volumen de aspiración (Fig. 7). La desviación en volumen puede ser estimada para cualquier volumen de pipeta y cualquier ángulo de inclinación. Con un ángulo de 45° divergente de la vertical, el volumen extra con una pipeta de 1.000 µl es 2,9 µl ó 0,29%. Para una pipeta de 100 µl a un ángulo de 60°, resultará un volumen extra de 0,53 µl ó 0,53% (fig. 7).

El hecho de que personas diferentes no pipeteen exactamente el mismo volumen con la misma pipeta exactamente también se puede explicar por factores como los diferentes ángulos de inclinación al aspiración de líquido. Aunque el efecto es pequeño en cada caso, el error puede ser mucho mayor cuando se reúnen todos los factores diferenciales.

Fig. 7: Influencia de la profundidad de inmersión y ángulo de sujeción de la pipeta durante la aspiración de líquidos

Desviación de la medición sistemática 0,2–0,4%



Pipeta vertical, profundidad de la inmersión de la punta en el líquido aprox. 1 cm

Pipeta vertical, profundidad de la inmersión de la punta en el líquido aprox. 3 cm

Pipeta en el ángulo de sujeción de 30° a 40°, profundida de la inmersión de la punta en el líquido aprox. 3–4 cm


Independientemente de la técnica de dispensación empleada, deben tenerse en cuenta los siguientes elementos durante el pipeteo:

‡ En el caso de pipetas con cámara de aire, debe seleccionarse la punta de la pipeta de forma que la cámara de aire entre el émbolo de la pipeta y la superficie del líquido sea lo más pequeña posible. Cuanto más pequeña sea la punta, menos volumen de aire y mayor precisión de los resultados.

‡ Al aspirar el líquido, la punta debe sumergirse sólo unos milímetros en el medio (tab. 1, fig. 7).

‡ La punta llenada debe elevarse contra la pared del recipiente para evitar que queden residuos de líquido en el exterior de la punta.

‡ Humectar previamente la punta dos o tres veces mejorará la precisión de los resultados.

‡ El líquido debe aspirarse lentamente y de forma constante.‡ Debe permitirse un periodo de espera de 1a 3 seg para que el

líquido se eleve en la punta.

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4.3. Posibilidad y prevención de contaminación

Se hace una distinción entre tres posibles fuentes de contaminación:‡ De la pipeta a la muestra‡ De la muestra a la pipeta‡ De muestra a muestra, también conocido como carry over.

La primera fuente de contaminación es a través de una punta de pipeta o una pipeta contaminada. La contaminación de muestras se puede evitar utilizando puntas estériles de pipetas y limpiando o autoclavando la pipeta.El segundo tipo de contaminación implica el acceso de la muestra o sus aerosoles en la pipeta. Para evitarlo, la pipeta debe sostener-se en vertical durante la aspiración del líquido. También se reco-mienda expulsar inmediatamente la punta de la pipeta después de usarla para evitar entren aerosoles en la pipeta y también colocar la pipeta suspendida en el soporte de pipetas. Además, el pulsador debe elevarse lentamente en la aspiración.

La protección más eficaz contra la contaminación de pipetas es utilizar puntas con filtro. Evitan la posibilidad de que penetren ae-rosoles y contaminen la pipeta (fig. 8 izquierda). El uso de pipetas de desplazamiento positivo con puntas que ofrecen un émbolo con un sello para fugas integrado también evita la contaminación de la pipeta (fig. 8 izquierda).El tercer tipo de contaminación se produce durante la dispensación de muestras. El carry over tiene lugar cuando se adhiere parte de la muestra A a la superficie interior de la punta de la pipeta en forma de gotita. Entonces se mezcla con la muestra B, produciendo así un resultado falso del ensayo (fig. 8 derecha). Para evitar la conta-minación muestra a muestra, la punta de la pipeta debe renovarse después de dispensar cada muestra .

Fig. 8:

Evitar la contaminación de una pipeta de émbolo Contaminación de muestra a muestra

Rest of sample A in the

pipette tip

Contamination of

sample B

Piston-stroke pipette

with Standard tip

Piston-stroke pipette

with Filter tip

Positive-displacement

with integrated

piston in the tip

Protected area

Aerosol barrier

Filter

Unprotected area

Risk of contamination via aerosols

No risk of contamination via aerosols

Sealing lip of piston

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5. Calibración

5.�. Procedimiento de ensayo gravimétrico

El requisito previo para un procedimiento de ensayo gravimétrico es una balanza analítica o un dispositivo de pesado equivalente. El valor de graduación de la escala debe corresponder al volumen se-leccionado del sistema de dispensación que va a examinarse (tab. 2). Para minimizar la pérdida de la evaporación durante el pesaje, particularmente con volúmenes pequeños (< 50 µl), debe utilizarse un recipiente de pesaje adecuado para el volumen y posiblemente también una salida para la evaporación (fig. 9).

Además, deben tenerse en cuenta los siguientes puntos

durante la calibración gravimétrica:

‡ El ensayo debe realizarse en una sala sin corrientes de aire.‡ En la sala de ensayos debe haber un exceso de un 50% de

humedad relativa y una temperatura constante (±0,5 °C) de entre 15 y 30 °C.

‡ Antes del ensayo, el sistema de dispensación y el líquido de ensayo deben haber estado en vertical el tiempo suficiente en la sala de ensayos (mín. dos horas) para establecer un equilibrio con las condiciones de la sala.

‡ Los ciclos del ensayo deben ser lo más uniformes posibles. Es importante que el tiempo de medición sea lo más idéntico posible dentro de cada ciclo, así como de ciclo a ciclo, para compensar de forma fiable los efectos de la evaporación durante una serie de mediciones mediante cálculo.

‡ Debe utilizarse agua desgasificada, destilada o desionizada como líquido de ensayo.

Con pipetas variables se prueban tres volúmenes diferentes:

‡ Volumen nominal (el mayor volumen que puede ajustar el usuario y establecer el fabricante)

‡ 50% del volumen nominal‡ El límite inferior del volumen útil o el 10% del volumen nominal.

Generalmente se llevan a cabo diez mediciones por volumen de ensayo. No obstante, el usuario puede alterar el número de volúme-nes de ensayo, el número de mediciones por volumen de ensayo y, con pipetas multicanal, el número de canales probados de forma adecuada para que el ensayo satisfaga sus necesidades en cuanto a precisión.

De acuerdo con el ajuste inicial del fabricante, las pipetas y los

dispensadores deben ser probados para la dispensación de

líquido de ensayo en un recipiente de pesaje. El procedimiento

de prueba es el siguiente:

‡ El recipiente de pesaje se llena con el líquido de ensayo hasta un nivel de mín. 3 mm.

‡ Debe medirse la temperatura del líquido, la temperatura de la sala y la presión del aire. (Las temperaturas y la presión del aire son necesarios para la selección del factor Z de corrección).

‡ La pipeta dispone de la punta de pipeta adecuada, y la punta de la pipeta humectada previamente cinco veces con el líquido de ensayo para producir un equilibrio de la humedad en el volumen „justo“ de aire.

‡ Entonces se cambia la punta y se vuelve a humectar.‡ La balanza está calibrada.‡ La pipeta se sostiene verticalmente y la punta de la pipeta está

inmersa unos milímetros (véase la página 270, tab. 1) en el líquido de ensayo.

‡ Debe aspirarse lentamente y de forma constante el volumen que se desea probar. Aquí debe tenerse en cuenta un periodo de espera de 1 a 3 seg.

‡ A continuación, se saca lentamente la punta de la pipeta del líquido, secándola contra la pared del recipiente.

‡ La punta llenada se inclina contra la pared del recipiente de pesaje, y el líquido de ensayo se dispensa lentamente hasta el primer recorrido (recorrido de medición).

‡ El líquido residual se dispensa presionando el pulsador hasta el segundo tope (expulsión).

‡ El pulsador se mantiene presionado y la punta contra la pared del recipiente.

‡ El valor de pesaje, es decir, la masa del líquido pipeteado, se calcula entonces.

Todas las mediciones en una serie de mediciones se llevan a cabo tal como se ha descrito.

‡ Fig. 9: calibración de la pipeta en la balanza analítica con salida para la evaporación.

Tabla. �: Valores estándar para ensayos gravimétricos de pipetas

Desviación de medición aleatoria (imprecisión) (µl)

Escala graduación valor (mg)

Tipo de balanza

hasta 0,01 0,001 Microbalanza

hasta 0,01 0,01 Semi-microbalanza

hasta 0,01 0,1 Balanza analítica

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InfoAppendix | G




6.�. Descontaminación y limpieza de pipetas de cámara de aire

Clasificación de sustancias Recomendaciones de manipulación Descontaminación y limpieza

Soluciones acuosas y tampones La pipeta se calibra con agua destilada. Los resultados son muy precisos.

Abrir la pipeta, limpiar bien las partes contaminadas con agua destilada. Dejar secar a un máximo de 60 °C en el compartimento de secado. Lubricar el émbolo si es necesario.

Ácidos inorgánicos Es recomendable limpiar de vez en cuando la parte inferior de la pipeta con agua destilada si se pipetean con frecuencia ácidos muy concentrados.

Los plásticos utilizados en las pipetas Eppendorf son resistentes a los ácidos, pues son émbolos de cerámica (excepto al ácido fluorídrico). Sin embargo, los aerosoles ácidos pueden filtrarse en la parte inferior de la pipeta y afectar al rendimiento de la misma. Limpiar tal como se ha descrito en “Soluciones acuosas”.

Alcalinos Es recomendable limpiar de vez en cuando la parte inferior de la pipeta con agua destilada si se pipetean con frecuencia alcalinos muy concentra-dos. También se recomienda el uso de puntas con filtro.

Los plásticos utilizados en las pipetas Eppendorf son resistentes a los alcalinos, pues son émbolos de cerámica (excepto al ácido fluorídrico). Sin embargo, los aerosoles de los alcalinos pueden filtrarse en la parte inferior de la pipeta y afectar al rendimiento de la misma. Limpiar tal como se ha descrito en “Soluciones acuosas”.

Líquidos potencialmente infecciosos

Para evitar la contaminación, deben utilizarse puntas con filtro. También pueden utilizarse sistemas de desplazamiento positivo.

Autoclavar las partes contaminadas a 121 °C durante 20 min (la Eppendorf Reference puede autoclavarse por completo. Debe desmontarse de antemano desenroscando dos veces), o sumergir las partes inferiores en desinfectan-tes normales de laboratorio. Limpiar con agua destilada y dejar secar tal como se ha descrito.

Cultivos de células Para garantizar la esterilidad, deben utilizarse puntas estériles.

Proceder tal como se ha descrito en “Líquidos potencialmente infecciosos”.

Disolventes orgánicos 1. La densidad es diferente a la del agua. Por eso, es necesario ajustar la pipeta. 2. El pipeteo debe realizarse con rapidez debido a la elevada presión de vapor y a los cambios en el comporta-miento de humectación. 3. Una vez finalizado el pipeteo, abrir la pipeta y dejar que se evapore el líquido.

Por lo general, este proceso de evaporación es suficiente para líquidos con elevada presión de vapor. También se pueden sumergir las partes contaminadas en detergente, limpiar bien con agua destilada y secar tal como se ha descrito antes. Lubricar ligeramente el émbolo.

Soluciones radioactivas Para evitar contaminaciones, deben utilizarse puntas con filtro. También se pueden utilizar sistemas de desplaza-miento positivo.

Abrir la pipeta y colocar las partes contaminadas en soluciones complejantes o soluciones especiales de limpieza. Limpiar bien con agua destilada y secar tal como se ha descrito antes.

Proteínas/ácidos nucleicos Para evitar contaminaciones, deben utilizarse puntas con filtro. También se pueden utilizar sistemas de desplaza-miento positivo.

1. Proteínas: Abrir la pipeta, lavarla bien con detergente. Lavar y secar tal como se ha descrito.

2. Ácidos nucleicos: Descontaminar hirviendo en tampón de glicina/HCL (pH = 2) durante 10 minutos (esto asegura que no se detecte ADN en gel de agarosa). Lavar bien con agua destilada y secar tal como se ha descrito antes. Lubricar ligeramente el émbolo.

3. Limpiar con hipoclorito sódico (5%), lavar bien con agua destilada y secar tal como se ha descrito antes. Lubricar ligeramente el émbolo.

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6.3. Conversión de diferentes unidades de presión

Conversión Multiplicar porde a

bar Pascal (Pa) 105

bar Hectopascal (hPa) 103

bar Kilopascal (kPa) 102

millibar (mbar) Pascal (Pa) 102

millibar (mbar) Hectopascal (hPa) 1

millibar (mbar) Kilopascal (kPa) 0,1



6.�. Posibles fuentes de error para el pipeteo con pipetas de cámara de aire

Parámetros que influyen Efecto*� Puede estar influenciado por Puede ser reconocido por

Diferencia en la densidad de aire del líquido que se va a pipetear en comparación con la del agua utilizada para el ajuste

hasta 1.0% Reajustar la pipeta (observar información de usuario)

Comparar la densidad del líquido que se va a pipetear con la del agua

Diferencia en la presión de vapor del líquido que se va a pipetear en comparación con la del agua utilizada para el ajuste

hasta 2.0% Suficiente humectación previa de la punta de la pipeta; observar EN ISO 8655-6

Empapar punta

Movimiento desigual del émbolo

hasta 0.5% Funcionamiento sin problemas del émbolo; limpieza y lubricación del émbolo

Monitorizar la propia técnica de pipeteo

Ritmo desigual y tiempo durante el pipeteo

hasta 1.5% Técnica constante de pipeteo Se ha sobrepasado el número máximo de errores

Profundidad de inmersión de la punta de la pipeta y ángulo de manipulación durante el pipeteo

hasta 1.0 Sujetar la pipeta en posición vertical. Observar la información de usuario o las normas EN ISO 8655-6

Control visual de la profundidad de inmersión y el ángulo de manipulación

Error al humectar previamente la punta de la pipeta

hasta 2% Humectación previa de la punta de la pipeta

Se ha sobrepasado el número máximo de errores

Error al limpiar la punta de la pipeta contra la pared del recipiente

hasta 3.0% Limpiar la punta de la pipeta en la pared del recipiente. Observar las normas EN ISO 8655-6

Se ha sobrepasado el número máximo de errores

Puntas de pipeta que pierden

De 0.5% hasta 50%

Utilización de puntas de pipeta originales o recomendadas

Se ha sobrepasado el número máximo de errores o el empapado de la punta

*1 Las posibles desviaciones de medición son valores de referencia y aparecen en porcentajes a partir del valor nominal.

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InfoAppendix | G



6.4. Datos físicos de los líquidos (ejemplos relevantes)

Sustancia Fórmula Punto de ebullición (°C)

Densidad mg/µl (�0 °C)

Presión de vapor hPa (�0 °C)

Viscosidad mPas (�0 °C)

Acetona C3H6O 56,5 0,79 233 0,32

Ácido acético CH3COOH 118 1,06 15,4 1,53 (25 °C)

Ácido clorhídrico HCl 1,15 213 2

Ácido cloroacético CH2ClCOOH 189 1,60

Ácido fluorídrico HF 112 1,13

Ácido fórmico HCOOH 100,7 1,23 42 1,8

Ácido fosfórico H3PO4 1,71 2

Ácido nítrico HNO3 121,8 1,41 9 1,49 (40 °C)

Ácido sulfúrico H2SO4 1,84 0,0016 26,9

Ácido tricloroacético CCl3COOH 196 1,62

Amoníaco NH3 37,7 0,91 500

Butanol C4H9OH 117,2 0,81 6,7

Cloroformo CHCl3 61,7 1,47 213

Etanol C2H5OH 78,5 0,79 59 1,2

Fenol C6H5OH 181,4 1,06 1,099 (100 °C)

Glicerol C3H8O3 290 1,26

Metanol CH3OH 65 0,79 128 0,597

2-Propanol (alcohol isopropilo) C3H7OH 82,4 0,78 42,5 2,2

Solución hidróxido potásico KOH 1,29

Solución hidróxido sódico NaOH 1,33 19


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6.5. Resistencia química de los consumibles

Sustancia Fórmula Concentración (%)

PE (Polietileno)

PP (Polipropi-leno)

PC (Policarbo-nato)

PS (Poli- estireno)

Acetaldehído CH3CHO 40 0 4 2 2 4 4 4 4

Ácido acético CH3COOH 96 1 2 1 2 3 3 3 4

Ácido fluorídrico HF hasta 40 2 2 2 2 4 0 1 1

Ácido tricloroacético CCl3COOH 100 3 4 1 1 2 2 0 0

Aqua regia 4 4 3 4 4 4 3 4

Benceno 100 3 4 3 4 4 4 4 4

Bencina 100 3 4 3 4 2 2 3 4

Butanol C4H9OH 100 1 3 1 3 1 1 1 1

Diclorometano CH2Cl2 100 4 4 3 4 0 0 0 0

Dioxano C4H8O2 100 2 3 3 3 4 4 4 4

Éter dietílico (C2H5)2O 100 2 3 3 0 4 4 4 0

Éter de petróleo 100 3 3 2 3 2 3 3 3

Fenol C6H5OH Saturada de agua 1 1 1 1 3 3 3 4

Glicerol C3H5(OH)3 1 1 1 1 1 1 1 1

Hipoclórito sódico diluido 2 3 1 2 2 0 2 3

Metanol CH3OH 100 2 3 2 2 2 2 1 1

Piridina 100 2 3 3 3 3 3 4 4

Polietilenglicol (PEG) 40 1 1 0 0 0 0 0 0

Solución hidróxido sódico hasta 40 1 1 1 1 3 3 1 1

*1 ¡Atención! Ataca al émbolo de cerámica de la pipeta.Primer número: resistencia química a 20 °C, segundo número: a 50 °C1 = Resistente; el material no cambia ni siquiera después de estar mucho tiempo en contacto con la sustancia correspondiente.2 = Prácticamente resistente; el material no cambia después de estar varias semanas en contacto con la sustancia.3 = Conditionalmente resistente; si el material ha estado en contacto con la sustancia sólo durante un corto periodo de tiempo, no cambia.4 = No resistente; el material cambia incluso tras un breve contacto con la sustancia.0 = Ningún valor disponible.


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6. Puntas de aplicación en la manipulación de líquidos

6.6. Límites de error según EN ISO 8655

Según la norma EN ISO 8655, los límites de error se refieren siempre al sistema formado por la pipeta y la punta de pipeta. Los límites de error referidos al volumen nominal son válidos para el volumen útil total de la pipeta de émbolo, es decir para una pipeta con émbolo y volumen variable de 10 µl a 100 µl, el límite para los errores sistemáticos es de ± 0,8 µl y el límite para los errores aleatorios es de ± 0,3 µl para cada volumen medido.

Si el volumen nominal de una pipeta se encuentra entre dos volúmenes nominales de los indicados en la Tabla 1, los límites de error absolutos son válidos para el volumen nominal siguiente. La fórmula para calcular los límites de error en relación al volumen nominal es:

El volumen nominal de una pipeta de émbolo y volumen variable es el mayor volumen regulable por el usuario y el mayor volumen establecido por el fabricante.

A continuación se indican los límites de error de la norma EN ISO 8655 en relación al volumen.

Errores sistemáticos: desviaciones del volumen dosificado en relación al volumen nominal o del volumen seleccionado del aparato con émbolo. El error se calcula haciendo la media de los valores obtenidos en 10 mediciones.

Errores aleatorios: desviación de los volúmenes dosificados en relación a la media resultante de los volúmenes dosificados, se obtiene calculando la discrepancia media obtenida en 10 mediciones.

a) Pipetas de émbolo monocanal con cámara de aire

Volumen nominal µl � � 5 �0 �0 50 �00 �00 500 �.000 �.000 5.000 �0.000

Límites de los errores sistemáticos

±µl 0,05 0,08 0,125 0,12 0,2 0,5 0,8 1,6 4,0 8,0 16 40 60

Límites de los errores aleatorios

±µl 0,05 0,04 0,075 0,08 0,1 0,2 0,3 0,6 1,5 3,0 6,0 15,0 30,0

b) Los límites de los errores sistemáticos y aleatorios de las pipetas multicanal con émbolo son el doble de los valores indicados en la tabla para las pipetas monocanal de émbolo. Esta condición es válida para cada canal de la pipeta multicanal de émbolo.

c) Dosificador múltiple (Multipette)

Volumen nominal ml 0,00� 0,00� 0,003 0,0� 0,0� 0,05 0,� 0,� 0,5 � � 5 �0 �5 50 �00 �00


±µl 0,05 0,1 0,075 0,2 0,3 0,5 1,0 2,0 5,0 10 16 30 50 125 250 500 1.000


±µl 0,05 0,1 0,11 0,25 0,4 0,75 1,0 2,0 3,0 4,0 8,0 15 30 75 125 250 500

d) Dosificador sencillo (Varispenser)

Volumen nominal ml 0,0� 0,0� 0,05 0,� 0,� 0,5 � � 5 �0 �5 50 �00 �00


±µl 0,2 0,4 0,75 1,5 2,0 5,0 6,0 12 30 60 150 300 600 1.200


±µl 0,1 0,1 0,2 0,3 0,6 1,0 2,0 4,0 10 20 50 100 200 400

Límite de error [µl] x �00%

Volumen nominal [µl]


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6. Puntas de aplicación en la manipulación de líquidos

6.7. Declaración de conformidad

Resultados analíticos seguros en los laboratorios médicos requieren precisión en cada uno de los pasos de trabajo: comenzando con el pipeteo pasando por el análisis hasta llegar a la evaluación. Cuanto más pequeñas sean las tolerancias de errores de cada uno de los instrumentos, mayor serán la exactitud y precisión de los resultados.

Para que el laboratorio esté desde el inicio en el lado seguro, existe el certificado de conformidad para pipetas y puntas de pipeta.

Este certificado garantiza que los límites de error fijados por la norma EN ISO 8655 no se sobrepasan y que se cumplen las normativas legales.

Todas las pipetas de la marca Eppendorf se caracterizan por su gran exactitud y precisión.Para los siguientes productos certificamos el cumplimiento de las normas de calibración.

Monocanal de volumen fijo

Research® fix Todos los volúmenes

Reference® fix Todos los volúmenes

Monocanal de volumen variable

Reference® Todos los volúmenes

Research® Todos los volúmenes

Research® pro Todos los volúmenes

Varipette® 48�0 Todos los volúmenes

Varipette® 47�0 En todas las combinaciones

Multicanal

Research® Todos los volúmenes

Research® pro Todos los volúmenes

Multipette® plus

En combinación con todos los Combitips® plus

Multipette® Stream/Xstream

En combinación con todos los Combitips® plus (modo dispensador)

Dispensadores de frasco

Todos los volúmenes

Esto es válido para el “equipo” formado por pipetas y puntas de pipeta.

En Eppendorf se puede conseguir todo de una sola mano. Si bien es verdad que se pueden utilizar puntas de pipeta de otros fabricantes, no es menos cierto que la

seguridad sólo es posible si se cumplen los requisitos de las normas EN ISO, utilizando puntas de pipeta específicas para cada pipeta con certificado de conformidad. Los usuarios responsables utilizan el “equipo” Pipeta-Punta de pipeta, marcado con la común señal de conformidad.


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7.�. Tabla de conversión rpm/rcf (nomogramo)

Radio de centrifugación r de un punto a una distancia h del fondo del tubo con un rotor de ángulo fijo de 45°:

r = rmax – h x 0,71

Ejemplo de aplicación (bosquejo):rmax = 7,2 cmn = 14.000 1/minrcfmax = 16.000 x g

Tenga en cuenta que las centrífugas Eppendorf MiniSpin plus, 5415 D, 5415 R, 5417 C, 5417 R, 5418, 5424, 5430, 5702, 5702 R, 5702 RH, 5804, 5804 R, 5810 y 5810 R tienen una conversión automática rpm/fcr, no siendo necesario realizar cálculos complicados, al menos para el rotor estándar. El radio máximo de la MiniSpin es de 6 cm.

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7.�. Factores K y tiempos de centrifugación

El factor K es un valor determinado fundamentalmente por el rotor y que influye en el tiempo de sedimentación. Coloquialmente hablando, este valor es una medida para el tramo de sedimentación en el tubo de centrifugación, es decir, para la diferencia entre la distancia mínima y máxima de una muestra respecto al eje del rotor. Cuanto más grande es este tramo, mayor es el tiempo necesario para la separación en el tubo. Es evidente que el factor K depende del ángulo de los tubos en el rotor y de los tubos analizados. Un factor K pequeño es útil para una separación más rápida. El factor K está influenciado además por el número de revoluciones. Cuanto mayor sea este número, más rápida será la separación.

La fórmula es:

n = Velocidad; rmin y rmax: ver la figura

La fórmula para el cálculo del tiempo de centrifugación relativo es:

t = tiempo de centrifugación calculado experimentalmente en la centrífuga de comparación

tx = tiempo de centrifugación necesario en la centrífuga X

k = factor K de la centrífuga de comparación

kx = factor K de la centrífuga X

La comparación directa de rendimiento entre dos rotores es posible, si se calcula la velocidad relativa de una separación en ambos rotores.

Ejemplo:

El rotor de ángulo fijo de 30 posiciones de la centrífuga 5417 C ó 5417 R tiene un factor K de 377 (con microtubo Safe-Lock de Eppendorf de 1,5 ml) a un número de revoluciones máximo de 14.000 min-1 y a una fuerza de centrifugación relativa de 20.800 x g. Con el mismo microtubo y el mismo ángulo de rotor (45º), el rotor de ángulo fijo de 18 posiciones de la centrífuga 5415 C alcanza con el mismo número de revoluciones máximo (14.000 min-1) una fuerza de centrifugación relativa de 16.000 x g y un factor K de 525.

En el ejemplo de la 5417 C y 5415 C resulta un tiempo de centrifugación de 10 minutos para la 5415 C y un tiempo de centrifugación de sólo 7 minutos para la 5417 C para lograr el mismo rendimiento de separación.

Para establecer el tiempo de centrifugación, es conveniente tener también en cuenta las características físicas de la centrífuga a utilizar, especialmente cuando se vayan a centrifugar muestras críticas y cantidades pequeñas de muestras.

Separation example:


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InfoAppendix | Info

Index: Practical information for Molecular Biology


Description Page

II. Practical information for Molecular Biology: data, facts, tips and tricks

�. Abbreviations, symbols, conversion factors and data

1.1. Metric prefixes �8�

1.2. Abbreviations and symbols �8�

1.3. Tris-HCl Buffer, pH-Values �8�

1.4. Nucleic acid conversions �8�

1.4.1. Conversion of weight to absolute quantity (mol) �8�

1.4.2. Conversion of absolute quantity (mol) to weight �8�

1.4.3. Molecular weight of DNA fragments �83

1.4.4. Molecular weights for nucleotides �83

1.5. Protein conversions �83

1.5.1. Conversion of proteins to DNA length �83

1.5.2. Conversion of absolute quantity (mol) to weight �83

1.6. DNA content of various organisms �83

�. Genetic code, properties and molecular structure of amino acids

2.1. Genetic code �84

2.2. Nomenclature and properties of amino acids �84

2.3. Molecular structure of amino acids �85

3. Detection of nucleic acids and proteins

3.1. Electrophoretic resolution �86

3.1.1. Recommended agarose gel percentages for resolution of DNA �86

3.1.2. Recommended polyacrylamide gel percentages for resolution of DNA �86

3.1.3. Recommended polyacrylamide gel percentages for resolution of proteins �86

3.2. Dye migration in electrophoresis �86

3.2.1. Dye migration in polyacrylamide nondenaturing gels �86

3.2.2. Dye migration in polyacrylamide denaturing gels �86

3.3. Spectrophotometric conversion of nucleic acids and proteins �87

3.3.1. Physical properties of nucleotides �87

3.3.2. Biophysical data for deoxynucleoside triphosphates �87

3.3.3. Conversion to concentration (µg/ml) �87

3.3.4. Quantification made easy �88

4. Application tips for PCR

4.1. Procedure and conditions for the PCR �89

4.2. Calculating primer quantity �9�

4.2.1. Conversion to absolute quantity (in pmol) �9�

4.2.2. Conversion to weight (in µg) �9�

4.2.3. Calculating the molar concentration of the primer �9�

4.3. Using gradient PCR to optimize different reaction parameters �9�

4.4. Eppendorf® thermal cycler and SteadySlope® technology �93

4.5. Optimization of the Primer concentration (Primer-Matrix) �94

PCR disclaimers �94

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�.4. Nucleic acid conversions

�.4.�. Conversion of weight to absolute quantity (mol)

1 µg of 1,000 bp DNA = 1.52 pmol = 9.1 x 1011 molecules

1 µg of pUC18/19 DNA (2,686 bp) = 0.57 pmol = 3.4 x 1011 molecules

1 µg of pBR322 DNA (4,361 bp) = 0.35 pmol = 2.1 x 1011 molecules

1 µg of M13mp18/19 DNA (7,250 bp) = 0.21 pmol = 1.3 x 1011 molecules

1 µg of l-DNA (48,502 bp) = 0.03 pmol = 1.8 x 1010 molecules

�.4.�. Conversion of absolute quantity (mol) to weight

1 pmol of 1000 bp DNA = 0.66 µg

1 pmol of pUC18/19 DNA (2,686 bp) = 1.77 µg

1 pmol of pBR 322 DNA (4,361 bp) = 2.88 µg

1 pmol of M13mp18/19 DNA (7,250 bp) = 4.78 µg

1 pmol of l-DNA (48,502 bp) = 32.01 µg

1. Abbreviations, symbols, conversion factors and data

�.�. Abbreviations and symbols

ds double-stranded (as in dsDNA)

ss single-stranded (as in ssDNA)

bp base pair

kb kilobase: 1,000 bases or base pairs, as appropriate

nt Nucleotides (base)

Mb megabase: 1,000,000 bp

Da Dalton, the unit of molecular mass; kDa = 1,000 Da, MDa = 1,000,000 Da.

MW molecular weight (g/mol)

M Molar or molarity, moles of solute per liter of solution (mol/L)

mol Mole, absolute amount of a substance (1 mol = 6.023 x 10E23, Avogadro number)

l wavelength

lmax wavelength at the absorption maximum

�.3. Tris-HCl buffer, pH values

5 ºC 7.76 7.89 7.97 8.07 8.18 8.26 8.37 8.48 8.58 8.68 8.78 8.88 8.98 9.09 9.18 9.28

�5 ºC 7.20 7.30 7.40 7.50 7.60 7.70 7.80 7.90 8.00 8.10 8.20 8.30 8.40 8.50 8.60 8.70

37 ºC 6.91 7.02 7.12 7.22 7.30 7.40 7.52 7.62 7.71 7.80 7.91 8.01 8.10 8.22 8.31 8.42

�.�. Metric prefixes

E = exa = 1018

P = peta = 1015

T = terra = 1012

G = giga = 109

M = mega = 106

k = kilo = 103

h = hecto = 102

da = deca = 101

d = deci = 10-1

c = centi = 10-2

m = milli = 10-3

µ = micro = 10-6

n = nano = 10-9

p = pico = 10-12

f = femto = 10-15

a = atto = 10-18

z = zepto = 10-21

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InfoAppendix | Practical inform

ation for Molecular B

iology


1. Abbreviations, symbols, conversion factors and data

�.4.3. Molecular weight of DNA fragments

500 bp dsDNA = 325,000 Da

500 nt (nukleotide) ssDNA = 162,500 Da

1 kb dsDNA = 660,000 Da

1 kb ssDNA = 330,000 Da

1 kb ssRNA = 340,000 Da

1 MDa dsDNA = 1.52 kb

Average molecular weight of dNMP = 325 Da

Average molecular weight of DNA base pair

= 650 Da

�.4.4. Molecular weights for nucleotides

Compound Molecular weight (in Dalton)

ATP 507.2

CTP 483.2

GTP 523.2

UTP 484.2

dATP 491.2

dCTP 467.2

dGTP 507.2

dTTP 482.2

AMP 347.2

CMP 323.2

GMP 363.2

UMP 324.2

dAMP 312.2

dCMP 288.2

dGMP 328.2

dTMP 303.2

�.5. Protein conversions

�.5.�. Conversion of proteins to DNA length

Protein with a molecular weight of 10,000 = 270 bp DNA

Protein with a molecular weight of 30,000 = 810 bp DNA

Protein with a molecular weight of 37,000 (corresponds to 333 amino acids) = 1,000 bp DNA

Protein with a molecular weight of 50,000 = 1.35 kb DNA

Protein with a molecular weight of 100,000 = 2.7 kb DNA

�.5.�. Conversion of absolute quantity (mol) to weight

100 pmoles of 100,000 Da protein = 10 µg



�.6. DNA content of various organisms

Organism DNA content (in bp) (haploid Genome)

Escherichia coli 4.2 x 106

Arabidopsis thaliana 4.7 x 106

Saccharomyces cerevisiae 1.4 x 107

Drosophila melanogaster 1.4 x 108

Homo sapiens 3.3 x 109

Triticum aestivum (hexaploid wheat) 1.7 x 1010

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U C A G

U U

C

A

G

C U

C

A

G

A U

C

A

G

G U

C

A

G

2. Genetic code, properties and molecular structure of amino acids

Termination codons:

UAA: ochre

UAG: amber

UGA: opal

�.�. Nomenclature and properties of amino acids

Amino acid 3-letter symbol �-letter symbol Major properties of side chains

Alanine Ala A Aliphatic

Arginine Arg R Basic group

Asparagine Asn N Amide group

Aspartic acid Asp D Acidic group

Cysteine Cys C Sulfur-containing

Glutamic Acid Glu E Acidic group

Glutamine Gln Q Amide group

Glycine Gly G No side chain

Histidine His H Imidazole group

Isoleucine Ile I Aliphatic

Leucine Leu L Aliphatic

Lysine Lys K Basic group

Methionine Met M Sulfur-containing

Phenylalanine Phe F Aromatic group

Proline Pro P Aliphatic

Serine Ser S Hydroxyl group

Threonine Thr T Hydroxyl group

Tryptophan Trp W Aromatic group

Tyrosine Tyr Y Aromatic group

Valine Val V Aliphatic


�.�. Genetic code

�nd Codon position

�st C

od

on

po

siti

on

U C A G

3rd C

od

on p

ositio

n

U UUU Phe UCU Ser UAU Try UGU Cys U

UUC UCC UAC UGC C

UUA Leu UCA UAA Stop UGA Stop A

UUG UCG UAG Stop UGG Trp G

C CUU Leu CCU Pro CAU His CGU Arg U

CUC CCC CAC CGC C

CUA CCA CAA Gln CGA A

CUG CCG CAG CGG G

A AUU Ile ACU Thr AAU Asn AGU Ser U

AUC ACC AAC AGC C

AUA ACA AAA Lys AGA Arg A

AUG Met, Start ACG AAG AGG G

G GUU Val GCU Ala GAU Asp GGU Gly U

GUC GCC GAC GGC C

GUA GCA GAA Glu GGA A

GUG GCG GAG GGG G

In yeast mitochondria, the AUA and UGA codons are used for Met and Trp, not for Ile and Stop as normally.Start codon:AUG: Methionine

�5



iology

2. Genetic code, properties and molecular structure of amino acids

�.3. Molecular structure of amino acids

Alanine (Ala)

Arginine (Arg)

Asparagine (Asn)

Aspartic acid (Asp)

Cysteine (Cys)

Glutamine (Gln)

Glutamic acid (Glu)

Glycine (Gly)

Histidine (His)

Isoleucine (Ile)

Leucine (Leu)

Lysine (Lys)

Methionine (Met)

Phenylalanine (Phe)

Proline (Pro)

Serine (Ser)

Threonine (Thr)

Tryptophan (Trp)

Tyrosine (Tyr)

Valine (Val)


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3. Detection of nucleic acids and proteins

3.�. Electrophoretic resolution

3.�.�. Recommended polyacrylamide gel percentages for resolution of DNA

Gel percentage DNA size range

3.5% 1,000–2,000 bp

5.0% 75–500 bp

8.0% 50–400 bp

12.0% 35–250 bp

15.0% 20–150 bp

20.0% 5–100 bp

3.�. Dye migration in electrophoresis

3.�.�. Dye migration in polyacryamide denaturing gels

Gel percentage Bromophenol blue Xylene cyanol

5.0% 35 nucleotides 130 nucleotides





3.�.�. Recommended agarose gel percentages for resolution of DNA

Gel percentage DNA size range

0.5% 1–30 kb

0.7% 0.8–12 kb

1.0% 0.5–10 kb

1.2% 0.4–7 kb

1.5% 0.2–3 kb

3–4% sieved agarose 0.01–1 kb

3.�.�. Dye migration in polyacryamide nondenaturing gels

Gel percentage Bromophenol blue Xylene cyanol

3.5% 100 bp 460 bp

5.0% 65 bp 260 bp

8.0% 45 bp 160 bp

12.0% 20 bp 70 bp

15.0% 15 bp 60 bp

20.0% 12 bp 45 bp


3.�.3. Recommended polyacrylamide gel percentages for resolution of proteins

Gel percentage Protein size range

5% 57 – 212 kDa

7.5% 36 – 94 kDa

10% 16 – 68 kDa

15% 12 – 43 kDa

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iology

3.3.3. Conversion to concentration (µg/ml)

Double-stranded DNA (dsDNA): A260 = OD260 = 1 for a 50 µg/ml dsDNA-solution*

Single-stranded RNA: A260 = OD260 = 1 for a 40 µg/ml RNA-solution*

Single-stranded DNA (ssDNA): A260 = OD260 = 1 for a 33 µg/ml ssDNA-solution*

Absorbance is calculated as: Molar extinction coefficient x concentration x path length (usually cuvette width)

* These values apply when using a neutral-to-light alkaline measuring medium and a cuvette optical path length of 1 cm.


3. Photometric detection of nucleic acids and proteins

3.3. Spectrophotometric conversion of nucleic acids and proteins

3.3.�. Biophysical data for deoxynucleoside triphosphates

Component Molecular weight (Daltons) Molar extinction coefficient and l max

dATP 491 15,200 at 259 nm

dCTP 467 9,300 at 271 nm

dGTP 507 13,700 at 253 nm

dTTP 482 9,600 at 267 nm

3.3.�. Physical properties of nucleotides

Compound Molecular weight l max (pH 7,0) Absorbance at l max of a � M solution (pH 7.0)

ATP 507.2 259 nm 15,400

CTP 483.2 271 nm 9,000

GTP 523.2 253 nm 13,700

UTP 484.2 260 nm 10,000

dATP 491.2 259 nm 15,400

dCTP 467.2 272 nm 9,100

dGTP 507.2 253 nm 13,700

dTTP 482.2 267 nm 9,600

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3. Photometric detection of nucleic acids and proteins

3.3.4. Quantification made easy

With the aid of spectroscopy, the quantitative analysis of nucleic acids and proteins has established itself as a routine method in many laboratories. It includes absorption measurements in the ultraviolet and visible ranges. Proteins are measured (directly) at 280 nm and nucleic acids at 260 nm; colorimetric protein determination is performed in the 550 nm to 600 nm range.

The Eppendorf® BioPhotometer offers the following preinstalled test procedures:

�. Nucleic acid determination

DNA, RNA, oligonucleotides and even mononucleotides can be measured directly in aqueous solutions. Aqueous buffers with low ion concentrations (e.g., TE buffer) are ideal for this method. The concentration is determined by measuring at 260 nm against a blank and then calculating via a factor. Normally, the user has to calculate the concentration of the measured sample using the appropriate factor. The BioPhotometer can change these factors easily and will do all necessary calculations.

The absorption of 1 OD at 260 nm is equivalent to approximately 50 µg/ml dsDNA, 37 µg/ml ssDNA, 40 µg/ml RNA or 30 µg/ml for oligonucleotides. Purity determination of DNA interference by contaminants can be recognized by ratio calculations. The ratio A260/A280 is used to estimate the purity of nucleic acid since proteins absorb at 280 nm. Pure DNA should have a ratio of approximately 1.8, whereas pure RNA should give a ratio of approximately 2.0. Absorption at 230 nm reflects contamination of the sample by substances such as carbohydrates, peptides, phenols or aromatic compounds. In the case of pure samples, the ratio A260/A230 should be > 2.0.

�. Protein determination

The protein content of a sample can be determined by various analytical procedures using the BioPhotometer. Calculations can be performed via factor or via a calibration curve with up to 10 standards.

�.� Absorption measurement at �80 nm (A�80)

A280 method may be used in concentrations of up to approximately 4 mg/ml (3.0 A). This method is simple and rapid, but it may be disturbed by the parallel absorption of nonproteins (e.g., DNA). Unlike the colorimetric process, this method is less sensitive, requires higher protein concentrations and should thus be used with pure protein solutions. In addition to the direct absorbance display, evaluation is possible with the BioPhotometer via the Warburg formula or against a standard.

�.� Colorimetric determination (dye tests)

Protein samples often consist of a complex mixture of many different proteins. The quantitative detection of the protein content is usually based on the reaction shown by functional groups of the proteins to dye-forming reagents. The intensity of the dye correlates directly with the concentration of the reacting groups and can be measured exactly. Different methods for dye-quantification are available depending on the type of dye being used:

�.�.� Lowry assay

Specialist literature contains a multitude of modifications for the Lowry assay. The principal goal is to reduce the high susceptibility to interference. In comparison to the pure Biuret assay, the sensitivity of this assay is greatly increased. However, the Lowry method is adversely affected by a wide range of nonproteins. Additives such as EDTA, ammonia sulfate or Triton® X-100, in particular, are incompatible with the test.

�.�.� Bicinchoninine acid assay (BCA)

This test represents a highly regarded alternative to the Lowry assay. It is easier to perform, sensitivity can be varied using different temperatures and the dye complex is very stable. In addition, its sensitivity to detergents is similar to that of the Lowry method. This test is also highly susceptible to interference.

�.�.3 Bradford assay

This most rapid and easiest method to use is twice as sensitive as the Lowry or BCA tests and is thus the most sensitive quantitative dye assay. Its additional advantage is that a number of reducing substances (e.g., DTT and mercaptoethanol), which interfere with the Lowry or BCA test, have no adverse effect on results; ho-wever, it is sensitive to several detergents. The main disadvantage is that identical amounts of different standard proteins can cause considerable differences in the resulting absorption coefficients.

3. Bacterial cell density

The density of bacterial suspensions may be measured photometrically at OD600 without adding dyes. This applies, for example, to the preparation of competent cells, which must be in a specific phase of growth.

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iology



4.�. Procedure and parameters for PCR

This PCR table is intended to provide all PCR newcomers with an overview of the common rules and concentrations that should be observed when developing their experiments.

There are, of course, a number of exceptions and special points that we are unable to accommodate in the table.

We invite you to send us any comments or tips of general interest on this topic. References: Sambrook, J., Fritsch EF., Maniatis T. Molecular cloning, 2nd ed. New York; Cold Spring Harbor Laboratory Press: 1989

Steps Basic rules Comments

�No. of source molecules No. of cycles Do only perform as many cycles as necessary

to obtain sufficient PCR product. With too many cycles the formation of unspecific products may occur.

For calculation of molecule number please refer to table 1.4.1 and 1.4.2 on page 282

105 25–30

104 30–35

No. of cycles 103 35–40

50 and less 20–30 followed by a second PCR with “nested” primers, i. e. with a primer pair that binds between the first two primers of the target sequence

�‡ 95 °C for 30 s or 97 °C for 15 s

‡ For complex templates (e.g. genomic DNA) begin with an initial denaturation for 2–3 min before the actual cycles

‡ G/C content greater than 50% increases the denaturation temperature

Inefficient denaturation is a frequent cause of errors. However:

‡ T½ Taq at 92.5 °C = 2 h

‡ T½ Taq at 95.0 °C = 40 min

‡ T½ Taq at 97.5 °C = 5 min

(T½ = half life of Taq at a specific temperature)

Denaturation step

3For standard primers (approx. 20 nucleotides [nt]; 1 µM; 100% match)

‡ Approx. 20 s, Tm should be approx. 55-72°C

‡ Low concentrations and long primers extend necessary annealing times. The optimal an-nealing temperature is normally 5-10°C lower than the primer melting temperature (Tm). The Tm value can be calculated using the following formulas:

‡ Tm = (A+T) x 2 + (C+G) x 4 [Wallace], up to approx. 20 nt

‡ Tm = 81.5 °C + 16.6 (log[Na+]) + 0.41 (%G+C) – (500/n) – 0.61 (%FA) [Meinkoth and Wahl]; FA = Formamide

Annealing step

4‡ 1 kb require approx. 1 min ‡ The shorter the fragment, the easier it is to

control the reaction

‡ 200–500 bp fragments are sufficient for most detection reactions

Elongation step

5Initial denaturation: 2 min 94 °C

Denaturation: 0.5 min 94 °C

Annealing: 0.5 min 50–68 °C 25–35 cycles

Elongation: 1 min/kb 72 °C

Final elongation: 10 min 72 °CBasic thermo cycling protocol

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4.�. Procedure and parameters for PCR

Reagents Basic rules Comments

Buffers

The most common components (as 10x buffers):

‡ 500 mM KCl

‡ 100 mM Tris-HCl, pH 8.3 (at 25 °C) or 150–200 mM (NH4)2SO4 with 500–750 mM Tris-HCl, pH 9 (at 25 °C)

‡ 1–2% Triton® X-100 or 0.1% Tween®

‡ 10–15 mM Mg2+ (usually available separately)

‡ The buffers delivered with the polymerase are specially tailored to this variety, and it is often not possible to use them with enzymes from other manufacturers

‡ NaCl concentrations greater than 50 mM inhibit the Taq polymerase

‡ Mg2+ must be added (if not present in buffer) as Mg2+ is essential as a cofactor for the DNA polymerase

Mg�+

‡ 0.5–3.5 mM in the assay

‡ Essential as a cofactor of the DNA polymerase

‡ If dUTP is used instead of dTTP, the Mg2+ concentration usually must be increased (max. 5 mM).

‡ Concentration too high: promotes the amplification of nonspecific fragments (smears appear); increases the melting temperature

‡ Concentration too low: reduces annealing efficiency and the synthesis rate of the polymerase

Taq Polymerase

‡ 0.5 - 2.5 units per PCR reaction ‡ Concentration too high: reduced specificity

‡ Concentration too low: reduced efficiency

‡ Please see step 2, “Denaturation step”

dNTP

‡ Storage in 10 mM, pH 7.0 aliquots

‡ 20–200 µM in the assay

‡ Concentration too high: leads to mispriming and the misincorporation of nucleotides

‡ Following a successful PCR, theoretically the major part of the dNTPs are left over

‡ All nucleotides must have the same concentration

‡ Modified nucleotides must have a higher concentration

Primer

‡ 0.1–1 µM in the assay

‡ Length: approx. 15–30 nt

‡ Secondary structures should not be able to form (Stemloop, Hairpin)

‡ Primer must not be complementary at the 3‘ ends, as this will lead to the formation of primer-dimers

‡ Both primers should have the same Tm

‡ No stretches of individual nucleotides

‡ G or C at the 3‘ end improves binding

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iology



4.�. Calculating primer quantity

4.�.�. Conversion to absolute quantity (in pmole)

Primer in pmole =Weight in µg x 1,000,000

Length x 327

Example: 0.1 µg of 20 oligomer:

0.1 x 1,000,000= 15.3 pmole primer

20 x 327

4.�.3. Calculation of the molar concentration of the primer

Micromolar concentration of primer = pmol/µl

Example � Example �

20 pmol of primer in 100 µl PCR mixture = 0.20 micromolar (µM) Primer is 24 nucleotides in length and is dissolved in 0.1 ml of water

A 10 µl aliquot is diluted to 1.0 ml for A260 measurement: A260 = 0.76. The stock solution has an absorbance at 260 nm (A260) of 76. The stock solution (0.1 ml) contains 2.6 A260 units.

The base composition of the primer is:

A = 6 C = 6 G = 6 T = 6

The Molar Extinction Coefficient at 260 nm for the primer = k (15,200) + l (12,010) + m (7,050) + n (8,400) where:

k = number of A’s m = number of G’s l = number of C’s n = number of T’s

The Molar Extinction of the PCR primer = 6 (15,200) + 6 (12,010) + 6 (7,050) + 6 (8,400) = 255,960a

The Molar concentration of the PCR primer stock solution is76

= 297 micromolar255,960

For more information on DNA quantification, see page �88.

4.�.�. Conversion to weight (in µg)

Weight in µg =pmol x Length x 327

1,000,000

Example: 10 pmol of 25 oligomer:

10 x 25 x 327= 0.081 µg primer

1,000,000

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300 bp

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14

53 °C 67 °C

4.3. La PCR de gradientes para optimizar diferentes parámetros de reacción


La PCR en gradientes es una técnica que permite determinar empíricamente las condiciones óptimas para la PCR dando los menos pasos posibles. Esta optimización puede obtenerse a menudo mediante un solo ensayo. Tanto el termociclador del nuevo sistema Mastercycler ep como el clásico de la serie Mastercycler ofrecen una función de gradiente que permite llevar a cabo, durante una única sesión, el análisis de hasta 12 ó 24 temperaturas diferentes de anillamiento, elongación y/o desnaturalización. Durante la misma sesión es posible además chequear una serie de otros parámetros de reacción, fila por fila.Durante la amplificación de un fragmento específico de ADN es posible que se produzcan problemas en el trabajo cotidiano de laboratorio. A menudo se generan después de la reacción PCR bandas secundarias no específicas que dificultan o imposibilitan otras aplicaciones posteriores o bien la evaluación correcta del resultado de la PCR. En estos casos debe llevarse a cabo una optimización de las condiciones PCR.

l Fig. �: Determinación de la temperatura ideal de anillamiento.

Temperatura de anillamiento

La selección de la temperatura de anillamiento es, en este proceso, el componente más crítico para la optimización de la especificidad de una reacción PCR. En la mayoría de los casos debe comprobarse este parámetro empíricamente.La formación de bandas secundarias no específicas demuestra que la temperatura óptima es a menudo muy superior a la calculada (hasta 12 °C más).

Los termocicladores con gradiente de Eppendorf permiten comprobar rápidamente las condiciones óptimas de temperatura en un solo bloque y ensayo. Durante la fase de anillamiento se genera un gradiente de 12 ó 24 temperaturas que aumentan gradualmente a lo largo del termobloque. Al mismo tiempo todas las filas, cada una con 8 ó 16 pocillos, presentan una perfecta homogeneidad de temperaturas, de forma que también es posible comprobar al mismo tiempo los componentes de la reacción como las cantidades de enzimas, cebadores y moldes de ADN.

Temperatura de desnaturalización y elongación

La temperatura de desnaturalización para la mayoría de las muestras de ADN se encuentra entre los 94 °C y 96 °C. Dependiendo del contenido en GC, de la complejidad y de la estructura, el punto de fusión específico de un fragmento de ADN puede estar por encima o debajo de este rango. Por otro lado, la temperatura, o bien el tiempo de permanencia deben mantenerse suficientemente bajos con el fin de reducir lo menos posible la actividad de la polimerasa. En estos casos se simplifica considerablemente la determinación de la temperatura óptima de desnaturalización mediante los Mastercycler gradient. Para ello se ajusta un gradiente entre 90 °C y 99 °C, de modo que sea posible determinar empíricamente la temperatura de des-naturalización menor posible que permita el mayor rendimiento de ADN amplificado.

En la mayoría de las aplicaciones estándar con Taq polimerasa no se requiere una optimización. No es así en protocolos más complejos, por ejemplo, en la amplificación de largos fragmentos con una mezcla de diferentes polimerasas. En este caso la optimi-zación de la temperatura de elongación puede desempeñar un papel muy importante, ya que la temperatura ideal de los enzimas Taq polimerasa y proof reading puede variar considerablemente.

l Fig. �: Registro termográfico del termobloque del Mastercycler gradient.


33



iology


4.4. Eppendorf Thermocycler: control de temperatura es sinónimo de calidad

Homogeneidad de las filas en el modo gradiente

Mediante la tecnología de triple circuito se dispone de una zona de calentamiento y refrigeración adicional, garantizando así un control preciso de la temperatura para todos los perfiles de gradientes.

l Control adicional de la temperatura mediante TCT

Características del control de la temperatura

Las características del control de la temperatura influyen notable-mente en la calidad del resultado, es decir el perfil de las temperaturas y la velocidad con la que se lleva a cabo el cambio de temperatura de los ensayos (el calentamiento y el enfriamiento entre los distintos pasos de la PCR).

La aplicación PCR más conocida, que indica la importancia de una velocidad de control de la temperatura constante, es el análisis del ADN polimórfico amplificado al azar (random amplified polymorphic DNA analysis, RAPD) para detectar polimorfismos en el marco de investigaciones de la huella genética del ADN. Los cambios en la velocidad de control de la temperatura alteran la muestra de bandas resultante, al igual que las imprecisiones térmicas dificultan la interpretación de los resultados obtenidos. Para que el ciclador de gradiente transmita con éxito los protocolos PCR del modo gradiente al modo normal, la temperatura se tiene que desarrollar en ambos modos de la forma más similar posible. Con la técnica de pendiente constante “SteadySlope” de Eppendorf se cumple este requisito: también en el modo gradiente se alcanza la temperatura con la misma característica, es decir cada temperatura a la velocidad óptima. Para las aplicaciones PCR estándar, la velocidad mayor posible es siempre la mejor para una óptima especificidad. Ésta está claramente definida y también se reproduce 1:1 en el modo normal. Así se garantiza la transmisión segura entre los dos modos de servicio y se excluye una reducción de la ganancia o de la especificidad debido a las diferentes características de la temperatura, y se asegura una transferencia sin problemas de las condiciones de reacción obtenidas del modo gradiente al normal.

Control del bloque y control del tubo

El control del bloque es el modo de servicio para largas incu-baciones estáticas. Para tiempos de incubación cortos, como es el caso durante la PCR, el tiempo programado y el tiempo de sometimiento real a la temperatura seleccionada en la mezcla de reacción pueden diferir, por el contrario, considerablemente. El control del tubo compensa automáticamente este tiempo cuidando que la mezcla de reacción se mantenga durante todo el tiempo a la temperatura por usted indicada, tal y como usted la ha programado. El algoritmo altamente desarrollado de la familia Mastercycler garantiza que este principio sea válido para todos los tipos de tubos usados permitiéndole emplear todo el bloque para sus ensayos.

Tecnología SteadySlope

de Eppendorf: curva de la temperatura constante en el modo gradiente

Equipo de otra marca con

característica dinámica: característica variable del control de temperatura (diferentes velocidades de refrigeración) en el modo gradiente


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PCR disclaimers

Eppendorf Mastercycler® family

Practice of the patented polymerase chain reaction (PCR) process requires a license. The Mastercycler is an Authorized Thermal Cycler and may be used with PCR licenses available from Applied Biosystems. Its use with Authorized Reagents also provides a limited PCR license in accordance with the label rights accompanying such reagent

Real-Time PCR

Practice of the patented polymerase chain reaction (PCR) process requires a license. The Eppendorf [or appropriate trademark] Thermal Cycler is an Authorized Thermal Cycler and may be used with PCR licenses available from Applied Biosystems. Its use with Authorized Reagents also provides a limited PCR license in accordance with the label rights accompanying such reagents. This is a Licensed Real-Time Thermal Cycler under Applera’s United States Patent No. 6,814,934 and corresponding claims in non-U.S. counterparts thereof, for use in research and for all other applied fields except human in vitro diagnostics. No right is conveyed ex-pressly, by implication or by estoppel under any other patent claim.

Combinación típica de primeres directo y reverso para una Matriz de primers.

Forward

50 nM �00 nM 300 nM 600 nM 900 nM

Rev

erse

50 nM 50/50 100/50 300/50 600/50 900/50

�00 nM 50/100 100/100 300/100 600/100 900/100

300 nM 50/300 100/300 300/300 600/300 900/300

600 nM 50/600 100/600 300/600 600/600 900/600

900 nM 50/900 100/900 300/900 600/900 900/900


Para encontrar la combinación óptima de concentraciones para los primers es recomendable construir una matriz de primers que ab-arque un rango de concentraciones empleadas habitualmente para los primers directo y reverso. Normalmente se usa un rango de 50-900 nM. En la tabla 1 se muestra una matriz de primers típica. Para conseguir unos resultados fiables, cada combinación debería usarse por triplicado y con controles negativos adicionales.

4.5. Optimización de la concentración de Primers

(Matriz de Primers)

pipeteo.conver de centrifuga y mas gc07_chap_09_es.pdf

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