MECANISMOS GERAIS DOS PIGMENTOS VEGETAIS

Pigmentos são substâncias naturais de células e tecidos de plantas e animais que conferem cor. Eles são sintetizados e acumulados ou excretados a partir das células vivas. Além disso, as transformações que ocorrem nos alimentos durante o processamento podem resultar na formação ou na transformação dessas cores. Os pigmentos naturais de animais e plantas sempre constituíram uma parte normal da dieta humana e, por isso, têm sido consumidos com segurança por inúmeras gerações. Suas estruturas químicas tendem a serem complexas, podendo ser usadas para fins de classificação.

Grupo químico Pigmento Exemplos Coloração OcorrênciaTetrapirróis Compostos

heme Oximioglobina Vermelha Carnes frescas

Mioglobina Púrpura/VermelhaMetamioglobina Marrom Carnes embaladas

Clorofilas Clorofila a Verde-azulada Brócolis, alfaceClorofila b Verde

Tetraterpenóides Carotenóides Caroteno Amarelo-alaranjada Cenouras, laranja, pimentas

Licopeno Laranja-avermelhado TomatesCompostos O-heterocíclicos/ quinonas

Flavonóides/ fenólicos

Antocianinas Laranja/vermelho/azul

Frutas vermelhas, repolho roxo, rabanete

Flavonóis Branco-amarelada Cebola, couve-flor

Taninos Vermelho-marrom Vinho envelhecido

Compostos N-heterocíclicos

Betalaínas Betanina Púrpura/vermelho Beterraba, figo-da-índia

Betaxantina Amarelo

COMPOSTOS HEMEOs pigmentos heme são responsáveis pela cor da carne. A mioglobina (Mb) é seu principal

pigmento, sendo que a hemoglobina, que é o pigmento do sangue, é de importância secundária. A maior parte da hemoglobina é removida quando os animais são abatidos e sangrados. Dessa forma, com o sangramento devido, a Mb do tecido muscular é responsável por 90% ou mais da pigmentação. A quantidade de Mb varia consideravelmente entre os tecidos musculares, sendo influenciada por espécie, idade, gênero e atividade física.

Mioglobina/hemoglobina Estrutura dos compostos heme A mioglobina é uma proteína globular constituída por uma única cadeia polipeptídica. Sua massa

molecular é 16,8 kD, sendo composta por 153 aminoácidos. A porção protéica da molécula é conhecida como globina.

O cromóforo responsável pela absorção de luz e pela cor é uma porfirina conhecida como heme. O anel da porfirina é formado por quatro anéis pirrólicos unidos e ligados a um átomo central de ferro. Desse modo, a Mb é um complexo de globina e heme.

A porfirina heme está presente em uma bolsa hidrofóbica da proteína globina, estando ligada a um resíduo de histidina. A localização central do átomo de ferro apresenta seis sítios de coordenação, sendo que quatro deles estão ocupados por átomos de nitrogênio dentro do anel tetrapirrólico. O quinto sítio de coordenação está ligado a um resíduo de histidina da globina, permitindo que o sexto sítio esteja à disposição para a formação de complexos com átomos eletronegativos doados por diversos ligantes.

A hemoglobina é constituída por 4 Mbs ligadas entre si sob a forma de tetrâmero. A hemoglobina, um componente dos glóbulos vermelhos, forma complexos reversíveis com o oxigênio do pulmão. Esse complexo é distribuído ao longo do sangue para vários tecidos do corpo do animal, nos quais o oxigênio é absorvido. O grupo hemo liga-se ao oxigênio molecular. A Mb de dentro do tecido celular age de forma semelhante, aceitando o oxigênio transportado pela hemoglobina. Sendo assim, a Mb armazena oxigênio dentro do tecido, tornando-o disponível para o metabolismo.

Química e cor: Estado de oxidação A cor da carne é determinada pela química da Mb, por seu estado de oxidação, pelo tipo de ligantes

ao grupo heme e pelo estado da proteína globina. O ferro heme do anel da porfirina pode assumir duas formas: ferroso reduzido (+2) ou férrico oxidado (+3). O estado de oxidação para o átomo de ferro do grupo heme é variável dependendo da oxigenação da Mb. Quando o oxigênio molecular liga-se à Mb, forma-se a oximioglobina (MbO2), o que é conhecido como oxigenação. Quando ocorre a oxidação da Mb, o átomo de ferro é convertido para o estado férrico (+3), formando metamioglobina (MMb). O ferro heme no estado ferroso (+2), o qual necessita de uma ligação na sexta posição, é chamado de mioglobina.

Os tecidos cárneos que contêm, principalmente, Mb (também chamada desoximioglobina) possuem cor vermelho-púrpura. A ligação do oxigênio molecular na sexta ligação forma MbO2 e a cor do tecido altera-se para o vermelho brilhante habitual. Tanto o roxo da Mb como o vermelho da MbO2 podem oxidar-se, alterando o estado do ferro de ferroso para férrico. Se essa mudança de estado ocorrer por meio da auto-oxidação, os pigmentos irão adquirir a cor indesejável vermelho-acastanhado da MMb. Nesse estado, a MMb não é capaz de ligar-se ao oxigênio e a sexta posição de ligação é ocupada por água. A MMb da carne pode ser reduzida de volta à Mb, tanto enzimaticamente como não enzimaticamente. A principal via parece se dar pela ação de uma MMb redutase que, na presença de NADH pode reduzir com

efetividade a MMb para o estado ferroso. As cores das reações em carnes frescas são dinâmicas, sendo determinadas pelas condições do músculo e das proporções de Mb, MMb e MbO2. Enquanto a interconversão entre Mb e MbO2 pode ocorrer com facilidade (e espontaneamente), dependendo da tensão de oxigênio, a conversão da MMb para as outras formas requer redução enzimática ou não enzimática do ferro, do estado férrico para o estado ferroso.

Descoloração Duas reações diferentes podem causar descoloração da Mb para a cor verde. O peróxido de

hidrogênio pode reagir com o estado férrico ou com o estado ferroso do grupo heme, resultando em coleglobina, um pigmento de cor verde. Além disso, na presença de sulfeto de hidrogênio e oxigênio, pode-se formar a sulfomioglobina de cor verde. Acredita-se que o peróxido de hidrogênio e/ou sulfeto de hidrogênio surge a partir do desenvolvimento de bactérias.

Pigmentos de carnes curadas Na fabricação da maioria das carnes curadas, adicionam-se nitratos e nitritos para melhorar sua cor

e seu sabor. Durante o processo de cura, ocorrem reações específicas, as quais são responsáveis pela coloração rosa estável de produtos à base de carnes curadas.

A primeira reação ocorre entre o óxido nítrico (NO) e a Mb, produzindo a mioglobina óxido nítrico (MbNO), também conhecida como nitrosilmioglobina. A MbNO é vermelha, brilhante e instável. Após o aquecimento, forma-se a mio-hemocromogena óxido nítrico (nitrosil-hemocromo), que é mais estável. Esse composto produz a coloração rosa desejável das carnes curadas. O aquecimento desse pigmento desnatura a globina, mas a coloração rosa permanece. Na presença de excesso de ácido nitroso a nitrimioglobina (NMb) será formada. Após aquecimento em meio redutor, a NMb é convertida a nitri-hemina, um pigmento verde. Essa série de reações gera o defeito conhecido como “queima por nitrito”.

Na ausência de oxigênio, os complexos NO e Mb são relativamente estáveis. No entanto, sob condições aeróbicas, esses pigmentos são sensíveis à luz. Se forem adicionados agentes redutores, como o ascorbato ou compostos sulfídrilicos, a conversão redutora de nitrito para NO será favorecida. Dessa forma, sob essas condições a formação de MbNO ocorre com mais facilidade.

Estabilidade dos pigmentos da carneAlgumas condições importantes que exercem efeitos importantes sobre a cor da carne e a

estabilidade dos pigmentos são exposição à luz, temperatura, umidade relativa, pH e presença de bactérias específicas.

Reações específicas, como a oxidação lipídica, são conhecidas por aumentar a taxa de oxidação dos pigmentos. Da mesma forma, a estabilidade da cor pode ser melhorada pela adição de antioxidantes.

A irradiação de carnes também pode causar alterações na cor devido a suscetibilidade da molécula de Mb, especialmente do ferro, alteração química do meio ambiente e energia consumida.

CLOROFILASEstrutura das clorofilas e derivados As clorofilas são moléculas complexas especialmente ajustadas para as funções de absorção de luz,

transferência de energia e transferência de elétrons durante a fotossíntese. Elas são os principais pigmentos absorvedores de luz em plantas verdes, algas e bactérias fotossintéticas. Elas são complexos de magnésio derivados de porfina. Esta é uma estrutura macrocíclica completamente insaturada que contém 4 anéis pirrólicos ligados por uma única ponte de carbono. Os anéis são numerados de I a IV ou de A a D, de acordo com o sistema de numeração de Fischer. Os átomos de carbono encontrados na periferia da estrutura da porfina são numerados de 1 a 8. Os átomos de carbono da ponte de carbono são designados como α, β, γ e δ.

As porfinas substituídas são chamadas de porfirinas. Uma porfirina é qualquer pigmento

tetrapirrólico macrocíclico no qual os anéis pirrólicos estão unidos por pontes metina e o sistema de ligações duplas formam uma configuração cíclica e conjugada. A forbina é considerada como o núcleo de todas as clorofilas, sendo formada pela adição de um quinto anel isocíclico (V) à porfina. Por isso, as clorofilas são chamadas de porfirinas.

Diversas clorofilas são encontradas na natureza. Suas estruturas diferem entre si em torno dos substituintes do núcleo da forbina. As clorofilas a e b são encontradas em plantas verdes, em uma proporção aproximada de 3:1. Elas diferem no substituinte do carbono C-3. A clorofila a contém um grupo metil, enquanto a clorofila b contém um grupo formil. Ambas as clorofilas apresentam um grupo vinil e um grupo etil, nas posições C-2 e C-4, respectivamente; um grupo carbometoxi, na posição C-10 dos anéis isocíclicos; e um grupo fitol esterificado no propionato, na posição C-7. O fitol é um álcool isoprenóide monoinsaturado com 20 carbonos. A clorofila c é encontrada em associação à clorofila a, em algas marinhas, dinoflagelados e diatomáceas. A clorofila d é um constituinte minoritário que acompanha a clorofila a em algas vermelhas.

Características físicas As clorofilas estão localizadas nas lamelas de organelas intercelulares das plantas verdes conhecidas

como cloroplastos. Elas estão associadas a carotenóides, lipídeos e lipoproteínas. Ocorrem ligações fracas (ligações não covalentes) entre essas moléculas. As ligações são facilmente quebradas, assim, as clorofilas podem ser extraídas pela maceração dos tecidos vegetais em solventes orgânicos. Solventes polares, como acetona, metanol, etanol, acetato de etila, piridina e dimetilformamida são os solventes mais eficazes para a extração completa das clorofilas. Solventes apolares, como hexano ou éter de petróleo, são menos eficazes. Hoje em dia, a cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE) é o método de escolha para a separação individual das clorofilas e seus derivados. No caso das clorofilas a e b, por exemplo, o aumento da polaridade favorece o substituinte formil no C-3 da clorofila b, fazendo com que ele seja adsorvido com mais força em colunas de fase normal e com menos força em colunas de fase reversa, em comparação à clorofila a.

Biossíntese da clorofilaComo outras moléculas biológicas, as clorofilas são construídas por uma rota de síntese em que se

empregam moléculas simples para a montagem de moléculas complexas. Cada etapa na rota de síntese é catalisada enzimaticamente.

A rota de síntese das clorofilas consiste de mais de uma dúzida de etapas. O processo pode ser dividido em várias fases, podendo cada uma ser considerada isoladamente, porém, na célula, são altamente coordenadas e reguladas. Essa regulagem é essencial, pois a clorofila, quando livre, e muitos dos intermediários biossintéticos são prejudiciais aos componentes celulares. O dano pode ser grande, pois as clorofilas absorvem a luz eficientemente, porém, na ausência das outras proteínas do sistema de transporte, elas não possuem a rota para liberar a energia resultando na formação de singletos de oxigênio.

O precursor na biossíntese da clorofila e heme é o ácido δ-aminolevulínico (ALA). Em plantas e cianobactérias, ALA é produzido de glutamato a partir de reações envolvendo RNAtGlu. Duas moléculas de ALA são então condensadas para formar porfobilinogênio (PBG), que forma o anel pirrólico na clorofila.

Quatro moléculas de PBG se unem para formar uma estrutura de porfirina, a protoporfirina IX, mediado por seis passos enzimáticos. Apesar da síntese de ALA diferir em plantas e animais, a formação da protoporfirina IX é comum em ambos os grupos. Nos animais, a partir daí, é inserido um átomo de ferro (Fe) no centro do anel pirrólico para formar o grupo heme, enquanto que no primeiro passo da rota da clorofila é inserido um átomo de magnésio (Mg), formando Mg-protoporfirina IX.

União de quatro moléculas de PBG e formação da protoporfirina IX.

Em seguida, o quinto anel é formado pela ciclização da cadeia lateral de um dos ácidos propiônicos, formando o protoclorofilídeo. A conversão de Mg-protoporfirina IX em protoclorofilídeo envolve, em primeiro lugar, a esterificação do resíduo propiônico no carbono 6 realizada por uma metil transferase com S-adenosilmetionina como doador do grupo metil. O fechamento do anel começa a partir de Mg 2,4-divinilprotoporfirina IX metil éster (Mg-protoporfirina monometil-éster), resultando em Mg 2,4-divinilfaeoporfirina a5 metil éster (divinil protoclorofilídeo a), por outro caminho, formando Mg-vinil-faeoporfirina IX metil éster (monovinil-protoclorofilídeo a – protoclorofilídeo). Este também pode ser formado pela redução do composto anterior. A produção do anel envolve a sequinte sequência: acrilato → β-hidroxipropionato → β-cetopropionato, com fechamento do anel no carbono γ-metino. Esses passos têm evidência genética.

O protoclorofilídeo é reduzido a clorofilídeo na presença de luz. Este processo envolve a redução de uma ligação dupla no quarto anel, mediada pela enzima protoclorofilídeo oxidorredutase (POR), que usa um NADPH.

Formação do protoclorofilídeo e sua redução a clorofilídeo.

O passo final da síntese de clorofila a envolve esterificação da cadeia lateral do fitol hidrofóbico, catalisada pela enzima clorofila sintetase.

Os cloroplastos da plantas superiores sempre contêm dois tipos de clorofila. Uma é invariavelmente a clorofila a e a segunda, em muitas espécies, é a clorofila b. Esta última é sintetizada da clorofila a através da ação de uma enzima oxigenase que converte um grupo metil ligado ao anel II a aldeído. Esta mudança altera as propriedades de absorção de luz das clorofilas. A absorção é também alterada pela interação de clorofila com proteínas encontradas na membrana fotossintética.

A rota de quebra das clorofilas em folhas senescentes é bastante diferente da rota de síntese. A primeira etapa é a remoção da cauda de fitol por uma enzima conhecida como clorofilase, seguida pela remoção do magnésio pela magnésio dequelatase. Em seguida, a estrutura da porfirina é aberta por uma enzima oxigenase (dependente de oxigênio), formando um tetrapirrol de cadeia aberta. O tetrapirrol é, então, modificado para formar produtos hidrossolúveis e incolores. Tais metabólitos incolores são exportados do cloroplasto senescente e transportados para o vacúolo, onde são permanentemente armazenados. Os metabólitos da clorofila não são mais processados ou reciclados, embora as proteínas associadas a eles no cloroplasto sejam recicladas subsequentemente para novas proteínas. Acredita-se que a reciclagem das proteínas seja importante para a economia de nitrogênio na planta.

Em resumo, as rotas de biossíntese das clorofilas são construídas por uma série de etapas complexas, com diversos intermediários e enzimas específicas Figura 3).

O precursor na biossíntese de clorofila é o ácido δ-aminolevulínico (ALA), que é produzido a partir da condensação da glicina (8 moléc.) e succinato (proveniente do Ciclo de Krebs). Essa reação é catalisada pela enzima ALA sintetase (Figura 1A). Duas moléculas de ALA são então condensadas para formar porfobilinogênio (PBG), que forma o anel pirrólico na clorofila, sintetizado pela enzima ALA desidratase.

Quatro moléculas de PBG se unem para formar uma estrutura de porfirina, a protoporfirina IX, mediado por seis passos enzimáticos. Há a saída de 4 grupos NH3 catalisada pela enzima PBG deaminase. A partir daí, é inserido um átomo de magnésio (Mg) no centro do anel pirrólico pela enzima Magnésio chelatase para formar Mg-protoporfirina IX. Em seguida, o quinto anel é formado pela ciclização da cadeia lateral de um dos ácidos propiônicos, formando o protoclorofilídeo. O protoclorofilídeo é reduzido a clorofilídeo na presença de luz. Este processo envolve a redução de uma ligação dupla no quarto anel, mediada pela enzima protoclorofilídeo oxidorredutase (POR). O passo final na síntese de clorofila a envolve esterificação da cadeia lateral do fitol hidrofóbico catalisada pela enzima clorofila sintetase. A clorofila b é sintetizada através da oxidação do grupo metil da clorofila a para um

grupo aldeído. A clorofila a é convertida em clorofila b através de uma enzima chamada clorofila a oxigenase em presença de oxigênio, que catalisa a conversão do grupo metil ao grupo aldeído.

Alterações da clorofila A clorofila pode ser alterada enzimaticamente, por aquecimento e ácido, formação de complexos

metálicos, alomerização e fotodegradação. Existe uma terminologia particular para determinadas estruturas relativas às clorofilas e obtidas por

modificações desses pigmentos por diferentes agentes: Porfina: esqueleto tetrapissólico, cíclico, completamente conjugado (estrutura básica das

clorofilas) Porfirina: porfina com os substituintes nas diferentes posições. Forbina: porfirina com a adição do anel em C9-C10. Feofitina: clorofila com o cátion Mg2+ substituído por prótons. Feorfobina: feofitina menos o fitol Clorofilida: clorofila menos o fitol Clorofilina: clorofila com os dois ésteres hidrolisados, a partir da clivagem do anel isocíclico

(ácido dicarboxílico). O átomo central de Mg é facilmente removido da clorofila, principalmente em condições ácidas,

sendo substituído por hidrogênio, formando as feofitinas, de cor verde-oliva, insolúveis em água. Enzimas presentes nos vegetais, como a clorofilase, hidrolisam o grupo fitila formando a clorofilida, verde, mas mais solúvel em água que a clorofila. Os produtos resultantes da perda do grupo fitila e do Mg 2+, os feoforbídeos, têm cor verde acastanhada e sofrem possivelmente transformações oxidativas que dão origem a produtos incolores de degradação. As clorofilas e as feotitinas são lipossolúveis em decorrência de sua porção fitol, enquanto as clorofilidas e os feorfobídeos (sem fitol) são hidrofílicos.

O mecanismo de degradação da clorofila pode ocorrer por duas reações: Tipo I, envolvendo a perda do fitol, do Mg2+ e outras modificações das cadeias laterais da molécula. As reações do Tipo II correspondem a fragmentação oxidativa do anel tetrapirrólico.

Todo o processo parece ter início com a ação de duas enzimas, a clorofilase e a Mg-dequelatase, que removem o fitol e o Mg2+, respectivamente, formando clorofilídeos e feofitinas, embora não esteja clara a ordem em que essas reações ocorrem; acredita-se que além da ação das enzimas, fatores não-enzimáticos também possam estar envolvidos.

A coloração dos clorofilídeos é semelhante à da clorofila original, enquanto as feofitinas e os feoforbídeos, que são os produtos resultantes da ação da Mg-dequelatase sobre as clorofilas e os clorofilídeos, respectivamente, apresentam uma cor verde tendendo ao marrom, deduzindo-se que a remoção do átomo de Mg é fundamental para a mudança de cor.

Foi demonstrado que o passo fundamental responsável pela perda total da cor, corresponde à abertura do anel tetrapirrólico com introdução de um átomo de oxigênio, por intermédio de um processo co-oxidativo, catalizado por uma enzima, a feoforbídeo a mono-oxigenase.

Durante o processamento térmico, a principal via de degradação é a substituição do átomo de Mg por dois átomos de H, processo conhecido por feofitinização, além de poder ocorrer também uma epimerização. Neste caso, a reação não é catalisada enzimaticamente e, sim, pela acidez do meio que favorece a perda do Mg2+. As feofitinas possuem coloração próxima ao verde oliva e estão sujeitas a hidrólise química, que resulta na liberação da molécula do fitol, produzindo um feoforbídeo hidrossolúvel. Observou-se que o tratamento térmico prolongado e a produção de enlatados pode resultar também na perda do grupo metilcarboxila havendo formação de pirofeofitinas.

As clorofilas podem ser alteradas quimicamente por diversos fatores. Por exemplo, o fitol pode ser removido facilmente por álcalis com formação das clorofilidas, compostos de cor verde que possuem praticamente a mesma absorvância das clorofilas, embora sejam bastante mais solúveis em água. No processo de alimentos a reação mais importante é, sem dúvida, a facilidade com que o magnésio é substituído por prótons, pela ação de ácidos diluídos, com formação das feofitinas, compostos de cor verde oliva, cor essa que prejudica a aparência dos alimentos ricos em clorofilas. In situ, embora os

tecidos vegetais sejam ácidos, as clorofilas são bastante estáveis, talvez devido ao fato de se encontrarem associadas a proteínas e lipídeos, que teriam ação protetora.

Um fenômeno adicional muito importante que acontece com as clorofilas é a facilidade com que os íons de magnésio nesses pigmentos são substituídos por metais divalentes. Os complexos formados com cobre apresentam cor verde brilhante, o que faz com que os alimentos se tornem mais atraentes. Esses complexos possuem o metal firmemente ligado, somente sendo libertado pela ação de ácidos concentrados, o que torna seguro o seu emprego em alimentos, uma vez que o cobre nessa forma não é absorvido pelo organismo. A quantidade de cobre livre ionizável não deve ultrapassar 200 ppm.

A descoberta que há a formação de um complexo com zinco ou com cobre que possui cor verde brilhante e estável resultou na aprovação de dois corantes, conhecidos por clorofila e clorofilina cúprica, na forma de sal de sódio, potássio ou de amônio. O cobre forma complexos mais rapidamente do que o zinco, mas o uso de complexos com zinco é preferível devido à natureza tóxica dos íons Cu2+.

As clorofilas oxidam quando dissolvidas em álcool ou outros solventes, estando expostas ao ar. Esse processo é chamado de alomerização e está associado à absorção de oxigênio equimolar para as clorofilas presentes. Os produtos são de cor verde-azulados.

Outro processo de alteração da clorofila é a fotodegradação. A clorofila é protegida da destruição pela luz durante a fotossíntese, em células de plantas saudáveis, as quais são envolvidas por carotenóides e outros lipídeos. Ela pode agir como sensibilizador, gerando oxigênio singlete, enquanto os carotenóides são conhecidos como desativadores das espécies reativas de oxigênio, protegendo as plantas da fotodegradação. Uma vez que essa proteção é perdida, devido à senescência das plantas, por extração do pigmento do tecido, ou dano celular causado durante o processamento, as clorofilas tornam-se suscetíveis à fotodegradação. Quando isso ocorre, estando presentes luz e oxigênio, as clorofilas branqueiam irreversivelmente. Acredita-se que a fotodegradação das clorofilas resulte na abertura do anel tetrapirrólico e na fragmentação para compostos de menor peso molecular.

CAROTENÓIDESOs carotenóides são pigmentos amplamente distribuídos na natureza, embora nas plantas superiores,

os carotenóides de cloroplastos muitas vezes são mascarados pela clorofila, que é o pigmento dominante. Eles desempenham funções importantes na fotossíntese e na fotoproteção dos tecidos vegetais. Em todos os tecidos que contêm clorofila, os carotenóides funcionam como pigmentos secundários de coleta de energia luminosa. O papel de fotoproteção dos carotenóides decorre de sua capacidade de desativação ou inativação das espécies reativas de oxigênio (especialmente 1O2), formadas pela exposição à luz e ao ar.

O principal papel dos carotenóides na dieta dos seres humanos e de outros animais é sua capacidade de atuarem como precursores da vitamina A.

Estrutura dos carotenóides Os carotenóides são compostos por dois grupos estruturais: os carotenos hidrocarbonetos e as

xantofilas oxigenadas. Os oxigenados (xantofilas) consistem de diversos derivados, os quais costumam conter grupos hidroxila, epóxi, aldeídos e ceto. Além disso, os ésteres de ácidos graxos de carotenóides hidroxilados também são muito encontrados na natureza.

A base estrutural da espinha dorsal do carotenóide é constituída por unidades de isopreno ligadas covalentemente na forma cabeça-cauda ou cauda-cauda, para que se crie uma molécula simétrica. Outros carotenóides são derivados dessa estrutura primária de 40 carbonos. Algumas estruturas contêm grupos cíclicos terminais (β-caroteno), enquanto outras possuem apenas uma ou nenhuma ciclização (licopeno). Outros catotenoides podem ter o esqueleto carbônico mais curto, sendo conhecidos como apocarotenais (bixina).

A cor é resultante da presença de um sistema de duplas ligações conjugadas. Para que a cor amarela apareça, são necessárias, no mínimo, sete ligações conjugadas. O aumento no número de ligações conjugadas resulta em maiores bandas de absorção em maiores comprimentos de onda e neste caso, os carotenóides tornam-se mais vermelhos.

Os carotenóides são subdivididos em dois grupos principais:- Carotenos: compostos constituídos por carbono e hidrogênio;- Xantofilas: derivados obtidos por oxidação dos carotenos com formação dos grupos: hidroxila, metoxila, carboxila e cetona.

O carotenóide de ocorrência mais comum nos tecidos vegetais é o β-caroteno. Ele também é utilizado como corante em alimentos.

Os animais adquirem os pigmentos carotenóides por consumo de matérias vegetais que os contêm.

Ocorrência e distribuição Os tecidos vegetais contêm diversos carotenóides. Geralmente as maiores concentrações destes

pigmentos são encontradas nos tecidos com maior quantidade de pigmentos de clorofila. As frutas vermelhas, amarelas e laranjas, as raízes e os vegetais são ricos em carotenóides. Exemplos notáveis são tomates (licopeno), cenouras (α e β-carotenos), pimentas (capsantinas), milho (luteína e zeaxantinas).

Muitos fatores influenciam no teor dos carotenóides das plantas. Em algumas frutas, a maturação pode ocasionar mudanças drásticas nos carotenóides. Por exemplo, no tomate, o conteúdo de carotenóides, em especial o licopeno, aumenta significativamente durante o processo de amadurecimento. Dessa forma, as concentrações diferem dependendo do estádio de maturidade do vegetal. Mesmo após a colheita, os carotenóides do tomate continuam a ser sintetizados. Uma vez que a luz estimula a sua síntese, sabe-se que o grau de exposição à luz pode afetar sua concentração. Outros fatores que alteram a ocorrência e a quantidade de carotenóides incluem o clima durante o desenvolvimento do vegetal, os pesticidas e adubos utilizados e o tipo de solo.

Os pigmentos carotenóides podem já estar presentes, tornando-se visíveis com a degradação da clorofila ou podem ser sintetizados simultaneamente com a degradação desta. Nos frutos cítricos e na banana, a síntese de carotenóides ocorre durante o desenvolvimento do fruto e bem antes do desaparecimento da clorofila. Nesse caso, a destruição da clorofila revela a presença de carotenóides. Em tomate, os carotenóides são sintetizados simultaneamente com a degradação da clorofila.

Propriedades físicas, extração e análise Todas as classes de carotenóides (hidrocarbonetos: carotenos e licopeno e xantofilas oxigenadas)

são compostos lipofílicos e, portanto, são compostos solúveis em óleos e solventes orgânicos. Eles são moderadamente estáveis ao calor, estando sujeitos à perda de cor por oxidação. Os carotenóides podem ser isomerizados com facilidade por calor, ácido ou luz.

Propriedades físicas Oxidação

Os carotenóides oxidam com facilidade, pois contêm um grande número de ligações duplas conjugadas. Essas ligações ocasionam a perda de cor dos carotenóides em alimentos, sendo seus principais mecanismos de degradação. Dentro dos tecidos, os pigmentos estão compartimentalizados e protegidos da oxidação, o que lhes confere maior estabilidade. No entanto, danos físicos aos tecidos ou extração dos catotenóides aumentam sua suscetibilidade à oxidação.

Durante a oxidação, epóxidos e compostos carbonílicos são formados inicialmente. Grandes oxidações resultam na formação de cadeias curtas de compostos mono e dioxigenados, incluindo compostos epóxi-β-ionona. Em geral, os epóxidos formam-se dentro do anel final, embora possa ocorrer cisão oxidativa para diversos sítios ao longo da cadeia. Para carotenóides pró-vitamínicos A, a formação do epóxido no anel resulta em perda de atividade pró-vitamínica. Auto-oxidações grandes resultarão no clareamento dos carotenóides e na perda de sua cor. A destruição oxidativa do β-caroteno é intensificada na presença de sulfito e íons metálicos.

A atividade enzimática, em especial da lipoxigenase, acelera a degradação oxidativa dos carotenóides. Isso se dá por mecanismos indiretos. A lipoxigenase a princípio catalisa a oxidação de ácidos graxos insaturados ou poli-insaturados para produzir peróxidos, os quais, por sua vez, reagem prontamente com os carotenóides.

Atividade antioxidante Além das proteções celular e in vitro contra o oxigênio singlete, os carotenóides, sob baixas

pressões parciais de oxigênio, inibem a peroxidação lipídica. Sob altas pressões parciais de oxigênio, o β-caroteno exibe propriedades pró-oxidantes. Os carotenóides desativam o oxigênio singlete, proporcionando, dessa forma, proteção contra danos oxidativos celulares.

Isomerização cis/trans Em geral, as ligações duplas conjugadas dos carotenóides ocorrem na configuração totalmente trans

(all-trans). As reações de isomerização são induzidas com facilidade por tratamentos térmicos, exposição a solventes orgânicos, contato por períodos prolongados com determinadas superfícies ativas, tratamento

com ácidos e iluminação das soluções (em particular na presença de iodo). A isomerização cis/trans afeta a atividade de pró-vitamina A, apesar de não afetar a cor dos carotenóides. A atividade pró-vitamínica A dos isômeros cis do β-caroteno varia, dependendo da forma isomérica, de 13 a 53% quando em comparação ao all-trans-β-caroteno.

Estabilidade durante o processamento Os carotenóides são relativamente estáveis durante o armazenamento e a manipulação típicos da

maior parte das frutas e vegetais. O congelamento gera poucas mudanças no seu conteúdo. No entanto, o branqueamento é conhecido por influenciar (aumentar em relação ao produto cru) o conteúdo de carotenóides. Isso se deve à inativação da lipoxigenase, a qual é conhecida por catalisar de modo indireto a decomposição oxidativa dos carotenóides. A perda de componentes solúveis para a água de branqueamento ou os tratamentos térmicos leves tradicionalmente utilizados durante o branqueamento podem aumentar a eficiência da extração do pigmento em relação ao tecido fresco. Além disso, a homogeneização física intensa e os tratamentos térmicos também aumentam a extração e a biodisponibilidade, quando há consumo.

Biossíntese de carotenóides Em frutas, durante a maturação, grandes quantdes de carotenóides são formadas. Os mais frequentes

são alfa e beta-caroteno e xantofilas. A presença de luz é necessária para a síntese de carotenóides. Os terpenos são biossintetizados a partir de metabólitos primários por no mínimo duas rotas diferentes.

Na rota do ácido mevalônico, três moléculas de acetil CoA (glicólise) são ligadas, a partir de uma série de etapas da rota, para formar o ácido mevalônico (6C), que é então pirofosforilado, descarboxilado e desidratado para produzir o isopentenil difosfato (IPP) (5C), que é a unidade básica na formação dos terpenos.

O IPP também pode ser formado a partir de intermediário da glicose ou do ciclo de redução fotossintética do carbono, através de um conjunto de reações denominado de rota do metileritritol fosfato (MEP), que ocorre nos clorosplastos e outros plastídeos. O gliceraldeído-3-fosfato (GAP) (glicólise) e dois átomos de carbono derivados do piruvato se combinam para formar o metileritritol fosfato (MEP), que é convertido em no isômero do IPP, o dimetilalil difosfato (DMAPP) (5C) que são as unidades pentacarbonadas ativas na biossíntese dos terpenos que se unem para formar moléculas maiores.

Inicialmente o IPP e o DMAPP reagem e formam o geranil difosfato (GPP), uma molécula de 10 carbonos, a partir da qual são formados os monoterpenos. O GPP pode, então, ligar-se a outra molécula de IPP, formando um composto de 15 carbonos, farnesil difosfato (FPP), precursor da maioria dos sesquiterpenos. A adição de outra molécula de IPP forma o geranilgeranil difosfato (GGPP), composto de 20 carbonos precursor dos diterpenos. Finalmente, FPP e GGPP podem dimerizar para formar triterpenos (C30) e tetraterpenos (C40), ou de forma geral os politerpenos como o α e β-caroteno.

ANTOCIANINASOs compostos fenólicos compreendem um grande grupo de substâncias orgânicas, sendo os

flavonóides um importante subgrupo. O subgrupo flavonóide contém as antocianinas, um dos grupos de pigmentos de maior distribuição no reino vegetal.

Estrutura As antocianinas pertencem ao grupo dos flavonóides, devido a sua característica de esqueleto

carbônico C6C3C6. Dentro de cada grupo, há muitos compostos diferentes, e sua cor depende da presença e do número de substituintes ligados à molécula.

A estrutura básica das antocianinas é o 2-fenilbenzopirona do sal flavylium. As antocianinas ocorrem como glicosídeos de poli-hidroxi e/ou polimetoxi derivados do sal. Elas diferem no número de grupos hidroxila e/ou nos grupos metoxi presentes, tipos, números, sítios de ligação dos açúcares na molécula e tipos e números de ácidos alifáticos ou aromáticos que estão ligados aos açúcares da molécula. Os açúcares mais comuns são glicose, ramnose, galactose, arabinose, xilose, di e trissacarídeos (homogêneos ou heterogênios) formados como glicosídeos desses açúcares. Os ácidos mais envolvidos na acilação dos açúcares são os ácidos aromáticos, como os p-cumárico, cafeico, ferúlico, sinápico, gálico e/ou os alifáticos, como ácido malônico, acético, málico, succínico ou oxálico. Esses substituintes acil costumam estar ligados ao açúcar do C-3, esterificados ao 6-OH ou, com menos freqüência, ao grupo 4-OH dos açúcares.

Onde: R1 e R2: -H, -OH ou –OCH3, R3: -glicosil, R4: -H ou –glicosilQuando o agrupamento do açúcar da antiocianina é hidrolisado, a aglicona (produto da hidrólise

sem o açúcar) é chamada de antocianidina. A cor das anticianinas e das antocianidinas resultam da excitação de uma molécula pela luz visível. A facilidade com a qual uma molécula é excitada depende da mobilidade eletrônica relativa da estrutura. As ligações duplas, que são abundantes nas anticianinas e nas antocianidinas, são excitadas com muita facilidade, sendo que sua presença é essencial para a cor. Existem 19 antocianidinas de ocorrência natural, mas apenas 6 costumam ocorrer nos alimentos.

O aumento da substituição na porção da antocianidina da molécula resulta em mais tonalidade. O aumento da tonalidade é resultado de uma mudança batocrômica (maior comprimento de onda), o que significa que a banda de absorção da luz na faixa de espectro visível muda de um comprimento de onda pequeno para um grande, com alteração conseqüente da cor, de laranja/vermelho para roxo/azul. A mudança oposta é chamada de mudança hipsocrômica. Os efeitos batocrômicos são causados por grupos auxocromos, grupos que, por si só, não têm propriedades de cromóforo, mas que causam o aumento da tonalidade quando ligados à molécula. Os grupos auxocromos são grupos de doadores de elétrons e, no caso das antocianidinas, eles são os grupos metoxi e hidroxila. Os grupos metoxi, devido a sua grande capacidade de doar elétrons, causam mais mudança batocrômica que os grupos hidroxila. Nas anticianinas, o tipo e o número da substituição de açúcares e da acilação também desempenham um papel importante sobre as características da cor, assim como diversos outros fatores, como mudança de pH,

formação de complexos metálicos e copigmentação (antocianina condensada consigo própria ou com outros compostos orgânicos).

As antocianidinas são menos hidrossolúveis que seus glicosídeos correspondentes (antocianinas), não sendo encontradas livremente na natureza.

Cor e estabilidade das antocianinas As antocianinas são pigmentos relativamente instáveis, sendo que sua maior estabilidade ocorre sob

condições ácidas. Tanto as características de cor (tonalidade e saturação) dos pigmentos como sua estabilidade são muito influenciadas pelos substituintes na aglicona.

A degradação das antocianinas ocorre não apenas durante a extração a partir dos tecidos vegetais, mas também durante o processamento e o armazenamento dos alimentos. Os principais fatores que regem a degradação das antocianinas são pH, temperatura e concentração de oxigênio. O fator que costuma assumir menor importância é a presença de enzimas deteriorantes, ácido ascórbico, dióxido de enxofre, íons metálicos e açúcares.

As taxas de degradação variam muito entre as antocianinas, o que se deve à diversidade de suas estruturas. Em geral, o aumento da hidroxilação diminui a estabilidade, enquanto o aumento da metilação e/ou da glicosilação aumentam a estabilidade. Também já se demonstrou que o tipo de açúcar do meio influencia a estabilidade.

Em geral, as características estruturais que conduzem ao aumento de estabilidade do pH também levam ao aumento da estabilidade térmica. As antocianinas altamente hidroxiladas são menos estáveis que aquelas metiladas, glicosiladas ou aciladas.

A natureza insaturada da estrutura das antocianinas a torna suscetível ao oxigênio molecular. Existe um efeito positivo na remoção do oxigênio sobre retenção da cor das antocinaninas demonstrado pelo processamento de suco de frutas com pigmentos antociânicos, sob nitrogênio ou a vácuo. É sabido que o ácido ascórbico e as antocianinas desaparecem ao mesmo tempo nos sucos de frutas, o que indica a existência de interação direta entre as duas moléculas. Condições que não favorecem a formação de H2O2

durante a oxidação do ácido ascórbico, são responsáveis pela estabilidade da antocianina em alguns sucos de frutas.

É reconhecido que a luz acelera a degradação das antocianinas. Diglicosídeos acilados e metilados são mais estáveis que os diglicosídeos não acilados, os quais são mais estáveis que os monoglicosídeos.

Concentrações elevadas de açúcares, como em conserva de frutas, estabilizam as antocianinas. Acredita-se que esse efeito seja resultado da diminuição da atividade de água. O ataque nucleofílico do cátion flavylium pela água ocorre na posição C-2, formando a base carbinol incolor. A taxa de degradação das antocianinas segue a de açúcar para furfural. O furfural, que é obtido a partir de Aldo pentoses e hidroximetilfurfural, o qual, por sua vez, é obtido de ceto-hexoses, resulta da reação de Maillard ou a partir da oxidação do ácido ascórbico. Esses compostos se condensam facilmente com as antocianinas, formando compostos marrons.

As antocinainas com grupos hidroxilas fenólicos vicinais podem seqüestrar diversos metais polivalentes. A complexação produz um efeito batocrômico em direção ao azul.

As antocianinas são conhecidas pro se condensarem entre si (autoassociação) e com outros compostos orgânicos (copigmentação). Os complexos fracos são formados com proteínas, taninos, outros flavonóides e polissacarídeos. Embora a maior parte desses compostos não seja colorida, eles aumentam a cor das antocianinas, causando um efeito batocrômico e proporcionando o aumento da absorção da luz para um comprimento de onda máximo. Esses complexos também tendem a serem mais estáveis durante o processamento e o armazenamento. Acredita-se que a cor estável do vinho seja um resultado da autoassociação covalente das antocianinas. Esses polímeros são menos sensíveis ao pH.

A adsorção do cátion flavylium para um substrato adequado, como pectinas e amidos, pode estabilizar as antocianinas. Essa estabilização deve aumentar sua utilidade como potenciais aditivos de cor para os alimentos. Outras reações de condensação podem causar a perda de cor. Alguns nucleófilos, como os aminoácidos e a catequina, podem condensar com os cátions flavylium formando compostos incolores.

As enzimas têm sido implicadas na descoloração das antocianinas. Dois grupos foram identificados: glicosidases e polifenoloxidases. Juntos, eles costumam ser chamados de antocianases. As glicosidades hidrolisam ligações glicosídicas, resultando em açúcares e aglicona. A perda da intensidade da cor resulta da diminuição da solubilidade das antocianinas e de sua transformação em produtos incolores. As polifenoloxidases agem na presença de o-difenóis e oxigênio, oxidando as antocianinas.

BiossínteseOs compostos fenólicos são sintetizados a partir de duas rotas metabólicas principais: a via do ácido

chiquímico e a via do ácido malônico, a qual é menos significativa. A rota do ácido chiquímico participa na biossíntese da maioria dos fenóis vegetais das plantas superiores. A rota do ácido malônico, embora seja uma fonte importante de produtos secundários fenólicos em fungos e bactérias, é menos significativa nas plantas superiores.

O ácido chiquímico é formado pela condensação de dois metabólitos da glicose, ou seja, o fosfoenolpiruvato e a eritrose-4-fostato. O próximo passo dessa via é a formação do ácido corísmico através da junção do ácido chiquímico e uma molécula de fosfoenolpiruvato. O ácido corísmico por sua vez gera os aminoácidos aromáticos (triptofano, fenilalanina e tirosina) que são precursores de vários alcalóides. Contudo, um dos primeiros grupos de compostos fenólicos formados a partir do ácido corísmico são os fenilpropanóides, importantes unidades básicas para a formação de compostos fenólicos mais complexos, como as antocianinas.

O aminoácido aromático fenilalanina (sintetizado através da via ácido chiquímico) é desaminado pela enzima fenilalanina amônia liase (PAL) resultando no ácido cinâmico que é hidroxilado ao ácido 4-curamato pela 4-hidroxilase cinamato. A ativação do 4-curamato pela formação do éster 4-Cumaroil- CoA é catalisada pela ligase de 4-curamato-CoA. O 4-Cumaroil- CoA serve como substrato para a formação das chalconas, juntamente com o malonil CoA que é proveniente do acetil CoA carboxilase do ciclo de Krebs e CO2 catalisado pela enzima acetil CoA carboxilase (ACC).

Na biossíntese dos flavonóis, o primeiro passo específico é catalisado pela chalcona sintetase (CHS), na reação de condensação dos tioésteres de 4-cumaroil CoA (proveniente da rota da fenilalanina) com três unidades de malonil CoA, formando-se uma chalcona. A chalcona isomerase (CHI) catalisa a ciclização intramolecular da chalcona para formar uma flavanona, a (2S)-naringenina, precursorde muitos flavonóides incluindo a sub-família das antocianinas.

A oxidação de (2S)-flavanonas a dehidroflavonóis (3-OH-flavanonas) é catalisada pela enzima flavanona 3-hidroxilase (F3H). A enzima flavonol sintetase (FLS) catalisa a insaturação de (2R,3R)-trans-desidroflavonóis para formar os flavonóis. A oxidação da (2R,3S,4S)-cis-leucoantocianidina catalisada pela enzima leucoantocianidina dioxigenase (LDOX) (ou antocianidina sintetase, ANS) dá origem a 3-OH-antocianidinas. Que pela ação da enzima UDP-flavonóide glucosil transferase (UFGT) obtém-se as antocianinas. A leucoantocianidina redutase (LAR) catalisa a síntese de catequina, o monómero iniciador na formação de taninos condensados ou proantocianidinas a partir da leucocianidina.