phuong_phap_phan_tich_4935

8/3/2019 phuong_phap_phan_tich_4935

http://slidepdf.com/reader/full/phuongphapphantich4935 1/30

Ch ng 5ươPH NG PHÁP PHÂN TÍCH VI SINH V T TRONG N CƯƠ Ậ ƯỚ

VÀ TH C PH MỰ Ẩ

1. PH NG PHÁP L Y M U TH C PH MƯƠ Ấ Ẫ Ự Ẩ

1.1 K ho ch l y m uế ạ ấ ẫM t đ các vi sinh v t trong th c ph m đ c qui đ nhgi i h n v i m t s l ng nh tậ ộ ậ ự ẩ ượ ị ớ ạ ớ ộ ố ượ ậ

đ nh tuỳ theo t ng nhóm vi sinh v t c n phân tích và yêu c u c a t ng đ i t ng th c ph mị ừ ậ ầ ầ ủ ừ ố ượ ự ẩ cũng nh các lu t v v sinh an toàn th c ph m. Đ i v i các vi sinh v t gây b nh thông th ngư ậ ề ệ ự ẩ ố ớ ậ ệ ườ yêu c u không đ c hi n di n trong m t kh i l ng th c ph m xác đ nh. S l ng vi sinh v tầ ượ ệ ệ ộ ố ượ ự ẩ ị ố ựơ ậ đ c xác đ nh trong th c ph m có th không bao gi ph n ánh chính xác s l ng vi sinh v tượ ị ự ẩ ể ờ ả ố ượ ậ th c t có trong m u, vì th m t kho ng gi i h n theo thông l đ c thi t l p đ nh n bi tự ế ẫ ế ộ ả ớ ạ ệ ượ ế ậ ể ậ ế các m u th c ph m đ t hay không đ t yêu c u vi sinh v t. Thông th ng các kho ng gi i h nẫ ự ẩ ạ ạ ầ ậ ườ ả ớ ạ m t đ vi sinh v t trong th c ph m đ c xác đ nh b ng các kho ng nh sau: Kho ng ch pậ ộ ậ ự ẩ ượ ị ằ ả ư ả ấ nh n khi m t đ vi sinh v t n m d i m t thông s ch p nh n (m), kho ng sát mép gi i h nậ ậ ộ ậ ằ ướ ộ ố ấ ậ ả ớ ạ

khi m t đ vi sinh này l n h n gi i h n ch p nh n nh ng nh h n gi i h n trên (M). Kho ngậ ộ ớ ơ ớ ạ ấ ậ ư ỏ ơ ớ ạ ả không ch p nh n khi m t đ này cao h n gi i h n trên M. Gi i h n M th ng cao h n ít nh tấ ậ ậ ộ ơ ớ ạ ớ ạ ườ ơ ấ 10 l n so v i thông s gi i h n m. Ví d t ng s vi sinh v t trong s n ph m tr ng đ c thanhầ ớ ố ớ ạ ụ ổ ố ậ ả ẩ ứ ượ trùng Pasteur có yêu c u nh sau:ầ ư

n = 5, c = 2, m = 5 x 104, M = 106

Trong đó n là s m u th nghi m, c là s m u đ c phép n m trong kho ng sát mépố ẫ ử ệ ố ẫ ượ ằ ả gi a m và M.ữ

K ho ch l y m u lo i 2 đ c dùng cho các th nghi m phân tích vi sinh v t gây b nh.ế ạ ấ ẫ ạ ượ ử ệ ậ ệ Theo k ho ch này, s m u đ c l y có th 5,10, 20, 25 hay nhi u h n đ phân tích đ nh tínhế ạ ố ẫ ượ ấ ể ề ơ ể ị nh m phát hi n có hay không có s hi n di n các vi sinh v t trong kh i l ng m u th nghi mằ ệ ự ệ ệ ậ ố ượ ẫ ử ệ nh trên. S không ch p nh n n u có m t trong s các m u trên có s hi n di n c a các vi sinhư ẽ ấ ậ ế ộ ố ẫ ự ệ ệ ủ

v t gây b nh (n = 5,10,20 hay nhi u h n, c = 0 và n = 0). S l ng m u th ph thu c vào m iậ ệ ề ơ ố ượ ẫ ử ụ ộ ố nguy hi m c a t ng lo i th c ph m n u có s hi n di n c a vi sinh v t gây b nh. Th c ph mể ủ ừ ạ ự ẩ ế ự ệ ệ ủ ậ ệ ự ẩ có m i nguy hi m cao là nh ng lo i th c ph m không qua gia nhi t tr c khi s d ng hayố ể ữ ạ ự ẩ ệ ướ ử ụ nh ng th c ph m có tính nh y c m cao, ví d th c ph m dành cho ng i già và tr em …ữ ự ẩ ạ ả ụ ự ẩ ườ ẻ

L y m u cho vi c phân tích Salmonella:ấ ẫ ệS l ng đ n v m u đ phân tíchố ượ ơ ị ẫ ể Salmonella ph thu c vào các y u t đ c tr ng c aụ ộ ế ố ặ ư ủ

t ng lo i th c ph m, có th chia thành 3 nhóm th c ph m chính nh sau:ừ ạ ự ẩ ể ự ẩ ư - Nhóm th c ph m dùng cho các đ i t ng nh y c m v iự ẩ ố ượ ạ ả ớ Salmonella nh ng không quaư

quá trình ch bi n tr c khi s d ng, ví d th c ph m dành cho ng i già, dành cho ng iế ế ướ ử ụ ụ ự ẩ ườ ườ b nh hay dành cho tr em. Trong nhóm này s l ng đ n v m u ph i l y kho ng 60 đ n vệ ẻ ố ượ ơ ị ẫ ả ấ ả ơ ị m u.ẫ

- Nhóm th c ph m dành cho ng i tr ng thành. S l ng đ n v m u đ c l y th ngự ẩ ườ ưở ố ượ ơ ị ẫ ượ ấ ườ là 30 đ n v .ơ ị- Nhóm th c ph m mà trong ch bi n quá trình có qua giai đo n có th tiêu di tự ẩ ế ế ạ ể ệ

Salmonella. B c ch bi n này có th di n ra trong quá trình s n xu t hay ch bi n t i giaướ ế ế ể ể ả ấ ế ế ạ đình. Trong nhóm này, s l ng m u đ c l y th ng là 15 đ n v .ố ượ ẫ ượ ấ ườ ơ ị

M i đ n v m u đ c l y ít nh t 100g, thông th ng đ c l y nguyên m t đ n v s nỗ ơ ị ẫ ượ ấ ấ ườ ượ ấ ộ ơ ị ả ph m. Đ n v m u đ c l y ngãu nhiên sao cho m u đó đ i di n cho c lô s n ph m. Trongẩ ơ ị ẫ ượ ấ ẫ ạ ệ ả ả ẩ tr ng h p ph i tách m u vào trong các v t d ng l y m u ph i luôn l y m t m u ki m ch ngườ ợ ả ẫ ậ ụ ấ ẫ ả ấ ộ ẫ ể ứ

53



đ đ m b o đi u ki n b o qu n m u t ng t v i đi u ki n khi l y m u. N u m t đ n vể ả ả ể ệ ả ả ẫ ươ ự ớ ề ệ ấ ẫ ế ộ ơ ị s n ph m không đ kh i l ng m u c n thi t, nh trong tr ng h p đ n v s n ph m đ cả ẩ ủ ố ượ ẫ ầ ế ư ườ ợ ơ ị ả ẩ ượ đóng gói nh h n 100g, khi đó m i đ n v m u ph i l y nhi u h n m t đ n v s n ph m.ỏ ơ ỗ ơ ị ẫ ả ấ ề ơ ộ ơ ị ả ẩ

T i phòng thí nghi m, các chuyên viên phân tích s l y đ i di n 25g (hay kh i l ngạ ệ ẽ ấ ạ ệ ố ượ theo yêu c u phân tích) t các đ n v m u đ phân tíchầ ừ ơ ị ẫ ể Salmonella. Trong tr ng h p s đ n vườ ợ ố ơ ị

s n ph m nhi u h n s đ n v m u, các đ n v s n ph m s đ c t h p m t cách vô trùng vàả ẩ ề ơ ố ơ ị ẫ ơ ị ả ẩ ẽ ượ ổ ợ ộ phân tích viên s l y đ i di n kh i l ng m u phân tích.ẽ ấ ạ ệ ố ượ ẫ

1.2 Ph ng pháp l y m u và b o qu nươ ấ ẫ ả ảGiá tr c a k t qu đ c phát hành b i các phòng thí ngi m phân tích ph thu c r tị ủ ế ả ượ ở ệ ụ ộ ấ

nhi u vào ph ng pháp và qui trình l y m u. K ho ch l y m u đ c áp cho t ng tr ng h pề ươ ấ ẫ ế ạ ấ ẫ ượ ừ ườ ợ c th đ m u đ c mang v phòng thí nghi m ph n ánh đúng tình tr ng s n ph m c n phânụ ể ể ẫ ượ ể ệ ả ạ ả ẩ ầ tích. Trong các nhà máy s n xu t, thông th ng m u đ c l y v i m t kh i l ng nh t iả ấ ườ ẫ ượ ấ ớ ộ ố ượ ỏ ạ nhi u th i đi m và công đo n khác nhau trong quá trình s n xu t, không nên l y m t kh iề ờ ể ạ ả ấ ấ ộ ố l ng l n m u t i cùng m t v trí hay m t công đo n. Có th t p trung l y m u t i công đo nượ ớ ẫ ạ ộ ị ộ ạ ể ậ ấ ẫ ạ ạ thành ph m nhi u h n, nh ng trong m t s tr ng h p c n thi t có th t p trung l y m u t iẩ ề ơ ư ộ ố ườ ợ ầ ế ể ậ ấ ẫ ạ

m t vài công đo n tr ng y u trong quá trình s n xu t.ộ ạ ọ ế ả ấ D ng c l y m u và thùng ch a m u:ụ ụ ấ ẫ ứ ẫ Th ng s d ng các bình nh a có n p b ngườ ử ụ ự ắ ằ nhôm hay b ng ch t d o, báo bao nylon đ ch a m u. Không nên s d ng các bình b ng thuằ ấ ẻ ể ứ ẫ ử ụ ằ ỷ tinh đ ch a m u b i vì có th b v gây nhi m m u hay gây t i n n cho ng i phân tích.ể ứ ẫ ở ể ị ở ễ ẫ ạ ạ ườ

D ng c l y m u th ng làm b ng các lo i ch t li u khác khác nhau nh v t d ngụ ụ ấ ẫ ườ ằ ạ ấ ệ ư ậ ụ dùng đ l y m u đông l nh là các khoan tay đã đ c vô trùng, hay các dao đ c r a trong cácể ấ ẫ ạ ượ ượ ử dung d ch t y trùng. Không nên l y vào các m ng băng. S d ng các thìa, kéo … đ cho m uị ẩ ấ ả ử ụ ể ẫ vào trong bình ch a. Đ i v i các th c ph m đã đóng gói, l y m u t các gói l n t đó l y raứ ố ớ ự ẩ ấ ẫ ừ ớ ừ ấ các đ n v bao gói nh h n.ơ ị ỏ ơ

M u ph i đ c l y ít nh t kho ng 100-250g cho m i m u tuỳ theo các yêu c u phânẫ ả ượ ấ ấ ả ỗ ẫ ầ tích, ph i l y t i nhi u v trí trên s n ph m hay trong cùng m t công đo n sao cho m t kh iả ấ ạ ề ị ả ẩ ộ ạ ộ ố l ng nh m u cũng đ i di n cho s n ph m đó.ượ ỏ ẫ ạ ệ ả ẩ

Đ i v i các lo i m u th t hay cá, n i nhi m vi sinh ch y u là trên b m t, vì th có thố ớ ạ ẫ ị ơ ễ ủ ế ể ặ ế ể s d ng các d ng c l y m u b m t đ quét trên b m t s n ph m hay c t m u trên b m tử ụ ụ ụ ấ ẫ ể ặ ể ể ặ ả ẩ ắ ẫ ể ặ v i đ dày kho ng 2-3mm.ớ ộ ả

V n chuy n và b o qu n m uậ ễ ả ả ẫ : Các m u sau khi l y đ c b o qu n m t các đ c l p v iẫ ấ ượ ả ả ộ ộ ậ ớ nhau trong các thùng b o qu n m u, làm l nh b ng các bao n c đá. N c đá ph i không đ cả ả ẫ ạ ằ ướ ướ ả ượ tan ch y trong su t quá trình v n chuy n m u đ n phòng thí nghi m. T i phòng thí nghi mả ố ậ ể ẫ ế ệ ạ ệ m u đ c chuy n vào trong t đông hay đ c phân tích ngay trong th i gian có th .ẫ ượ ể ủ ượ ờ ể

N u không th phân tích ngay, m u ph i đ c b o qu n –20ế ể ẫ ả ượ ả ả ở oC cho đ n khi phân tích.ế N u các m u không th b o qu n đông, thì ph i b o qu n trong t l nh 0-4ế ẫ ể ả ả ả ả ả ủ ạ oC không đ c quáượ 36 gi . Các lo i th c ph m nh đ h p, th c ph m có đ m th p, hay th c ph m khó hờ ạ ự ẩ ư ồ ộ ự ẩ ộ ẩ ấ ự ẩ ư h ng có th b o qu n nhi t đ phòng cho đ n khi phân tích.ỏ ể ả ả ở ệ ộ ế

1.3 Rã đông tr c khi phân tíchướ Ph i s d ng k thu t rã đông trong đi u ki n vô trùng tr c khi phân tích m u. Trongả ử ụ ỹ ậ ể ệ ướ ẫ

tr ng h p ph i ph i tr n m u tr c khi phân tích, m u ph i đ c rã đông trong các d ng cườ ợ ả ố ộ ẫ ướ ẫ ả ượ ụ ụ ch a nh khi mang đ n phòng ki m nghi m. Tránh các tr ng h p chuy n m u sang các bìnhứ ư ế ể ệ ườ ợ ể ẫ ch a th hai khi rã đông. Thông th ng nhi t đ r đông là 2-5ứ ứ ườ ệ ộ ả oC trong kho ng 18 gi , n u c nả ờ ế ầ

54



ph i rã đông nhanh có th th c hi n 45ả ể ự ệ ở oC trong vòng 15 phút. Khi rã đông nhi t đ cao,ỡ ệ ộ ph i liên t c l c bình ch a m u đ tăng t c đ rã và nhi t đ c a m u đ c đ ng nh t.ả ụ ắ ứ ẫ ể ố ộ ệ ộ ủ ẫ ượ ồ ấ1.1 Đ ng nh t m uồ ấ ẫ

S phân ph i c a các vi sinh v t trong m u không đ ng đ u nhau. Đ đ m b o tínhự ố ủ ậ ẫ ồ ề ể ả ả đ ng nh t trong các m u phân tích, các m u l ng đ c l c k tr c khi phân tích. Các m u r nồ ấ ẫ ẫ ỏ ượ ắ ỹ ướ ẫ ắ

đ c l c hay đão tr n b ng các d ng c chuyên dùng trong đi u ki n vô trùng. Sau khi đ mượ ắ ộ ằ ụ ụ ề ệ ả b o m u đ c đ ng nh t, l y m t l ng m u xác đ nh đ phân tích tùy theo yêu c u c a t ngả ẫ ượ ồ ấ ấ ộ ượ ẫ ị ể ầ ủ ừ ch tiêu c th , ví d đ i v i các ch tiêu đ nh l ng trong 1 gam, kh i l ng m u trích ra đỉ ụ ể ụ ố ớ ỉ ị ượ ố ượ ẫ ể phân tích là 10g, đ i v i các ch tiêu đ nh tính nhố ớ ỉ ị ư Salmonella kh i l ng m u trích ra là 25 gamố ượ ẫ …

1.2 Cân m uẫCân m t l ng m u xác đ nh đ phân tích tuỳ theo t ng ch tiêu yêu c u nh trên, cân chínhộ ượ ẫ ị ể ừ ỉ ầ ư

xác kh i l ng m u nh t đ nh, sai s c a phép cân này làố ượ ẫ ấ ị ố ủ ± 0.1g. L ng m u trích đ phân tíchượ ẫ ể đ c cho vào trong các bình ch a b ng nh a hay các bao nh a vô trùng.ượ ứ ằ ự ự

2. L Y VÀ B O QU N M U N CẤ Ả Ả Ẫ ƯỚTiêu chí c a vi c l y m u là m u ph i đ i di n m c cao nh t c a n c c n phân tích.ủ ệ ấ ẫ ẫ ả ạ ệ ứ ấ ủ ướ ầ

Đ đ t đ c m c đích này, ng i l y m u c n ph i tuân th các qui đ nh và qui trình trongể ạ ượ ụ ườ ấ ẫ ầ ả ủ ị vi c l y m u và phân tích.ệ ấ ẫ 2.1 D ng c ch a m uụ ụ ứ ẫ

Các d ng c l y m u nh m đ phân tích vi sinh v t là nh ng chai l đã đã đ c súc r aụ ụ ấ ẫ ằ ể ậ ữ ọ ượ ử c n th n, tráng l i l n cu i cùng b ng n c c t và kh trùng tr c khi s d ng đ l y m u.ẩ ậ ạ ầ ố ằ ướ ấ ử ướ ử ụ ế ấ ẩ Có th s d ng các túi nh a đã đ c kh trùng đ làm d ng c ch a m u.ể ử ụ ự ượ ử ể ụ ụ ứ ẫ

Kh chlorin và đ c tính kim lo i trong m u n cử ộ ạ ẫ ướ Thêm m t nhân t có tính kh vào trong trong các chai l dùng đ ch a m u đ khộ ố ử ọ ẩ ứ ẫ ể ử

chlorin hay các halogen khác. Trong tr ng h p không có các tác nhân kh trong các l l y m u,ườ ợ ử ọ ấ ẫ sau khi thu nh ng m u n c có ch a chlorin các chai l l y m u không đ c đóng n p. Nhânữ ẫ ướ ứ ọ ấ ẫ ượ ắ t kh th ng đ c s d ng đ kh chlorin trong n c là sodium thiosulphate, ch t này trungố ử ườ ượ ử ụ ế ử ướ ấ hoà và kh các các haologen trong n c nh m ngăn c n s tác đ ng c a chúng lên các vi sinhử ướ ằ ả ự ộ ủ v t trong m u trong th i gian v n chuy n. S lo i b các nhân t tác đ ng lên vi sinh v t trongậ ẫ ờ ậ ể ự ạ ỏ ố ộ ậ quá trình v n v n chuy n và b o qu n m u đ sau khi phân tích qu s l ng vi sinh v t ph nậ ậ ể ả ả ẫ ể ả ố ượ ậ ả ánh đúng m t đ c a chúng ngay khi l y m u.ậ ộ ủ ấ ẫ

Hàm l ng sodium thiocianate đ c cho vào trong các l sao cho sau khi l y m u chúngượ ượ ọ ấ ẫ phòng thích vào trong n c v i n ng đ 100mg/l. Trong chai l y m u có th tích 120ml thêmướ ớ ồ ộ ấ ẫ ể vào 0,1ml dung d ch Naị 2S2O3 10% s trung hoà h t chlorin trong m u v i n ng đ 15mg/l. đ iẽ ế ẫ ớ ồ ộ ố v i n c u ng hàm l ng ch t kh chlorin có th s d ng th p h n, kho ng 0,1ml dung d chớ ướ ố ượ ấ ử ể ử ụ ấ ơ ả ị

Na2S2O3 n ng đ 3% trong l ch a 120ml m u. N ng đ ch t kh này phóng thích vào trongồ ộ ọ ứ ẫ ồ ộ ấ ử m u n c là 18ml/l s trung hoà n ng đ chlorin trong m u là 5ml/l. Trong tr ng h p m uẫ ướ ẽ ổ ộ ẫ ườ ợ ẫ n c đ c kh trùng v i hàm l ng chlorin cao, n ng đ các ch t cho vào trong các l l yướ ượ ử ớ ượ ồ ộ ấ ọ ấ m u ph i đ t 100ml/l. Các tác nhân kh chlorin đ c cho vào trong các l l y m u tr c khiẫ ả ạ ử ượ ọ ấ ẫ ướ kh trùng. Có th s d ng ph ng pháp kh trùng t hay kh trùng khô đ i v i các d ng cử ể ử ụ ươ ử ướ ử ố ớ ụ ụ l y m u. Ngày nay có các túi l y m u ch a s n các tác nhân kh chlorin đ c bán t i các c aấ ẫ ấ ẫ ứ ằ ử ượ ạ ủ hàng v t t phòng thí nghi m.ậ ư ệ

55



Trong tr ng h p m u n c ch a các kim lo i nh đ ng, k m và các kim lo i n ng …ườ ợ ẫ ướ ứ ạ ư ồ ẽ ạ ặ v i hàm l ng cao hay n c th i, trong các d ng c l y m u ph i cho vào các tác nhân khớ ượ ướ ả ụ ụ ấ ẫ ả ử đ c tính c a các kim lo i này. Tác nhân này đ c bi t c n thi t khi th i gian v n chuy n m uộ ủ ạ ặ ệ ầ ế ờ ậ ể ẫ trên 4 gi . Ch t kh đ c tính c a kim lo i n ng đ c s d ng là mu i sodium c a EDTAờ ấ ử ộ ủ ạ ặ ượ ử ụ ố ủ (ethylenediaminetetraacetic acid) v i hàm l ng phóng thích vào trong m u là 372ml/l. EDTAớ ượ ẫ

đ c đi u ch nh v pH 6,5 tr c khi dùng. EDTA cũng đ c cho vào trong các d ng c l yượ ề ỉ ể ướ ượ ụ ụ ấ m u tr c khi kh trùng, hàm l ng cho vào là 0.3ml dung d ch EDTA 15% đ i v i chai l yẫ ướ ử ượ ị ố ớ ấ 120ml m u. Có th k t h p sodium thiocianat v i EDTA trong cùng m t d ng c l y m u.ẫ ể ế ợ ớ ộ ụ ụ ấ ẫQui trình l y m uấ ẫ

M u đ c l y vào trong các d ng c l y m u, không đ c l y đ y chai mà mà ph iẫ ượ ấ ụ ụ ấ ẫ ượ ấ ầ ả ch a m t kho ng không trong chai ch a m u đ đ m b o m u đ c tr n đ u b ng cách l cừ ộ ả ứ ẫ ể ả ả ẫ ượ ộ ề ằ ắ tr c khi phân tích. M u đ c l y ph i đ i di n cho n c đ c th nghi m, ph i s d ng cácướ ẫ ượ ấ ả ạ ệ ướ ượ ử ệ ả ử ụ bi n pháp vô trùng đ tránh các tr ng h p m u b nhi m t bên ngoài hay nhi m chéo gi aệ ể ườ ợ ẫ ị ễ ừ ễ ữ các m u v i nhau. Trong quá trình l y m u, gi ch c chai cho đ n khi n c đ y chai, gi cácẫ ớ ấ ẫ ữ ặ ế ướ ầ ữ nút hay n p chai không đ c nhi m trong khi l y m u. Sau khi l y đ y m u ph i nút mi ngắ ượ ễ ấ ẫ ấ ầ ẫ ả ệ chai ngay.

Cách th c l y m u đ c ti n hành nh sau:ự ấ ẫ ượ ế ư - L y m u t các ngu n là sông, su i, h ch a b ng cách c m chai l y m u trong tay,ấ ẫ ừ ồ ố ồ ứ ằ ầ ấ ẩ g n v trí đáy chai, đ a c chai h ng xu ng d i và đ a sâu vào d i m t n c. Xoay nh đầ ị ư ổ ướ ố ướ ư ướ ặ ướ ẹ ể c chai h i nghiên lên b m t n c và mi ng chai h ng v phía dòng ch y. Trong tr ng h pổ ơ ề ặ ướ ệ ườ ề ả ườ ợ không có dòng ch y nh n c trong h hay trong các b n ch a ph i t o ra m t dòng ch y nhânả ư ướ ồ ồ ứ ả ạ ộ ả t o b ng cách xoay chai theo h ng n m ngang và đ y chai di chuy n v phía theo h ngạ ằ ướ ằ ẩ ể ề ươ mi ng chai. Trong tr ng h p l y m u khi đi trên thuy n, m u ph i đ c l y phía tr c mũiệ ườ ợ ấ ẫ ề ẫ ả ượ ấ ở ướ thuy n. N u không th l y b ng cách th c này, có th bu c m t v t n ng vào bên d i đáyề ế ể ấ ằ ứ ể ộ ộ ậ ặ ướ chai r i đ a t t vào trong n c. Trong m i tr ng h p đ u tránh chai l y m u ti p xúc v iồ ư ừ ừ ướ ọ ườ ợ ề ấ ẫ ế ớ b hay đáy c a su i hai b n ch a.ờ ủ ố ồ ứ

- Có các d ng c đ c bi t cho phép m n p và l y m u bên d i m t n c đ c sụ ụ ặ ệ ở ắ ấ ẫ ướ ặ ướ ượ ử d ng đ l y các m u n c sâu trong các h hay các b n ch a. Có r t nhi u bình l t m u sâuụ ể ấ ẫ ướ ồ ồ ứ ấ ề ấ ẫ ho t đ ng theo nhi u cách khác nhau nh ph bi n nh t là bình l y m u ZoBell-J-Z. Các d ngạ ộ ề ư ổ ế ấ ấ ẫ ụ c l y m u n c t đ ng theo yêu c u ngày nay cũng đã đ c bán t i các c a hàng v t tụ ấ ẫ ướ ự ộ ầ ượ ạ ủ ậ ư phòng thí nghi m.ệ

- L y m u n c sinh ho t ấ ẫ ướ ạ : N u l y m u n c t các vòi c a h th ng c p n c d chế ấ ẫ ướ ừ ủ ệ ố ấ ướ ị v , ch n nh ng vòi c p n c tr c ti p t các đ ng ng chính, không nên l y t các thùng hayụ ọ ữ ấ ướ ự ế ừ ườ ố ấ ừ b n ch a. M vòi n c th t l n và đ ch y ra ngoài t 2-3 phút, trong th i gian này nh m đồ ứ ở ướ ậ ớ ể ả ừ ờ ằ ề r a s ch h th ng vòi n c tr c khi l y m u, gi m vòi n c đ l y m u vào trong các bìnhử ạ ệ ố ướ ướ ấ ẫ ả ướ ể ấ ẫ ch a. Trong m t s tr ng h p c n ph i làm s ch vòi tr c khi l y m u, dung d ch sodiumứ ộ ố ườ ợ ầ ả ạ ướ ấ ẫ ị hypochorite đ c cho ch y qua vòi tr c khi l y m u, sau khi kh trùng, ph i m n c vòi choượ ả ướ ấ ẫ ử ả ở ướ ch y khoàng 2-3 phút tr c khi l y m u vài chai. Không l y m u t các dòng n c ch y tràngả ướ ấ ẫ ấ ẫ ừ ướ ả bên ngoài vòi. Đ ngăn ng a các dòng n c ch y tràn t bên ngoài vòi vào trong m u, có thể ừ ướ ả ừ ẫ ể dùng d ng c ph u l c đ ngăn ng a các dòng n c tràn t bên ngoài vào trong bình ch a m u.ụ ụ ễ ọ ể ừ ướ ừ ứ ẫ Cũng có th lo i b s nhi m t bên ngoài do các dòng n c ch y tràn, cho n c nóng ch yể ạ ỏ ự ễ ừ ướ ả ướ ả qua vòi kho ng hai phút, làm l nh t 2-3 phút sau đó l y m u vào bình.ả ạ ừ ấ ẫ

N u l y m u n c t các gi ng b m tay, b m n c đ r a vòi gi ng kho ng 5 phútế ấ ẫ ướ ừ ế ơ ơ ướ ể ử ế ả tr c khi l y m u. N u gi ng đào đ c trang b máy b m, cũng tr c hi n t ng t nh trênướ ấ ẫ ế ế ượ ị ơ ự ệ ươ ự ư sau khi kh i đ ng máy. Trong tr ng h p các gi ng đào không có trang b máy b m, m u đ cờ ộ ườ ợ ế ị ơ ẫ ượ

56



l y tr c ti p t gi ng b ng cách bu c chai l y m u vào m t v t n ng bên d i đáy. Ph iấ ự ế ừ ế ằ ộ ấ ẫ ộ ậ ặ ở ướ ả th t c n th n đ tránh s nhi m b n t v t n ng hay n c trên b m t gi ng.ậ ẩ ậ ể ự ễ ẩ ừ ậ ặ ướ ề ặ ế

Trong tr ng h p l y m u n c u ng, ph i l y m u giai đo n cu i c a quá trình s nườ ợ ấ ẫ ướ ố ả ấ ẫ ở ạ ố ủ ả xu t, các v trí phân ph i m u n c u ng ph i đ c ch n l c đ đ m b o s tích lũy có hấ ị ố ẫ ướ ố ả ượ ọ ọ ể ả ả ự ệ th ng trong su i m i tháng. Ph i xem xét th t k càng v trí c a h th ng phân b m u, ngayố ố ỗ ả ậ ỹ ị ủ ệ ố ổ ẫ

c t i các đi m chi t đ đ m b o ch t l ng vi sinh v t thông qua toàn b h th ng đ đ mả ạ ể ế ể ả ả ấ ượ ậ ộ ệ ố ể ả bào r ng không có các v trính nhi m vi sinh v t hay nhi m chéo do qua trình tiên t c c a hằ ị ể ậ ể ụ ủ ệ th ng nh hi n t ng b ng hay gi m áp l c trong qua trình kh trùng hay m t nguyên nhânố ư ệ ượ ể ố ả ự ử ộ nào đó khác. V trí l y m u có th là vòi n c công c ng, các n i kinh doanh ngành th c ph m,ị ấ ẫ ể ướ ộ ơ ự ẩ nhà hàng hay gi ng n c các nhân … Nh ng đ c bi t quan tr ng khi l y m u t i các m ngế ướ ư ặ ệ ọ ấ ẫ ạ ạ l i cung c p n c cho c ng đ ng. S l y m u, k ho ch cũng nh t ng su t và v trí l yướ ấ ướ ộ ồ ự ấ ẫ ế ạ ư ầ ấ ị ấ m u ph i đ c lên ch ng trình có s tham v n c a các chuyên gia v sinh y t công c ng, vàẫ ả ượ ươ ự ấ ủ ệ ế ộ ngành c p n c.ấ ướ

- L y m u t i các ngu n c p n cấ ẫ ạ ồ ấ ướ : M u đ c l y tr c ti p t các t sông, su i, l ch,ẫ ượ ấ ự ế ừ ừ ố ạ ao, các gi ng hay các h ch a sao cho chúng đ i di n cho ngu n n c cung c p cho con ng iế ồ ứ ạ ệ ồ ướ ấ ườ s d ng. M u không nên l y quá g n b hay quá xa n i đ t ng b m n c, cũng không nên l yử ụ ẫ ấ ầ ờ ơ ặ ố ơ ướ ấ

m u quá sâu hay quá c n so v i vòi ng b m. M u đ c l y càng g n mi ng ng b m, càngẫ ạ ớ ố ơ ẫ ượ ấ ầ ệ ố ơ đ i di n cho ngu n ch t l ng c a ngu n c p n c.ạ ệ ồ ấ ượ ủ ồ ấ ướKích c m u: Th tích m u ph i đ đ đáp ng các yêu c u phân tích t i phòng thíở ẫ ể ẫ ả ủ ể ứ ầ ạ

nghi m. Th tích m u ph i l y không đ c nh h n 100ml.ệ ể ẫ ả ấ ượ ỏ ơM u sau khi l y ph i ghi đ y đ và chính xác v ký hi u, tên và các d li u đ c môẫ ấ ả ầ ủ ề ệ ữ ệ ượ

t . Không ti n hành phân tích các m u không đ y đ các d li u yêu c u.ả ế ẫ ầ ủ ữ ệ ầ

Th i gian và nhi t đ b o qu n m uờ ệ ộ ả ả ẫ :N u có th , phân tích các ch tiêu vi sinh ngay sau khi l y m u đ tránh nh ng s thayế ể ỉ ấ ẫ ể ữ ự

đ i không l ng tr c đ c. N u m u không th phân tích ngay trong vòng 1 gi sau khi l yổ ườ ướ ượ ế ẫ ể ờ ấ m u, ph i b o qu n trong các thùng l nh tr c khi v n chuy n đ n các phòng thí nghi m. N uẫ ả ả ả ạ ướ ậ ể ế ệ ế k t qu phân tích có liên quan đ n pháp lu t, ph i s d ng m t ph ng ti n v n chuy n đ cế ả ế ậ ả ử ụ ộ ươ ệ ậ ể ặ bi t đ chuy n m u đ n phòng thí nghi m trong kho ng th i gian 6 gi v i m t qui trình b oệ ể ể ẫ ế ệ ả ờ ờ ớ ộ ả qu n đ c bi t.ả ặ ệ

Nhi t đ b o qu n n c u ng, n c su i, hay n c b ô nhi m là d i 10ệ ộ ả ả ướ ố ướ ố ướ ị ễ ướ oC và th iớ gian v n chuy n không quá 6 gi . B o qu n trong t l nh t i các phòng thí nghi m cũng khôngậ ể ờ ả ả ủ ạ ạ ệ d c quá 2 gi . Trong đi u ki n b t bu c không th v n chuy n m u v phòng thí nghi mượ ờ ề ệ ắ ộ ể ậ ể ẫ ề ệ nhanh h n 6 gi , ph i xem xét đ n vi c trang b các ph ng ti n phân tích ngay t i v trí l yơ ờ ả ế ệ ị ươ ệ ạ ị ấ m u ho t s d ng qui trình ch . Tuy nhiên các yêu c u nh trên khó đ c đáp ng. Trên th cẫ ặ ử ụ ủ ờ ầ ư ượ ứ ự t các ch tiêu yêu c u th i gian v n chuy n và bào qu n không quá 24 gi . Không ch p nh nế ỉ ầ ớ ậ ể ả ờ ấ ậ các m u khi g i đ n phòng thí nghi m b ng đ ng b u đi n và không đ c b o qu n theo cácẫ ở ế ệ ằ ườ ư ệ ượ ả ả yêu c u. Th i gian và nhi t đ b o qu n m u ph i đ c l u tr đ sau khi phân tích dùng vàoầ ờ ệ ộ ả ả ẫ ả ượ ư ữ ế vi c x lý s li u.ệ ử ố ệ

3. Đ NH L NG T NG S VI SINH V T HI U KHÍỊ ƯỢ Ổ Ố Ậ Ế

3.1. Đ nh nghĩaị Vi sinh v t hi u khí: là nh ng vi sinh v t phát tri n đ hình thành khu n l c trong đi uậ ế ư ậ ể ể ẩ ạ ề

ki n có s hi n di n c a ôxy phân t .ệ ự ệ ệ ủ ử

57



S đ n v hình thành khu n l c (cfu – colony forming unit) là s khu n l c xu t hi nố ơ ị ẩ ạ ố ẩ ạ ấ ệ trong môi tr ng n ôi c y. S l ng đ n v hình thành khu n l c cho phép c đoán đ c sườ ụ ấ ố ượ ơ ị ẩ ạ ướ ượ ố l ng vi sinh v t trong m t đ n v kh i l ng th c ph m.ượ ậ ộ ơ ị ố ượ ự ẩ 3. 2. Nguyên t cắ

Đ xác đ nh s l ng vi sinh v t trong m t đ n v kh i l ng th c ph m b ng ph ngể ị ố ượ ậ ộ ơ ị ố ượ ự ẩ ằ ươ

pháp đ m s l ng khu n l c ph i qua quá trình đ ng nh t, pha loãng m u thành các n ng đế ố ượ ẩ ạ ả ồ ấ ẫ ồ ộ xác đ nh. Chuy n m t th tích xác đ nh các đ pha loãng đã đ ng nh t vào trong môi tr ngị ể ộ ể ị ộ ồ ấ ườ nuôi c y. Các khu n l c đ c hình thành trong môi tr ng sau khi đ c xem nh là chúngấ ẩ ạ ượ ườ ủ ượ ư hình thành t m t t bào đ n l .ừ ộ ế ơ ẻ

Tuỳ theo các yêu c u c th trong vi c phân tích, các đĩa môi tr ng sau khi c y m uầ ụ ể ệ ườ ấ ẫ đ c các đi u ki n nhi t đ và th i gian khác nhau. Theo yêu c u c a các tiêu chu n c aượ ủ ở ề ệ ệ ộ ờ ầ ủ ẩ ủ nhi u qu c gia, ch tiêu này đ c 30ề ố ỉ ượ ủ ở oC trong kho ng th i gian kho ng 3 ngày. Tuy nhiênả ờ ả m t s yêu c u khác có th nhi t đ 20 - 22ộ ố ầ ể ủ ở ệ ộ oC trong cùng th i gian trên.ờ

Đ m t t c các khu n l c xu t hi n trên đĩa, căn c vào đ pha loãng cũng nh th tíchế ấ ả ẩ ạ ấ ệ ứ ộ ư ể c y đ qui v t ng s vi sinh v t trong m t đ n v kh i l ng m u th c ph m. Ch tiêu t ngấ ể ề ổ ố ậ ộ ơ ị ố ượ ẫ ự ẩ ỉ ổ s vi sinh v t hi u khí đ c dùng đ đánh giá ch t l ng c a m u v khía c nh vi sinh v t,ố ậ ế ượ ể ấ ượ ủ ẫ ề ạ ậ

qua đó đánh giá kh năng h h ng, cũng nh th i h n b o qu n các s n ph m th c ph m.ả ư ỏ ư ờ ạ ả ả ả ẩ ự ẩ T ng s vi sinh v t hi u khí còn là ch tiêu đánh giá m c đ v sinh trong quá trình ch bi n,ổ ố ậ ế ỉ ứ ộ ệ ế ế b o qu n th c ph m, n c u ng hay các s n ph m khác.ả ả ự ẩ ướ ố ả ẩ 3.3. Môi tr nng và v t li u phân tíchườ ậ ệ- Môi tr ng Plate Count Agar có pH 7.0ừơ ± 0.2. Môi tr ng đ c phân ph i vào trong cácườ ượ ố

bình thu tinh hay trong các ng nghi m. H p kh trùng 121ỷ ố ệ ấ ử ở oC trong 15 phút. B o qu nả ả ở trong t l nh t 2–8ủ ạ ừ oC. Tr c khi s d ng môi tr ng ph i đ c đun ch y và làm ngu iướ ử ụ ườ ả ượ ả ộ ở 45oC trong b đi u nhi t.ể ề ệ

- Dung d ch pha loãng saline pepton water: g m 8.5 gam NaCl và 1.0gam pepton. Dung d chị ồ ị đ c phân ph i vào trong các bình ch a 0.5-1.0 lít và phân ph i vào trong các ng nghi mượ ố ứ ố ố ệ v i th tích chính xác 9.0ml sau khi kh trùngớ ể ử

3.4 Chu n b m u tr c khi phân tíchẩ ị ẫ ướ - Dùng các d ng c nh kéo, k p đã đ c kh trùng cânụ ụ ư ẹ ượ ữ chính xác 10.0g m u vào trong bao PE. T t c các đi u ki n làm vi c và thao tác ph i ti n hànhẫ ấ ả ề ệ ệ ả ế trong đi u ki n vô trùng. Thêm vào l ng m u này 90 ml dung d ch pha loãng Saline Peptonề ệ ượ ẫ ị Water. Sau khi đ ng nh t nh n đ c dung d ch m u có đ pha loãng 10ồ ấ ậ ượ ị ẫ ộ -1.- Đ ng nh t m uồ ấ ẫ b ng máy d p m u, th i gian d p m u ph thu c vào tính ch t c lý c a m u, nh ng khôngằ ậ ẫ ờ ậ ẫ ụ ộ ấ ơ ủ ẫ ư quá 2,5 phút. - D ch m u ngay sau khi đ ng nh t đ c pha loãng theo dãy th p phân b ng cáchị ẫ ồ ấ ượ ậ ằ dùng pipet vô trùng chuy n 1 ml d ch m u vào ng nghi m ch a 9 ml dung d ch pha loãngể ị ẫ ố ệ ứ ị Saline Pepton Water , tránh ti p xúc pipet v i dung d ch pha loãng, đ ng nh t m u trong ngế ớ ị ồ ấ ẫ ố nghi m b ng máy l c ho c dùng pipet vô trùng khác hút đ o d ch m u lên xu ng 5 -10 l n.ệ ằ ắ ặ ả ị ẫ ố ầ Dùng pipet đó chuy n 1 ml d ch m u vào ng th hai ch a 9 ml dung d ch pha loãng. Ti p t cể ị ẫ ố ứ ứ ị ế ụ nh v y s có các dung d ch m u v i các đ pha loãng 10ư ậ ẽ ị ẫ ớ ộ -2; 10-3; 10-4; …cho đ n khi có đ cácế ủ

n ng đ pha loãng c n thi t.ồ ộ ầ ế 3.5. C y m uấ ẫ Ch n hai hay ba đ pha loãng liên ti p saoọ ộ ế cho trong 1 ml ch a 25-250 t bào vi sinh v t đ c y. Dùng pipet vô trùng chuy n 1 ml d chứ ế ậ ể ấ ể ị m u pha loãng đã ch n vào gi a đĩa petri vô trùng. M i n ng đ c y ít nh t vào 2 hay 3 đĩa. Sauẫ ọ ữ ỗ ồ ộ ấ ấ khi c y, đ vào m i đĩa 10-15 ml môi tr ng Plate Count Agar đã đ c đun ch y và đ n đ nhấ ổ ỗ ườ ượ ả ể ổ ị

45ở oC.Tr n đ u d ch m u v i môi tr ng b ng cách l c tròn đĩa petri xuôi và ng c chi uộ ề ị ẫ ớ ườ ằ ắ ượ ề kim đ ng h , m i chi u 3-5 l n ngay sau khi đ môi tr ng. Đ t các đĩa trên m t ph ng ngangồ ồ ỗ ề ầ ổ ườ ặ ặ ẳ cho agar đông đ c.ặ L t ng c và các đĩa trong t m nhi t đ 30.0ậ ượ ủ ủ ấ ở ệ ộ ± 1.0oC (hay

58



yêu c u nhi t đ khác) trong th i gian 72 gi . Trong m t s yêu c u, nhi t đ đĩa và th i gianầ ệ ộ ờ ờ ộ ố ầ ệ ộ ủ ờ có th thay đ i.ủ ể ổ 3.6. Đ m k t quế ế ả

Đ m t t c s các khu n l c xu t hi n trên các đĩa sau khi . Ch n các đĩa có s đ mế ấ ả ố ẩ ạ ấ ệ ủ ọ ố ế t 25 đ n 250 đ tính k t qu . S l ng t ng s vi sinh v t trong 1 gam m u đ c tính nhừ ế ể ế ả ố ượ ổ ố ậ ẫ ượ ư sau:

NA = (cfu/g)

n1 x V1 x f1 + … + ni x Vi x fi

Trong đó: A: s l ng vi sinh v t trong 1 gam m uố ượ ậ ẫN: t t c các khu n k c đ m đ c trên các đĩa đã ch n.ấ ả ẩ ạ ế ượ ọni: s l ng đĩa c y t i đ pha loãng th iố ượ ấ ạ ộ ứ V: th tích d ch m u c y vào trong 1 đĩa.ể ị ẫ ấfi: đ pha loãng t ng ng.ộ ươ ứ

Ví d trong m t tr ng h p phân tích m u c th nh n đ c k t qu nh sau:ụ ộ ườ ợ ẫ ụ ể ậ ượ ế ả ư

N ng đ pha loãngồ ộ 10-3 10-4

K t qu : Đĩa 1ế ảĐĩa 2

235246

2621

235 + 246 + 26A = ≅ 2.4 x 105(cfu/g)

2 x 1 x 0,001+ 1 x 1x 0.0001

Các k t qu t ng s vi sinh v t hi u khí th ng đ c bi u di n d i d ng s mũ cùaế ả ổ ố ậ ế ườ ượ ể ể ướ ạ ố c s th p phân.ơ ố ậ

Tr ng h p có các vi sinh v t m c loang, tính m i v t loang là 1 khu n l c. N u sườ ợ ậ ọ ỗ ế ẩ ạ ế ố khu n l c loang chi m h n 1/3 đĩa thì ph i ghi nh n đi u này và đánh d u k t qu nh n đ c.ẩ ạ ế ơ ả ậ ề ấ ế ả ậ ượN u đ pha loãng cao nh t, s khu n l c đ m đ c trên 1 đĩa >250, ví d n ng đ 10ế ở ộ ấ ố ẩ ạ ế ượ ụ ở ồ ộ -5 số đ m l n h n 250, k t qu đ c ghi: >2.5 x 10ế ớ ơ ế ả ượ 7 CFU/g. N u đ pha loãng th p nh t, sế ở ộ ấ ấ ố khu n l c đ m đ c trên 1 đĩa <25, ví d n ng đ 10ẩ ạ ế ượ ụ ở ồ ộ -1 s đ m nh h n 25, k t qu đ cố ế ỏ ơ ế ả ượ ghi: <2.5 x102 CFU/g.

4. XÁC Đ NH T NG S COLIFORMS VÀ COLIFORM PHÂN BĂNG PH NG PHÁPỊ Ổ Ố ƯƠ Đ M KHU N L CẾ Ẩ Ạ

4.1. Đ nh nghĩaị Coliforms là nhóm vi sinh v t ch th vì s l ng hi n di n c a chúng trong th c ph m,ậ ỉ ị ố ượ ệ ệ ủ ự ẩ

n c hay các lo i m u môi tr ng đ c dùng nh d u hi u ch th kh năng hi n di n c a cácướ ạ ẫ ườ ượ ư ấ ệ ỉ ị ả ệ ệ ủ vi sinh v t gây b nh khác. Các nhà nghiên c u đ u cho th y r ng v i s l ng cao c a coliformậ ệ ứ ề ấ ằ ớ ố ượ ủ trong th c ph m thì kh năng hi n di n c a các vi sinh v t gây b nh khác cao. Tuy nhiên m iự ẩ ả ệ ệ ủ ậ ệ ố liên h gi a vi sinh v t gây b nh và vi sinh v t ch th còn có nhi u tranh cãi.ệ ữ ậ ệ ậ ỉ ị ề

Coliform t ng s là nhóm vi sinh v t hi u khí tuỳ nghi, thu c nhóm vi khu n gram âm,ổ ố ậ ế ộ ẩ không sinh bào t , có hình que, lên men lactose và sinh h i t ngu n carbon này trong vòng 24-ử ơ ừ ồ48 gi nhi t đ 37ờ ờ ệ ộ oC.

59



Khi nâng cao nhi t đ nuôi c y lên 44ệ ộ ấ oC có th phân bi t Coliform phân v i nhómể ệ ớ Coliform t ng s và nhóm không ph i Coliform. Coliform đ c đ nh nghĩa nh sau: Coliformổ ố ả ượ ị ư phân là nhóm vi sinh v t hi u khí và k khí tuỳ ý, thu c nhóm vi sinh v t gram âm, không sinhậ ế ỵ ộ ậ bào t và có kh năng lên men lactose và sinh h i trong kho ng th i gian nuôi c y 24-48 giử ả ơ ả ờ ấ ờ ở nhi t đ 44ệ ộ oC.

Nhóm Coliform phân là m t ph n c a h vi sinh ru t đ ng ng i và các đ ng v tộ ầ ủ ệ ộ ườ ở ườ ộ ậ máu nóng khác, các nhóm vi sinh v t sau đ c li t vào nhóm Coliform phân: Escherichia;ậ ượ ệ Klebsiella, Citrobacter và Enterobacter. Nhóm vi sinh v t này đ c s d ng nh y u t ch thậ ượ ử ụ ư ế ố ỉ ị m c đ v sinh trong quá trình ch bi n, b o qu n và v n chuy n th c ph m, n c u ng vàứ ộ ệ ế ế ả ả ậ ể ự ẩ ướ ố môi tr ng. Các đ c đi m sinh hoá khác nhau đ phân bi t các thành viên trong nhóm coliformườ ặ ể ể ệ phân nh sau:ư 4.3. Nguyên t cắ

C y m t l ng m u xác đ nh trên môi tr ng th ch ch n l c. Sau khi 37,0 + 1,0ấ ộ ượ ẫ ị ườ ạ ọ ọ ủ ở oC24 - 48 gi , đ m s l ng khu n l c Coliforms đi n hình. Xác đ nh l i b ng các ph n ng đ cờ ế ố ượ ẩ ạ ể ị ạ ằ ả ứ ặ tr ng. Môi tr ng ch n l c cho Coliform là môi tr ng ch a lactose, đây ngu n carbon duyư ườ ọ ọ ườ ứ ồ nh t, đ ng th i trong môi tr ng còn ch a mu i m t là tác nhân ch ch n l c cho vi khu nấ ồ ờ ườ ứ ố ậ ỉ ọ ọ ẩ

gram âm, ch a các tác nhân ch th các d u hi n đi n hình khi vi sinh v t trao đ i các thành ph nứ ỉ ị ấ ệ ể ậ ổ ầ trong môi tr ng nh neutral red, hay crystal violet. Kh ng đ nh các dòng vi khu n cho hìnhườ ư ẳ ị ẩ d ng khu n l c đi n hình băng các môi tr ng canh ch n l c nh Brilliant green bile lactose.ạ ẩ ạ ể ườ ọ ọ ư

Đ ch n l c đ i v i các nhóm Coliform phân nhi t đ nuôi c y là 44ể ọ ọ ố ớ ệ ộ ấ oC trong 24-48 gi .ờ Đ m các khu n l c đ c tr ng cho Coliform phân, ngoài vi c kh ng đ nh kh năng sinh h i tế ẩ ạ ặ ư ệ ằ ị ả ơ ừ lactose b ng các môi tr ng canh còn đ c kh ng đ nh kh năng t o indol trong môi tr ngằ ườ ượ ằ ị ả ạ ườ canh ch a trypton 44ứ ở oC.

Đ tránh các tr ng h p không phát hi n đ c s l ng t bào Coliform b t n th ngể ườ ợ ệ ượ ố ượ ế ị ổ ươ hay suy y u trong quá trình ch bi n hay b o qu n th c ph m, khi ti p xúc v i môi tr ngế ế ế ả ả ự ẩ ế ớ ườ ch n l c chùng s b ch t hay không th phát tri n thành khu n l c, m t môi tr ng khôngọ ọ ẽ ị ế ể ể ẩ ạ ộ ườ ch n l c nh ng không ch a m t ngu n carbon khác đ c s d ng nh Trypton Soy Agar. Môiọ ọ ư ứ ộ ồ ượ ử ụ ư tr ng này đ c cho vào sau khi c y m u và nhi t đ 20-25ườ ượ ấ ẫ ủ ệ ộ oC (nhi t đ phòng) trong th iệ ộ ờ gian 1-2 gi nh m khôi ph c nh ng t bào b suy y u tr c khi cho môi tr ng ch n l c vàoờ ằ ụ ữ ế ị ế ướ ườ ọ ọ đĩa.

S l ng Coliform hay Coliform phân đ c xác đ nh b ng s l ng khu n l c đi nố ượ ượ ị ằ ố ượ ẩ ạ ể hình đ m đ c, h s xác nh n và đ pha loãng m u tr c khi c y vào đĩa.ế ượ ệ ố ậ ộ ẫ ướ ấ 4.4. Môi tr ngườ

- Tryptone Soya Agar (TSA) đ c chu n b trong các bình hay chai thu tinh, kh trùngượ ẩ ị ỷ ử ở nhi t đ 121ệ ộ oC trong 15 phút b ng n i h p. B o qu n nhi t đ 4-8ằ ồ ấ ả ả ở ệ ộ oC. Tr c khi s d ng,ướ ử ụ môi tr ng đ c đun ch y và làm ngu i 45ườ ượ ả ộ ở oC trong b đi u nhi t.ể ề ệ

- Violet Red Bile Agar (VRB) đ c chu n b vô trùng trong các chai thu tinh,đun ch y vàượ ẩ ị ỷ ả làm ngu i nhi t đ 45ộ ở ệ ộ oC trong b đi u nhi t tr c khi s d ng. Có th s d ng các môiể ề ệ ướ ử ụ ể ử ụ tr ng khác nh Desoxycholate agar cũng đ c chu n b nh trên.ườ ư ượ ẩ ị ư

- Brilliant Green Bile Lactose Broth (BGBL) đ c phân ph i vào trong các ng nghi m, m iượ ố ố ệ ỗ ng 10ml và có ng Durham đ t ng c bên trong. Kh trùng 121ố ố ặ ượ ử ở oC trong 15 phút. Sau khi khử

trùng ph i đ m b o không có b t khí trong các ng Durham ng c.ả ả ả ọ ố ượ- E.C broth: đ c chu n b t ng t nh môi tr ng BGBL.ượ ẩ ị ươ ự ư ườ- Canh trypton: đ c phân ph i vào trong các ng nghi m, m i ng 5ml. Môi tr ng khượ ố ố ệ ỗ ố ườ ử

trùng 121ở oC trong 15 phút.- Thu c th Kovac’s hay Ehrlishố ử

60



4. 5. Qui trình phân tíchChu n b m u:ẩ ị ẫQuá trình chu n b m u t ng t nh ph n đ nh l ng t ng s vi sinh v t hi u khí.ẩ ị ẫ ươ ự ư ầ ị ượ ổ ố ậ ế

Nh ng quá trình pha loãng m u sao cho trong 1ml dung d ch pha loãng ch a kho ng <100 t bàoư ẫ ị ứ ả ế Coliform.

C y m u và đ môi tr ngấ ẫ ổ ườ C y chuy n 1 ml d ch pha loãng m u đã ch n vào đĩa petri, m i n ng đ c y ít nh t vàoấ ể ị ẫ ọ ỗ ồ ộ ấ ấ hai đĩa petri, ch n 2 n ng đ pha loãng liên ti p đ c y sao cho sau khi m i đĩa xu t hi nọ ồ ộ ế ể ấ ủ ỗ ấ ệ d i 100 khu n l c.ướ ẩ ạ

Cho vào m i đĩa đã c y m u kho ng 5ml môi tr ngTSA đã đ c đun ch y và n đ nhỗ ấ ẫ ả ườ ượ ả ổ ị trong b đi u nhi t 45ể ề ệ ở oC, tr n đ u d ch m u v i môi tr ng b ng cách l c tròn đĩa petri xuôiộ ề ị ẫ ớ ườ ằ ắ và ng c chi u kim đ ng h , m i chi u 3-5 l n ngay sau khi đ môi tr ng và đ n đ nhượ ề ồ ồ ỗ ề ầ ổ ườ ể ổ ị ở nhi t đ phòng trong 1-2 gi nh m ph c h i các t bào b t n th ng hay các t vào b suyệ ộ ờ ằ ụ ồ ế ị ổ ươ ế ị thoái do quá trình ch bi n. Đ thêm 10-15 môi tr ng VRB lên trên môi tr ng TSA. Ch choế ế ổ ườ ườ ờ môi tr ng trong đĩa đông đ c, l t ng c đĩa và 37.0 + 1.0ườ ặ ậ ượ ủ ở oC trong 24 -48 gi .ờ Đ m k t ế ế quả

Ch n các đĩa có s đ m t d i 100 khu n l c Coliforms đ tính k t qu . Khu n l cọ ố ế ừ ướ ẩ ạ ể ế ả ẩ ạ Coliforms có màu đ đ n màu đ đ m và có đ ng kính > 0.5 mm, xung quanh khu n l c cóỏ ế ỏ ậ ườ ẩ ạ vùng t a c a mu i m t.ủ ủ ố ậ

Giai đo n xác đ nhạ ịTrong tr ng h p phân tích các m u th c ph m có ch a các ngu n carbon khác khôngườ ợ ẫ ự ẩ ứ ồ

ph i lactose, đ tránh các tr ng h p vi sinh v t s d ng các ngu n carbon trong m u đ lênả ể ườ ợ ậ ử ụ ồ ẫ ể men và có bi u hi n hình d ng khu n l c t ng t Coliform, giai đo n kh ng đ nh là c n thi t.ể ệ ạ ẩ ạ ươ ự ạ ẳ ị ầ ế Qui trình kh ng đ nh đ c ti n hành nh sau: ch n ít nh t 5 khu n l c nghi ng đã đ m v i cácẳ ị ượ ế ư ọ ấ ẩ ạ ờ ế ớ hình d ng khác nhau, c y chuy n sang các ng có ch a môi tr ng kh ng đ nh. BGBL đ c sạ ấ ể ố ứ ườ ẳ ị ượ ử d ng khi kh ng đ nh Coliform t ng s , E.C đ c s d ng đ kh ng đ nh Coliform phân. U cácụ ẳ ị ổ ố ượ ử ụ ể ằ ị

ng nghi m BGBL đã c y nhi t đ 37.0 + 1.0ố ệ ấ ở ệ ộ oC và các ng nghi m E.C broth 44ố ệ ở oC trongth i gian 24-48 gi . K t qu d ng tính khi vi khu n phát tri n và sinh h i trong môi tr ngờ ờ ế ả ươ ẩ ể ơ ườ nuôi c y, h i t o ra đ c gi l i trong các ng Durham ng c hay t l i trên b m t ngấ ơ ạ ượ ữ ạ ố ượ ụ ạ ề ặ ố nghi m. T l xác nh n là t s gi a khu n l c cho k t qu d ng tính v i s khu n l c kh ngệ ỉ ệ ậ ỉ ố ữ ẩ ạ ế ả ươ ớ ố ẩ ạ ẳ đ nh.ị

Trong tr ng h p kh ng đ nh Coliform phân, các khu n l c sinh h i trong môi tr ngườ ợ ẳ ị ẩ ạ ơ ườ E.C broth đ c th nghi m indol 44ượ ử ệ ở oC. T l d ng tính ch đ c tính cho các khu n l c cóỉ ệ ươ ỉ ượ ẩ ạ kh năng sinh h i và ph n ng indol d ng tính.ả ơ ả ứ ươ

Báo cáo k t quế ảN

A(coliform/coliform phân) = x R (cfu/g(ml))n1v1f1 + … + nivifi

Trong đó: N : t ng s khu n l c đ m đ cổ ố ẩ ạ ế ượni : s đĩa có s khu n l c đ c ch n t i m i đ pha loãngố ố ẩ ạ ượ ọ ạ ỗ ộv : Th tích c y vào m i đĩaể ấ ỗfi : Đ pha loãng có s khu n l c đ c ch n t i các đĩa đ mộ ố ẩ ạ ượ ọ ạ ếR : T l xác nh nỉ ệ ậ

61



K t qu coliform hay coliform phân đ c làm tròn ch n ch c và đ c bi u di n d iế ả ượ ẵ ụ ượ ể ệ ướ d ng s mũ có c s th p phân.ạ ố ơ ố ậ

5. ®Þnh tÝnh ESCHERICHIA COLI trong thc phm

5. 1 Ph¹m vi ¸p d ngơ Ph¬ng ph¸p nµy (tham chiu theo TCVN 5287, t i b¶n lÇn th 2, n¨m 1994) ® c ¸p d ng choỵ ơ tt c¶ çc lo¹i thc phm (® c bi t lµ thc phm thđy s¶n ®«ng l¹nh) ®Ĩ x¸c ®Þnh s hi n di n cđaỈ Ư Ư Ư Escherichia coli.5.2 §Þnh ngha

Escherichia coli lµ d¹ng Coliform c ngun gc t ph©n, ph¸t triĨn ® c 44ỵ 0C, sinh Indol, sinh axit,kh«ng sinh acetoin vµ kh«ng s d ng citrat lµm ngun Cacbon.ư ơ Escherichia coli ® c ph¸t hi n doỵ Ư kh¶ n¨ng lªn men lactose vµ sinh h¬I 440C, c kt qu¶ nghi m ph¸p IMViC ++ --.Ư5.3.Nguyªn t¾c

Ph¬ng ph¸p nµy dng ®Ĩ ®Þnh tÝnh vµ kt lun ph¸t hi n hay kh«ng ph¸t hi nƯ Ư E.coli trong mtkhi l ng mu x¸c ®Þnh.ỵ

Cy mu vµo m«i trng t¨ng sinh (BGBL), ph©n lp trªn m«i trng ph©n lp (EMB) vµ kh¼ng ®Þnhb»ng çc th nghi m sinh ha ph h p (nghi m ph¸p IMViC) .ư Ư ỵ Ư5.4. DÞch pha lo·ng vµ m«i trng:

- Dung dÞch Saline Pepton (SPW)- Brilliant green bile lactose broth (BGBL)- Th¹ch Eosin Methylene Blue Lactose agar (EMB)- Canh Methyl Red Voges Proskauer (MR-VP)- Canh Tryptone (ho c peptone)Ỉ- Th¹ch Simmons Citrat- Thuc th Methyl red 0.2%ư - Dung dÞch KOH 40%

- Thuc th -naphtol 5%ư - Thuc th Kovac’sư 5.5. Thit bÞ chÝnh

- Tđ m 37.0 + 1.00C.- Tđ m 44.0 + 0.50C.

5.6. Quy tr×nhChun bÞ mu:

Chun bÞ mu vµ pha lo·ng t¬ng t nh ®Þnh l ng ColiformsỵT¨ng sinh:

Cy 1ml dÞch mu c nng ® 10 -1 vµo ng nghi m c cha 10ml m«i trƯ ng t¨ng sinh (BGBL), đ44.0 + 0.50C/24 gi.

Ph©n lpSau 24 gi, chn ng nghi m c ph¶n ng dƯ ¬ng tÝnh (lµm ® c m«i trơ ng vµ sinh h¬i), cy sangm«i trng ph©n lp (EMB), đ 37.0 + 1.00C/24 gi.

Nhn d¹ng khun l¹c E.coli: Trªn m«i trng EMB: khun l¹c mµu tÝm, ¸nh kim, trßn, b ® u, ®Ị ngkÝnh kho¶ng 0.5mm. Kh¼ng ®Þnh

Nh÷ng khun l¹c nghi ng ® c thc hi n qua çc th nghi m sinh ha (thc hi n nghi mỵ Ư ư Ư Ư Ư ph¸p IMViC)

62



Chn Ýt nht 2 khun l¹c ®iĨn h×nh hay nghi ng m«i trng ph©n lp, cy chuyĨn sang m«i trngr¾n kh«ng chn lc (TSA) , đ 37.0 ± 1.0OC trong 18-24 gi.Th nghi m sinh haư Ư

C¸c th nghi m sinh ha ®ư Ư c dng ®Ĩ kh¼ng ®Þnhỵ E.coli nh b¶ng díi ®©yTT Th nghi m sinh haư Ư Kt qu¶

1234

IndolMethyl redVoges ProskauerKh¶ n¨ng s d ng citratư ơ

++--

B¸o c¸o kt qu¶Ph¸t hi n hay kh«ng ph¸t hi nƯ Ư E.coli trong 10g mu.

6. Đ NHỊ L NGƯỢ ESCHERICHIA COLI TRONG TH C PH MỰ Ẩ

6.1 Đ nh nghĩa ị E.coli là loài vi sinh v t thu c nhóm Coliform phân, có hình que, gram âm, di đ ng, cóậ ộ ộ

kh năng lên men và t o acid và sinh h i t đ ng lactose 44ả ạ ơ ừ ườ ởo

C hay nhi t đ th p h n, cóệ ộ ấ ơ kh năng sinh indol 44ả ở oC và 37oC, có ph n ng Voges Proskauer âm tính, không có kh năngả ứ ả s d ng citrate nh ngu n car bon duy nh t.ử ụ ư ồ ấ

Trong m t s ph ng pháp ki m nghi m th c ph m, có nh ng đ nh nghĩa phân bi t sộ ố ươ ể ệ ự ẩ ữ ị ệ ố l ngượ E.coli kh ng đ nh và s l ngẳ ị ố ượ E.coli gi đ nh. S l ngả ị ố ượ E.coli gi đ nh đ c coi làả ị ượ nh ng Coliform phân, chúng có ph n ng Indol d ng tính, không ti n hành kh ng đ nh cácữ ả ứ ươ ế ẳ ị ph n ng khác.ả ứ

E.coli còn đ c g i là faecal coli, chúng hi n di n th ng xuyên trong ru t ng i và cácượ ọ ệ ệ ườ ộ ườ loài đ ng v t. Chúng phân b r ng kh p trong t nhiên, m t dù có ngu n g c t phân, nh ngộ ậ ố ộ ắ ự ặ ồ ố ừ ư s hi n di n c a chúng v i m t s l ng nh trong th c ph m không có nghĩa là th c ph m đóự ệ ệ ủ ớ ộ ố ượ ỏ ự ẩ ự ẩ b nhi m phân. S hi n di n c a vi sinh v t trong th c ph m, n c u ng là d u hi u ch th sị ễ ự ệ ệ ủ ậ ự ẩ ướ ố ấ ệ ỉ ị ự

kém ch t l ng v m t v sinh.ấ ượ ề ặ ệKhi xâm nhi m m t li u l ng l n vào trong c th ng i và đ ng v t,ễ ộ ề ượ ớ ơ ể ướ ộ ậ E.coli là loàiph bi n nh t gây viêm nhi m đ ng ti u, th nh tho ng có th tìm th y chúng gây l loét vàổ ế ấ ễ ườ ể ỉ ả ể ấ ở t o m , nhi m trùng máu và có th tìm th y vi sinh v t này gây viêm não.ạ ủ ễ ể ấ ậ

Cho đ n nay ng i các nhà khoa h c đã tìm đ c ít nh t 4 loài gây b nh đ ng ru t choế ườ ọ ượ ấ ệ ườ ộ ng i. Theo phân lo i c a Gorbach chúng đ c chia thành: enterobathogenic (EPEC);ườ ạ ủ ượ enterotoxigenic (ETEC), enteroinvasive (EIEC), và verotoxigenic (ETEC). Các ki u huy t thanhể ế c a các dòng E.coli gây b nh đ c li t trong b ng 26.3ủ ệ ượ ệ ả6.2 Nguyên t cắ

C y m t th tích xác đ nh các n ng đ pha loãng thích h p lên môi tr ng ch n l c. Sauấ ộ ể ị ồ ộ ợ ườ ọ ọ khi 44ủ ở oC trong kho ng th i gian 24 gi , đ m các khu n l c có hình d ng đ c tr ng c aả ờ ờ ế ẩ ạ ạ ặ ư ủ

Coliform. Xác nh n các khu n l c đã đ m b ng các ph n ng sinh hoá.ậ ẩ ạ ế ằ ả ư E. coli có các ph n ngả ứ sinh hoá đ c tr ng nh sau: indol d ng tính, methyl red d ng tính; Vogesproskauer âm tính vàặ ư ư ươ ươ citrat âm tính.6.3Môi tr ngườ

Tryptone soya agar ( TSA ) (chu n b t ng t ph n coliform)ẩ ị ươ ự ầViolet red bile agar ( VRB ) (chu n b t ng t ph n coliform)ẩ ị ươ ự ầ Escherichia coli broth (EC broth): đ c phân ph i trong các nghi m, m i ng ch a 10ml,ượ ố ệ ỗ ố ứ

cho vào bên trong ng durham ng c, h p kh trùng b ng n i h p và làm ngu i t t đ khôngố ượ ấ ử ằ ồ ấ ộ ừ ừ ể

63



còn các b t khí trong ng durham. B o qu n các ng môi tr ng nhi t đ 2-8ọ ố ả ả ố ườ ở ệ ộ oC cho đ n khiế s d ng.ử ụ

Lactose tryptone lauryl sulphate broth (LST Broth ): (Chu n b t ng t nh EC broth).ẩ ị ươ ự ư Tryptone broth (chu n b t ng t ph n coliform)ẩ ị ươ ự ầThu c th Kovac’số ử

MR-VP broth: phân ph i vào trong các ng nghi m, m i ng 5ml. H p kh trùng b ngố ố ệ ỗ ố ấ ử ằ n i h p. B o qu n 2-8ồ ấ ả ả oC cho đ n khi s d ng.ế ữ ụSimmon citrate: đ c chu n b nh là nh là các môi tr ng th ch nghiêng trong cácượ ẩ ị ư ư ườ ạ

ng nghi m. Môi tr ng sau khi pha ch có màu xanh l c.ố ệ ườ ế ụ6.4 Qui trình c y m uấ ẫ

Chu n b và c y m u:ẩ ị ấ ẫ T ng t nh ph n chu n b m u cho ki m nghi n coliform vàươ ự ư ầ ẩ ị ẫ ể ệ coliform phân.

Đ c k t qu :ọ ế ả Ch n các đĩa có t 10 - 100 khu n l c. Đ i v i nh ng đĩa có s khu n l cọ ừ ẩ ạ ố ớ ữ ố ẩ ạ nhi u thì kích th c các khu n l c th ng nh và không rõ. Đ m nh ng khu n l c màu đ đ nề ướ ẩ ạ ườ ỏ ế ữ ẩ ạ ỏ ế đ s m và có đ ng kính l n h n 0.5 mm, xung quanh có vùng t a c a mu i m t.ỏ ậ ườ ớ ơ ủ ủ ố ậ

Giai đo n xác đ nh:ạ ị Đ i v i m i d ng khu n l c, ch n 5 khu n l c nghi ng c yố ớ ỗ ạ ẩ ạ ọ ẩ ạ ờ ấ

chuy n sang canh thang EC. U 44.0ể ở ± 0.5o

C trong kho ng 24 gi , k t qu d ng tính khi viả ờ ế ả ươ sinh v t có kh năng sinh sinh h i trong môi tr ng, đ c bi u hi n b ng b t khí đ c gi l iậ ả ơ ườ ượ ể ệ ằ ọ ượ ữ ạ trong các ông durham hay đ ng l i trên b m t môi tr ng.ọ ạ ề ặ ườ

Ch n các ng canh thang EC có sinh h i đ c y chuy n sang các môi tr ng sau: canhọ ố ơ ể ấ ể ườ thang Tryptone, canh thang MRVP, simmoncitrate. U các môi tr ng trên 44,0ườ ở ± 0.5oC trongkho ng 24 gi . Th ph n ng indol, methylred; vogesposkauer, citrate (xem ph n th nghi mả ờ ử ả ứ ầ ử ệ các ph n ng sinh hoá). T l xác nh n s l ng khu n l c th nghi m cho k t qu đúng làả ứ ỉ ệ ậ ố ượ ẩ ạ ử ệ ế ả E.coli b ng t s gi a s l ng khu n l c xác nh n ban đ u và s l ng khu n l c cho k tằ ỉ ố ữ ố ượ ẩ ạ ậ ầ ố ượ ẩ ạ ế qu làả E.coli.

S l ngố ượ E.coli đ c tính nh sau:ượ ư

NS CFUố E.coli = x R

n x V x fTrong đó: N: s l ng khu n l c coliform đã đ mố ượ ẩ ạ ế

V: th tích m u c y vào đĩaể ẫ ấn: s l ng đĩa c y cho m t m uố ượ ấ ộ ẫf: đ pha loãng c a m uộ ủ ẫR: t l xác nh n c aỉ ệ ậ ủ E.coli

Có th tính s l ngể ố ượ E.coli gi đ nh b ng cách tính t l s l ng khu n l c cho ph nả ị ằ ỉ ệ ố ượ ẩ ạ ả ng indol d ng tính, công th c tính t ng t nh trên.ứ ươ ứ ươ ự ư

Báo cáo k t qu :ế ả K t quế ả E.coli đ c th hi n b ng s l ng đ n v hình thànhượ ể ệ ằ ố ượ ơ ị khu n l cẩ ạ E.coli trong m t gram hay mililitre m u.ộ ẫCác ph ng pháp khác dùng trong đ nh l ngươ ị ượ E. coli:Ngoài ph ng pháp nuôi c y theo qui trình nh trên,ươ ấ ư E.coli còn đ c đ nh l ng b ngượ ị ượ ằ

ph ng ph ng pháp màng l c nuôi c y trên các môi tr ng chuyên bi t hay ph ng phápươ ươ ọ ấ ườ ệ ươ MPN. Đ n nay có nh ng ph ng pháp màng l c có th phân bi t đ c s l ngế ữ ươ ọ ể ệ ượ ố ượ E.coli trongt ng s coliform. Các ph ng pháp mi n d ch h c hay sinh h c phân t có th phân bi t cácổ ố ươ ễ ị ọ ọ ử ể ệ loài E.coli gây b nh v i các loài không gây b nh khác.ệ ớ ệ

64



7. Đ NH L NGỊ ƯỢ STAPHYLOCOCCUS AUREUS B NGẰPH NG PHÁP Đ M KHU N L CƯƠ Ế Ẩ Ạ

7.1Đ nh nghĩaị

Staphylococcus aureus là vi khu n hi u khí hay k khí tuỳ nghi, có hình c u, gramẩ ế ỵ ầ d ng, có ph n ng đông huy t t ng d ng tính do chúng ti t ra enzyme coagulase. Ngoài raươ ả ứ ế ươ ươ ế còn các đ c đi m nh có ph n ng Dnase, phosphatease d ng tính, có kh năng lên men vàặ ể ư ả ứ ươ ả sinh acid t mannitol, trehalose, sucrose. T t c các dòngừ ấ ả S. aureus đ u nh y v i novobiocine,ề ạ ớ có kh năng phát tri n trong môi tr ng ch a đ n 15% mu i NaCl.ả ể ườ ứ ế ố

M t s dòngộ ố S. aureus có kh năng gây tan máu trên môi tr ng th ch máu, vòng tanả ườ ạ máu ph thu c vào t ng ch ng nh ng chúng đ u có vòng tan màu h p so v i đ ng kính c aụ ộ ừ ủ ư ề ẹ ớ ườ ủ khu n l c. H u h t các vi sinh v t này đ u s n sinh s c t vàng. Nh ng các s c t này ít th yẩ ạ ầ ế ậ ề ả ắ ố ư ắ ố ấ khi quá trình nuôi c y còn non, s c t này th ng th y rõ sau 1-2 ngày nuôi c y nhi t đấ ắ ố ườ ấ ấ ở ệ ộ phòng. S c t đ c t o ra nhi u h n khi trong môi tr ng có hi n di n c a lactose hay cácắ ố ượ ạ ề ơ ườ ệ ệ ủ ngu n carbohydrate khác mà vi sinh v t này có th b g y và s d ng chúngồ ậ ể ẻ ả ử ụ

H u h t các dòng thu c loài này có th t ng h p enterotoxin. Ngoài ra các loàiầ ế ộ ể ổ ợ S.intermedius, và S.hyicus cũng có th t o enterotoxin, nh ng hai loài này có ph n ng coagulaseể ạ ư ả ứ âm tính. Đ c t đ c s n sinh ch khi vi sinh v t phát tri n trong môi tr ng có nhi t đ trênộ ố ượ ả ỉ ậ ể ườ ệ ộ 15oC, đ c t đ c s n sinh nhi u nh t khi chúng phát tri n trong nhi t đ 35-37ộ ố ượ ả ề ấ ể ệ ộ oC.

S. aureus phân b kh p n i, nh ng ch y u phân l p đ c t da, màng nh y c a ng iố ắ ơ ư ủ ế ậ ượ ừ ầ ủ ườ và đ ng v t máu nóng. Trong th c ph m vi sinh v t đ c nhi m vào ch y u qua con đ ngộ ậ ự ẩ ậ ượ ễ ủ ế ườ ch bi n có các công đo n ti p xúc tr c ti p v i ng i. N u có s hi n di n v i m t đ caoế ế ạ ế ự ế ớ ườ ề ự ệ ệ ớ ậ ộ c a sinh sinh v t này trong th c ph m cho th y đi u ki n v sinh c a quá trình ch bi n kém,ủ ậ ự ẩ ấ ề ệ ệ ủ ế ế ki m soát nhi t đ trong các công đo n ch bi n không t t.ể ệ ộ ạ ế ế ố7.2 Nguyên t cắ

C y trang m t l ng m u xác đ nh trên b m t môi tr ng th ch ch n l c. Sau khi ,ấ ộ ượ ẫ ị ề ặ ườ ạ ọ ọ ủ đ m s khu n l c có nh ng đ c đi m đ c tr ng và không đ c tr ng c aế ố ẩ ạ ữ ặ ể ặ ư ặ ư ủ Staphyloccocusaureus. Xác nh n các khu n l c đã đ m b ng ph n ng coagulase và các ph n ng đ c tr ngậ ẩ ạ ế ằ ả ứ ả ứ ặ ư khác. K t qu đ c xác đ nh b ng s l ng khu n l c đã đ m, th tích c y, đ pha loãng vàế ả ượ ị ằ ố ượ ẩ ạ ế ể ấ ộ h s xác nh n.ệ ố ậ7.3 Môi tr ngườ

Môi tr ng th ch máuườ ạCác thành ph n c b n c a môi tr ng đ c hoàn tan trong n c, đun cho đ n khi cácầ ơ ả ủ ườ ượ ướ ế

thành ph n hoà tan hoàn toàn. Kh trùng nhi t đ 121ầ ử ở ệ ộ oC trong 15 phút. Làm ngu i môi tr ngộ ườ đ n 45-50ế oC trong b đi u nhi t. Thêm vào 5% th tích máu c u hay bê non d i 5 tháng tu iể ể ệ ể ừ ướ ổ đã đ c lo i b các s i máu hay máu đ c thêm ch t ch ng đông citrat. Hoàn tan đ u máu vàoượ ạ ỏ ợ ượ ấ ố ề trong môi tr ng. Phân ph i vào trong đĩa petri. Môi tr ng ph i đ c pha ch tr c ít nh t 2ườ ố ườ ả ượ ế ướ ấ ngày tr c khi s d ng đ ki m tra kh năng b nhi m. Môi tr ng th ch máu không nên đướ ử ụ ể ể ả ị ễ ườ ạ ổ quá dày đ có th nh n r các vòng tan máu.ể ể ậ ỏ

Môi tr ì ng th ch Baird Parkerư ơ ạ :Môi tr ng này có ch a lòng đ tr ng t i và potassium tellurite, đây là hai thành ph nườ ứ ỏ ứ ươ ầ

không ch u nhi t, vì th ph i b sung vào môi tr ng sau khi kh trùng và làm ngu i đ nị ệ ể ả ổ ườ ử ộ ế kho ng 60ả oC. Sau khi b sung đ y đ các thành ph n, môi tr ng đ c phân ph i vào trong đĩaổ ầ ủ ầ ườ ượ ố petri. Sau khi pha ch đĩa môi tr ng ph i có màu vàng đ c.ế ườ ả ụ

Huy t t ng th (th ph n ng đông huy t t ng)ế ươ ỏ ử ả ứ ế ươ

65



Huy t t ng th đ c c đ nh v i 0.1% EDTA hay c đ nh trong sodium oxalate. Phânế ươ ỏ ượ ố ị ớ ố ị ph i vào trong các ông nghi m nh , m i ng 0,.3 ml. Có th th ph n ng này trên lam kính.ố ệ ỏ ỗ ố ể ử ả ứ 7.4 Ti n hànhế

X lý và pha loãng m u:ử ẫ Cân 10,0± 0,1 gram m u trong túi vô trùng, thêm 90 ml dungẫ d ch pha loãng, đ ng nh t b ng máy d p m u kho ng 30 giây. Chu n b dãy pha loãng thíchị ồ ấ ằ ậ ẫ ả ẩ ị

h p tùy theo m c nhi m c a t ng lo i m u sao cho khi c y m t th tích xác đ nh lên đĩa BP sauợ ứ ễ ủ ừ ạ ẫ ấ ộ ể ị khi có kho ng <100 khu n l c xu t hi n trên đĩa.ủ ả ẩ ạ ấ ệC y m u:ấ ẫ C y 0,1ml m u nguyên ho c đã pha loãng vào đĩa môi tr ng Baird Pakerấ ẫ ặ ườ

Agar, n u m t đế ậ ộ S.aureus trong m u th p có th c y 1ml dung d ch pha loãng phân ph i vào 3ẫ ấ ể ấ ị ố đĩa môi tr ng BP, dùng que c y tam giác trang đ u trên b m t cho đ n khi khô m t. Th cườ ấ ề ề ặ ế ặ ự hi n t ng t nh trên v i môi tr ng th ch máu. L t ng c đĩa, 37.0ệ ươ ự ư ớ ườ ạ ậ ượ ủ ở oC± 1.0oC trong th iờ gian 24-48 gi đ i v i môi trt ng Baird Parker, 24 gi v i môi tr ng th ch máu.ơ ố ớ ườ ờ ớ ườ ạ

Đ c k t qu :ọ ế ả Sau 24 gi , trên môi tr ng Baird Paker Agar, khu n l cờ ườ ẩ ạ Staphyloccus aureuscó đ ng kính kho ng 0.5 - 1mm, l i, đen bóng có vòng sáng r ng kho ng 1 - 2 mm bao quanh.ườ ả ồ ộ ả Đánh d u trên m t đáy c a đĩa các khu n l c có đ c đi m nh trên và ti p t c đ n 48 gi .ấ ặ ủ ẩ ạ ặ ể ư ế ụ ủ ế ờ Sau 48 gi khu n l cờ ẩ ạ S. aureus có đ ng kính kho ng 1 - 1.5 mm, màu đen bóng, l i, có vòngườ ả ồ

tr ng đ c h p và vòng sáng r ng kho ng 2 - 4 mm bao quanh. Có m t s dòngắ ụ ẹ ộ ả ộ ố S. aureus chokhu n l c không đ c tr ng (không t o các vòng quanh khu n l c nh miêu t trên). C n đ mẩ ạ ặ ư ạ ẩ ạ ư ả ầ ế và đánh d u c hai d ng khu n l c.ấ ả ạ ẩ ạ

Trên môi tr ng th ch máu sau 24 giườ ạ ờ ủ S. aureus cho khu n l c bóng loáng, đ c, l i cóẩ ạ ụ ồ màu xám hay vàng nh t. Đ ng kính khu n l c kho ng 1-2 mm. H u h tạ ườ ẩ ạ ả ầ ế S.aureus có vùng tanhuy t, tuy nhiên m t s dòng có không có vòng tan huy t này.ế ộ ố ế7.5 Kh ng đ nhẳ ị

Trên môi tr ng BP: C y 5 khu n l c đ c tr ng và 5 khu n l c không đ c tr ng t môiườ ấ ẩ ạ ặ ư ẩ ạ ặ ư ừ tr ng Baird Parker vào môi tr ng TSA. 37,0ườ ườ ủ ở oC ± 1,0oC trong 24 gi . C y vi khu n tờ ấ ẩ ừ môi tr ng TSA vào các ng nghi m ch a huy t t ng đã rã đông, 37,0ườ ố ệ ứ ế ươ ủ ở ± 1,0oC. Theo dõik t qu ph n ng đông huy t t ng sau các kho ng th i gian 2, 4, 6, 8 và 24 gi . Tính t lế ả ả ứ ế ươ ả ờ ờ ỉ ệ

kh ng đ nh trên các khu n l c đ c tr ng và không đ c tr ng.ẳ ị ẩ ạ ặ ư ặ ư Th c hi n t ng t v i các khu n l c đ c tr ng trên môi tr ng th ch máu.ự ệ ươ ự ớ ẩ ạ ặ ư ườ ạ K t qu ph n ng:ế ả ả ứ

- D ng tính: Có kh i đông huy t t ng hình thành. M i m c đ đông k t đ u đ c coiươ ố ế ươ ọ ứ ộ ế ề ượ là d ng tính.ươ

- Âm tính: Không có kh i đông, h n d ch v n đ ng nh t nh ng không c y.ố ỗ ị ẫ ồ ấ ư ố ấNgoài S. aureus, ch cóỉ S. intermedius và m t s ítộ ố S. hyicus cho ph n ng đông huy tả ứ ế

t ng d ng tính. Không gi ng nhươ ươ ố ư S. aureus và S. intermedius, đa s loàiố S. hyicus subsp hyiuscho ph n ng d ng tính ch m và y u.ả ứ ươ ậ ế S. intermedius và S. hyius subsp hyius có ph n ngả ứ d ng tính nh ng có khu n l c nh không đ c tr ng trên môi tr ng Baird Parker Agar, khôngươ ư ẩ ạ ỏ ặ ư ườ có vòng tan máu và không sinh s c t trên môi tr ng th ch máu.ắ ố ườ ạ

7.6Tính k t quế ảS l ngố ượ S.aureus trong m u đ c tính nh sau:ẫ ượ ư 10

Số S. aureus [CFU/g(ml)] = (Nt x Ht +Na x Ha)F1 + F2

Trong đó: F: đ pha loãngộNt: t ng s khu n l c đ c tr ngổ ố ẩ ạ ặ ư Na: t ng s khu n l c không đ c tr mgổ ố ẩ ạ ặ ư

66



S khu n l c đ c tr ng cho k t qu ĐHT d ng tínhố ẩ ạ ặ ư ế ả ươHt =

S khu n l c đ c tr ngố ẩ ạ ặ ư

S khu n l c không đ c tr ng cho k t qu d ng tínhố ẩ ạ ặ ư ế ả ươ

Ha = S khu n l c không đ c tr ngố ẩ ạ ặ ư

8.PH NG PHÁP MPN Đ NH L NGƯƠ Ị ƯỢ S. AUREUSPh ng pháp này đ c dùng đ đ nh l ngươ ượ ể ị ượ S.aureus trong các m u có m tẫ ậ S. aureus

th p và có m t đ vi sinh v t c nh tranh cao, khó có th xác đ nh b ng ph ng pháp đ mấ ậ ộ ậ ạ ể ị ằ ươ ế khu n l c. Dung d ch m u đ c pha lo ng theo h s th p phân v i ba đ phaloãng liên ti pẩ ạ ị ẫ ượ ả ệ ố ậ ớ ộ ế sao cho trong chu i pha loãng này sau khi c y vào các môi tr ng canh v a cho các k t qu âmỗ ấ ườ ừ ế ả tính v a cho k t qu d ng tính, th ng s d ng các đ pha lo ng 10ừ ế ả ươ ườ ử ụ ộ ả -1; 10-2,10-3.

Tuỳ theo m c đ yêu c u c a k t qu phân tích, có th s dung ph ng pháp MPN v iứ ộ ầ ủ ế ả ể ử ươ ớ h th ng:ệ ố

3 ng m i ng c y 1ml dung d ch pha loãng 10ố ổ ố ấ ị -1



Hay h th ngệ ố5 ng m i ng c y 1ml dung d ch pha loãng 10ố ổ ố ấ ị -1



Môi tr ng canh đ c s d ng là Mannitol Salt Broth hay Tryptose Soy Broth có 10%ườ ượ ử ụ mu i NaCl. Sau khi c y, nhi t đ 37ố ấ ủ ở ệ ộ oC trong 48± 2 gi . Ch n các ng d ng tính, khi cóờ ọ ố ươ các vi sinh v t phát tri n làm đ c canh tr ng đ phân l p trên môi tr ng BP, các đĩa môiậ ể ụ ườ ể ậ ườ tr ng BP đ c 37ườ ượ ủ ở oC trong 48 gi . Ch n các khu n l c đ c tr ng trên môi tr ng BP đờ ọ ẩ ạ ặ ư ườ ể

xác nh nậ S. aureus. Các đĩa cho k t quế ả S. aureus d ng tính đ c đ i chi u v i các ngươ ượ ố ế ớ ố nghi m trong h th ng các dãy c y ban đ u. Tra b ng MPN đ có k t qu đ nh l ngệ ệ ố ấ ầ ả ể ế ả ị ượ S.aureus trong m u.ẫ

9. PHÁT HI NỆ SALMONELLA TRONG TH C PH MỰ Ẩ9.1 Đ nh nghĩaị

Salmonella là tr c trùng gram âm, hi u khí và k khí tùy nghi, có kh năng di đ ng (trự ế ỵ ả ộ ừ S. gallinarum và S.pullorum ), sinh acid t glucose và mannitol nh ng không lên men sacharoseừ ư và lactose, không sinh indole và không phân gi i ure. H u h t các ch ng đ u sinh Hả ầ ế ủ ề 2S ( tr S.ừ typhi).

Cho đ n nay gi ngế ố Salmonella có h n đ c phát hi n có h n 2300 serotypes. Cácơ ượ ệ ơ

serotype này đ c chia theo h th ng c a Kaffmann – White d a trên công th c kháng nguyên Oượ ệ ố ủ ự ứ (kháng nguyên somatic) và kháng nguyên lông H (flagella). Trong s các serotype trên, có m t số ộ ố serotype đ c đ c tên nh Enteritidis, Typhi, Paratyphi, Typhimurium … h u h t serotypeượ ặ ư ầ ế không có tên đ c bi u di n d i d ng công th c kháng nguyên.ượ ể ể ướ ạ ứ 9.2 Nguyên t cắ

Ph ng pháp đ c mô t sau đây nh m đ nh tínhươ ượ ả ằ ị Salmonella, k t qu đ c báo cáo làế ả ượ có hay không có Salmonella trên l ng m u đ c ki m nghi m. Đ đ t hi u qu cao, quy trìnhượ ẫ ượ ể ệ ể ạ ệ ả ki m traể Salmonella b t bu c ph i qua giai đo n ti n tăng sinh. Đi u này c n thi t vìắ ộ ả ạ ề ề ầ ế

67



Salmonella th ng có m t trong m u v i s l ng nh , b t n th ng n ng qua quá trình chườ ặ ẫ ớ ố ượ ỏ ị ổ ươ ặ ế bi n và s t n t i m t s l ng l n các lo i vi khu n khác thu c h Enterobateriaceae, cácế ự ồ ạ ộ ố ượ ớ ạ ẩ ộ ọ dòng này c nh tranh và c ch s phát tri n c aạ ứ ế ự ể ủ Salmonella. B n giai đo n c n ti n hành đố ạ ầ ế ể phát hi nệ Salmonella: ti n tăng sinh, tăng sinh ch n l c, phân l p và kh ng đ nh. Vi c kh ngề ọ ọ ậ ẳ ị ệ ẳ đ nh d a trên các k t qu th nghi m sinh hóa phù h p đ c tr ng choị ự ế ả ử ệ ợ ạ ư Salmonella spp.

9.3 Dung d ch pha loãng và môi tr ng nuôi c yị ườ ấ - N c peptone đ m (Buffered peptone water)ướ ệ- Canh Rappaport-Vassiliadis soya pepton- Canh Selenite Cystein broth- Th ch Xylose lysine desoxycholate (XLD)ạ- Th ch Brilliant green phenol red Th ch Triple sugar iron (TSI)ạ ạ- Canh Urea- Canh Lysine decarboxylase- Canh Ornithine decarboxylase- Canh Manitol (Phenol red broth base)- Canh Sucrose (Phenol red broth base)

- Canh sorbitol (Phenol red broth base)- Canh Tryptone Thu c th Kovac’s Indoleố ử - Kháng huy t thanh Salmonella đa giá.ế

9.4 Qui trình phân tíchTi n tăng sinhềCân 25 g m u trong túi vô trùng, Thêm 225ml n c peptone đ m, đ ng nh t m u. Th iẫ ướ ệ ồ ấ ẫ ờ

gian đ ng nh t m u (15 ho c 30 giây) tùy thu c vào lo i th c ph m. 37.0ồ ấ ẫ ặ ộ ạ ự ẩ ủ ở oC± 1.0oC/18-24gi .ờ

Tăng sinhTr n đ u canh thang ti n tăng sinh tr c khi chuy n 0,1ml sang 10ml canh thang tăngộ ề ề ướ ể

sinh ch n l c Rappapport-vassliadis soya pepton. Tr c khi c y m u, canh thang tăng sinh ph iọ ọ ướ ấ ẫ ả

đ c m đ n nhi t đ 42ượ ủ ấ ế ệ ộo

C, nhi t đ này là y u t quan trong cho vi c tăng sinh t i u. Uệ ộ ế ố ệ ố ư m u trong b đi u nhi t 42,0ẫ ể ề ệ ở oC ± 0,2oC trong18-24h (có th kéo dài th i gian thêm 24 giể ờ ủ ờ n a n u th y c n thi t).ữ ế ấ ầ ế

C y và đ c k t qu trên đĩaấ ọ ế ảDùng khuyên c y tròn ria d ch m u t canh thang tăng sinh lên đĩa th ch XLD và th chấ ị ẫ ừ ạ ạ

Brilliant green-phenol red đ t o nh ng khu n l c riêng r . 37.0ể ạ ữ ẩ ạ ẽ ủ ở oC± 1.0oC trong kho ng 18-ả24 gi .ờ

Trên th ch XLD: Khu n l c đi n hình trong su t, h i nhu m đ , tâm đen, th ng cóạ ẩ ạ ể ố ơ ố ỏ ườ vùng đ h ng bao quanh, đ c bi t khiỏ ồ ặ ệ Salmonella phát tri n m nh.ể ạ

Trên th ch Brilliant green-phenol red: Khu n l c đi n hình trong, có vùng đ h ng baoạ ẩ ạ ể ỏ ồ quanh.

Kh ng đ nhẳ ịKhu n l c nghi ng làẩ ạ ờ Salmonella ph i đ c ki m tra sinh hóa và kháng huy t thanh. Tả ượ ể ế ừ m i môi tr ng phân l p (XLD hay th ch Briliant green-phenol red) c y chuy n ít nh t 5 khu nỗ ườ ậ ạ ấ ể ấ ẩ l c nghi ng sang môi tr ng không ch n l c (TSA). 37.0ạ ờ ườ ọ ọ ủ ở oC ± 1.0oC trong kho ng 18-24ả gi .ờ

- Kh ng đ nh b ng th nghi m sinh hóa:ẳ ị ằ ử ệ

68



Dùng các th nghi m sinh hóa đ kh ng đ nhử ệ ể ẳ ị Salmonella. Các th nghi m chính g mử ệ ồ glucose, lactose, saccharose, H2S (trên th ch TSI hay KIA), urea, indol, VP, ornithineạ decarboxylase (ODC), lysine decarboxylase (LDC), mannitol, sorbitol.

Th nghi m trên môi tr ng TSI hay KIA :Dùng kim c y nh n c y vi sinh v t đã đ cử ệ ườ ấ ọ ấ ậ ượ làm thu n vào trong ph n nghiêng và ph n sâu c a môi tr ng. 37.0ầ ầ ầ ủ ườ ủ ở ± 1.0oC trong kho ngả

18-24 gi . N p ng nghi m không nên v n quá ch t đ duy trì tình tr ng hi u khí và tránhờ ắ ố ệ ặ ặ ể ạ ế l ng Hượ 2S đ ng quá nhi u. Sau khi nuôi c y,ứ ọ ề ấ Salmonella chuy n pH c a môi tr ng sangể ủ ườ ki m trên ph n nghiêng (màu đ ) và sang acid ph n sâu (màu vàng), có hay không có Hề ầ ỏ ở ầ 2S(xu t hi n nh ng v t màu đen trong môi tr ng).ấ ệ ữ ệ ườ

Th nghi m Lysin Decarboxylase:ử ệ C y vi sinh v t đã đ c làm thu n vào môi tr ngấ ậ ượ ầ ườ canh Lysin decarboxylase. V n ch t n p và nuôi 37.0ặ ặ ắ ủ ở ± 1.0oC trong kho ng th i gian 48 giả ờ ờ nh ng ph i ki m tra sau 24 gi .ư ả ể ờ Salmonella làm ki m môi tr ng Lisin decarboxylase, giề ườ ữ nguyên màu tím c a môi tr ng (ph n ng d ng tính). Ph n ng âm tính khi môi tr ngủ ườ ả ứ ươ ả ứ ườ chuy n thành màu vàng.ể

Th nghi n Urease:ử ệ Dùng kim c y vô trùng c y vi sinh v t đã đ c làm thu n vào môiấ ấ ậ ượ ầ tr ng canh urea phenol red broth. Nuôi 37.0ườ ủ ở ± 1.0oC trong kho ng 24 gi kèm theo ng môiả ờ ố

tr ng đ i ch ng không c y vi sinh v t.ườ ố ứ ấ ậ Salmonella cho ph n ng âm tính v i môi tr ng canhả ứ ớ ườ urea (không chuy n sang màu đ ).ể ỏTh nghi m trên môi tr ng Mannitol phenol red : C y vi sinh v t đã đ c làm thu nử ệ ườ ấ ậ ượ ầ

vào canh Mannitol phenol red. Không nên v n ch t n p ng nghi m. Nuôi 37.0ặ ặ ắ ố ệ ủ ở ± 1.0oC trongkho ng 48 gi , nh ng ph i ki m tra sau 24 gi .ả ờ ư ả ể ờ Salmonella làm acid hóa môi tr ng qua sườ ự xu t hi n màu vàng (ph n ng d ng tính).ấ ệ ả ứ ươ

Th nghi m Indol: C y m t l ng nh vi sinh v t đã đ c làm thu n vào ng canhử ệ ấ ộ ượ ỏ ậ ượ ầ ố Tryptone. 37.0ủ ở ± 1.0 oC /24 gi . Chuy n 5 ml canh d ch sang 1 ng nghi m khác. Thêm vàoờ ể ị ố ệ 0.2 - 0.3 ml thu c th Kovac’s. H u h tố ử ầ ế Salmonella cho ph n ng âm tính, không có s xu tả ứ ự ấ hi n màu đ trên b m t môi tr ng nuôi c y.ệ ỏ ề ặ ườ ấ

Th nhi m ph n ng Voges- Proskauer:ử ệ ả ứ C y vi sinh v t đã đ c làm thu n vào ngấ ậ ượ ầ ố

nghi m ch a canh MR-VP và 37.0ệ ứ ủ ở ± 1.0oC trong kho ng 24 gi . Chuy n 1ml sang ngả ờ ể ố nghi m có kích c 13x100 mm. Thêm 0.6 ml (-napthol và 0.2 ml KOH 40%, l c đ u. đ yênệ ở ắ ề ể trong hai gi .ờ Salmonella cho ph n ng VP âm tính (không có s xu t hi n màu đ h ng trongả ứ ự ấ ệ ỏ ồ

ng nghi m).ố ệ Kh ng đ nh b ng th nghi m kháng huy t thanhẳ ị ằ ử ệ ế Th nghi m kháng huy t thanh ph i đ c ti n hành song song v i m u tr ng (dung d chử ệ ế ả ượ ế ớ ẫ ắ ị

n c mu i sinh lý) nh m lo i tr kh năng ng ng k t gi . Dùng kháng huy t thanhướ ố ằ ạ ừ ả ư ế ả ế Salmonellapolyvalent O và Salmonella polyvalent H.9.5 Trình bày k t quế ả: Không có (ho c có)ặ Salmonella đ c phát hi n trong 25g m u.ượ ệ ẫ9.6 An toàn Salmonella là vi khu n gây b nh.ẩ ệ

Khi làm vi c v i các ch ng ch ng d ng, ki m nghi m viên c n th n tr ng và tuân thệ ớ ủ ứ ươ ể ệ ầ ậ ọ ủ

các qui đ nh v an toàn phòng thí nghi m đ tránh nhi m b nh ho c làm lây lan m m b nh.ị ề ệ ể ễ ệ ặ ầ ệ

10. XÁC Đ NHỊ SHIGELLA TRONG TH C PH MỰ Ẩ

10.1 Đ nh nghĩaị Shigella là tr c khu n gram âm, hi u khí và k khí tùy nghi, Catalase d ng (trự ẩ ế ỵ ươ ừ Shigella

dysenteriae), oxidase âm, lactose âm (tr m t vài ch ng) và Hừ ộ ủ 2S âm. H u nh các ch ngầ ư ủ

69



Shigella không sinh h i t glucose. Ngoài ra h u h t các loài thu c gi ng Shigella không thơ ừ ầ ế ộ ố ể lên men và t o acid t Duciltol, không có enzym lisine decarboxylase.ạ ừ

Gi ngố Shigella g m 4 loài nh sau:ồ ư Shigella dysenteriae: thu c nhóm kháng huy t thanh A, trong đó có 10 serovar. Các dòngộ ế

trong nhóm này không lên men đ c mannitol.ượ

Shigella flexneri thu c nhóm kháng huy t thanh B bao g m 6 serovar. Có th chia thànhộ ế ồ ể nhi u subserovar khác nhau, tuỳ theo s hi n di n c a các nhân t kháng nguyên khác nhauề ự ệ ệ ủ ố trong nhóm này.

Shigella boydii thu c nhóm kháng huy t thanh C. Bao g m 15 serovar. T t c các dòngộ ế ồ ấ ả trong nhóm này đ u lên men cà sinh acid t mannitol.ề ừ

Shigella sonnei nhóm kháng huy t thanh D ch có m t serovar khác bi t. Nhóm này lênế ỉ ộ ệ men đ c mannitol.ượ

Shigella là vi sinh v t gây nên b nh Shigellosis, đây là m t b nh nguy hi m có th lanậ ệ ộ ệ ể ể truy n r t nhanh trong c ng đ ng. S lan truy n ph bi t nh t là t ng i sang ng i. Nh ngề ấ ộ ồ ự ề ổ ế ấ ừ ườ ướ ữ tr em có đi u ki n v sinh cá nhân kém, s ng trong đi u ki n thi u th n ph ng ti n v sinhẻ ề ệ ệ ố ề ệ ế ố ươ ệ ệ là đi u ki n đ lan tuy n d ch b nh này.ề ệ ể ể ị ệ Shigella cũng đ c lan truy n qua đ ng th c ph mượ ề ườ ự ẩ

và n c u ng. Ngu n nhi mướ ố ồ ễ Shigella vào th c ph m th c ch y u là t nguyên li u, t n c,ự ẩ ự ủ ế ừ ệ ừ ướ hay t công nhân ch bi n. Các lo i th c ph m th ng xuyên phân l p đ cừ ế ế ạ ự ẩ ườ ậ ượ Shigella là cácmón salad, th t băm th y s n …ị ủ ả

Li u l ng gây ng đ th c ph n doề ượ ộ ộ ự ẩ Shigella r t th p, có th 10 t bào/g s n ph mấ ấ ể ế ả ẩ c ng có nguy c gây ng đ c. Vì v y vi c ki m soátủ ơ ộ ộ ậ ệ ể Shigella ytrong th c ph m ph i r tự ẩ ả ấ nghiêm ng t, đòi h i ph ng pháp ki m nghi m ph i r t nh y, các qui trình th c hi n ph iặ ỏ ươ ể ệ ả ấ ạ ự ệ ả ki m soát ch t ch .ể ặ ẻ10.2 Nguyên t cắ

M t l ng m u xác đ nh đ c tăng sinh trong môi tr ng l ng không ch n l c, sau đóộ ượ ẫ ị ượ ườ ỏ ọ ọ đ c chuy n vào môi tr ng tăng sinh ch n l c, d ch khu n sau khi tăng sinh ch n l c đ cượ ể ườ ọ ọ ị ẩ ọ ọ ượ c y phân l p trên ít nh t 2 đĩa môi tr ng th ch đĩa v i m c đ ch n l c khác nhau. Khu n l cấ ậ ấ ườ ạ ớ ứ ộ ọ ọ ẩ ạ nghi ng đ c ki m tra b ng th nghi m sinh hóa và kháng huy t thanh.ờ ượ ể ằ ử ệ ế10. 3. Thu c th và môi tr ngố ử ườ 3 Môi tr ng ch n l c và không ch n l c:ườ ọ ọ ọ ọ

- Canh Tryotose soya- Canh Gram negativeMôi tr ng ch n l c:ườ ọ ọ- Th ch MacConkeyạ- Th ch Xylose lysine desoxycholateạ- Th ch Hektoen entericạMôi tr ng và thu c th sinh hoá:ườ ố ử - Thu c th Oxidaseố ử - Thu c th catalaseố ử - Th ch Triple sugar ironạ- Môi tr ng th nghi m tính di đ ngườ ử ệ ộ- Mannitol phenol red broth- Duciltol phenol red broth- Lisine decarboxylase brothKháng huy t thanh: bao g m các lo i huy t thanh nh sau: polyvalent A; B; C; Dế ồ ạ ế ư

10.4 Qui trình phân tích ti n hànhế

70



Ti n tăng sinhềL y 25g m u cho vào túi d p m u, thêm 225ml canh Tryptone soya. Sau khi đ ng nh tấ ẫ ậ ẫ ồ ấ

m u, đo pH và n u c n ch nh v pH 7.0ẫ ế ầ ỉ ề ± 0,2. Bu c ch t mi ng túi và 37.0ộ ặ ệ ủ ở oC trongkho ng th i gian 16 - 20 gi . Có th cho m u vào trong các bình tam giác, sau khi ch nh pHả ờ ờ ể ẫ ỉ ủ các bình này trong đi u ki n k khí nhi t đ và th i gian nh trên.ề ệ ỵ ở ệ ộ ờ ư

Tăng sinh ch n l cọ ọChuy n 0,1ml d ch ti n tăng sinh sang 10ml canh thang tăng sinh GN. 37.0ể ị ề ủ ở oC trongth i gian 16 - 20 gi .ờ ờ

Phân l p:ậDùng khuyên c y c y t canh thang tăng sinh lên các môi tr ng th ch đĩa ch n l c. Viấ ấ ừ ườ ạ ọ ọ

khu nẩ Shigella là vi sinh v t r t nh y c m v i đi u ki n môi tr ng nuôi c y vì th đ có thậ ấ ạ ả ớ ề ệ ườ ấ ế ế ể phát hi n đ cệ ượ Shigella v i hi u su t cao nh t, nên s d ng ít nh t hai lo i môi tr ng phânớ ệ ấ ấ ử ụ ấ ạ ườ l p khác nhau. Có các lo i môi tr ng phân l p có c ng đ ch n l c khác nhau đ c s d ngậ ạ ườ ậ ườ ộ ọ ọ ượ ử ụ cho Shigella nh : Tergitol – 7 agar, XLD (Xylose lisine desoxycholate agar), Hektoen Enteric agarư và MAC (Macconkey agar). Sau khi c y, các đĩa môi tr ng nhi t đ 37.0ấ ủ ườ ở ệ ộ oC trong th i gianớ 24-48 gi .ờ

Bi u hi n c aể ệ ủ Shigella trên các môi tr ng phân l p nh sau:ườ ậ ư Trên môi tr ng Tergitol – 7 agarườ : môi tr ng sau khi pha ch có màu xanh h i vàngườ ế ơ nh , có màu đ c s a. Khu n l c xu t hi n trên môi tr ng này có màu xanh nh t.ẹ ụ ữ ẩ ạ ấ ệ ườ ạ

Trên môi tr ng MacConkey agarườ : Khu n l c có màu nâu đ , trong su t.ẩ ạ ỏ ốTrên môi tr ng XLDườ : Khu n l cẫ ạ Shigella có màu đ , trong su tỏ ốTrên môi tr ng Dexoxycholate citrate agarườ , môi tr ng có màu đ cam, h i đ c. Khu nườ ỏ ơ ụ ẩ

l cạ Shigella trên môi tr ng này có màu đ nh t.ườ ỏ ạ- Trên Hektoen entric agar: Khu n l c có màu xanh nh t, trong xu t.ẩ ạ ạ ố

10.5 Kh ng đ nh b ng tr c nghi m sinh hóaẳ ị ằ ắ ệT các khu n l c nghi ng trên môi tr ng phân l p, ch n ít nh t 5 khu n l c c y lênừ ẩ ạ ở ườ ậ ọ ấ ẩ ạ ấ

môi tr ng không ch n l c (nh TSA), nhi t đ 37ườ ọ ọ ư ủ ở ệ ộ oC trong th i gian 20-24 gi . Các khu nớ ờ ẩ

l c xu t hi n trên môi tr ng này đ c s d ng đ th nghi m sinh hoá và kháng huy t thanh.ạ ấ ệ ườ ượ ử ụ ể ử ệ ếThử nghi m sàn l cệ ọCác dòng đ c nghi ng làượ ờ Shigella đ c c y vào môi tr ng TSI, 37ượ ấ ườ ủ ở oC trong 24

gi .ờ Shigella cho ph n ng ki m trên m t nghiên và acid ph n sâu. Không sinh h i và khôngả ứ ề ặ ở ầ ơ có H2S đ c t o thành trong môi tr ng. Các dòng có ph n ng nh trên đ c th nghi m đượ ạ ườ ả ứ ư ượ ử ệ ể kh ng đ nhẳ ị Shigella

Th nghi m kh ng đ nhử ệ ẳ ịPh n ng đ c tr ng c a các dòngả ứ ạ ư ủ Shigella đ c th hi n trong b ng sau:ượ ể ệ ả

TT Th nghi m sinh hoáử ệ Ph n ngả ứ 1

23456789

Simmon citrate

Arginine decarboxylaseLisine decarboxylaseUreaseMalonateMRVPSalicineXylose

-

----+---

71



11121314

CellobioseAdonitolDucitolInositol

----

B ngả 1: Các ph n ng sinh hoá đ c tr ng c a Shigella sppả ứ ạ ư ủ

Các vi sinh v t có các ph n ng sinh hoá đ c tr ng nh trên đ c kh ng đ nh làậ ả ứ ạ ư ư ượ ẳ ị Shigellaspp. Đ xác đ nh loàiể ị Shigella nhi m vào trong m u, các ph n ng sinh hoá đ c tr ng c a t ngễ ẫ ả ứ ạ ư ủ ừ loài nh b ng sau:ư ả

S. dysenteriae S. flexneri S. boydii S. sonneiSinh gas từ Glucose

- - -1 -1

Beta Galactose +/-1 - +/- +Ornithindecarboxylase

- - -1 +

Indol +/-2

+/-2

+/- -Acid fromDulcitol -4 -4 - -Lactose - -1 -1 +3

Mannitol - + + +Raffinose - +/- - +3

Saccharose - - - +3

Xylose - - +/- -1: Các dòng S.dysenteriae 1 và S.sonnei ph n ng d ng tínhả ứ ươ2: S.dysenteriae 1; S. flexneri 6 luôn cho ph n ng âm tính;ả ứ S.dysenteriae 2 có ph n ng d ng tínhả ứ ươ3: Ph n ng d ng tính ch bi u hi n khi th i gian nuôi c y quá 24 gi .ả ư ươ ỉ ể ệ ờ ấ ờ4: S.dysenteriae và S.flexneri 6 có th cho ph n ng d ng tính.ể ả ứ ươ

Ph n ng sinh hoá phân bi t các loài Shigellaả ứ ệ

Xác đ nh b ng th nghi m huy t thanh kháng ị ằ ử ệ ế : Th c hi n th nghi m kháng huy tự ệ ử ệ ế thanh b ng huy t thanh đa giá A, B,C,D t các l a c y trên môI tr ng th ch không ch n l c.ằ ế ừ ứ ấ ườ ạ ọ ọ Ph i ti n hành các đ i ch ng m tính trên n c mu i sinh lý đ tránh hi n t ng ng ng k tả ế ố ứ ấ ướ ố ể ệ ượ ư ế gi có th di n ra.ả ể ễ

Trong m t s tr ng h pộ ố ườ ợ Shigella t o thành kháng nguyên b m t (kháng nguyên K) cóạ ề ặ th làm che m t kháng nguyên O và làm cho ph n ng ng ng k t không di n ra. Vì th khiể ấ ả ứ ư ế ễ ế không có bi u hi n ng ng k t, đun sôi d ch vi khu n trong kho ng 30 phút đ lo i b khángể ệ ư ế ị ẩ ả ể ạ ỏ nguyên b m t. Sau đó ti n hành th nghi m ng ng k t tr l i.ề ặ ế ử ệ ư ế ở ạ10.5 Báo cáo k t quế ả

Phát hi n hay không phát hi nệ ệ Shigella trong 25g m u.ẫ10.6 Bi n pháp an toànệ

Shigella là vi khu n gây b nh r t nguy hi m, có th bi u hi n b nh khi m t đ xâmẩ ệ ấ ể ể ể ệ ệ ậ ộ nhi m r t th p. Vì th khi làm vi c v i các ch ng đ i ch ng d ng tính ng i phân tích c nễ ấ ấ ế ệ ớ ủ ố ứ ươ ườ ầ ph i th n tr ng, các môi tr ng, m u v t sau khi nuôi c y ph i đ c h p ti t trùng tr c khiả ậ ọ ườ ẫ ậ ấ ả ượ ấ ệ ướ r a hay th i vào môi tr ng.ử ả ườ

11. Vibrio cholerae vµ Vibrio parahaemolyticus

72



11.1 Ph¹m vi p d ngơ Ph¬ng ph¸p nµy (tham chiu theo S tay ph©n tÝch vi sinh cđa FDA t¸i b¶n lÇn th 8 n¨mỉ

1995) dng ®Ĩ ph t hi nƯ Vibrio cholerae vµ Vibrio parahaemolyticus trong thc phm. Ph¬ng ph¸pnµy kh«ng ¸p d ng cho hµu (ơ Oyster).

11.2 Nguyªn t¾cPh¸t hi nƯ Vibrio cholerae vµ Vibrio parahaemolyticus trong thc phm ® c thc hi n b»ngỵ Ư c¸ch c©n 1 l ng mu , nu«i đ trong m«i trỵ ng lng chn lc. T m«i trng nµy, cy chuyĨn sang m«i trngr¾n chn lc. Nh÷ng khun l¹c ging Vibrio cholerae vµ Vibrio parahaemolyticus s ® c th nghi mỵ ư Ư sinh ha.11.3 M«i trng vµ thuc thư

- Th¹ch Thiosulphate citrate Bile salt sucrose (TCBS agar)- Peptone ki m c 1% NaCLỊ- M«i trng di ®ng- TSA + 1,5% NaCl- Th¹ch Triple sugar iron

- ONPG- Thuc th Oxydaseư - O/129 Vibriostaticum dics containing 150 and 10 µg 2,4-diamino-6,7-di- isopropylpteridine.- Thuc th Cytochrome oxidaseư - Arginine decarboxylase- Lysine decarboxylase- Fermentation: - Sucrose, lactose, mannitol- Urea phenol red broth- Na desoxycholate 5% (String test solution)- KOH

11.4 Thit bÞ chÝnh

- Tđ m 37.0 ± 1.0o

C11.5 Quy tr×nhT¨ng sinh: C©n 25g mu cho vµo tĩi v« trng, thªm vµo 225ml APW. Dp mu trong 2 phĩt, đ

37.0± 1.0oC trong 16 – 18 gi .§ ®a vµ ®c kt qu¶ trªn ®a:ỉ T m«i trng t¨ng sinh, cy ria lªn m«i tr¬ng th¹ch TCBS, đ trong

18-24h 37.0 ± 1.0oC.Trªn m«i trngTCBS agar:Khun l¹c V.cholera trßn, lín c ®ng kÝnh 2-3mm, mµu vµngKhun l¹c V.para trßn, lín c ®ng kÝnh 3-4mm, mµu xanh.

11.6 Th nghi m sinh haư Ư T c¸c khun l¹c nghi ng trªn TCBS, cy chuyĨn sang m«i trng TSA c b sung 1.5% NaCl, đỉ

37.0± 1.0o

C trong 12-24 gi.Th nghi m s¬ bư Ư

Th nghi mử ệ Vibrio parahaemolyticus

Vibrio cholerae

Th nghi m TSIử ệ K/A - - K/A - -Tính di đ ngộ + +Oxydase + +KOH + +

73



Th nghi m kh ng đ nhử ệ ẳ ịTh nghi mử ệ Vibrio

parahaemolyticusVibrio cholerae

Kh năng phát tri nả ể0% NaCl

6% NaCl8% NaCl10% NaCl

-

++-

+

+--

T o Acid t :ạ ừ SucroseLactoseManinitol

--+

+-+

ONPG - +ADH - -LDC + +Urease + +

Nh y c m v i:ạ ả ớ10 µg O/129150 µg O/129

RS

SS

Th nghi m kháng huy t thanh v iử ệ ế ớ V. choleraeV. cholerae đa giá O1 và non – O1V. cholerae đ n giá: Inaba, Ogawa, Hikojimaơnon-O1 group:O139

12. Đ NH TÍNHỊ LISTERIA MONOCYTOGENES TRONG TH C PH MỰ Ẩ

1.2 Đ nh nghĩaị

Listeria monocytogenes có hình g y ng n, m nh, gram d ng trong l a c y 20 gi , ph nậ ắ ả ươ ứ ấ ờ ả ng catalase d ng tính, oxidase âm tính, chuy n đ ng xoay tròn thành đ t trong tiêu b n gi tứ ươ ể ộ ợ ả ọ treo và di đ ng t o hình dù trong phép th tính di đ ng ( 20-25ộ ạ ử ộ ở oC). Có kh năng th y gi iả ủ ả esculin và kh năng làm tan huy t (trên môi tr ng th ch máu. Listeria monocytogenes t o acidả ế ườ ạ ạ t đ ng rhamnose, nh ng không t o acid t đ ng xylose. Cho ph n ng CAMP d ng tínhừ ườ ư ạ ừ ườ ả ứ ươ v iớ Staphylococcus aureus, và âm tính v iớ Rhodococcus equi.

Listeria monocytogenes th ng đ c tìm th y trong th c ăn gia súc, trong n c, n cườ ượ ấ ự ướ ướ th i. Đây là m t vi sinh v t gây b nh r t nguy hi m, b nh do chúng gây ra đ c g i làả ộ ậ ệ ấ ể ệ ượ ọ Listeriosis, b nh này có t l t vong r t cao, đ i v i ng i l n t l này kho ng 30-35 %, đ iệ ỉ ệ ử ấ ố ớ ườ ớ ỉ ệ ả ố v i tr em t l này lên đ n 70%, các bi u hi n c a lo i b nh này nh sau: nhi m trùng máu,ớ ẻ ỉ ệ ế ể ệ ủ ạ ệ ư ễ s y thai ph n , viêm màng não, gây t vong thai nhi. Vi sinh v t này đ c bi t nguy hi mẩ ở ụ ữ ử ậ ặ ệ ể

trong các lo i th c ph m đã qua gia nhi t. Các qui đ nh v an toàn v sinh th c ph m th ngạ ự ẩ ệ ị ề ệ ự ẩ ườ không cho phép s hi n di n c aự ệ ệ ủ Listeria monocytogenes trong 25g th c ph m qua gia nhi tự ẩ ệ nh ng cho phép 100 cfu/g đ i v i th c ph m ph i gia nhi t tr c khi s d ng.ư ố ớ ự ẩ ả ệ ướ ử ụ12.2 Nguyên t cắ

Qui trình đ nh tínhị Listeria monocytogenes đ c th c hi n qua quá trình tăng sinh hai giaiượ ự ệ đo n. M u đ c cân vào trong túi ch a vô trùng, đ ng nh t m u v i môi tr ng tăng sinh sạ ẫ ượ ứ ồ ấ ẫ ớ ườ ơ c p. Sau khi 24 gi , d ch nuôi c y đ c chuy n vào môi tr ng tăng sinh th c p và nuôiấ ủ ờ ị ấ ượ ể ườ ứ ấ ủ ti p 24 gi n a. Hi n nay đã có qui trình c i ti n c a qui trình trên, ch s d ng quá trình tăngế ờ ữ ệ ả ế ủ ỉ ử ụ

74



sinh m t giai đo n nh ng th i gian tăng sinh v n kéo dài 48 gi . Qui trình tăng sinh m t giaiộ ạ ư ờ ẩ ờ ộ đo n đ c th c hi n khi các m u có m t đ vi sinh v t nhi m vào nh . Trong khi đó qui trìnhạ ượ ự ệ ẫ ậ ộ ậ ễ ỏ tăng sinh hai hai giai đo n nên s d ng trong vi c phân tích các m u có m t đ vi sinh v t lôn.ạ ử ụ ệ ẫ ậ ộ ậ

Trong m t s tr ng h p có th yêu c u đ nh l ng hay bán đ nh l ng m t đ vi sinh v tộ ố ườ ợ ể ầ ị ượ ị ượ ậ ộ ậ này trong m u.ẫ

Sau giai đo n tăng sinh, canh khu n đ c chuy n sang giai đo n phân phân l p trên môiạ ẩ ượ ể ạ ậ tr ng ch n l c đ c tr ng. Kh ng đ nh các khu n l c nghi ng b ng các đ c tính hình thái,ườ ọ ọ ặ ư ằ ị ẩ ạ ờ ằ ặ sinh lý và sinh hoá và mi n d ch b ng các th nghi m đ c tr ng.ễ ị ằ ử ệ ặ ư

Ch ng vi sinh v t khác đ c dùng đ đ i ch ng và th nghi mủ ậ ượ ể ố ứ ử ệ Listeria monocytogenes Listeria innocua

Staphylococcus aureus, dung huy tế β y uế Rodococcus equi.

12.3 Môi tr ng và thu c thườ ố ử Giai đo n tăng sinh:ạCanh tăng sinh s c p LBI (Listeria enrichment broth I): đ c chu n b trong các bìnhơ ấ ượ ẩ ị

ch a l n đ đ ng nh t v i m u.ứ ớ ể ồ ấ ớ ẫCanh tăng sinh th c p LBII (Listeria enrichment broth II): đ c chu n b trong các ngứ ấ ượ ẩ ị ố nghi m, m i ng 10ml.ệ ỗ ố

Môi tr ng EB (enrichment broth): là môi tr ng c i biên t môi tr ng LB đ c sườ ườ ả ừ ườ ượ ử d ng trong qui trình tăng sinh m t giai đo n.ụ ộ ạ

Môi tr ng phân l pườ ậ : Oxford agar đ c chu n b trên các đĩa.ượ ẩ ịCác môi tr ng và thu c th dùng trong các th nghi m sinh hoáườ ố ử ử ệ :Th ch máu (Blood Agar): nên s d ng máu c u hay máu c a bê non d i 5 tháng tu iạ ử ụ ừ ủ ướ ổ

đ pha ch môi tr ng.ể ế ườMôi tr ng th ch m m dùng trong th tính di đ ng: Môi tr ng BHI đ c b sung 3-5gườ ạ ề ử ộ ườ ượ ổ

agar/lit. phân ph i vào trong các ng nghi m, m i ng 5ml.ố ố ệ ỗ ố

Rhamnose phenol red broth và Xylose phenol red broth.Thu c th catalaseố ử Thu c th oxydaseố ử

12.4 D ng c và thi t bụ ụ ế ị T m: 25ủ ấ oC, 30.0oC, và 37oC .Phi n kính gi t treo.ế ọ

12.5 Ti n hành th nghi mế ử ệTăng sinh: L y 25 gam m u, thêm vào 225ml môi tr ng tăng sinh LBI. Đ ng nh t m uấ ẫ ườ ồ ấ ẫ

30 giây. 30ủ oC trong th i gian 24 gi , chuy n 0,1 ml LBI sang 10 ml LBII, 30C trong 24giớ ờ ể ủ ờQui trình tăng sinh m t giai đo n: Cân 25 gam m u, thêm vào 225 ml canh EB. Canh EBộ ạ ẫ

ph i đ c làm m 45ả ượ ấ ở oC n u m u th là các s n ph m c a s a và 30ế ẫ ử ả ẩ ủ ữ oC đ i v i các s n ph mố ớ ả ẩ

khác tr c khi cho vào m u. Đ ng nh t m u 30 giây. U 30ướ ẫ ồ ấ ẫ

o

C trong 48 giờ Phân l pậ :Dùng tăm bông vô trùng th m d ch m u t ng tăng sinh, c y trang sang 1/2 đĩaấ ị ẫ ừ ố ấ môi tr ng Oxford agar, t nh ng v t c y này dùng que c y vòng ria sang 1/2 đĩa còn l i.ườ ừ ữ ệ ấ ấ ạ ủ ở 37oC/24 - 48 gi . Trên môi tr ng Oxford agar khu n l c Listeria spp. đ c tr ng, có màu xám hayờ ườ ẩ ạ ặ ư nâu đ c bao quanh b i vòng đen, khu n l c lõm, nh , kho ng 1mmượ ở ẩ ạ ỏ ả

Kh ng đ nhẳ ịTh kh năng tan huy t: Ch n khu n l c nghi ng trên môi tr ng th ch Oxford c yử ả ế ọ ẩ ạ ờ ườ ạ ấ

chuy n sang môi tr ng th ch máu. 37ể ườ ạ ủ 0C 24-48 gi . Trên môi tr ng th ch máu khu n l cờ ườ ạ ẩ ạ L.

75



monocytogenes đ c bao quanh b i vòng tan huy t h p do hi n t ng dung huy t d ngượ ở ế ẹ ệ ượ ế ạ β.Tr c khi ti n hành phép th kh ng đ nh Lướ ế ử ẳ ị .monocytogenes, Chuy n khu n l c nghi ngể ẩ ạ ờ L.monocytogenes sang môi tr ng canh thang không ch n l c, 25ườ ọ ọ ủ oC trong kho ng 20 gi .ả ờ

Th catalase:ử Listeria monocytogenes catalase d ng tính.ươNhu m gram:ộ Listeria spp. Gram d ng.ươ

Th kh năng di đ ng ph ng pháp gi t treo:ử ả ộ ươ ọ Listeria spp. chuy n đ ng nhào l n trongể ộ ộ canh trùng 25ủ ở oC.Th tính di đ ng trong ng nghi m: C y vi trùng b ng cách đâm sâu vào th ch m mử ộ ố ệ ấ ằ ạ ề

trong ng nghi m. 25ố ệ ủ oC trong kho ng 40 gi ho c lâu h n. Ki m tra s phát tri n xung quanhả ờ ặ ơ ể ự ể đ ng c y đâm sâu.ườ ấ Listeria spp. di đ ng t o hình chi c dù cách b m t th ch vài mmộ ạ ế ề ặ ạ

Kh năng bi n d ng đ ng: các ng canh trùng th kh năng lên men đ ng 37ả ế ưỡ ườ ủ ố ử ả ườ ở oCtrong vòng 7 ngày. K t qu d ng tính (màu vàng) th ng quan sát đ c trong vòng 24 - 48ế ả ươ ườ ượ gi .ờ L.monocytogenes lên men đ ng rhamnose nh ng không có kh năng lên men đ ngườ ư ả ườ xylose.

S đ th ph n ng CAMP ơ ồ ử ả ứ

Th ph n ng CAMPử ả ứ : Trên đĩa th ch dùng đ th ph n ng CAMP, c y m t đ ngạ ể ử ả ứ ấ ộ ườ c y m ng ch ngấ ỏ ủ S.aureus song song và cách 4 cm v i đ ng c y c a ch ngớ ườ ấ ủ ủ R.equi. C y ch ngấ ủ nghi ngờ Listeria gi a, g n nh ng không ch m vào hai đ ng c y trên. M t đĩa có th c yở ữ ầ ư ạ ườ ấ ộ ể ấ m t ho c nhi u dòng vi khu n nghi ngộ ặ ề ẩ ờ L.monocytogenes. C y ch ng d ng vàấ ủ ươ L.innocua. ủ ở

37

o

C trong kho ng 20-36 gi . Ph n ng d ng tính khi xu t hi n vùng c ng h ng tan huy tả ờ ả ứ ươ ấ ệ ộ ưở ế ngay t i ranh gi i c a ch ng th vàạ ớ ủ ủ ử S.aureus ho cặ R.equi. Ph n ng CAMP d ng tính v iả ứ ươ ớ R.equi s t o vùng dung huy t r ng (5 – 10 mm) và có hình d ng đ u mũi tên. Ph n ng d ngẽ ạ ế ộ ạ ầ ả ứ ươ tính gi aữ L.monocytogenes v iớ S.aureus th ng t o vùng tan huy t h p (kho ng 2mm) có d ngườ ạ ế ẹ ả ạ hình tròn. L.monocytogenes cho ph n ng CAMP d ng tính v iả ứ ươ ớ S.aureus và âm tính v iớ R.equi,k t q a ph n ng CAMP có th r t khác nhau gi a các ch ngế ủ ả ứ ể ấ ữ ủ L.monocytogenes, L.innocua cóph n ng CAMP âm tính v i c hai loàiả ứ ớ ả S.aureus và R.equi.

76

S. aureus R. equi

L. monocytogenes

L. innocua

Ch ng ki m traủ ể



12.6 K t quế ả:Báo cáo phát hi n ho c không phát hi nệ ặ ệ L.monocytogenes trong 25 g m u.ẫ12.7 Bi n pháp an toànệ : L.monocytogenes là nguyên nhân gây ra m t s b nh đ c bi t nguyộ ố ệ ặ ệ hi m. Nhân viên đang mang thai, ng i suy y u h mi n d ch,... không nên tr c ti p làm vi cể ườ ế ệ ễ ị ự ế ệ v i các vi sinh v t này.Khi ti n hành th nghi mớ ậ ế ử ệ Listeria, các thao tác ph i h t s c c n th n.ả ế ứ ẩ ậ T t nh t, nên phân khu v c dành riêng cho các ho t đ ng th nghi mố ấ ự ạ ộ ử ệ Listeria. Các s n ph mả ẩ

hau d ng c sau khi nuôi c y ph i đ c h p t y trùng kh c khi r a hay lo i bụ ụ ấ ả ượ ấ ẩ ươ ử ạ ỏ13. XÁC Đ NHỊ ENTEROCOCCUS TRONG TH C PH MỰ Ẩ

13.1 Đ nh nghĩaị Enterococcus là vi khu n có hình c u, hay hình oval kéo dài, gram d ng, th ng t t pẩ ầ ươ ườ ụ ậ

thành t ng đôi hay t ng chu i. Chúng không di đ ng, không sinh bào t , m t s dòng có t o vừ ừ ổ ộ ử ộ ố ạ ỏ nh y. H u h t các loài thu c nhóm này s ng hi u khí tuỳ nghi nh ng phát tri n t t trong đi uầ ầ ế ộ ố ế ư ể ố ề ki n k khí.ệ ỵ Enterococcus phát tri n trong môi tr ng nu i c y, các vi sinh v t khác s b cể ườ ộ ấ ậ ẽ ị ứ ch do có s t o thành bacteriocine.ế ự ạ

Khi nuôi c y trong môi tr ng có c ch t azide tetrazolium, khu n l c hình thành có màuấ ườ ơ ấ ẩ ạ

h ng đ n màu đ đ m do có s kh triphenyl tetrazolium chloride. Đ đ m b o các khu n l cồ ế ỏ ậ ự ử ể ả ả ẩ ạ hình thành trên môi tr ng ch n l c có hình hình d ng đ c tr ng, các khu n l c này ph i khôngườ ọ ọ ạ ặ ư ẩ ạ ả n m quá g n nhau.ằ ầ

Enterococcus không có enzym catalase, và không các cytochrom C (ph n ng oxydaseả ứ âm tính) chúng có th phát tri n đ c trong môi tr ng có 6.4% mu i NaCl pH 9.6 khi nuôiể ể ượ ườ ố ở c y nhi t đ 45ấ ở ệ ộ oC. Theo ph ng pháp này, các loài thu c nhómươ ộ Enterococcus thu c nhóm Dộ đ c phát hi n, các loài này bao g m:ượ ệ ồ Enterococcus faecalis; E. faecicum, E.avium và E.durans.

Các đ c đi m sinh hoá quan tr ng đ c th hi n nh sau:ặ ể ọ ượ ể ệ ư

Loài Phát tri n đ cể ượ ở ADH

Có kh năng sinh acid t các ngu n carbohydrateả ừ ồ10oC 44oC Mannito

l

Sorbitol Sucrose arabinos

e

Adonotol

E.faecalis + + + + + + - - E.faecicum

+ + + + v + + -

E.durans + + + - - - - - E.avium v* + - + + + v +

v: ph n ng không n đ nh (variable)ả ứ ổ ị

E. faecalis: đây là vi sinh v t th ng xuyên đ c tìm th y trong ru t già c a ng i,ậ ườ ượ ấ ộ ủ ườ chúng đ c coi là nhân t ch th ô nhi m phân. Th nh tho ng tìm th y vi sinh v t này trong ru tượ ố ỉ ị ễ ỉ ả ấ ậ ộ gà nh ng ít khi tìm th y trong đ ng v t khác. Chúng có th phát tri n đ c trong môi tr ng cóư ấ ộ ậ ể ể ượ ườ 0.03% potassium tellurite.

S. faecicum: chúng th ng hi n di n trong ru t l n và các v t khác. Đây là m t trongườ ệ ệ ộ ợ ậ ộ nh ng vi sinh v t gây h h ng các s n ph m nh jambon và th t ngu i. Không th phát tri nữ ậ ư ỏ ả ẩ ư ị ộ ể ể trong môi tr ng có có 0.03% potassium tellurite. Đây là loài vi sinh có kh năng kháng khángườ ả sinh cao nh t so v i các loài khác trong nhómấ ớ Enterococcus.

S. durans: th ng đ c tìm th y trong s a và các s n ph m c a s a, không tìm th yườ ượ ấ ữ ả ẩ ủ ữ ấ trong các m u b nh ph m.ẫ ệ ẩ

77



S. avium: hi n di n trong ru t gà và m t s đ ng v t khác. Vi sinh v t không tìm th y trongệ ệ ộ ộ ố ộ ậ ậ ấ các m u b nh ph m.ẫ ệ ẩ13.2 Nguyên t cắ

S hi n di n c aự ệ ệ ủ Enterococcus đ c coi nh là m t nhân t ch th ch t l ng v sinhượ ư ộ ố ỉ ị ấ ượ ệ c a th c ph m. S l ngủ ự ẩ ố ượ Enterococcus đ c xác đ nh b ng cách c y m t l ng m u bi tượ ị ằ ấ ộ ượ ẫ ế

tr c lên b m t môi tr ng ch n l c choướ ề ặ ườ ọ ọ Enterococcus, sau khi đ m các khu n l c đ củ ế ẫ ạ ặ tr ng, kh ng đ nh các khu n l c đã đ m b ng các th nghi m sinh hoá. Trong tr ng h p nghiư ẳ ị ẩ ạ ế ằ ử ệ ườ ợ ng các vi sinh v t b th ng t n trong quá trình ch bi n hay b o qu n, c y m u vào trongờ ậ ị ươ ổ ế ế ả ả ấ ẫ môi tr ng không ch n l c, 37ườ ọ ọ ủ ở oC trong 2 gi , sau đó ph m t l p môi tr ng ch n l c lênờ ủ ộ ớ ườ ọ ọ trên. Cac đĩa môi tr ng sau khi c y đ c 44ườ ấ ượ ủ ở oC trong kho ng 48 gi .ả ờ13.4 Môi tr ng và thu c thườ ố ử

- Enterococcus agar đ c chu n b trên các đĩa petri, làm khô b m t tr c khi s d ng.ượ ẫ ị ề ặ ướ ử ụ- Tryptose soy agar- Brain heart infusion ch a 6.5% NaCl đ c phân ph i vào trong các ông nghi m, m i ngứ ượ ố ệ ỡ ố

5ml.- Brain heart infusion có pH 9.6 đ c phân ph i vào trong các ông nghi m, m i ng 5mlượ ố ệ ỡ ố

- Thu c th catalase (Hố ử 2O2)- Thu c th oxydase: N,N,N’,N’-tetramethyl-p-phenylenediamineố ử 13.5 Thi t bế ị

- T m 37ủ ấ oC- T m 44ủ ấ oC

13.6 Ph ng pháp th c hi n.ươ ự ệChu n b m u:ẩ ị ẫ M u đ c chu n b và pha loãng thành các n ng đ phù h p b ng dungẫ ượ ẩ ị ồ ộ ợ ằ

d ch pha loãng sao cho sau khi c y 0.1 ml vào đĩa s xu t hi n 100-150 khu n l c.ị ấ ẽ ấ ệ ẩ ạC y m uấ ẫ : c y 0.1 ml lên b n m t môi tr ng ch n l c Enterococcus agar , trang đ uấ ề ặ ườ ọ ọ ề

kh p b m t đĩa b ng que trang tam giác.ắ ề ặ ằTrong tr ng h p nghi ng các vi sinh v t trong m u b y u hay th ng t n do quá trìnhườ ợ ờ ậ ẫ ị ế ươ ổ

ch bi n và b o qu n, c y 1ml m u vào trong đĩa petri tr ng, đ 5-6ml môi tr ng tryptose soyế ế ả ả ấ ẫ ố ổ ườ agar đã đ c làm ngu i trong b đi u nhi t đ n 45ượ ộ ể ề ệ ế oC, l c đ m u phân tán đ u vào trong môiắ ể ẫ ề tr ng, 37ườ ủ ở oC trong kho ng 2 gi . Đ 10-12ml môi tr ng enterococcus agar lên trên m t.ả ờ ổ ườ ặ

L t ng c đĩa petri và 44ậ ượ ủ ở oC trong kho ng th i gian 2 ngày.ả ớĐ m t t c các khu n l c có màu h ng đ n màu đ đ m, có th có m t vòng khôngế ấ ả ẩ ạ ồ ế ỏ ậ ể ộ

màu xung quanh khu n l c, kích th c các khu n l c này kho ng 0.5-3mm, không đ n cácẩ ạ ướ ẩ ạ ả ế khu n l c không có màu.ẩ ạ

Kh ng đ nhẳ ị : Ch n ít nh t 5 khu n đã đ m c y chuy n vào môi tr ng TSA, qua đêmọ ấ ẩ ế ấ ể ườ ủ 37oC. Sinh kh i vi khu n trên môi tr ng STA đ c c y chuy n vào các môi tr ng thở ố ẩ ườ ượ ấ ể ườ ử

nghi m sinh hoá nh BHI ch a 6.5% NaCl, BHI có pH 9.6, th nghi m catalase, oxydase …ệ ư ứ ử ệ Enterococcus có ph n ng catalase và oxydase âm tính, nh ng chúng phát tri n đ cả ứ ư ể ượ

trong các môi tr ng BHI ch a 6.5% NaCl và BHI có pH 9,6.ườ ứ

14. N M MEN VÀ N M M CẤ Ấ Ố

14.1 Đ nh nghĩaị N m men và n m m c là nhóm vi sinh v t r t đa d ng, cho đ n nay có h n 400 000 loàiấ ấ ố ậ ấ ạ ế ơ

n m nen và n m m c đã đ c mô t . Đây là nhóm vi sinh v t nhân th t, có vách t bào là l pấ ấ ố ượ ả ậ ậ ế ớ v chitin, có nhân và các bào quan khác. T t c các loài men và m c đ u thu c nhóm vi sinh vỏ ấ ả ố ề ộ ậ

78



d d ng, chúng c n ngu n d nh d ng cung c p năng l ng t môi tr ng bên ngoài, vì th viị ưỡ ầ ồ ị ưỡ ấ ượ ừ ườ ế sinh v t này th ng xuyên đ c phân l p t th c ph m hay các ngu n giàu dinh d ng khác.ậ ườ ượ ậ ừ ự ẩ ồ ưỡ Phân bi t n m men và n m m c theo khái ni m đ n gi n nh sau:ệ ấ ấ ố ệ ơ ả ư

N m m c là vi n m d ng s i, sinh s n b ng bào t ho c khu n ty.ấ ố ấ ạ ợ ả ằ ử ặ ẩMen là nh ng t bào đ n tính phát tri n theo ki u n y ch i. Th nh tho ng có th nhìnữ ế ơ ể ể ả ồ ỉ ả ể

th y các t bào k t nhau thành chu i.ấ ế ế ổĐ n v hình thành khu n l c c a m c và men là m m t o nên m t khu n l c khi nuôi c yơ ị ẩ ạ ủ ố ầ ạ ộ ẩ ạ ấ trong môi tr ng. M m có th là m t bào t , m t t bào hay m t đo n c a khu n ty.ườ ầ ể ộ ử ộ ế ộ ạ ủ ẩ

Trong th c ph m, khi có s hi n di n c a m c và men, chúng phát tri n làm thay đ iự ẩ ự ệ ệ ủ ố ể ố màu c a th c ph m, gây mùi hay v l , làm h h ng hay thay đ i c c u c a th c ph m. M tủ ự ẩ ị ạ ư ỏ ổ ơ ấ ủ ự ẩ ộ s loài có th t o đ c t gây ng đ c th c ph m.ố ể ạ ộ ố ộ ộ ự ẩ14.2 Các yêu c u v môi tr ng cho s tăng tr ng và phát tri n c a n m men và n mầ ề ườ ự ưở ể ủ ấ ấ

m cố Quá trình tăng tr ng c a n m men và n m m c ph thu c vào r t nhi u y u t t môiưở ủ ấ ấ ố ụ ộ ấ ề ế ố ừ

tr ng. S tác đ ng đ u tiên đ n quá trình phát tri n c a vi sinh v t này là nhi t đ , h u h tườ ự ộ ầ ế ể ủ ậ ệ ộ ầ ế các loài thu c nhóm này đ u thu c nhóm vi sinh v t a mát, nhi t đ thích h p cho s phátộ ề ộ ậ ư ệ ộ ợ ự

tri n c a chúng trong kho ng 20-28ể ủ ả

o

C, m t s ít trong nhóm này a l nh hay a nóng. Tuyộ ố ư ạ ư nhiên trong các đi u ki n nhi t đ l nh hay nóng quá ng ng phát tri n, các vi sinh v t nàyề ệ ệ ộ ạ ữ ể ậ không phát tri n nh ng có th t n t i d i d ng tìm sinh.ể ư ể ồ ạ ướ ạ

Ho t tính n c cũng là m t nhân t nh h ng r t nhi u đ n quá trình phát tri n c aạ ướ ộ ố ả ưở ấ ề ế ể ủ m c và men. h u các loài m c và men phát tri n t t trong c ch t có ho t tính n c kho ngố ầ ố ể ố ơ ấ ạ ướ ả 85% hay l n h n nh ng cũng có m t s ít loài có th phát tri n trong c ch t có h t tính n cớ ơ ư ộ ố ể ể ơ ấ ạ ướ th p h n, có th 60-70%.ấ ơ ể

pH cũng là nhân t tác đ ng tr c ti p đ n quá trình tăng tr ng c a n m m c và men.ố ộ ự ế ế ưở ủ ấ ố Trong d i pH t 2-9 vi sinh v t này đ u phát tri n. Tuy nhiên kho ng pH thích h p nh t choả ừ ậ ề ể ả ợ ấ n m m c và men n m trong kho ng 4-6.5.ấ ố ằ ả

Nhân t quan tr ng khác tác đ ng lên quá trình phát tri n c a n m m c và men là oxyố ọ ộ ể ủ ấ ố phân t . h u h t các loài vi sinh v t nhóm này đ u thu c nhóm hi u khí b t bu c, m t dù m tử ầ ế ậ ể ộ ế ắ ộ ặ ộ s trong nhóm này có th phát tri n trong đi u ki n hàm l ng oxy th p vi hi u khí, m t số ể ể ể ệ ượ ấ ế ộ ố loài có th ti p nh n oxy nguyên t t c ch t c a chúng, nh ng dù d ng nào, oxy v n làể ế ậ ử ừ ơ ấ ủ ư ở ạ ẫ nguyên t c n thi t cho quá trình phát tri n c a m c và men.ố ầ ế ể ủ ố14.3 Nguyên t cắ

Xác đ nh s l ng m c hay men trong m u b ng k thu t pha loãng và đ đĩa, m t kh iị ố ượ ố ẫ ằ ỹ ậ ổ ộ ố l ng m u xác đ nh đ c c y trang trên môi tr ng DG 18 (Dichloran Glycerol Agar) hayượ ẫ ị ượ ấ ườ DRBC (Dichloran Rose Bengal Chloramphenicol Agar). Sau khi 25ủ oC trong 5-7 ngày, đ m sế ố khu n l c n m men và n m m c riêng bi t.ẩ ạ ấ ấ ố ệ14.4 Môi tr ng và thu c thườ ố ử

Dung d ch pha loãng: ch a 1 gam pepton trong 1000ml n c c t.ị ứ ướ ấMôi tr ng Dichloran glycerol agar (DG18): đ c s d ng cho các lo i m u th c ph mườ ượ ữ ụ ạ ẫ ự ẩ

có ho t tính n c th p nh các lo i th c ph m khô nh g o ngu, c c, tiêu, hay các lo i th cạ ướ ấ ư ạ ự ẩ ư ạ ố ạ ự ph m có d u, có hàm l ng đ ng hay mu i cao.ẩ ầ ượ ườ ố

Môi tr ng Dichloran rose Bengal agar (DRBC): đ c s d ng cho các m u có ho t tínhườ ượ ử ụ ẫ ạ cao nh s a và các s n ph m c a s a, các lo i rau qu và trái cây t i, các lo i đ h p …ư ử ả ẩ ủ ử ạ ả ươ ạ ồ ộ

Các lo i môi tr ng trên đ c chu n b trên các đĩa petri, làm khô m t tr c khi sạ ườ ượ ẩ ị ặ ướ ử d ng. Các lo i môi tr ng này ch a các thành ph n nh y c m c i ánh sáng, vì th c n bàoụ ạ ườ ứ ầ ạ ả ớ ế ầ qu n trong t i cho đ n khi s d ng.ả ố ế ử ụ

79



14.5 Thi t bế ị - Kính hi n viể- T m 25ủ ấ oC

14.6 Ph ng pháp phân tíchươ Chu n b m uẩ ị ẫ : Cân 10g m u và thêm 90 ml dung dich pha loãng. Ngâm m u khô trongẫ ẫ

dung d ch kho ng 30 phút. D p 2 phút trong máy d p m u. Pha loãng thành các n ng đ thíchị ả ậ ậ ẫ ồ ộ h p.ợC yấ : C y trang 0,1 ml trên các đĩa môi tr ng DBRC ho c DG 18. N u m t đ n m menấ ườ ặ ề ậ ộ ấ

và n m m c trong m u th p, có th c y 1 ml vào 3 đĩa môi tr ng, trang đ u kh p b m t đĩaấ ố ẫ ấ ể ấ ườ ề ắ ề ặ môi tr ng cho đ n khi khô m t b ng que c y tam giác. Đ t ng a đĩa trong bao nylon và đ hườ ế ặ ằ ấ ặ ử ể ở mi ng bao khi đem .ệ ủ

U: nhi t đ 25ủ ở ệ ộ oC trong th i gian 5-7 ngày, đ t ng a đĩa đ t o đ m thích h p choờ ặ ử ể ạ ộ ẩ ợ s phát tri n c a n m men m c và h n ch làm khô th ch.ự ể ủ ấ ố ạ ế ạ

Đ m khu n l cế ẩ ạ : Đ m và tính s l ng khu n l c n m m c và n m men trên t t c cácế ố ượ ẩ ạ ấ ố ấ ấ ả đĩa c y, khi c n thi t ph i quan sát b ng kính hi n vi đ phân bi t khu n l c n m men hayấ ầ ế ả ằ ể ể ệ ẩ ạ ấ n m m c. K t qu đ c ghi nh n b ng đ n v Cfu/g. N u có yêu c u phân lo i hay đ nh danhấ ố ế ả ượ ậ ằ ơ ị ế ầ ạ ị

các loài nghi ng sinh đ c t , các khu n l c đ c c y chuy n vào trong các ng nghi m ch aờ ộ ố ẩ ạ ượ ấ ể ố ệ ứ môi tr ng Sabouraud agar nghiêng đ g i đ n các phòng thí nghi m chuyên đ nh danh và phânườ ể ở ế ệ ị lo i n m.ạ ấ14.7 Ghi chú:

Trong th i gian nuôi c y, n m m c có th t o bào t và phát tán vào trong môi tr ngờ ấ ấ ố ể ạ ử ườ nuôi c y t o nên các khu n l c m i. Đ h n ch hi n t ng này, trong su t th i gian nuôi c y,ấ ạ ẩ ạ ớ ể ạ ế ệ ượ ố ớ ấ không di chuy n hay đ ng vào các đĩa cho đ n khi đ m k t qu , không m đĩa đ h n ch sể ộ ế ế ế ả ở ể ạ ế ự phân b c a bào t vào trong không gian làm vi c, gây nhi m vào trong m u hay môi tr ngố ủ ử ệ ễ ẫ ườ nuôi c y khác.ấ

15. Đ NH L NG COLIFORMS, COLIFORMS CH U NHI T,Ị ƯỢ Ị Ệ E. COLI GI Đ NH VÀẢ Ị E.COLI

TRONG S N PH M TH Y S N B NG PH NG PHÁP MPN.Ả Ẩ Ủ Ả Ằ ƯƠ

Ph ng páhp này đ c áp d ng đ đ nh l ng các vi sinh v t v i m t đ th p trong cácươ ượ ụ ể ị ượ ậ ớ ậ ộ ấ m u th c ph m.ẫ ự ẩ15.1 Đ nh nghĩaị

Trong ph ng pháp này, Coliforms đ c hi u là nh ng vi sinh v t sinh h i trong môiươ ượ ể ữ ậ ơ tr ng canh Lauryl Sulphate Broth và canh Brilliant Green Lactose Bile Salt broth, nuôiườ ủ ở 37oC trong kho ng th i gian 48 gi . Coliforms ch u nhi t là nh ng vi sinh v t sinh h i trongả ờ ờ ị ệ ữ ậ ơ môi tr ng canh EC nuôi 44. trong th i gian 24 gi . Coliforms phân (ườ ủ ở ờ ờ E. coli gi đ nh) làả ị Coliforms ch u nhi t sinh indole trong canh trypton nuôi 44.5ị ệ ủ ở oC trong kho ng 24 gi .ả ờ E.colilà Coliforms phân cho k t qu theo nghi m pháp IMViC là ++ - -ế ả ệ15.2 Nguyên t cắ

S l ng Coliforms, Coliforms ch u nhi t,ố ượ ị ệ E.coli gi đ nh (Coliforms phân) vàả ị E.coliđ c xác đ nh b ng ph ng pháp MPN, ph ng pháp này d a vào nguyên t c m u đ c phaượ ị ằ ươ ươ ự ắ ẫ ượ loãng thành m t dãy th p phân (hai n ng đ k ti p chênh nhau 10 l n) và đ a vào các ngộ ậ ồ ộ ế ế ầ ư ố nghi m có ch a môi tr ng thích h p, và đ c s ng cho k t qu d ng tính. S ngệ ứ ườ ợ ủ ọ ố ố ế ả ươ ố ố nghi m cho ph n ng d ng tính c a các n ng đ pha loãng đ c tra theo b ng MPN đ xácệ ả ứ ươ ủ ồ ộ ượ ả ể đ nh t ng s Coliforms trong 1 gam (ho c 1 ml) s n ph m.ị ổ ố ặ ả ẩ15.3 Môi tr ng và thu c thườ ố ử

80



Canh Lauryl sulphate (sodium dodecyl sulphate - LSB)Canh Brilliant green lactose bile salt (BGBL)Canh EC (E.coli medium)(Các môi tr ng canh trên đ c chu n b trong các ng nghi m, có ng durham ng c,ườ ượ ẩ ị ố ệ ố ượ

ch s d ng các ng khi không còn b t khí đ ng trong các ng durham)ỉ ử ụ ố ọ ọ ố

Canh TryptoneThu c th Kovac’số ử Canh MR-VPThu c th Methyl red.ố ử Thu c th Alpha napthol.ố ử Th ch Simmon citrateạ(Xem ph ng pháp chu n b các môi tr ng thu c th trên ph ng pháp đ nh l ngươ ẩ ị ườ ố ử ở ươ ị ượ coliform, E.coli )

15.4 Các thi t b chínhế ị B đi u nhi t 44ể ề ệ oC ± 0.5 oCT m 37.ủ ấ oC ± 1.0oC

15.5 Qui trình c y m u và đ c k t quấ ẫ ọ ế ảColiforms: C y 1 ml d ch m u đã pha loãng 1:10 vào dãy 5 ng nghi m, m i ng ch aấ ị ẫ ố ệ ỗ ố ứ 10 ml canh Lauryl sulphate. Th c hi n t ng t v i d ch m u đã pha loãng 1:100 và 1:1000.ự ệ ươ ự ớ ị ẫ N u nghi ng l ng vi sinh v t trong m u quá cao, ph i tăng đ pha loãng m u. U 37.0ế ờ ượ ậ ẫ ả ộ ẫ ở oc +10C/48 gi . Ghi nh n s ng có sinh h i. Dùng khuyên c y c y chuy n d ch m u t các ngờ ậ ố ố ơ ấ ấ ể ị ẫ ừ ố LSB d ng tính sang các ng có ch a canh Brilliant green lactose bile salt. 37.0ươ ố ứ ủ ở oC± 1.oCtrong th i gian 48 gi . Ghi nh n s ng có sinh h i. Đ c s l ng các ng cho k t qu d ngờ ờ ậ ố ố ơ ọ ố ượ ố ế ả ươ tính. S ng nghi m cho ph n ng d ng tính c a các n ng đ pha loãng đ c tra theo b ngố ố ệ ả ứ ươ ủ ồ ộ ượ ả MPN đ xác đ nh t ng s Coliforms trong 1g (ho c 1 ml) s n ph m.ể ị ổ ố ặ ả ẩ

Coliforms ch u nhi t ị ệ

Dùng khuyên c y c y chuy n d ch m u t các ng canh Lauryl sulphate có sinh h i sangấ ấ ể ị ẫ ừ ố ơ môi tr ng canh EC, 44.5ườ ủ ở oC ± 0.2 oC trong th i gian 24 gi . Đ m s l ng các ng cho k tờ ờ ế ố ượ ố ế qu d ng tính. S ng nghi m cho ph n ng d ng tính c a các n ng đ pha loãng đ c traả ươ ố ố ệ ả ứ ươ ủ ồ ộ ượ theo b ng MPN đ xác đ nh t ng s Coliforms ch u nhi t trong 1 g (ho c 1 ml) s n ph m.ả ể ị ổ ố ị ệ ặ ả ẩ

Coliforms phânDùng khuyên c y vòng c y chuy n t các ng có sinh h i trên môi tr ng canh EC sangấ ấ ề ừ ố ơ ườ

môi tr ng th ch đĩa EMB. U các đĩa này 37ườ ạ ở oC trong th i gian 24 gi . Ch n các khu n l cờ ờ ọ ẩ ạ tròn, d t có hình đĩa và có ánh kim tím, đ ng kính kho ng l n h n 1mm. Các khu n l c nghiẹ ườ ả ớ ơ ẩ ạ ng này đ c c y chuy n vào môi tr ng canh Trypton, 44.5ờ ượ ấ ể ườ ủ ở oC± 0.2oC trong kho ng 24ả

gi . Nh thu c th Kovac’s vào các ng nghi m đã . Ph n ng d ng tính khi có màu đ xu tờ ỏ ố ử ố ệ ủ ả ứ ươ ỏ ấ hi n trong môi tr ng trong vòng vài phút. Đ c s l ng các ng cho k t qu d ng tính. Sệ ườ ọ ố ượ ố ế ả ươ ố ng nghi m cho ph n ng d ng tính c a các n ng đ pha loãng đ c tra theo b ng MPN đố ệ ả ứ ươ ủ ồ ộ ượ ả ể

xác đ nh t ng s Coliforms phân trong 1g (ho c 1 ml) s n ph m.ị ổ ố ặ ả ẩ E. coli

Dùng khuyên c y phân l p chuy n d ch m u t các ng có sinh h i trên môi tr ngấ ậ ể ị ẫ ừ ố ơ ườ canh EC sang môi tr ng th ch đĩa EMB. U các đĩa này 37ườ ạ ở oC trong th i gian 24 gi . Ch n cácờ ờ ọ khu n l c tròn, d t có hình đĩa và có ánh kim tím, đ ng kính kho ng l n h n 1mm. Các khu nẩ ạ ẹ ườ ả ớ ơ ẩ

81



l c nghi ng này đ c c y chuy n vào môi tr ng canh Trypton, 44.5ạ ờ ượ ấ ể ườ ủ ở oC± 0.2oC trongkho ng 24 gi đ ng th i c y vào các môi tr ng MRVP, simmoncitrate agar đ th c hi n cácả ờ ồ ờ ấ ườ ể ự ệ ph n ng trong nghi m pháp IMViCả ứ ệ

E.coli đ c xác đ nh khi nghi m pháp IMViC cho k t qu phù h p (++ - -). Đ m sượ ị ệ ế ả ợ ế ố l ng các ng cho k t qu IMViC ++ - - t các đĩa cho các khu n l c nghi ng . S ngượ ố ế ả ừ ẩ ạ ờ ố ố

nghi m cho k t qu IMViC phù h p c a các n ng đ pha loãng đ c tra theo b ng MPN đệ ế ả ợ ủ ồ ộ ượ ả ể xác đ nh t ng sị ổ ố E.coli trong 1 g (ho c 1 ml) s n ph m.ặ ả ẩ15.6 Bi u di n k t quể ễ ế ả

S l ng coliforms, coliforms ch u nhi t,ố ượ ị ệ E. coli gi đ nh vàả ị E. coli đ c bi u di n v iượ ể ễ ớ đ n v MPN/g (ml). Trong tr ng h p n ng đ c y vào dãy đ u tiên có s pha loãng nh h nơ ị ườ ợ ồ ộ ấ ầ ự ỏ ơ 10-1 k t qu thu đ c là s li u t b ng MPN nhân v i h s pha loãng so v i n ng đ 10ế ả ượ ố ệ ừ ả ớ ệ ố ớ ồ ộ -1

phuong_phap_phan_tich_4935

Documents